JPH02257890A - ペプチドアミドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 この発明は、ペプチドアミドの製造方法に関し、さらに
詳しくは、ペプチドとアミノ酸アミドを縮合することに
よる生理活性ペプチドアミドの製造方法に関する。

（ロ）従来の技術と発明が解決しようとする課題生理活
性を有する種々のペプチドが知られており、いくつかは
すでに医薬等として使用され、又研究、開発中のものも
多い。例えば、オキシトシン、インシュリン、セクレチ
ン、カルシトニン等が、生体から抽出したり、又は化学
合成することによって得られている。しかし、ペプチド
によっては動物種によりアミノ酸配列が異なり、人への
使用が困難な場合がある。また、長鎖ペプチドの場合、
その化学合成は非常に高価につく。

近年、遺伝子工学的手法によって、ペプチド、蛋白質を
作ることが可能となり、すでに本手法により生産された
インシュリン、成長ホルモンが医薬品として使用されて
いる。

ところで、ペプチド性生理活性物質の中にはその活性発
現のために、Ｃ末端がアミド化された、ペプチドアミド
の構造であることを必要とするものが多くある。例えば
カルシトニン、セクレチン、成長ホルモン分泌因子等で
、アミド基の存在が重要であることが知られている。こ
れまでの研究結果より、アミド化ペプチドは、前駆体ペ
プチドのＣ末グリシンがＣ末端、アミド化酵素の作用を
受けてアミドに変換されて生成することが明らかにされ
ている。これまで、種々の動物の組織、器官にこのＣ末
端アミド化酵素の存在が認められている［Ｎａｔｕｒｅ
　２９８．６８６（１９８２）、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｎ＋ｕｎ、、　１１２．３７２（１９
８３）等］。

前述の遺伝子工学的手法では、宿主として細菌や酵母が
使用されるが、これらにおいては、アミド化に必要なＣ
末端アミド化酵素が欠如しているため、直接的にペプチ
ドアミドを作り出すことは出来ない。そこで、現在では
、Ｃ末にグリシンが延長したペプチドを遺伝子工学的手
法で作り、これに別途調製したＣ末端アミド化酵素を作
用させ目的とする生理活性ペプチドアミドを得ようとす
る試みがなされている（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　１９８７゜芝、榊原編、ペプチド研究所発行、
１９８８年Ｐ４３１〜４３４）。しかしながら、Ｃ末端
アミド化酵素は生体内に極めて微量にしか存在せず、そ
の精製は困難であり、又本酵素は不安定で容易に失活す
るため、反復使用は困難である。

本発明は、上記Ｃ末端アミド化酵素を使用する方法とは
本質的に異なる方法でペプチドアミドを製造しようとす
るものである。すなわち、本発明は、プロテアーゼが持
つペプチド形成能を利用し、Ｎ端および側鎖官能基が無
保護の短鎖あるいは長鎖ペプチドとアミノ酸アミドを適
当な反応条件下で縮合し目的のペプチドアミドを得よう
とするものである。

プロテアーゼが蛋白加水分解の逆反応であるペプチド結
合の形成反応をも触媒しうろことは古くから知られてお
り、これまで、基質特異性の異なる種々のプロテアーゼ
を用いてペプチド合成が検討されてきた。プロテアーゼ
によるペプチド合成では反応に際して側鎖官能基を全て
保護する必要は必ずしもないが、合成収率を高めるため
、カルボキシル成分のＮ″アミノ基側鎖官能基は保護し
て行われて来た。すなわち従来の方法では、生成物を採
取するため、反応生成物が水溶性基を失って水に不溶と
なり析出することを利用していた。

又、巾広い基質特異性を示すプロテアーゼをオリゴペプ
チドの合成に使用した際には、基質の加水分解が起こり
やすく、反応の制御は困難とされ、これまでの研究は主
としてジあるいはトリペプチド程度の短鎖ペプチドの合
成に限られていた。

本発明に記載した金属プロテアーゼに関して、ペプチド
合成への反応は数報告ある［Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

８８、８０７（１９８０）、、　Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ
　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１４゜１８２（１９８６）、、
　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　
Ｒｅｓ、、　３１゜２４５（１９８８）、、　Ｐｅｐｔ
ｉｄｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９８Ｇ、大用編、ペプ
チド研究所発行、１９８１年２１３〜２１８頁、ＴｅＬ
ｒａｈ−ｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、　２８．２６１１（
１９７９）等コ。これらの報告中で行われた実験は、は
とんどがジあるいはトリペプチドに関するものであり、
かついずれの場合も、Ｎ″７７ミノ基いは側鎖官能基は
保護して実験に供されている。又、日本化学会第３５秋
季年会、講演予稿集■、４Ｂ２Ｌ、、　Ｂｕｌｌ、　Ｃ
ｌｅｗ、　Ｓｏｃ。

Ｊｐｎ、、　５０．２７６２（１９７？）には、各々テ
トラペプチド、ヘキサペプチドの合成例の記載があるが
、これらにおいても、Ｎ’アミノ基や側鎖官能基は保護
して使用されている。さらにアミン成分にはエステル基
質が使用されている。

側鎖官能基を無保護とした場合、通常、基質や目的とす
るペプチドは水溶性が増加する。従って、水系溶媒を使
用する従来の技術では、目的物は沈澱として得ることが
出来ず、また使用した酵素による二次的加水分解が生じ
やすくなり、目的を達成することが出来なかったもので
ある。

本発明者等は、反応条件を種々検討し、無保護のペプチ
ドをカルボキシル成分として使用した場合にも効率良く
反応が進行し、目的物が得られることを見い出し、これ
に基づいて、本発明を完成した。この際、プロテアーゼ
としては、イミノ側のアミノ酸に親和性を示す金属プロ
テアーゼを使用することが肝要である。

（ハ）課題を解決するための手段 この発明によれば、ペプチドとアミノ酸アミドを、水性
媒体中で、金属プロテアーゼの存在下にｐＨ５〜８で縮
合させ、該ペプチドのＣ末端がアミノ酸アミド化された
ペプチドアミドを得ることを特徴とするペプチドアミド
の製造方法が提供される。

この発明の方法の原料のペプチドとしてはジペプチド以
上の全てのペプチドが使用できる。ことに、生理活性を
有するペプチドの前駆体が好ましい対象である。これま
で構造が明らかにされた生理活性ペプチドを例にして示
すと、ＦＭＲＦアミドのＣ末フェニルアラニンアミドが
欠如したペプチド（フェニルアラニル−メチオニル−ア
ルギニン）、コレシストキニンＣ末子トラペプチドアミ
ドのＣ末フェニルアラニンアミドが欠如したペプチド（
メチオニル−グリシル−アスパラギン酸）を示すことが
出来る。同様に、サブスタンスＰのＣ末メチオニンアミ
ドが欠如したペプチド（アミノ酸敗１０個）、ブタセク
レチンのＣ末バリンアミドが欠如したペプチド（アミノ
酸敗２６個）、ヒトニューロペプチドＹのＣ末チロシン
アミドが欠如したペプチド（アミノ酸敗３５個）、ヒト
コルチコトロピン分泌因子のＣ末イソロイシンアミドが
欠如したペプチド（アミノ酸敗４０個）、パンクレアテ
ィクポリペブタイドのＣ末チロシンアミドが欠如したペ
プチド（アミノ酸敗３５個）、ガストリンのＣ末フェニ
ルアラニンアミドが欠如したペプチド（アミノ酸数１６
（ｉｔ）、コレシストキニンのＣ末フェニルアラニンア
ミドが欠如したペプチド（アミノ酸敗３２個）、ガスト
リン分泌因子のＣ末メチオニンアミドが欠如したペプチ
ド（アミノ酸数２６１１１）、Ｐ旧のＣ末イソロイシン
アミドが欠如したペプチド（アミノ酸敗２６個）　、Ｐ
ＹＹのＣ末チロシンアミドが欠如したペプチド（アミノ
酸敗３５個）、サウバギンのＣ末イソロイシンアミドが
欠如したペプチド（アミノ酸敗３９個）、マストパラン
ＭＯＣ末ロイシンアミドが欠如したペプチド（アミノ酸
敗１３個）、成長ホルモン分泌因子のＣ末ロイシンアミ
ドが欠如したペプチド（アミノ酸敗４３個）、ヒトカル
シトニン遺伝子関連ペプチドのＣ末フェニルアラニンア
ミドが欠如したペプチド（アミノ酸敗３６個）等を示す
ことができる。

これらのペプチドは、それらの含有するアミノ基やカル
ボキシル基のごとき官能基を何ら保護することなく用い
られる。

この発明の方法の反応剤として、アミノ酸アミドが用い
られる。そのアミノ酸アミドとしては次式を存するもの
の使用が望ましい。

ＲＯ ＨｔＮ　　　ＣＨＯＮＨＲｚ （式中Ｒ１は低級アルキル基、低級アルキルチオ低級ア
ルキル基又は置換らしくは非置換アラルキル基、及びＲ
１は水素原子又は低級アルキル基を意味する） Ｒ，における低級アルキル基としては炭素数１〜５個を
有するアルキル基が含まれ、例えばメチル、エチル、プ
ロピル、　１ｓｏ−プロピル、ブチル、１ｓｏ−ブチル
、５ｅｃ−ブチル、ペンチル、１ｓｏ−ペンチルが挙げ
られる。Ｒ８における低級アルキルチオ低級アルキル基
としては、メチルチオメチル、メチルチオエチル、エチ
ルチオエチル、メチルチオプロピル、エチルチオプロピ
ル、メチルチオブチル、メチルチオペンチルなどが挙げ
られる。

Ｒ１における置換らしくは非置換アラルキル基としては
、ベンジル、ｐ−ヒドロキシベンジル、ｐ−フルオロベ
ンジル基などが挙げられる。

上記のＲ，は、疎水性基であるのが望ましい。

Ｒ２における低級アルキル基としては、Ｒ１における低
級アルキル基と同一のものが適用できる。

より具体的にはアミノ酸アミドとして、疎水性アミノ酸
のアミド（例えばロイシンアミド、イソロイシンアミド
、メチオニンアミド、フェニルアミド、バリンアミド、
チロシンアミド）、又は疎水性アミノ酸のアルキルアミ
ド（例えばフェニルアラニンエチルアミド、ロイシンプ
ロピルアミド）さらには疎水性アミノ酸の側鎖を一部変
化させたアナログのアミドおよびアルキルアミド（例え
ばｐ−フルオロフェニルアラニンアミド）が挙げられる
。

この発明の方法に用いる金属プロテアーゼとしては、サ
ーモライシン、エラスターゼ（緑膿菌）、プロナーゼ、
タシナーゼなどが挙げられる。

この発明における水性媒体とは、水又は水と、昆和しう
る有機溶媒と水と、の混合液を意味する。有機溶媒とし
て、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、ジ
メチルホルムアミド、Ｌ、４−ブタンジオール、アセト
ニトリル、アセトン、プロピレングリコール、グリセロ
ール、メチルセロソルブが挙げられる。これらの有機溶
媒は、１種類以上混合して用いてもよい。

この発明の方法は、Ｐ）１５〜８好ましくはｐＨ約６〜
７で行われる。また反応温度は約ｌθ〜４０℃で行なう
のが好ましい。

水性媒体の種類、原料（ペプチド）と反応剤（アミノ酸
アミド）の濃度は適宜選択される。しかし反応剤は原料
に対して過剰量用いることが望ましい。好ましくは、反
応剤は原料に対して５倍モル程度用いられる。ａ度でい
えば、原料１〜１００ｍＭ。

反応剤５〜５００ｍＭが好ましい。

これに対する金属プロテアーゼの好ましい使用濃度は、
１０μＭ〜２Ｉｌ１Ｍである。

反応時間は、目的物の生成が最大になるよう任意に選択
される。

かくしてこの発明によれば原料のペプチドのＮ′アミノ
基又は側鎖官能基を保護することなく、その末端に存在
するカルボキシル基に、反応剤のアミノ酸アミドのアミ
ノ基が結合してアミドが形成される。

反応生成物は、例えば高速液体クロマトグラフィーやイ
オン交換クロマトグラフィーによって採取することがで
きる。

なお、原料のペプチドは公知のペプチド合成技術によっ
て合成して得ろことができろ。化学合成法としては液相
法（生化学実験講座１．タンパク質の化学■、矢島治明
２０７〜４００頁、東京化学同人、１９７８年、ペプチ
ド合成の基礎と実験、泉塵信之ら１〜１９３頁、丸善、
１９８５年等）や固相法（生化学実験講座１．タンパク
質の化学■、榊原俊平４０１〜４９６頁、東京化学同人
、１９７８年、ペプチド合成の基礎と実験、泉屋信夫ら
１９４〜２９５頁、丸善、１９８５年等）などの合成法
が使用できる。又遺伝子工学的手法としては、例えばフ
レアら（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｉ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７５．
５７６５（１９７ｇ））によるインシュリンの合成、Ｇ
ｏｅｄｄｅｌら（Ｎａｔｕｒｅ、　２８１゜５４４（１
９７４））による成長ホルモンの合成のほか、カルシト
ニン誘導体の製造法（特開昭５８−２０３９５３゜ＰＣ
Ｔ公表特許公報昭５８−５０１１２１．　Ｐ　ＣＴ公表
特許公報昭５９−５０１０９５．　Ｐ　ＣＴ公表特許公
報昭５９−５０１２４３、特願昭５９−１７０４９２．
特願昭６０−９８８９１．特願昭６０−１１３２５４．
特願昭６０−１３０８１５）やその池の種々のペプチド
、蛋白質の合成がある。また、実施例で使用した、フェ
ニルアラニル−メチオニル−アルギニン（Ｈ−Ｐｈｅ−
Ｍｅｔ−Ａｒｇ−ＯＲ）や、トリプトファニル−メチオ
ニル−アスパラギン酸（Ｈ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−
ＯＨ）は液相法で化学合成したものであり、又デス−チ
ロシン３６−アミド　ヒトニューロペプチドＹは固相法
で合成したものである。

（ニ）実施例 実施例１ Ｈ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−ＯＨのアミノ酸アミド化
（１）　トＴｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｏｔｌ　（１０ｕ
ｍｏｌ）　、Ｈ−Ｐｈｅ−ＮＨｔ・ｆｌｃｌ　（５０ｕ
ｍｏｌ　）およびサーモライシン（０，Ｏ１μｍｏｌ　
）を５０％水性メタノール（２００μＱ）に溶解。反応
液のｐＨを７％アンモニア水（２μＱ）で６．５に調整
後、室温３時間撹拌。反応液に０．ＩＮ塩酸−メタノー
ル（１：９％）混液ｌＯμＱを加え、遠心して不溶物を
除去した後、上清をヌクレオシル５Ｃ３８カラムを用い
る高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製
した（溶出条件、２２％アセトニトリル−０，２％トリ
フルオロ酢酸、流速４　ｙ、（１／　ｗｉｎ）。化学合
成により得られた標準品（市販品）と同じ保持時間に溶
出されるピークを分取し、凍結乾燥してＨ−Ｔｒｐ−Ｍ
ｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨｔを得た（４．８ｍ９、収
率８０％）。

（２）上記のＨ−Ｐｈｅ−ＮＨｔ・ＨＣｌをトＬｅｗ−
ＮＨｔ・ＨＣｌ、Ｈ−Ｖａｌ−ＮＨｔ・ＧＣｌ、Ｈ−Ｄ
Ｌ−（Ｐ−Ｆ）Ｐｈｅ−ＮＨｔ４Ｃ１に変え同様に処理
し、各々に対応する縮合物を精製、単離した。

（３）　（１）、　（２）で得られた縮合物のアミノ酸
組成は次の通りであり、各々理論値に一致した。

（以下余白） Ｈ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｘのアミノ酸組成Ｘ＝Ｐ
ｈｅ−ＮＨ，：」、Ｌｅｕ−ＩＨ，：３　、Ｐｈｅ−Ｎ
ＨＥｔ　：３．Ｍａｌ−ＮＨｔ　：３　、Ａ　１ａ−Ｉ
Ｈ唖、（ｐ−Ｆ）Ｐｈｅ−ＮＨ，；多Ｔｒｐ　　Ｍｅｔ
　　Ａｓｐ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｍａｌ　　Ａｌａ
　　（ｐ−ｒｌｕｏｒｏ）Ｐｈｅｌ　　Ｇ、９５　０．
９２　１１０　１．０４２　０．９６　０．９２　１．
０Ｇ　　１．００　　Ｇ、９２３　　Ｇ、９０　０９５
　１．００　１．１０４　０．９６　０．９７　１．０
０　　　　　　　　Ｇ、９ｇ５　０．９３　０．９５　
１．０Ｇ　　　　　　　　　　　０．９７６　０９２　
０９４　１、Ｑｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　Ｏ，９０（４）上記（２）で、非天然型のアミノ酸ア
ナログのＤＬ体混合物をアミノ成分とした時にも縮合反
応は進行した。この際、Ｌ体のみがとり込まれていた。

実施例２ Ｈ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−＾ｒｇ−ＯＨのアミノ酸アミド化
実施例１と同様に、Ｈ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−ＯＨ
と種々アミノ酸アミドとの縮合を行ない、生成物をＨＰ
ＬＣで分取、精製した。ここでは反応媒体として９０％
水工チルアミン ０．８７ 性メタノールを用い、ｐｉ（７，０で反応した。縮合物
の同定は標準品（市販品）とのＨＰＬＣによる比較およ
びアミノ分析により行なった。アミノ酸分析結果は次の
通りで、各々理論値に一致した。

Ｈ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−＾ｒｇ−Ｘのアミノ酸組成Ｐｈｅ
　　Ｍｅｔ　　Ａｒｇ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｌ　　Ａｌａ
　　（ｐ−ｆｌｕｏｒｏ）Ｐｈｅｌ　　２．００　０．
９７　１．００ ２　　＋、００　１．００　１．Ｑｏ　　１．０５３　
４．０Ｇ　　０．９４　１．００ ４　１．００　１．００　０．９７　　　　　　１．１
０５１゜Ｏｏ　　Ｏ，９７０，９５１，０４６１，０ｏ
　　Ｏ，９９１，００１，０１エチル１ミン ０．９２ 実施例３ 酸化インシュリンＢ鎖のアミノ酸アミド化（１）ウシ酸
化インシュリンＢ鎖（アミノ酸敗３０個、３　μｍｏ＋
）　、）ｌ−Ｐｈｅ−ＮＨｔ・ＨＣｌ　（６０μｍｏｌ
）を水（６０μＱ）とジメチルホルムアミドーエタノー
ル（１：　１　、　ｖ／ｖ、　５４０ｕＱ＞の混液に溶
解した。この時のｐＦＩは６．０であった。サーモライ
シン（０，０３μｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌し
た。反応液にＩＮ塩酸（１，０スＱ）を加え、遠心で、
不溶物を除去した後、上滑をヌクレオシル５Ｃ，、カラ
ムを用いるＨＰＬＣで精製した（溶出条件、３４％アセ
トニトリル−０，２％トリフルオロ酢酸、流速４ｘ（ｌ
ｌｍｉｎ）。残存する原料の酸化インシュリンＢ鎖の後
に溶出される主ピークを分取し、凍結乾燥して酸化イン
シュリンＢ鎖とＨ−Ｐｈｅ−ＮＨ，の縮合物（酸化イン
シュリンＢ−Ｐｈｅ３１−Ｎｕ、　）を単離した（４０
１９　　収率３７％）。

（２）上記縮合物の固定はアミノ酸分析およびリシルエ
ンドペプチダーゼ消化物の分析により行なった。すなわ
ち、縮合物をリシルエンドペプチダーゼで消化して得ら
れる二個のペプチドをＨＰＬＣで分取、精製した。これ
らをアミノ酸分析に付した結果、一つはＡｌａ、Ｐｈｅ
からなり、他方はデス−Ａｌａ”−酸化インシュリンＢ
鎖のアミノ酸組成に一致するものであることを確認する
ことができた。よって、縮合物は目的とする酸化インシ
ュリンＢ−Ｐｈｅ”−ＮＨｔであることが判明した。

（３）上記（１）と同様にして、Ｈ−Ｐｈｅ−ＮＨｔ　
・ＨＣｌをＨ−Ｌｅｕ−ＮＯｔ−ＨＣｌ、）ｌ−Ｐｈｅ
−ＮＨＥｉＨＣｌ、　Ｈ−Ｖａｌ−ＮＨ，−ＨＣｌ、Ｈ
−ＤＬ−（＋）−Ｆ）Ｐｈｅ−１１Ｈ，・ＨＣＩに変え
縮合を行ない、各々に対応する縮合物を得た。

（４）　（１）、（３）で得られた縮合物のアミノ酸分
析結集を次に示す。いずれら理論値に一致した。

（５）　（１）においてサーモライシンをエラスターゼ
（緑膿菌）、プロナーゼ、タシナーゼに変えて反応を行
なった。エラスターゼの場合は、酵素懸濁液を所定量ピ
ペットで亀り取り、遠心し、上清を除いた後、ベレット
状の沈澱物を使用した。いずれの場合にも、縮合反応が
進行し、目的の酸化インシュリンＢ−Ｐｈｅ”−ＮＨ，
が得られた。

（以下余白） 実施例４ ヒトニューロペプチドＹ　（ＮＰＹ）の合成Ｃ末端のチ
ロシンアミドが欠如したｄｅｓ−Ｔｙｒ”ＮＨ＊　ＮＰ
Ｙ　（０，４ａ９）とＨ−Ｐｈｅ−ＮＨｔ４Ｃ１（１，
０８ａＨ）をジメチルホルムアミド−エタノール（１：
ｔ、ｖ／ｖ、１３μｅ）と５％アンモニア水（２μＱ）
の混液に溶解。

この時のｐＨは７．０であった。エラスターゼの懸濁液
（２０μＱ、酵素量にして７２０μ９）を遠心しく　２
００Ｏｒｐｍ、　５分）で得られるペレット状の沈澱物
を先の基質溶液と合した。室温４時間撹拌後、Ｏ，ＩＮ
塩酸−ジメチルホルムアミド（９：１．ｖ／ｖ）混液（
１８０μｍ２）を加え、生じた沈殿を遠心で除去。上演
をヌクレオシル５Ｃ３８カラムを用いるＨＰＬＣに付し
精製した。［溶出条件、アセトニトリル−５０ｍＭ酢酸
アンモニウム（ｐＨ７，０）の系でアセトニトリルの濃
度グラジェント（３０→４５％／２Ｇ＋ｏｉｎ）で溶出
。流速１．ｖ１２／ａｉｎｌ　　ＮＰＹ標準品（市販）
と同じ保持時間に溶出されるピークを分取し、凍結乾燥
してＮＰＹを得た（　１８ｂ９゜収率４５％）。

本品は、ＨＰＬＣで標準品と同一の保持時間を示すこと
、さらにアミノ酸分析値が理論値に一致することにより
、目的のＮＰＹであると判断した。

アミノ酸分析結果（カッコ内は理論値）Ａｓｐ　４．９
４（５）、　Ｔｈｒ　１．１１（１）、　Ｓｅｒ　１Ｊ
９（２）、Ｇｌｕ２．８８（３）、　Ｐｒｏ　４．０４
（４）、　Ｇｌｙ　１．０７（１）、　Ａｌａ　４．０
２（４）、　Ｍｅｔ　Ｏ，９４（１）、　Ｉｌｅ　１．
８５（２）、　Ｌｅｕ　１．８３（２）。

Ｔｙｒ　４，８３（５）、Ｌｙｓ　１．１０（１）、　
Ｈｉｓ　１．０６（１）、　Ａｒｇ３．８４（４）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ペプチドとアミノ酸アミドを、水性媒体中で、金属
   プロテアーゼの存在下にｐＨ５〜８で縮合させ、該ペプ
   チドのＣ末端がアミノ酸アミド化されたペプチドアミド
   を得ることを特徴とするペプチドアミドの製造方法。 ２、前記金属プロテアーゼが、加水分解反応時、切断部
   位でイミノ側の疎水性アミノ酸に基質特異性を示す金属
   プロテアーゼである請求項１記載の方法。 ３、前記金属プロテアーゼが、サーモライシン、エラス
   ターゼ（緑膿菌）、プロナーゼ又はタシナーゼである請
   求項１又は２記載の方法。 ４、前記アミノ酸アミドが一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒ＿１は低級アルキル基、低級アルキルチオ低級
   アルキル基、置換もしくは非置換アラルキル基、Ｒ＿２
   は水素原子、又は低級アルキル基である） で表わされるものである請求項第１項に記載の方法。 ５、前記ペプチドアミドが、サブスタンスＰ、ヒトコル
   チコトロピン分泌因子、パンクレアティクポリペプチド
   、ガストリン、コレシストキニン、ガストリン分泌因子
   、セクレチン、ＰＨＩ、ＰＹＹ、サウバギン、マストパ
   ランＭ、セルレイン、ＦＭＲＦアミド、成長ホルモン分
   泌因子、カルシトニン遺伝子関連ペプチド又はニューロ
   ペプチドＹのように、Ｃ末端部位アミノ酸として疎水性
   アミノ酸を有する生理活性ペプチドアミド、又はこれら
   の生理活性ペプチドアミドのＣ末端アミノ酸アミドが前
   第４項記載のアミノ酸アミドで置換されたペプチドアミ
   ドである請求項１〜４項の何れかに記載の方法。 ６、前記水性媒体が、水または水と混和しうる有機溶媒
   と水との混合液である請求項１〜５項の何れかに記載の
   方法。 ７、前記有機溶媒がメタノール、エタノール、ジメチル
   ホルムアミド、１，４−ブタンジオール、アセトニトリ
   ル、アセトン、プロピレングリコール、グリセロール、
   メチルセロソルブおよびこれらの混合液である請求項１
   又は６項に記載の方法。