JPH04501121A

JPH04501121A - 生物学的に活性な新規薬剤・ポリマー誘導体およびその製造方法

Info

Publication number: JPH04501121A
Application number: JP2510696A
Authority: JP
Inventors: ベロネーズ　フランチェスコ; サルトーレ　ルチアナ; オルソリニ　ピエロ; デゲンギ　ロマノ
Original assignee: デビオファルム　ソシエテ　アノニム
Priority date: 1989-08-07
Filing date: 1990-07-26
Publication date: 1992-02-27
Anticipated expiration: 2012-10-08
Also published as: CA2038935A1; ES2069082T3; DE69017180T2; CA2038935C; DE69017180D1; JP2662311B2; EP0437563A1; DK0437563T3; ATE118686T1; EP0437563B1; WO1991001758A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】・に　な　・ポリマーＬよびその　゛本発明は、　生物学的に活性な新ｍｌ剤・ポリマー誘導体、　すなわち、　医薬品として有用な、　ペプチドもしくはタンパク質の誘導体に関する。　さらに詳しくは、　本発明は、　ペプチドもしくはタンパク質のポリエチレングリフール誘導体に関する。こ　こ　で、ペ　プ　チ　ド　も　し　く　は　タ　ン　パ　り　質　部　分　は、アミノ酸もしくはペプチドからなるスペーサーアームによってポリエチレングリコール残基に結合している。生物学的に活性な物質（例えば、　ペプチドもしくはタンパク質）をモノメトキシポリエチレングリコールで改質すると、　これら物質の物理的、　化学的、　酵素学的、　免疫学的、　ならびに薬理学的および薬理運動学的な性質が広範囲に変化すると報告されている。　これまで、　このような改質を行うための方法がいくつか報告されている（例えば。米国特許第４，１７９，３３７号および第４，７６６．１０６号；Ａｐｐｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　ａｎｄ　Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖａｌ、１１．　ｐ、１４１／１９８５を参照されたい）。このような改質されたペプチドもしくはタンパク賀誘導体は、　ペプチドもしくはタンパク質それ自体と比較すると、　水に対する溶解性が増大したり、　抗原性が減少したり、　あるいは体内を循環するペプチドもしくはタンパク質の半減期が増大したりするなど、　いくつかの利点を示す。しかしながら、　このような改質された生物活性化合物を使用することは、　以下のような問題点が見い出されているので、　満足なことてはない：　薬理運動学的な実験に必要なポリマー・薬剤付加体に放射性のプローブを選択的に導入することが困難であること；　いくつかの酵素が不活性であること；　ポリマー・タンパク質問の結合を体内の特定の酵素が切断するように設定する（または調節する）のが困難であること；　ポリマー・薬剤付加体中に、　目標とする性質をこの付加体自体に与えうるアミノ酸配列を導入することが困難であること。これらの問題点は、　ポリマーを活性化させるのに利用される化学的作用と、　ポリマーが薬剤に直接結合しているということに関係している。上記問題点のうち、　たとえすべてではないにしても、　そのいくつかが、　以下に示す本発明の新規薬剤・ポリマー誘導体を使用することによって。解消されるか、　あるいは少なくとも有意に低減され得ることがわかった。本発明の新規薬剤・ポリマー誘導体は下記の一般式で表される：ＲＯ−（ＣＢａ−Ｃ１１ａＯ）−−（ｃｏ）−Ｎ［Ｉ−Ｘ−（ＣＯ）−１１１１−Ｚ　（＋）こ　こ　で。Ｒは低級アルキル基を表し。ｎは２５と２５０との間の整数であり。Ｘは隣接するＮＢ基およびＣＯ基と組み合わせると。アミノ酸残基もしくはジペプチド残基もしくはトリペプチド残基を表し、　そして２は隣接するＮＨ基と組み合わせると、　生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質、　またはＮＨ基もしくはＮ１１２基を含む薬剤残基を表す。式（＋）で表される化合物のうち、　好ましい化合物は、　Ｒがメチル基を表し、　ｎが４０と１１５との間の整数を表すような化合物、　すなわち、　ポリエチレン部分が約１．８００〜５．５００の分子量（例えば、１．ＩＯｏおよびｓ、　ｏｏｏという分子量）を示すような化合物である。式（＋）で表される化合物のうち、　記号Ｘが、　隣接するＮＵ基およびＣＯ基と組み合わせると、　グリシン。フ　ェ　ニ　ル　ア　ラ　エ　ン、　ト　リ　ブ　ト　フ　ァ　ン　お　よ　び　ノ　ル　ロイシンから選択されるアミノ酸、　あるいはＧｌｙ−Ｇｌｙ　、　Ａ　ｒ　ｇ　−Ａ　ｒｇ、Ｐ　ｈ　ｅ　−Ａ　ｒｇ、Ｇ　１　ｙ　−Ｇ　１　ｙ　−Ａ　ｒｇ、Ｇ　１　ｙ　−Ｇ　１　ｙ　−Ｐ　■ ｅもしくはＧｌｙ−Ｌａｕ−ＧＬｙ−Ｌｅｕのようなジペプチドまたはトリペプチドを表すような化合物も好ましい。式（＋＞で表される化合物のうち、　記号２が、　隣接するＮＨ基と組み合わせると、　以下のものから選択される。　生物学的に活性なペプチド、　タンパク質もしくは薬剤の残基を表すような化合物も好まし−酵素（例えば、　スーパーオ牛シトジスムターゼ、　リボヌクレアーゼ、　アルギナーゼ、　アスパラギナーゼ、　ウロキナーゼ）； −抗生物質（例えば、　アンビンリン、　ドキソルビ　ン　ン　）　； −合成薬剤（例えば、　トデスメチルータモキシフェン）； −ペプチド（例えば、ＬＨＲＨおよびその合成類似体、　ソマトスタチンおよびその合成類似体）；−タンパク質（例えば、　インターロイキン２゜腫瘍壊死因子、　インシュリン、ＩＣＦ−１）　；−ヌクレオシド（例えば、　アデニンーアラビノシ　ド　（ａｒａ−Ａ）、　シ　ト　シ　ン　−　ア　ラ　ビ　ノ　シ　ド　（ａｒａ−Ｃ）。アシクロバール）。ここに掲げたものは如何なる限定を行うものではない。式（＋）で表される最も興味深いペプチド誘導体のうち、　すべてではないが、　いくつかの誘導体は。実施例において個々に説明され、　かつ特徴づけられている。したがって、　本発明は、　上で定義されたような式（１）で表される生物学的に活性な新規ペプチド誘導体、　およびその製造方法に関する。本発明は、　また、　式（１）で表される化合物の少な（とも１つを活性成分として含有する薬剤組成物に関する。本発明の他の目的は、　この明細書および特許請求の範囲から明らかになる。本発明の方法は、　様々な構造および性質を有する。　ア　ミ　）　酸　も　し　く　は　ベ　プ　チ　ド　か　ら　な　る　ス　ペ　−　サーアームを、　モノアルコキンポリエチレングリコールの水酸基に、　このアミノ酸もしくはペプチドのＮＢ２基を含むカーボネート結合によって結合させることに基づいている。　この反応の後、　アミノ酸もしくはペプチドからなるスペーサアームのＣ０ＯＨ基はスクシンイミジルエステルとして活性化される。　このようにして、　スペーサアームは、　生物学的に活性なペプチド、　タンパク質または薬剤のアミ７基に対して反応性を宵するようになる。さらに詳しくは、　本発明の方法は、　以下の工程ＲＯ−（ＣＩ＋２−Ｃ［Ｉ２０）。Ｈ（ＩＩ）（ここで、　Ｒおよびｎは上で定義したとおりである）で表されるモノアルコキンポリエチレングリコール　誘導体　を、　２．４．Ｓ−）　リ　り　ロ　ル　フ　ェ　ニ　ル　り　ロ　ロ　ホｈｉ　−）　も　Ｌ＜　は　４−　ニ　ト　ロ　フ　ェ　ニ　ル　り　ロ　ロ　ホ　ル　メートと反応させて、　対応するカーボネートを得る工程；ｂ）このようにして得られたカーボネートを、　下記の式％式％（（ここで、　Ｘは上で定義したとおりである）で表されるアミノ酸もしくはジペプチドもしくはトリペプチドと反応させて下記の式％式％（）で表される化合物を得る工程：Ｃ）このようにし−Ｃ得られた式（１ｖ）で表される化金物を対応するスクシンイミジルエステルに転換する工程；　およびｄ）最後に、　このスクシンイ　ミ　ジルエステルを。下記の式％式％（）（ここで、　Ｒおよび２は上で定義したとおりである）で表される生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質、　または８８基もしくはＮ１１ｍ基を含む薬剤と反応させる工程。上記方法の工程ａ）〜ｄ）は、　特別な反応条件を必要とするものではなく、　通常の方法に従って実施することができる。上記の各反応工程の詳細は。本発明を例示する実施例で示す。このような新規なスペーサアーム（アミノ酸もしくはペプチド）を導入することによって、　生物活性なタンパク質もしくは薬剤に所定の性質を与えることができる。　即ち：　式（１）で表されるペプチド誘導体の促進リポソーム分解を促進し、　特定の細胞酵素によって、　この誘導体の特定の部位の切断を可能にし、　さらに場合によっては、　この誘導体の、　アミノ酸部分を認識する特定の細胞受容体に対し結合力を増大させることを可能にする性質である。さらに、　以下のような付加的な利点もある：　新規なスペーサーアーム（：、タンパク質に導入されたポリマー鎖を直接定量するのに好都合に用いられ得る残基を含ませることができるということであ　る。　こ　れ　は、　ト　リ　ブ　ト　）　ァ　ン　も　し　（は　）　エ　ニ　ルアラニンの場合にはυＶ膜吸収よって、　あるいは天然物由来のタンパク質には本来存在しないノルロイシンの場合にはアミノ酸分析によって、　実施する　こ　と　が　で　き　る。スペーサーアームは、　また、　標識化されたアミノ酸を用いて放射活性化してもよ、い。放射活性化すれば、　薬理運動学的または代１こ関する実験の間に、　生物学的に活性なペプチド誘導体の検出が非常に容易になる。これらの興味深い性質のいくつかは、　以下の実施例に例示されているが、　これらの実施例に限定はされない。以下の実施例において、ｒ　Ｍ−ＰＥＧＪという用語はモノメトキシポリエチレングリコールを意味し、　アミノ酸もしくはペプチドは当該分野の一般的な用語によって記述されている。Ａ、　アミノ酸もしくはペプチドからなるスペーサーアームを有する活性化Ｍ− ＰＥＧの製造ＳＯ■ｌの無水塩化メチレンに溶解したｌｏｇ（２−Ｍ）のＭ−ＰＥＧ−５０００に、　０．５８■ｌ（４ｍＭ＞　の　ト　リ　エ　チ　ル　ア　ミ　ン（ＴＥＡ）および０．８１ｇ（４ｍＭ）の４−ニトロフェニルクロロホルメー　トを、　攪拌しながら、’ＴＥＡでｐＢ７．ｓ〜８．０に調節した状態で添加した。この反応混合物を室温で４時間放置した。この混合物を真空下で約１０ｍ１に濃縮し、２００■１の攪拌したジエチルエーテル中に滴下した。沈澱物を濾別し、　熱い酢酸エチルから２度結晶イレさせた。　Ｍ−ＰＥＧ−ｐ−ニ　トロフェニルカーポネー　）　（Ｍ−ＰＥＧ−ＯＣＯ−ＯＰｈ−ＮＯ２）の収率は、　ｐ−ニ　ト　ロフェノールの吸収に基づく分光光度法によって算出したところ、９５％以上であった。グリシン１．５ｇ（２０ｍＭ）を２０ｓ１の水に溶解させ、　この溶液をｐｎａ、　０〜８．３に調節し、１０．３３ｇ（２■Ｍ）のＭ−ＰＥＧ−ＯＣＯ−０− Ｐｈ−Ｎｏ２を、　攪拌下、！１ａＯＲでｐｎａ、　３に調節しながら、　添加した。室温で４時間後、　この溶液を０℃に冷却して、２１１［ＩＣ１でｐ［１３とし、Ｃｌ１Ｃ１ｓで３回抽出した。　クロロホルム層を水゛で洗浄し、　ＮａｇＳＯ４で乾燥させ、　濃縮し、　ジエチルエーテルで沈澱させ、　そして沈澱物をエタノールから再結晶させた。収率は、ＣＯＯ［＋滴定と、酸加水分解させた後で通常のアミノ酸分析によって得られたグリシン含有量とから算出したところ、８５％であった。Ｍ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−０１１１０，２ｇ（２■Ｍ）を５０■ｌの無水塩化メチレンに溶解させ、　０℃に冷却し、０．４６ｇ（４■Ｍ）のＮ−ヒ　ド　ロ　キ　／　ス　り　ン　ン　イ　ミ　ド　お　よ　び　０．８３ｇ（４■　Ｍ　）　の　Ｎ　。Ｎ−ジシクロへキンル力ルポジイミドを攪拌しながら添加した。温度を２０℃に上昇させながら、　４時間、　攪拌し続けた。沈澱したジシクロヘキシル尿素を反応混合物から濾去し、　濾液を真空下で濃縮し、　生成物をジエチルエーテルで沈澱させ、　酢酸エチルから再結晶させた。エステル化の収率は。ヒドロキシスクシンイミドのυＶ膜吸収ら算出したと　こ　ろ、　ａＳ％　で　あ　っ　た。Ｍ−ＰＥ０１９００を出発材料として、　同一の手順により、　同様の収率で、Ｍ−ＰＥＧ−１９００−Ｇｌｙ−Ｏ３ｕ誘導体を得　た。上記の手順により、８０％の収率で、ＰＥＧ−）リプトラ１ン誘導体を得た。　なお、　収率は、　ヒドロキシスクシンイミドの吸収と、２８０ｎ■におけるトリプトファンの吸収（第１ａ図）とに基づいて算出した。生成物は、　第１図に示すようなトリプトファンの特徴的な吸収スペクトルを示した。夾−息一五−１關−ＰＥＧ　５０００−Ｐｂａ−ス　り　ンンイ　ミ　ジルエ　ス　チルＭ−ＰＥＧ　５０００−Ｐｈｅ−ＯＳｕ実施例１で述べた手順に従って、Ｍ−ＰＥＧフェニルアラニン誘導体を得た。生成物は、　フェニルアラニンの典型的な吸収が２６０ｎｍである（第２ａ図）、箪２図に示すようなスペクトルを示した。Ｕ五ユＭ−ＰＥＧ　５０００−ｎｏｒＬｅｕ　−ス　り　ン　ン　イ　ミ　ジ　ル　エ　ス　テ　ルＭ−Ｇ　５０００−ｎｏ　−−０Ｓｕこの誘導体は、　上述したようにＭ−ＰＥＧ　５０００およびＭ−ＰＥＧ　１９００の両方によって得られた。９５％の収率は、　酸加水分解させた後でアミノ酸分析装置によってｎｏｒ−Ｌｅｕの含有量から算出された。Ｌ１ヱユＭ−ＰＥＧ　５０００−Ｇ　−Ｇ　−ス　り　ン　ン　イ　ミ　ノ　ル　エ　ス　テ　ルＭ−ＰＥＧ　５０００−Ｇｌ　−Ｇｌ　−０Ｓｕモモ例１で述べた手順に従って、　ジペプチドをスペーサーアームとして有する活性化されたモノメト牛シポリエチレングリコールを製造した。酢酸エチルから結晶化させた生成物が８５％の収率で得られた。Ｂ、　アミノ酸誘導体化されたＭ−ＰＥＧによる生物活性物質の改質６．１　Ｍ−ＰＥＧ　５０００−Ｇｌｙ−ＯＳｕによる改買酵母スーパーオ牛シトジスムターゼ（ＳＯＤ、ＥＣ１、ｔｓ、１．ＮＮｏｏ會ｇ）を、１０■ｌのホウ酸緩衝液（０、２Ｍ。ｐＩｌｇ）に溶解させ、６４０ｍｇのＭ−ＰＥＧ　５０００−Ｇｌｙ−ＯＳｕを置屋にて激しい攪拌下、ｐＨを一定に保持しながら。添加した。　この混合物を３０分間放置した。ポリマー鎖の結合度を、５ｎｙｄｅｒおよび５ａｂｏｃｉｎｓｋ１のトリニトロフェニル化法（Ｓｎｙｄｅｒ　Ｓ、１．および５ａｂｏｃｉｎｓｋｙ　Ｐ、Ｚ、、Ａｎａｌ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、、　６４２４８−２８８゜１９７５）によって評価したアミノ基の改質率に基づいてめたところ、８５％〜９０％以上であった。一方、　酵素活性は２０％低下した。酵素活性は、Ｐａｏｌａｔｔｉらの方法（Ｐｘｏｌｓｔｔｉ　Ｆ、、　Ａｌｄｊｎｉｃｃｉ　Ｄ、、　Ｍｏｃａｌｌ＾、　ａｎｄ　Ｃ１ｐａｒｒｉｎｉ＾、、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５４５３６−５４１．　１９６６）によって評価した。ＰＭ　１０　ＡＭＩＣＯＮメンブレン上で、　遠心分離を２回行うことによって、　過剰のポリマーを除去し、　濃縮された酵素を、ＢＩＯ−ＧＥＬ　Ａ　カラム（０，５ｍ）上でクロマトグラフィーにかけた。Ｍ　−Ｐ　Ｅ’Ｇで改質された酵素は、ｕｖ吸収（第３ａ図）＋　Ｍ−ＰＥＧのヨウ素反応、　および酵素活性から明らかなように、　最初は対称的なピークで溶出する。その後過剰のＭ− ＰＥＧが溶出し。次いで、　脱離基であるヒドロキシスクシンイミドが溶出する。　タンパク質のピーク画分を採取し。メンブレンで限外濾過を行った後、　凍結乾燥させる。　Ｍ−ＰＥＧで　改　質　し　た　ＳＯＤは、デ　ノ　ケ　−　タ　−　中、０℃にて保存される。５．２　Ｍ−ＰＥＧ　５０００−Ｔｒｐ−ＯＳｕによる改質上述のように反応を行った（６．１を参照）。ＳＯＤに対するポリマー鎖の結合度、　および酵素活性の低下は同程度であったが、　生成物は第３図に示すスペ　り　ト　ル　を　示　し　た。　こ　の　ス　ペ　り　ト　ル　で　は、　ト　リ　ブトファンの寄与が明白である。６．３　Ｍ−ＰＥＧ　５０００−ｎｏｒ−Ｌｅｕ−ＯＳｕによる改質６．１節で述べたように反応を行うて、　同様の酵素的性質を有し、　かつＴＮＢＳ分析によって同程度の改質率を示す生成物を得た。この場合、　酸加水分解させた後でアミノ酸分析を行ったところ、　各ＳＯＤ分子１暑８個のＭ−ＰＥＧ鎖が結合していることを示す／ルロイシンの存在が明らかとなり、　これはＴＮＢＳ試験の結果と一致した。６．４　Ｍ−ＰＥＧ　１９００−Ｇｌｙ−ＯＳｕによる改質６．１節のように反応を行ったところ、　ポリマーの結合および酵素活性に関する限り、　同様の結果を得た。　この生成物は、　改質に用いたポリマーが低分子量であることから予想されるように、　遅い段階でカラムから溶出する。６．１〜６．４節に対する注釈：　未反応の菖−ＰＥＧ　５０００またはＭ−ＰＥＧ　１９００からの精製は、　反応混合物を希釈（約１〜１０倍）した後、ＡＭＩｃＯＮメンブレン上の限外濾過による濃縮によって、　成功裏に行うことができた；　この希釈および限外濾過の手順は少なくとも４回繰り返さなければならない。天然！！２　ＳＯＤおよびＭ−Ｆ’ＥＣで改質されたＳＯＤの薬理運動学的な挙動改質されていない酵母スーパーオキシドジスムタ　−　ゼ　（５，５ｍｇ）と、　Ｍ−ＰＥＧ　５０００−Ｇｌｙも　し　く　は　關−ＰＥＧ１９００−ＧＩＦで改質された等活性量のＳＯＤとを、　ライス９−　（ｌｊｌｓｔａｒ）の雄シロネズミの尾部静脈に注射した。予定された時点で、　ヘパリン処理した注射器で心臓を刺して血液を採取し、血漿中のＳＯＤ量を、　その酵素活性に基づいて評価した。血漿中の活性を評価する前に、　ＣＭセルロース　と５ＥＰＨＡＤＥＸ　Ｇ　２５とのカラムクロマトグラフィーによって妨害物質を除去Ｌ　タａ　天然型、Ｍ−ＰＥＧ　１９００およ６　Ｍ−ＰＥＧ　５１１００テ改質された各誘導体に対して、　６分間、１５時間および２８時間の５０％クリアランスを、　それぞれめた。酵素的性賀關−ＰＲｏ　１９００およびＭ−ＰＥＧ　５０００で改質された各酵母スーパーオキシドジスムターゼの様々な条件に対する安定性は以下のとおりである：ａ、Ｍ−ＰＥＧで改質された酵素は、　タンパク質変性剤（例えば、２Ｍ塩化グアニジウム）中におけるイ　ンキ島ベージ璽ンに対して不安定である；　４時　間後、　その残存活性は天然型の酵素が２０％であ　るのに比較して１０％である。ｔ＋、Ｍ−ＰＥＧ　５ｏｏｏ−ｃｔｙ−ｓｏｏを、　水中、　ｌ−ｇ／ｓｌの濃度で、　０℃、２０℃または３５℃にて放置した。少な（とも８日間のインキ１ベージ璽ンに対して活性はまったく失われなかった。０．０１ｍｇ／ｍｌまでの低濃度では、２０℃にて８日間放置しても安定であ　っ　た。Ｍ−ＰＥＧ　５ｏｏｏ−ｃｔｙ−ｓｏｏは、　凍結および融解の繰り返しサイクルに対して安定であることがわがっ　た。Ｍ−ＰＥＧ酵素溶液を、　真空下、　低温で蒸発乾燥させ、　溶解させ、　そして再び濃縮した；　Ｍ−ＰＥＧで修飾された酵素は、　少なくとも６回のこのようなサイクルに対して安定であったが、　改質されていない酵素は、　同じ条件下で少なくとも１５％の活性を失った。Ｍ−ＰＥＧ　５０００−Ｇｌｙ−５ＯＤは、　溶解および凍結乾燥の繰り返しサイクルに対して完全に安定であったが、　フリーの酵素は各処理段階で約５％の活性を失った。輩−ＰＥＧ　５０００−Ｇｌｙ−ＳＯＤは、　金属キレートの存在下では、　フリーの酵素に比較して、　活性に不可欠な金属を非常に失いにくいことがわかった。Ｌ１五ユアルギナーゼによるＭ−ＰＥＧ　５０００−Ｇｌ−アルギナーゼ文献に従って比活性が１９００１０／Ｉｇになるまで高度に精製された。１００■ｇのウシ肝臓アルギナーゼ（ＥＣ３、５，３，１）を、ｌＳｍ１の炭酸緩衝液（ｐ［Ｉ８．５．　０．２Ｍ）に溶解させ、　そして８００ｍｇのＭ−ＰＥＧ　５０００−Ｇｌｙ−ＯＳｕを、　激しい攪拌下、　マイク　ロ　ビルシブ　トに０．１１１　１１ｉ０１］を入れたｐ［１維持装置によってｐ［ｌを一定に保持しながら。添加した。３０分後、　この溶液を水で５０■ｌに希釈し。＾ＭＩＣＯＮ　ＰＭ　１０限外濾過メンブレンを用いて４℃にて限外濾過することによって、　容積を約５曹ｌに減少させた。Ｍ−ＰＥＧで改質したアルギナーゼを、　実施例１で述べたように、　過剰の試薬および反応副産物からカラムクロマトグラフィーによって精製した。　ポリマーの結合度はアルギナーゼのアミ７基５０％を越えていたが、　アルギナーゼの活性は、　わずか５％しか低下していなかった。Ｍ−ＰＥＧ　５０００−Ｇｌ−アルギナーゼの　、および・な改質を行うことによって、　タンパク質分解酵素（例えば、　トリプシン、　キモトリプシン、　エラスターゼおよびサブチリノン）の作用に対する上記酵素の安定性が増大した。天然型酵素と、ＰＥＧで誘導体化された酵素との薬理運動学的な挙動を、６．１節で述べたように、　ラットで評価した。　１．５時間および８時間の５０％クリアランス時間を、　改質されていないアルギナーゼと。ポリマーで改質したアルギナーゼとについて、　それぞれめた。叉二Ｅ」Ｌ」工１ボヌクレアーゼによるＭ−ＰＥＧ　５０００−Ｇｌ−リボヌクレアーゼウシ膵臓由来のりボヌクレアーゼＡ　（ＥＣ２，７，７゜１６）を、６．１節のように改質して精製した。改質に用いたＭ−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−ＯＳｕの量は、　酵素の利用可能なアミ７基に基づいて計算したところ、　モル比で２．５：１であった。改質を行った結果、　リボヌクレアーゼ１分子に対してポリマー１１分子が共有結合した。改質を行うと、　ンチノン−２゛、３”−環状リン酸を用いて確認したところ、　酵素活性が約１０％低下するが、　改質された酵素はリボ核酸に対して５０％の活性を有することがわかった。尿由来のウロキナーゼ（ＥＣ３，４，＋、ｍ）を、６．１節で述べたように改質して精製した。　この酵素を用い。活性化ポリマーとタンパク質のアミ７基とのモル比を１＝２として、　改質を行った。　これらの条件下では、　約１０個のポリマー分子が各ウロキナーゼ分子に結合した。血栓溶解について評価した酵素活性は天然型酵素の３０％であったが、　合成基質であるカルボベンゾ牛シリジンー〇−ニトロフェニルエステルのエステル分解活性は改質されていないウロキナーゼと同一であった。１０．１　Ｍ−ＰＥＧ　５０００−Ｇｌｙ−アン　ビシ　リ　ン５ｍｌのホウ酸緩衝液（０，２Ｍ、ｐ［１８）中にＳｏｎｇのアンピ　シ　リ　ン　・　す　ト　リ　ウ　ム　塩　を　含　む　溶　液　に、　６００ｍｇ（０゜１２ｍＭ）のＭ−ＰＥＧ　５０００−Ｇｌｙ−ＯＳｕを、　激しい攪拌下、　添加　し　た。反応混合物を２０分間放置した後、　過剰のアンビンリンオヨび反応副産物を、ＢＩＯＧＥＬ　Ｐ　６０（１００〜２００メッン、）のカラム上でのゲル濾過クロマトグラフィーによって分離した。Ｍ−ＰＥＧで改質された薬剤は、　アンビンリンのＵＶ吸収およびＰＥＧに対するヨウ素反応によって明らかなように、　最初は対称的なピークで溶出した。改質された薬剤のピーク分画を採取し、　限外濾過によって濃縮し、　そして凍結乾燥した。生成物は、　酢酸エチルから再結晶させたところ、　出発原料のアンピシリンを基準にして７０％の収率であった。以下に述べる手順によっても同じ生成物が製造　さ　れ　た。１０．２　Ｍ−ＰＥＧ　５０００−Ｇｌｙ　−ア　ン　ビ　／　リ　ン１００ｍｇ（０，２７＋＋Ｍ）　の　ア　ン　ピ　シ　リ　ン　・　す　ト　リ　ウ　ム　塩　を。２０■】のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させ。１．０ｇ（０，２ｍＭ）のＭ−ＰＥＧ　５０００−Ｇｌｙ−ＯＳｕおよび０．０３ｍ１の４−メチルモルホリン（ＮＭＭ）を、ＮＭＭでｐＨ８〜８．３に調節しながら、　添加した。反応混合物を、　攪拌下。室温で約４時間保持した後、　高真空下で濃縮乾燥させた。残留物を５　ｍｌのＣ［Ｉ２Ｃ１２に溶解させ、　攪拌したジエチルエーテル（１００■ｌ）中に滴下した。沈澱物を濾別して結晶化させた。　１回目は熱い酢酸エチルから結晶化させ、　２回目は熱いメタノールから結晶化させた。収率は出発原料のアンピシリンを基準にして６０％であった。塩酸ドキソルビシンの溶液に、５０ｍｇ＜８．６ｘ　１０−２ｍＭ）のＭ−ＰＥＧ　５０００−Ｇｌｙ−ＯＳｕを少しずつ添加した。　この混合物を、　激しい攪拌下、　室温にて放置した。１５分後、ＩＭＩＩＣＩでｐＨ７に調節し、　生成物を、　遊離した薬剤および脱離基であるヒドロキシスクシンイミ　ドか　ら、　ＢＩＯＧＥＬ　Ｐ　６０（１００〜２００メ　ブ　シュ　）のカラム上でのゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した。トＰＥＧで改質された薬剤は、　ドキソルビシンの典型的なＯｖ膜吸収ＯＤ２３０および４８０ｎｍ）と。Ｍ−ＰＥＧに対して予想されるヨウ素反応とを示すピークで溶出した。Ｍ−ＰＥＧ　５０００−ＧＩＦ−ドキソルビシンの画分を採取し、　限外濾過によって濃縮し、　そして凍結乾燥した。生成物を、ＢＩＧ　ＧＥＬ　Ａカラム（０，Ｓ■ ）上　で　の　り　ロ　マ　ト　グ　ラ　フ　イ　−　に　よ　っ　て、さ　ら　に　精製した。全収率は、　出発原料の薬剤を基準にして。５０％　で　あ　っ　た。ＦＩＧ。Ｉ　ＦＩＧ。１０ＦＩＧ、２　ＦＩＧ、２ａＦＩＧ。３　ＦＩＧ、３ａ国際調査報告国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１．下記の式で表される生物学的に活性な薬剤ポリマー誘導体：ＲＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ）ｎ−（ＣＯ）−ＮＨ−Ｘ−（ＣＯ）−ＮＨ−Ｚ（Ｉ）ここで，Ｒは低級アルキル基を表し，ｎは２５と２５０との間の整数であり，Ｘは隣接するＮＨ基およびＣＯ基と組み合わせると，アミノ酸残基もしくはジペプチド残基もしくはトリペプチド残基を表し，そしてＺは隣接するＮＨ基と組み合わせると，生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質，またはＮＨ基もしくはＮＨ２基を含む薬剤残基を表す。２．Ｒが，メチル基を表し，ｎが，４０と１１５との間の整数を表し，Ｘが，隣接するＮＨ基およびＣＯ基と組み合わせると，グリシン，フェニルアラニン，トリプトファンおよびノルロイシンから選択されるアミノ酸残基，あるいはＧｌｙ−Ｇｌｙ，Ａｒｇ−Ａｒｇ，Ｐｈｅ−Ａｒｇ，Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ，Ｇｌｙ−Ｃｌｙ−ＰｈｅおよびＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕから選択されるジペプチドもしくはトリペプチドを表し，ｚが，隣接するＮＨ基と組み合わせると，スーパーオキシドジスムターゼ，リボヌクレアーゼ，アルギナーゼ，アスパラギナーゼ，ウロキナーゼ，アンピシワン，ドキソルピシン，Ｎ−デスメチル−タモキシフェン，ＬＨＲＨおよびその合成類似体，ソマトスタチンおよびその合成鎖似体，インターロイキン２，腫瘍壊死因子，インシュリン，ＩＧＦ−１，天然型もしくほ組換え型のインターフェロン，アデニン−アラピノシド（ａｒａ−Ａ），シトシン−アラピノシド（ａｒａ−Ｃ）またはアシクロパールから選択される，生物学的に活性なペプチド，タンパク質もしくは薬剤の残基を表すことを特徴とする請求項１に記載の薬剤・ポリマー誘導体。３．請求項１で定義された式（Ｉ）で表される生物学的に活性な薬剤・ポリマー誘導体を製造する方法であって，ａ）下記の式ＲＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ）ｎＨ（ＩＩ）（ここで，Ｒおよびｎは上で定義したとおりである）で表されるモノアルコキシポリエチレングリコール誘導体を，２，４，５−トリクロルフェニルクロロホルメートもしくは４−ニトロフェニルクロロホルメートと反応させて，対応するカーボネートを得る工程と；ｂ）このようにして得られたカーボネートを，下記の式Ｈ２Ｎ−Ｘ−（ＣＯ）ＯＨ（ＩＩＩ）（ここで，Ｘは上で定義したとおりである）で表されるアミノ酸もしくはジペプチドもしくはトリペプチドと反応させて下記の式ＲＯ−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ）ｎ（ＣＯ）−ＮＨ−Ｘ−（ＣＯ）ＯＢ（ＩＶ）で表される化合物を得る工程と；ｃ）このようにして得られた式（ＩＶ）で表される化合物を対応するスクシンイミジルエステルに転換する工程と；ｄ）最後に，このスクシンイミジルエステルを，下記の式Ｒ−ＮＨ−ＺまたはＨ２Ｎ−Ｚ（Ｖ）（ここで，ＲおよびＺはクレーム１で定義したとおりである）で表される生物学的に活性なペプチドもしくはクンパク質，　またはＮＨ基もしくはＮＨ２基を含む薬剤と反応させる工程とからなることを特徴とする製造方法。４．請求項１に定義される式（Ｉ）で表される少なくとも１つの生物学的に活性な薬剤・ポリマー誘導体を活性成分として含有する薬剤組成物。５．式（Ｉ）で表される生物学的に活性な薬剤・ポリマー誘導体を活性成分として含有する請求項４に記載の薬剤組成物であって，Ｒが，メチル基を表し、ｎが，４０と１１５との間の整数を表し，Ｘが，隣接するＮＨ基およびＣＯ基と組み合わせると，グリシン，フェニルアラニン，トリプトファンおよびノルロイシンから選択されるアミノ酸残基，あるいはＧｌｙ−Ｇｌｙ，Ａｒｇ−Ａｒｇ，Ｐｈｅ−Ａｒｇ，Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ，Ｃｌｙ−Ｇｌｙ−ＰｈｅおよびＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕから選択されるジペプチドもしくはトリペプチドを表し，Ｚが，隣接するＮＨ基と組み合わせると，スーバーォキシドジスムターゼ，リボヌクレアーゼ，アルギナーゼ，アスバラギナーゼ，ウロキナーゼ，アンピシワン，ドキソルビシン，Ｎ−デスメチル−タモキシフェン，ＬＢＲＨおよびその合成類似体，ソマトスタチンおよびその合成類似体，カルシトニン，インターロイキン２，腫瘍壊死因子，インシュリン，ＩＧＦ−１天然型もしくは組換え型のインターフェロン，アデニン−アラピノシド（ａｒａ−Ａ），シトシン−アラピノシド（ａｒａ−Ｃ）またはアシクロバールから選択される，生物学的に活性なペプチド，タンパク質もしくは薬剤の残基を表すことを特徴とする薬剤組成物。６．請求項５に記載の薬剤組成物であって，以下のものからなる群から選択される生物学的に活性な薬剤・ポリマー誘導体を活性成分として含有する薬剤組成物：Ｍ−ＰＥＧ５０００−Ｇｌｙ−スバーオキシドジスムターゼ，Ｍ−ＰＥＧ５０００−Ｔｒｐ−スバーキシドジスムターゼ，Ｍ−ＰＥＧ５０００−ｎｏｒ−Ｌｅｕ −スバーオキシドジスムターゼ，Ｍ−ＰＥＧ１９００−Ｇｌｙ−スバーオキシドジスムターゼ，Ｍ−ＰＥＧ５０００−Ｇｌｙ−アルギナーゼ，Ｍ−ＰＥＧ５０００−Ｇｌｙ−リボヌクレアーゼ，Ｍ−ＰＥＧ５０００−Ｇｌｙ−ウロキナーゼ，Ｍ−ＰＥＧ５０００−Ｇｌｙ−アンビシリン，およびＭ−ＰＥＧ５０００−Ｇｌｙ−ドキソルビシン，（ここで，Ｍ−ＥＥＧはモノメトキシポリエチレンを表す）。