JPH02258728A - 高脂血症治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子
（以下ヒトＭ−Ｃ８Ｆとする。）を有効成分とする高脂
血症治療剤に関する。

［技術の背景及び従来の技術］ 高脂血症はコレステロール、中性脂肪、リン脂質等のう
ち一つ又はそれ以上のものが正常値以上に増加する疾患
である。日本人の場合血液１００ｍ１当り総コレステロ
ール値が２２０■以上、中性脂肪が１３０■以上、又は
リン脂質が２５０■以上に該当する場合を高脂血症とし
ている。高脂血症それ自体は重篤な疾患ではないが、放
置する事によって動脈硬化を起こし狭心症、心筋梗塞の
誘引となり、臨床上重大な問題となる。

現在高脂血症及び動脈硬化症の治療には数多くの薬剤が
あるが臨床的にはプロブコール製剤（渡辺彰他、動脈硬
化、１１巻、３号、５９７ページ、　１９８３年）及び
蛋白分、解酵素であるエラスターゼ（吉村正蔵、動脈硬
化、３巻、２２３ページ。

１９７５年）が主に用いられている。これらの薬剤の作
用はコレステロールを血管壁に付着しにくくしたり、血
管壁に付いたコレステロールを洗い流すものであるが、
その効果には一定の限界があり、現在高脂血症及び動脈
硬化症を根治治療する薬剤は無い。

造血因子の一種であるコロニー刺激因子中に単球−マク
ロファージ系幹細胞に作用する因子（Ｍ−Ｃ８Ｆ）があ
り、その蛋白質及び遺伝子構造について明らかにされて
いる（特開昭６４−２２８９９号公報）。このヒトＭ−
Ｃ８Ｆは成熟ヒト単球−マクロファージにも作用しその
機能活性化及び各種サイトカインの産生を促進すること
（Ｍ＋＋ｔｏ７ｏｓｂｌ　Ｋ、ｅｔ　１１．、　Ｂｘｐ
、　Ｈｅｍａｌｏｌ、、１７６Ｂ−１１（＋９１１９）
）　、また臨床的に顆粒球減少症（ＭｏｔｏｙＯｔｈｉ
　Ｋ、、　　ｅｆ　ａｔ、、　Ｅｔｐ、　Ｈｅｍｘｌｏ
ｌ、　　１４１０６９−１０７５　（１９１１６）　）
や骨髄移植（Ｍａｓａｏｋａ　Ｔ、。

ｅｔ　ａｌ、、　　Ｂｏｎｅ　Ｍｔｒｔｏｖ　Ｔｒｓｎ
ｓｐｌｇｎｌｘｔｉｏｎ、　　３１２１−１２７　（１
９ａ＆））に対する有用性が明らかにされ、医薬として
の期待が大きい。このヒトＭ−ＣＳＦは既に臨床試験の
上で、その安全性が確認されている（ＭｏｔｏｙＯｔｈ
ｉ　ＦＦ、、　　ｅｔ　ｍｌ、、　　Ｉｍｍｕ−ｎｏｈ
ｉｏｌｏｇ７．　１７２；　２（１５−２１２，（ＩＨ
＆））。

しかし、ヒトＭ−Ｃ３Ｆの高脂血症及び動脈硬化症治療
剤への利用可能性については未検討のまま置かれていた
。

［発明の目的及び要約］ 高脂血症は血液中のコレステロール、中性脂肪、又はリ
ン脂質が正常値より高い疾患であり、放置すると動脈硬
化を起こし心筋梗塞、狭心症等を誘発する事が明らかと
なっている。したがって優れた高脂血症及び動脈硬化治
療剤により動脈硬化を防止することが心筋梗塞、狭心症
を予防する上で極めて重要である。本発明は高脂血症患
者及び高脂血症モデル動物に対してヒトＭ−Ｃ３Ｆの高
脂血症及び動脈硬化治療剤としての検討をおこなった結
果、ヒトＭ−Ｃ３Ｆは高脂血症及び動脈硬化症において
最も重要な血中コレステロール量及び中性脂肪量を顕著
に減少させる作用を有していることを見いだし本発明を
完成した。

本発明はヒトＭ−Ｃ３Ｆを有効成分とする高脂血症治療
剤である。また本発明のヒトＭ−ＣＳＦはヒト尿由来の
もの又はヒトＭ−Ｃ３Ｆ産生細胞培養液若しくはヒトＭ
−Ｃ３Ｆ遺伝子組換え細胞の培養液より調製されたもの
である。

し本発明の詳細な説明］ 本発明に関わるヒト尿由来のヒトＭ−Ｃ８Ｆは、健常者
の尿より公知の方法（特開昭６３−１９８’１００号公
報、特開昭６３−２５０４Ｈ号公報、特開昭６４２２８
９９号公報）によって精製したものを凍結乾燥して調整
した。例えば特開昭６３−１９８７０θ号公報記載の方
法で次の通り調製した。

すなわち、健康人の尿１０００ＬをｐＨ８，５に調整後
、沈澱物を濾過除去し、分子団５ｏ、ｏｏｏダルトンの
限外ｍ′ｉＡｓ　＜アミコン社、）−１１０ｘ５０）で
濃縮と脱塩を行なった。次にｐＨを７．０に：Ｊ１整し
密閉容器中で６０℃で１０ＦＲ間加熱殺菌した。殺菌後
、遠心分離（５０００ｘ（１３０分間）して沈澱物を除
去した後、０．０２ＨリンＦｌｉＭ￥Ｊ液（ｐＨ７，２
）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースと混合し、吸着さ
せた。ＤＥＡＥ−セルロースを０．０５８食塩添加０．
０２８リン酸緩衝液（ｐＨ１７，２）で洗浄した後、０
．２５８食塩添加０．０２ＭリンＭ緩衝Ｉ（ρ１１７．
２＞で溶出させた。溶出液を限外濾過膜（アミコン社）
−１１０Ｐ１０）で濃縮して、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ
　−３０（ファルマシア社、直径２０ｃＪＩｘ高さ８０
υ）を用い、１Ｈ硫安添加緩衝液（ｐＨ７，２）でゲル
濾過した。グル濾過での分子ｔ１範囲７０，０００〜１
５０．０００ダルトン画分を上記１Ｈ硫安添加ＩＩ液で
平衡化したＰｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４　Ｂカ
ラム（ファルマシア社製直径１０ｘ長さ２０　ｃｍ　）
に吸着させ、次いで０，５Ｈ硫安添加緩扮液（ｐＨ７，
２）で溶出させた。溶出液を限外″濾過膜（アミコン社
製ト１１　Ｐ　１０’　”）で濃縮して、ＴＳＫ−Ｇ３
０００ＳＷ　＜東ソー製、経２．５Ｘ６０ｃｍ）で高速
液体クロマトグラフィーにかけ、相対溶出ｍ　（Ｖｅ／
Ｖｏ）１．２〜１．５の画分を得た。

この両分を再度濃縮し、Ｈｉ　−Ｐｏｒｅ２１４　ＴＰ
　（バイダック社、経２．２×長さ２５　ｃｔｒ　）の
逆相カラムで０．１％トリフルオロ酢酸を含む、アセト
ニトリル０−１００％（ｐＨ２，０）の直線潤度勾配に
よる高速液体クロマトグラフィーにかけヒトＭ−Ｃ３Ｆ
画分を集め、凍結乾燥しヒト尿由来のヒトＭ−Ｃ８Ｆ４
ｔｒｑを得た。得られたヒト尿出来のヒトＭ−Ｃ８Ｆの
理化学的性質は次の通りである。

ａ）分子団 同一のサブユニットから成るホモ２吊体であって、ドデ
シル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動で
測定した分子伍が７０，０００〜９０．０００ダルトン
であり、還元剤で解離させて生物活性を消失させたサブ
ユニットについてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリル
アミドゲル電気泳動で測定した分子曇は３５．０００〜
４５゜ＯＯＯダルトンである。

ｂ）、サブユニットのアミノ酸配ダト　・・ホモ２足体
を構成するサブユニット蛋白質は、次に示す２１４乃至
２３８個のアミノ酸配列を有し、１２２番目及び１．４
０番目のアスパラギンはそれぞれアスパラギン（Ａｓｎ
）−ｘ−スレオニン（Ｔｈｒ）／セリン（Ｓｅｒ）で表
される典型的なＮ−グリコシド結合部位を有する。ここ
でＸは任意のアミノ酸を示す。

Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｖａ　ｌ　−３ｅｒ−Ｇ　ｌ　
ｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−３ｅｒ−１１１５−）１ｅｔ−１
１ｅ−Ｇ　Ｉｙ−３ｅｒ−Ｇ　Ｉｙ−ｔｌ　ｉ　５−Ｌ
ｅｕ−Ｇ　ｌ　ｎ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ａｒ
ｇ−Ｌｅｕ−１ｉｅ−＾５ｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−）１ｅ
ｔ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ
−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｐｈｅ−Ｖａ　１−Ａ
ｓｐ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｌｅｕ　
−Ｌｙｓ−Ａｓ　ｐ−Ｐｒｏ−Ｖａ　Ｉ−Ｃｙｓ−Ｔｙ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｔ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−ｒｌｅ−Ｈａ
ｔ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｎｅｔ−＾ｒｇ−Ｐｈｅ
−Ａｒｇ−＾５ｐ−ＡＳｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−
＾１ａ−１１ｅ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｖａ　ｌ　−Ｇ　Ｉ
　ｎ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｇ　Ｉｕ−Ｌｅｕ−５ｅｒ
−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−
Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｕ−）１ｔｓ−Δ５ｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｖ
ａｌ−Ａｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−丁ｈ
ｒ−ｐｒ。

−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＧＩ　ｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｖａ　１−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｖａ　ｌ　−Ｐｈｅ
−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−＾５ｎ−ＬＱＵ−
Ｌ８ｔｌ−Ａｓｐ−１ｙ３−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−八５ｎ−
１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−八
５ｎ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｃｙ
ｓ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−八５ｐ−Ｖａｌ−Ｖａｔ
−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−八５ｎ−
Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−１
１ｅ−Ｐ　ｒｏ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ａ　５ｐ−Ｐ　ｒｏ
−Ａ　ｌ　ａ−３ｅｒ−Ｖａ　Ｉ　−３ｅｒ−Ｐ　ｒｏ
−Ｈｉ　５−Ｇｌ　ｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−八ｌａ−Ｐｒ
ｏ−８ｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−ＡＩ
ａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−丁ｈｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ
−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇ　ｌ　
ｙ−３ｅ　ｒ−８ｅｒ−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ−Ｐ　ｒｏ−
Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ
−旧５−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−３
ｅｒ−Δ１ａ−Ｌｙｓ−Ｇ　ＩローＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｒｏ−＾ｒｇ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇ　Ｉｎ−８
ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉｕ−Ｐｒ。

−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−
Ｌｙｓ−Ｃ）等電点 ポリアクリルアミドゲル等定点電気泳ａ法及びシュクロ
ース密度勾配等電点泳動法で測定した等定点（Ｄｒ）は
３．１〜３．７である。

ｄ）円二色性スペクトル 円二色性分散計による遠紫外部ＣＤスペクトルは波長２
０８　ｎｌ及び２２２　ｎｎにそれぞれ極小ピークがあ
りα−へリツクス構造を含んでいる。

ｅ）熱安定性 ６ｏ±０．５℃で６０分間加熱しても生物活性は失なわ
れない。

ｆ）赤外線吸収スペクトル 波数１６８０α　、１２００υ７１及び１１３０ｉｗ−
’ニ強ｆｌｊ吸収、１ｆｉ１５４０ｃｍ　　　１４３０
ｃｍ、”および１０７０（Ｊ？−’に中度吸収を示す赤
外線吸収スペクトラムを有する。

以　　下　　余　　白 この様な物理化学的性質を示すヒトＭ−Ｃ３Ｆは通常、
静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、腹腔内などの非経口投
与により投与することができる。投与用の製剤としては
、注射剤、注入剤などが挙げられ、これら製剤はそれ自
体公知の方法によって調製することができる。例えば、
ヒ）Ｍ−Ｃ３Ｆを適当な緩衝液に加えて、無菌濾過し、
ガラスバイアル中に無菌的に充填して密封し、必要に応
じて凍結乾燥して製剤を調製することができる。

ヒトＭ−Ｃ８Ｆはガラス、プラスチック、無菌濾過膜等
に吸着する性質を有しているが、この吸着は界面活性剤
、ヒト血清アルブミン及びゼラチンなどの高分子物質の
任意の単一又は複数を用いることにより防ぐことができ
、同時にこれら高分子物質と共に製剤化することにより
その安定性も著しく向上する。それぞれの使用濃度は製
剤当り界面活性剤の場合１ｈｇ／ｍ１以上、ヒト血清ア
ルブミン及びゼラチンの場合は、１ｍｇ　／　ｍ１以上
が望ましい。

ヒ）Ｍ−Ｃ３Ｆの投与量は動脈硬化を併発するか否かに
かかわらず、患者の年齢症状によって変動し得るが、通
常０．４月〜１６ｊｇ／ｋｇ・体重７日、好ましくは１
６＊に〜８ｒｔｇ／ｋｇ・体重７日である。

以上の方法で得られたヒトＭ−Ｃ８Ｆを使用した本発明
の実施例を次に示す。

実施例１ 高脂血症患者に対するヒトＭ−Ｃ８Ｆのコレステロール
低下作用 （＋）本発明の高脂血症治療剤（以下、水剤と言う）の
調製法 ｐＨ７，２の２０ｄリン酸緩衝液に、前記のとおり調製
されたヒトＭ−Ｃ３Ｆ及び表１に示す各濃度の安定剤を
添加し、ヒトＭ−Ｃ３Ｆの濃度としてＩＱｈｇ／ｍｌの
ものに調製した。ニトロセルロース系無菌濾過膜にて無
菌濾過し、ガラスバイアル中に無菌的にＩ　ｍｌ充填し
た。

凍結乾燥後密封し水剤を調製した。

（２）水剤の安定性 水剤の安定性はヒトＭ−Ｃ３Ｆ活性をマウス骨髄細胞を
用いた軟寒天法にて測定した。

その結果は表１に示す如く界面活性剤であるツウィ〒ン
８０では１０μ！／ｍ１以上、ヒト血清アルブミン及び
ゼラチンでは１■／ｍ１以上の濃度で調製した水剤の生
物活性は、試験開始時（製造直後）の７０％以上維持さ
れており安定とされた。

以　　下　　余　　白 （３）水剤の高脂血症患者に対するコレステロール低下
作用 高脂血症患者２名にアルブミン５■／ｍｌ添加して調製
した水剤を１．６　ａｇ／ｋｇ・体重７日にて１４日間
点□滴静注した。血清中のコレステロール量は本則投与
時から７日間間隔にて測定し、水剤のコレステロール低
下作用について検討した。

図１の示す如く水剤を投与することにより、１名の高脂
血症患者の血清コレステロール量は水剤投与前の３９５
■／　ｍｌから　１７０■／　ｍｌに顕著に減少し正常
値となった。また図２に示す如く、他の１名の患者の場
合においても血清コレステロール量が２８０■／　ｍｌ
から　１９５■／　ｍｌに著しく減少した。両図におい
て、横軸は週で表した期間を、縦軸は血清総コレステロ
ール量（■／ｍｌ）を示す。この結果から本薬剤が高脂
血症更には、高脂血症に起因する動脈硬化治療剤として
有用であることが明らかとなった。

実施例２ 高脂血症モデル動物の血清コレステロール低下に及ぼす
作用 実施例１において、安定剤としてツウイーン８０を２０
　ｓ、ｔ　／　ｍｌ濃度とした以外は緩衝液にて実施例
１と同様に調製した水剤を用い高脂血症モデル動物のコ
レステロール及び中性脂肪量低下に及ぼす水剤の効果を
検討した。

一群５匹からなる５ｐｒＢａｃ−ＤｘｖｌＢ系ラットを
高脂肪食にて１力月予備飼育した後水剤を１６μｇ／ｋ
ｇ・体重（Ｃ８Ｆ投与量１３．３月／ｋｇ・体重）にて
連続７日間静脈内投与し血清中のコレステロール量及び
中性脂肪量の変化を対照群と比較検討した。対照群には
水剤の調製時に用いた緩衝液を投与した。

表２に示す如く水剤の投与により血清コレステロール量
及び中性脂肪量が顕著に減少することが認められ水剤が
高脂血症及びそれに起因する動脈硬化治療剤として有用
であることが明らかとなった。

［発明の効果］ （１）　　異常に高い血清コレステロール量及び中性脂
肪量を顕著に減少させ、かつ副作用のない薬剤を提供し
得る。

（２）　　高脂血症を治療し、動脈硬化を改善・予防し
、かつ副作用のない薬剤を提供し得る。

【図面の簡単な説明】

図１は、ある高脂血症患者の血清コレステロール量と投
与期間の関係を示したグラフであり、図２は他の高脂血
症患者の血清コレステロール量と投与期間の関係を示し
たグラフである。 特許出願人　　森永乳業株式会社 眉ｖ！：ｘｒ１ムペトａ−仝−ン 署唸−輪ロコペｔドローυζイ　ツヒ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子を有
   効成分とする高脂血症治療剤