JPH02264728A - 高脂血症治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は、ヒト尿由来ヒト単球−マクロファージコロニ
ー刺激因子（以下ヒトＭ−Ｃ３Ｆとする。）を有効成分
とする高脂血症治療剤に関する。

［技術の背景及び従来の技術］ 高脂血症はコレステロール、中性脂肪、リン脂質等のう
ち一つ又はそれ以上のものが正常値以上に増加する疾患
である。日本人の場合血液１００ｍ１当り総コレステロ
ール値が２２０■以上、中性脂肪が１３０■以上、又は
リン脂質が２５０■以上に該当する場合を高脂血症とし
ている。高脂血症それ自体は重篤な疾患ではないが、放
置する事によって動脈硬化を起こし狭心症、心筋梗塞の
誘引となり、臨床上重大な問題となる３゜現在高脂血症
及び動脈硬化症の治療には数多くの薬剤があるが臨床的
にはプロブコール製剤（渡辺彰他、動脈硬化、　１１巻
、３号、５９７ページ、　１９８３年）及び蛋白分解酵
素であるエラスターゼ（吉村正蔵、動脈硬化、３巻、２
２３ページ。

１９７５年）が主に用いられている。これらの薬剤の作
用はコレステロールを血管壁に付着しにくくしたり、血
管壁に付いたコレステロールを洗い流すものであるが、
その効果には一定の限界があり、現在高脂血症及び動脈
硬化症を根治治療する薬剤は無い。

造血因子の一種であるコロニー刺激因子中に単球−マク
ロファージ系幹細胞に作用する因子（Ｍ−Ｃ３Ｆ）があ
り、その蛋白質及び遺伝子構造について明らかにされ′
Ｃいる（特開昭６４−２２８９９号公報）。このヒトＭ
−Ｃ３Ｆは成熟ヒト単球−マクロファージにも作用しそ
の機能活性化及び各種サイトカインの産生を促進するこ
と（Ｍｏｊｏ７ｏｓｂｉ　Ｋ、ｅｊ　ｇｌ、、　Ｅｘｐ
、　Ｈｅｍａｌｏｌ、、１７：６８−７１　（１９８９
））　、また臨床的に顆粒球減少症（Ｍｏｊｏ７ｏｓｈ
ｉ　Ｋ、、　ｅｊ　ｘｉｌＥｘｐ、Ｈｅｍａｔｏｌ、　
　１４：１０６９−１σ７５（１９８６）　）や骨髄移
植（Ｍａｓｘｏｋｘ　Ｔ、。

ｅｆ　ａｌ、、　　Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｔｒａｎ
ｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、　　３：＋２１−１２７　（
１９８８））に対する有用性が明らかにされ、医薬とし
ての期待が大きい。このヒトＭ−Ｃ３Ｆは既に臨床試験
の上で、その安全性が確認されている（ｌｌｏｔｏ７ｏ
ｘｈｉ　Ｋ、、　　ｅｔ　ｔｌ、、　　１ｍｍｕ−＋＋
ｏｂｉＯ１ｏｇ７．１７２；　２０５−２１２．　（１
９８６））。

しかし、ヒトＭ−Ｃ３Ｆの高脂血症及び動脈硬化症治療
剤への利用可能性については未検討のまま置かれていた
。

［発明の目的及び要約］ 高脂血症は血液中のコレステロール、中性脂肪、又はリ
ン脂質が正常値より高い疾患であり、放置すると動脈硬
化を起こし心筋梗塞、狭心症等を誘発する事が明らかと
なっている。したがって優れた高脂血症及び動脈硬化治
療剤により動脈硬化を防止することが心筋梗塞、狭心症
を予防する上で極めて重要である。本発明は高脂血症患
者及び高脂血症モデル動物に対してヒトＭ−Ｃ８Ｆの高
脂血症及び動脈硬化治療剤としての検討をおこなった結
果、ヒトＭ−Ｃ８Ｆは高脂血症及び動脈硬化症において
最も重要な血中コレステロール量及び中性脂肪量を顕著
に減少させる作用を有していることを見いだし本発明を
完成した。

本発明はヒトＭ−Ｃ３Ｆを有効成分とする高脂血症治療
剤である。また本発明のヒトＭ−Ｃ８Ｆはヒト尿由来の
ものである。

［本発明の詳細な説明］ 本発明に関わるヒト尿由来のヒトＭ−Ｃ３Ｆは、健常者
の尿より公知の方法（特開昭６３−１９８７００号公報
、特開昭６３−２５０４００号公報、特開昭６４−２２
８９９号公報）によって精製したものを凍結乾燥して調
整した。例えば特開昭６３−１９８７００号公−報記載
の方法で次の通り調製した。

すなわち、健康人の尿１０００ＬをｐＨ８，５に調整後
、沈澱物を濾過除去し、分子量５ｏ、ｏｏｏダルトンの
限外濾過膜（アミボン社、Ｈｌ　０ｘ５０）で濃縮と脱
塩を行なった。次にｐＨを７．０に調整し密閉容器中で
６０℃で１０時間加熱殺菌した。殺菌後、遠心力１ｍ（
５０００ｘｇ３０分間）して沈澱物を除去した後、０．
０２１（リン酸！！衝液（ｐＨ７，２）で平衡化したＤ
ＥＡＥ−セルロースと混合し、吸着させた。ＤＥＡＥ−
セルロースを０．０５８食塩添加０．０２Ｈリン酸緩衝
液（ｐＨ７，２）で洗浄した後、０．２５Ｈ食塩添加０
．０２）１リン酸Ｗｉ衝液（ｐｌ＋７．２）で溶出させ
た。溶出液を限外濾過膜（アミコン社８１０Ｐ１０）で
濃縮して、５ｅｐｈａｃｒＹＩ　Ｓ　−３０（ファルマ
シア社、直径２０ｃＪＩｘ高さ８０α）を用い、１Ｈ硫
安添加緩衝液（１）Ｈ７，２）でゲル濾過した。ゲル濾
過での分子量範囲７０，０００〜ｉ５０．０００ダルト
ン画分を上記１Ｈ硫安添加Ｍｉ市液で平衡化したｐＨｅ
ｎＶＩ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４　Ｂカラム（ファルマシ
ア社製直径１０×長さ２０　ｃｍ　）に吸着させ、次い
で０．５Ｈ硫安添加暖杓液（ｐＨ７，２）で溶出させた
。溶出液を限外濾′ｉＡ模（アミコン社製ト１１Ｐ１０
）で濃縮して、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ　（東ソー製、
経２．５Ｘ６０ｃＩｎ）で高速液体クロマトグラフィー
にかけ、相対溶出ｆｆ１（Ｖｅ／Ｖｏ）１．２〜１．５
の両分を得た。

この画分を再度濃縮し、Ｈｉ　−Ｐｏｒｅ２１４　ＴＰ
　（バイダック社、軽２．２×長さ２５　ｃｍ　）の逆
相カラムｒｏ、ｉ％トリフルオロ酢酸を含む、アセトニ
ド！Ｊ／Ｌ１０−１００　％　＜ｐＨ２、０）　（７）
直ａｍ度勾配に−よる高速液体クロマトグラフィーにか
けヒトＭ−Ｃ８Ｆ画分を集め、凍結乾燥しヒト尿由来の
ヒトＭ−Ｃ８Ｆ４！Ｉｔｇを得た。得られたヒト尿由来
のヒトＭ−Ｃ８Ｆの理化学的性質は次の通りである。

ａ）　分子量 同一のサブユニットから成るホモ２ｒｆ１体であって、
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳
動で測定した分子量が７Ｑ、０００〜９０．０００ダル
トンであり、還元剤で解離させて生物活性を消失させた
サブユニットについてドデシル硫酸ナトリウムポリアク
リルアミドゲル電気泳動で測定した分子伍は３５．００
０〜４５゜０００ダルトンである。

ｂ）サブユニットのアミノ酸配列 ホモ２ｍ体を構成するサブユニット蛋白質は、次に示す
２１４乃至２３８個のアミノ酸配列を有し、１２２番目
及び１４０番目のアスパラギンはそれぞれアスパラギン
（ＡＳｎ）−ｘ−スレオニン（Ｔｈｒ）／セリン（Ｓｅ
ｒ）で表される典型的なＮ−グリコシド結合部位を有す
る。ここでＸは任意のアミノ酸を示す。

Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｖａ　ｌ　−３ｅｒ−Ｇ　１
ｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−３ｅｒ−１ｆ　ｉ　５−Ｈｅｔ　
−１１ｅ−Ｇ　Ｉ　ｙ−３ｅｒ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｈｉ　ｓ
−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉ　ｎ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉ　ｎ−
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔ　Ｉ　ｅ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｇ　ｌ
　ｎ−）４ｅｔ−Ｇ　Ｉｕ　−ｒｈｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ
−Ｇ　ｌ　ｎ−１１，ｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉ　ｕ
−Ｐｈｅ−Ｖａ　ｌ　−Ａｓｐ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｇ　Ｉ　
ｕ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐ　ｒｏ−
Ｖａ　トＣｙｓ−Ｔｙｒ−１，ｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−
Ａ　ｉ　ａ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｔ−Ｇｉｎ
−Ａｓｐ−１１ｅ−）１ｅｔ−Ｇｌｕ−＾ｓｐ−Ｔｈｒ
−）ｌｅｔ−Ａｒｇ−ｐｈｅ−Ａｒｇ−八３１）−Ａｓ
ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−ＡＩａ−Ｉ　１ｅ−Ａｌ
ａ−Ｎ　１ｅ−Ｖａ　Ｉ　−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｌｅｕ−Ｇ　
Ｉ　ｎ−Ｇ　ｌｕ　−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｓｅｒ−ｃｙｓ−ｐｈｅ−ｒｈｒ−
ｔｙｓ−八５ｔ）−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−
Δ５ｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｙｓ−ＶａＩ−Ｌｙｓ−／１．５ｎ−ＶａＩ　−Ｐｈｅ
−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−＾５ｎ−Ｌ（＋Ｉ
Ｊ−ＩＪｕｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｒｉｌｌ−
Ａｓｎ−１ｉｅ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｃ
ｙｓ−Ａｓｎ−八５ｎ−ｓｅｒ−ｐｈｅ−Ａ　ｌ　ａ−
Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｃｙｓ−８ｅ　ｒ−８ｅｒ−Ｇ　Ｉ　ｎ−
Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ　−Ｖａ　Ｉ　−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−ｐ
ｒｏ−Ａｓｐ−ｅｙｓ−Δ５ｎ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙ
ｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−１１，ｅ−Ｐｒｏ−５ｅ
ｒ−８ｅｒ−＾５ｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−８ｅｒ−Ｖａｔ
−５ｅｒ−Ｐｒｏ−）ｔ＋ｓ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｐｒｏ−Ｌ
ｅｕ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｎｅｔ−Ａ　Ｉ　
ａ−Ｐｒｏ−Ｖａ　Ｉ　−Ａ　ｌ　ａ−Ｇｌｙ−ＬｅＵ
−丁ｈｒ−ＴｒＤ−Ｇ　ｌｕ−＾５ｐ−３ｅｒ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇ　Ｉｙ−８ｅｒ−３ｅｒ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　
ｌ　ｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−旧５−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓ
ｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−八Ｉａ−Ｌｙｓ−Ｇ！ｎ
−Ａｒ、０−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｐ−５ｅｒ−Ｔｈｒ
−ＣｙＳ−Ｇ　Ｉ　ｎ−８Ｃ！ｒ−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉｕ−
Ｐ　ｒ。

−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−
Ｌｙｓ−Ｃ）等電点 ポリアクリルアミドゲル等定点電気泳動法及びシュクロ
ース密度勾配等電点泳動法で測定した等電点（ｐＩ）は
３．１〜３．７である。

ｄ）円二色性スペクトル 円二色性分散計による遠紫外部ＣＤスペクトルは波長２
０８　ｎｍ及び２２２　ｎｍにそれぞれ極小ピークがあ
りα−ヘリックス構造を含んでいる。

ｅ）熱安定性 ６０±０，５℃で６０分間加熱しても生物活性は失なわ
れない。

ｔ）赤外線吸収スペクトル 波数１６８０ＣＭ　、１２００ｃｍ−’及び１１３〇α
　に強度吸収、波ν１５４０び　　１４３０ｃｍ　　お
よび１０７０ｃｆｆｉ−１に中度吸収を示す赤外線吸収
スペクトラムを有する。

以　　下　　余　　白 この様な物理化学的性質を示すヒＩ−Ｍ　−ＣＳＦは通
常、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、腹腔内などの非経
口投与により投与することができる。投与用の製剤とし
ては、注射剤、注入剤などが挙げられ、これら製剤はそ
れ自体公知の方法によって調製することができる。例え
ば、ヒトＭ　−ＣＳ　Ｆ’を適当な緩衝液に加えて、無
菌が過し、ガラスバイアル中に無菌的に充填して密封し
、必要に応じて凍結乾燥して製剤を調製することができ
る。

・ヒトＭ−Ｃ８Ｆはガラス、プラスチック、無菌濾過膜
等に吸着する性質を有しているが、この吸着は界面活性
剤、ヒト血清アルブミン及びゼラチンなどの高分子物質
の任意の単一又は複数を用いることにより防ぐことがで
き、同時にこれら高分子物質と共に製剤化することによ
りその安定性も著しく向上する。それぞれの使用濃度は
製剤当り界面活性剤の場合１０月／　ｍ１以上、ヒト血
清アルブミン及びゼラチンの場合は、１■／　ｍ１以上
が望ましい。

ヒ）Ｍ−Ｃ８Ｆの投与量は動脈硬化を併発するか否かに
かかわらず、患者の年齢症状によって変動し得るが、通
常０．４Ｎ〜１６μｔ／ｋｇ・体重７日、好ましくは１
．６μｇ〜８βｇ／ｋｇ・体重７日である。

以上の方法で得られたヒトＭ−Ｃ８Ｆを使用した本発明
の実施例を次に示す。

実施例１ 高脂血症患者に対するヒトＭ−Ｃ８Ｆのコレステロール
低下作用 （１３本発明の高脂血症治療剤（以下、水剤と言う）の
調製法 ｐＨ７，２の２０ｍＭリン酸緩衝液に、前記のとおり調
製されたヒトＭ−Ｃ３Ｆ及び表１に示す各濃度の安定剤
を添加し、ヒトＭ−Ｃ８Ｆの濃度として１００１１ｇ／
ｍｌのものに調製した。ニトロセルロース系無菌濾過膜
にて無菌濾過し、ガラスバイアル中に無菌的に１　ｍｉ
充填した。

凍結乾燥後密封し水剤を調製した。

（２）水剤の安定性 水剤の安定性はヒトＭ−Ｃ３Ｆ活性をマウス骨髄細胞を
用いた軟寒天法にて測定した。

その結果は表１に示す如く界面活性剤であるツウィーン
８０ではｌｈｇ／ｍ１以上、ヒト血清アルブミン及びゼ
ラチンでは１■／ｍ１以上の濃度で調製した水剤の生物
活性は、試験開始時（製造直後）の７０％以上維持され
ており安定とされた。

以　　下　　余　　白 ３）水剤の高脂血症患者に対するコレステロール低下作
用 高脂血症患者２名にアルブミン５■／　ｍｌ添加して調
製した水剤を１゜６μｇ／ｋｇ・体重７日にて１４日間
点滴静注した。血清中のコレステロール量は水剤投与時
から７日間間隔にて測定し、水剤のコレステロール低下
作用について検討した。

図１の示す如く水剤を投与することにより、１名の高脂
血症患者の血清コレステロール量は水剤投与前の３９５
■／　ｍｌから　１７０■／　ｍｌに顕著に減少し正常
値となった。また図２に示す如く、他の１名の患者の場
合においても血清コレステロール量が２８０■／ｍｌか
ら　１９５■／ｍｌに著しく減少した。両図において、
横軸は週で表した期間を、縦軸は血清総コレステロール
量（■／ｍｌ）を示す。この結果から本薬剤が高脂血症
更には、高脂血症に起因する動脈硬化治療剤として有用
であることが明らかとなった。

実施例２ 高脂血症モデル動物の血清コレステロール低下に及ぼす
作用 実施例１において、安定剤としてツウィーン８０を２０
月／ｍｌ濃度とした以外は緩衝液にて実施例１と同様に
調製した水剤を用い高脂血症モデル動物のコレステロー
ル及び中性脂肪量低下に及ぼす水剤の効果を検討した。

一群５匹からなるＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｖｌｅ７系ラッ
トを高脂肪食にて１力月予備飼育した後水剤を１６μｇ
／ｋｇ・体重（Ｃ８Ｆ投与量１３．３ｐｔ／ｋｇ・体重
）に″Ｃ連続７日間静脈内投与し血清中のコレステロー
ル量及び中性脂肪量の変化を対照群と比較検討した。対
照群には水剤の調製時に用いた緩衝液を投与した。

表２に示す如く水剤の投与により血清コレステロール量
及び中性脂肪量が顕著に減少することが認められ水剤が
高脂血症及びそれに起因する動脈硬化治療剤として有用
であることが明らかとなった。

［発明の効果］ （＋１　　異常に高い血清コレステロール量及び中性脂
肪量を顕著に減少させ、かつ副作用のない薬剤を提供し
得る。

（２）　　高脂血症を治療し、動脈硬化を改善・予防し
、かつ副作用のない薬剤を提供し得る。

【図面の簡単な説明】

図１は、ある高脂血症患者の血清コレステロール置き投
与期間の関係を示したグラフであり、図２は他の高脂血
症患者の血清コレステロール量と投与期間の関係を示し
たグラフである。 剖１贅１ぎ−べＩＫ口〜さ尋−ン と −ＥＩ七て’ｆ！ｎＪべ１トａ−毎ωζ肯　−ミ睡

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト尿由来ヒト単球−マクロファージコロニー刺
   激因子を有効成分とする高脂血症治療剤