JPH022587B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は活性タンパク物質（active protein
substances）即ち触媒として使用され得る酵素を
含有する水不溶性の複合粒子群に関する。本発明
は又該粒子群の製造方法に関するものである。

触触としての活性タンパク物質の用途の価値は
益々増大しつつある。特に高度の選択性が要求さ
れる或種の化学反応の遂行のために触媒能を利用
する酵素について然りである。これらのタンパク
物質の価格の面からして該物質を連続的工程で使
用することは経済上の理由から本質的である。し
かるに酵素は安定度の低い水溶性の製品であるの
で酵素を分離することを困難にし従つて回収する
ことを困難にする。

活性タンパク物質例えば酵素を固定化（不動
化）するための諸方法が従来提案されてきた。即
ち活性タンパク物質と不活性タンパク物質とを共
交差結合（co−crosslink）させることが提案さ
れた〔1968年３月29日出願のフランス特許願68／
146205号（出願人：Centre National de la
Recherche Scientifique）及び1969年１月24日出
願の追加特許願69／01451号、1969年３月19日出
願の追加特許願69／07897号、1970年９月11日出
願の追加特許願70／33059号（これら３件の出願
人：Agence National de Valorisation de la
Recherche）の各明細書を参照されたい〕。該方
法によつて得られた製品は水に不溶性ではあるけ
れども工業的利用のためには不適当である。該製
品は剛性を欠如した形状をなし、反応器内で使用
されたときに該製品の崩壊が認められ、その結果
反応器内の圧力損失（pressure losses）を起す
のみならず反応器の完全閉塞を招くことは事実で
ある。

これらの種々の欠点を克服するためにフエライ
トの小粒子群の存在下に共交差結合させる方法が
提案された（G.Gellf and J.Boudrant、
Biochimica et Biophysica Acta、1974、334、
pages467〜470）。この場合に活性タンパク物質
と不活性タンパク物質との共交差結合による生成
物をフエライト粒子群の外表面（この外表面が該
生成物を覆う）に単に接触させるだけで該生成物
が固定化されるのであるが但しその結果として工
業的使用の際に高度の消耗が観察され共交差結合
生成物が担体から離脱するので従前技術における
と同じ不利益を招くに至る。

更に酵素を多孔性担体に固定することが既に提
案されている。詳しくは1968年10月14日出願件で
ある米国特許第3666627号（権者：CORNING
GLASS WORKS）明細書に記載の通りこれは酵
素と共存し得る基質で予め処理された多孔質ガラ
スのような無機担体に酵素を吸着によつて固定す
る方法である。ところがかようにして得られた複
合物は工業的見地からして不充分である。という
のは該複合物は通常使用の反応媒質中で急速な溶
解と基質からの酵素の脱着とを伴つて酵素活性を
失つてしまうからである。

その後に1973年８月６日出願件であるベルギー
特許第803275号（権者：CORNING GLASS
WORKS）において1000Å以下の孔径の多孔性無
機担体の表面と孔の内側とに酵素を固定する方法
が提案された。しかるにこの方法においては推奨
された諸性質をもつ担体、水溶性酵素及び水溶性
交差結合剤の間の非共存性にもとづき非水性溶剤
類と種々に変改された水溶液類とを必要とする。
従つて分離の数工程と諸乾燥工程とを要するこの
方法は工業的見地からして魅力に乏しい。更に溶
剤使用の結果として起る酵素の変性の危険を無視
し得ないので各酵素について適宜の溶剤を探求し
選択しなければならない。

本発明は上述の諸技法に伴う種々の不利益を克
服すると共に水不溶性で剛性をもち耐消耗性の粒
子群の形に不動化（固定化）された酵素の取得を
可能にすることを目的とする。該粒子群は工業的
使用に適するのみならず更に優れた活性を呈する
ものである。

本発明は、チタンスポンジ担体に固定された酵
素を含有する複合粒子群において、平均寸法５〜
200ミクロンの空腔群が大部分を占める該空腔群
を粒子構造の内部に有する粒子群から成ること、
及び該複合粒子群がポリサツカライド並びにアル
ブミンから成る群から選ばれる不活性重合性構成
分をも含有することを特徴とする前記の複合粒子
群に関する。

以下本発明を詳細に説明する。

本発明に担体として使用するのは、チタン塩の
還元によつて得られる多孔性のチタンスポンジで
ある。この種のチタンスポンジは例えば文献
〔Reineund angewandte Metallkunde in
Einzeldarstellungen（Pure and applied
metallurgy in monographs）、Volume21、U.
Zwicker、Titan und Titan−legierungen
（Titanium and Titanium alloys）、1974、
Springer−Verlag〕記載の如きチタン金属工業
の常用技法に従う四塩化チタンの還元によつて得
られる。

担体として使用されるチタンスポンジは５〜
200ミクロン、好ましくは20〜100ミクロンの平均
寸法の空腔群を有する。

担体として使用される粒子群（チタンスポン
ジ）は種々の寸法をもち得るけれども通常は平均
直径100ミクロン以下でない。0.01〜２cmの寸法
をもつ粒子群が好適に使用される。適当であるな
らば粒子群は相互に凝集してもよいし又は他の適
宜の不活性増量剤と凝集してもよい。これらの凝
集物はいかなる幾何学的形状のもの例えばペレツ
ト、タブレツト、ブリケツト（塊）及びプレート
（板）であつてもよい。

担体として使用される粒子群（チタンスポン
ジ）の孔度は一般に0.05〜0.6cm³／ｇであつて0.1
〜0.5cm³／ｇである場合が最も多い。

担体として使用されるべき粒子群の比表面積は
著しく小さく一般に１m²／ｇ以下である。最も
屡々これらの粒子群の比表面積は0.005〜0.5m²／
ｇである。

特に適正なグレードをもつチタンスポンジは平
均直径0.1〜５mmの粒子群から成り、該粒子群は
自由流動法で測定された見掛け比重0.5〜1.5Kg／
ｄm³、平均孔径20〜100ミクロン（但し孔（複）
の15％以下はこれらの限界の外にある）、そして
比表面積0.01〜0.25m²／ｇを有する。該粒子群製
品は一般に少くとも95重量％、好ましくは少くと
も97重量％のチタンを含有する。

本発明は酵素を好適に不動化（固定化）する。
酵素は種々の型のものであり得る。使用可能酵素
の諸例は文献（H.R.Mahler and E.H.Cordes、
Biological Chemistry、Harper int.Edn.1976）
を参照されたい。特に適当である酵素はグルコー
スデヒドロゲナーゼ、グルタメートデヒドロゲナ
ーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルア
ルデヒドデヒドロゲナーゼ、アミノ酸オキシダー
ゼ、フエニルアラニンヒドロキシラーゼ、アセテ
ートキナーゼ、エノラーゼ類、ウレアーゼ、カル
ボキシペプチダーゼ、パパイン、レニン、キモト
リプシン、リジンラセマーゼ、インベルターゼ、
ヘキソキナーゼ、アスパルターゼ、セルラーゼ、
11−β−ヒドロキシラーゼ及び△¹デヒドロゲナ
ーゼから選ばれ得る。

酵素として例えばグルコースオキシダーゼ、グ
ルコースイソメラーゼ、カタラーゼ、ラクターゼ
類（β−ガラクトシダーゼを含む）、フマラーゼ、
アミノアシラーゼ類、トリプシン、ペプシン、ア
ミラーゼ類、ペニシリンアシラーゼ、ペニシリン
アミダーゼ及びグリコシルトランスフエラーゼ類
を使用して優良な成績が得られた。

本発明に従う複合粒子群内に存在する酵素は遊
離の酵素の形、該遊離酵素含有の細胞群の形（例
えば微生物の形）、又は天然物源或は合成物源の
他の化合物と化学的に結合した形のものであり得
る。酵素が細胞の形で存在するならばこの細胞を
既知の前処理方法例えば凍結乾燥又は部分分解或
は全分解にかけることができる。

本発明に従う複合粒子群中に存在する酵素の含
有率は広範囲に変えられ得るが一般に担体重量の
0.001〜10重量％である。

本発明の複合粒子群はポリサツカライドを含有
する。一般に使用されるポリサツカライドは寒
天、アガロース、デンプン、キトサン
（chitosan）、デキストラン、セフアデクス（商標
名Sephadex）、セフアロース（sepharose）及び
セルロースに起因する化合物である。これらの諸
化合物のうちアガロース、セフアデクス及びセル
ロースに起因する化合物が好ましく、アガロース
起因の化合物は特に著しく好適である。

交差結合剤としてはアルデヒド又はエポキシド
が用いられる。交差結合剤の諸例は上記のフラン
ス特許出願明細書（複）に開示されている。

好適な交差結合剤は脂肪族アルデヒド例えばグ
ルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、グリオキ
サル及びデンプンジアルデヒド（starch
dialdehyde）、及びエポキシド例えばエピクロル
ヒドリンから選ばれる。

本発明の複合粒子群は、アルブミン、例えばボ
ビン（bovine）アルブミン、オボアルブミンを
含有し得る。

本発明に従う複合粒子群内に存在し得る不活性
重合性構成分は広い制限範囲にわたり変り得る。
即ち一般に担体重量にもとづき0.001〜100重量％
である。酵素対不活性重合性構成分の重量比はか
なり広範囲に変り得るものであつて一般に20：１
〜１：1000である。

本発明に従う複合粒子群は多孔性担体及び不活
性重合性構成分を含むのみならず交差結合剤を含
有し得る。この場合には該複合粒子群は酵素で含
浸された担体の形状をなし、もし適当であるなら
ば交差結合剤によつてすべての可能な結合におい
て部分的に又は完全に交差結合した不活性重合性
構成分で含浸されてもいる担体の形状をなすもの
である。

一般的には交差結合剤は上文中に定義されたも
のと同じであつて広い範囲内で変り得る比率にお
いて使用され得る。担体に固定された活性及び不
活性物質の重量にもとづき0.01〜100重量％の交
差結合剤が一般に使用される。

その他の添加剤も又本発明の複合粒子群中に存
在し得る。けれども一般にはかなり少量で即ち組
成物重量の10重量％以下で存在することが多い。
これらの添加剤のうちPH調整剤、交差結合剤の
“中和（Neutralising）”用剤、酵素を担体へ化学
的に付着させる傾向をもつ製品、細菌汚染の恐れ
を制御するための殺菌剤又は殺真菌剤、及び酵素
の活性を改良するための添加剤を挙げ得る。

これらの諸添加剤は複合粒子群の製造方法、添
加剤の正確な構造及び使用目的によつて選択され
る。

本発明に従う複合粒子群内に存在する諸物質の
全量は、担体を除き、組成物重量の0.01〜60重量
％であることが一般である。

本発明に従う複合粒子群は元の固体担体の粒子
群の外径と殆ど同じ外径をもつ粒子群の形状をな
す。この組成物の見掛け比重は自由流動法で測定
したとき一般に0.5〜2.5Kg／ｄm³である。含浸の
後に粒子群は任意に凝集していかなる幾何学的形
状たとえばペレツト、タブレツト、ブリケツト又
はプレートの形状をもとり得る。

本発明は又複合粒子群の製造方法を指向するも
のである。

第一の方法は、酵素とポリサツカライド及びア
ルブミンから成る群から選ばれる不活性重合性構
成分とをチタンスポンジ担体に含浸させた後にア
ルデヒド及びエポキシドから成る群から選ばれる
交差結合剤によつて交差結合させることを特徴と
するチタンスポンジ担体に固定された酵素を含有
する複合粒子群であつて平均寸法５〜200ミクロ
ンの空腔群が大部分を占める該空腔群を粒子構造
の内部に有する空腔群から成る該複合粒子群の製
造方法である。

即ち担体、酵素、交差結合剤及びその他の共存
可能構成分を溶剤存在下に接触させ、交差結合さ
せ、次いで溶剤の全部又は一部を除去し得る。

溶剤の性質は臨界的でない。好適には水を使用
する。又複数溶剤の混合物を使用し得る。この場
合には低揮発性溶剤例えばグリセロールと水との
混合物の使用が好ましい。この際低揮発性溶剤は
水の重量の0.1〜20重量％で存在する場合が最も
多い。

担体と溶剤及び他の構成分とを一工程で又は複
数工程で接触させ得る。この接触を一工程で行う
ときには溶剤、交差結合剤及びその他のすべての
構成分を含む混合物を多孔性担体に含浸させる。
この混合物は溶液、懸濁物又は乳化物の形である
ことができ、最終目的組成物中における所望比率
と同じ比率で諸構成分を使用する。

そこで交差結合が既知の何れかの方法によつて
行われる。有利な方法はその含浸された担体の温
度を液体溶剤の氷点以下の値に下げることからな
る。その溶剤が水を含む場合には含浸された担体
は０℃以下、好適には０〜−200℃間に冷却され
る。最良の結果はその含浸された担体を−20〜−
200℃間に冷却して得られている。この冷却は
種々な技法によつて行われうる。即ちその含浸さ
れた担体を所望の温度に冷却された環境の中に一
般には２〜10時間置くことができる。所望の温度
に冷却されており、その氷点がその所望温度以下
であるような液状生成物中に該含浸された担体の
粒子群を落下させることも可能である。このため
に使用される適正な液状生成物には冷エーテル又
は液体窒素が含まれる。一旦その溶剤が凍ると含
浸された担体の粒子群は外囲温度に戻され、液体
溶剤の全部又は一部は既知法例えば蒸発、強制排
液或は凍結乾燥によつて除去される。

交差結合を行う別の適正な方法は含浸された担
体中にある液体溶剤を既知法例えば真空蒸発、乾
燥不活性ガス（空気又は窒素）の流通、又は凍結
乾燥によつて直接除くことからなる。この場合に
少量のグリセロールのような揮発性の低い水溶性
液体と水との混合物からなる溶剤の使用が有利で
ある。

この交差結合剤中の過剰の反応基は一般にはそ
の交差結合剤中に存在する官能基と反応しうる化
合物を架橋操作後に添加して中和される。これら
の“中和”剤の性質は用いられる交差結合剤の型
によつて明白に選ばれる。しばしば水及びアミノ
酸が適正である。即ち、交差結合剤がグルタルア
ルデヒドであれば、グリシン又はアルカンジアミ
ンがその“中和”剤として最も頻繁に使用され
る。

次にこの担体を１回又は数回連続して水又は適
当な中和剤水溶液で洗浄しうる。経済的な理由か
ら水が最もよく使用される。

架橋操作は２工程で行われることもできる。即
ちこの多孔性担体を溶剤、交差結合剤及び全て又
は若干の酵素以外の成分を含む第１混合液と接触
させ、上記の技法によつて交差結合させ、次に第
２工程でこのように含浸された担体を溶剤、交差
結合剤、酵素及びそれがよければその他の成分の
残りを含む第２混合液と接触させ、上記の技法の
１つ又はその他によつて第２の交差結合を行わせ
ることができる。

第２の方法は、ポリサツカライド及びアルブミ
ンから成る群から選ばれる不活性重合性構成分を
チタンスポンジ担体に含浸させた後にアルデヒド
及びエポキシドから成る群から選ばれる交差結合
剤によつて交差結合させ、さらに酵素とイオン結
合可能な官能基を導入した後に酵素をイオン結合
せしめることを特徴とするチタンスポンジ担体に
固定された酵素を含有する複合粒子群であつて平
均寸法５〜200ミクロンの空腔群が大部分を占め
る該空腔群を粒子構造の内部に有する空腔群から
成る該複合粒子群の製造方法である。上記の方法
によれば、第１工程は引き続いて酵素がイオン結
合によつて結合する様な不活性物質を、その空腔
群の内部で交差結合させることである。該不活性
物質はポリサツカライドをベースとしたイオン交
換体からなることが有利であり、可溶性ゲルを形
成してそこに酵素がイオン結合で結合することが
できる。こうするためにはポリサツカライドを先
ず溶剤に溶解してからその得られた溶液中に多孔
性無機担体を添加することができる。担体が含浸
された後にその孔（複）の内側にポリサツカライ
ドを固定させるためにそれを交差結合剤で処理す
る。交差結合は慣用的にタンパク質のクロマトグ
ラフイ用に使用される酵素とイオン結合可能な官
能基〔これらは特にジエチルアミノエチル
（DEAE）、カルボキシメチル（CM）、ホスフオ
Ｐ）、トリエチルアミノエチル（TEAE）或はエ
ピクロロヒドリントリエタノールアミン
（ECTEOLA）基である〕を導入して完結され
る。交差結合の結果得られる複合体は、単純なイ
オン結合によつて酵素を結合するために用いられ
るイオン交換性をもつ生成物である。第２の方法
で用いられる溶剤、交差結合剤及び架橋操作法は
第１の方法で用いられるものと同じである。第２
の方法の利点は酵素がたとえイオン結合で安定に
固定されていようともその酵素を回収しうるとい
う点にある。又担体と交差結合された不活性物質
とを持続又は貯蔵させることを可能にし、その実
施を単純化するという利点がある。

本発明の複合粒子群は化学反応を触媒するため
に使用される。

この目的に対して粒子群は反応容器中に、既知
の種々の様式即ち固定床、又は流動床の形、或は
移動床又は乱流床の形にでも配列される。この複
合粒子群をその液状反応混合物中に完全に浸漬し
うるし、或はその液状反応混合物を粒子群上に流
すことも可能である。複合粒子群を用いる方法は
連続式にも不連続式にも実施されうる。

これらの方法は食品及び製薬業界に成功裡に応
用されうる。即ちそれらは純粋な、そして適当に
行えば光学活性なアミノ酸例えばメチオニン、リ
ジン、フエニルアラニン、トリプトフアン及びバ
リンの製造に応用されうる。グルコースオキシダ
ーゼを含む複合粒子群をグルコースの酸化に使用
することもできる。同様に、グルコースイソメラ
ーゼを含む複合粒子群をグルコースのフラクトー
スへの異性化に使用しうる。この後者の場合にこ
の方法はグルコース／フラクトース混合物中のフ
ラクトースの割合を増大させるのに極めて適して
いる。

本発明の複合粒子群を化学反応遂行に使用する
のは特に有利である。実際にそれが固状であるた
めにその反応は粒子群を反応混合物から取り出す
ことによつて何時でも停止されうる。更に反応生
成物は夾雑物を含まない。最後に複合粒子群はそ
の活性を長い間保有する。

本発明の複合粒子群は特に高い物理的安定性
（磨滅耐性、破砕強度及び寸法安定性）をも示す。
従がつて該粒子群は傷害を受けることなくあらゆ
る型の反応槽に使用されうる。

更に、酵素は粒子群の表面に局在するだけでな
く空腔内部にも存在するので使用中磨耗の結果と
して活性の損失は実際上認められず、粒子群は集
塊化の傾向を示さない。

本発明の複合粒子群は酵素が完全に失活した後
に、担体であるチタンスポンジを再生することが
できる。

その方法は失活した複合粒子群の担体からまだ
そこに固定されている物質を除き、引続きその担
体をアルカリ性水溶液で洗浄することからなる。

このアルカリ溶液処理は種々の既知技法例えば
担体の溶液中浸漬、或は担体上への溶液の流通に
よつて実施されうる。

種々の型のアルカリ剤が使用されうる。良好な
結果は水酸化ナトリウムで得られている。このア
ルカリ性水溶液は種々の量のアルカリを含有しう
る：その量は一般には0.01〜10モル、更に頻繁に
は0.1〜５モルのアルカリを１の溶液中に含む
ものである。

アルカリ処理後にその担体を所望によつては洗
浄しうる。そこで担体を乾燥し再使用する。

乾燥は種々の既知方法で実施されうる。一つの
操作法は、担体を高温、一般には50〜200℃の温
度に加熱することからなる。担体に不活性ガス
（空気、窒素又はアルゴン）を吹きつけることも
できる。加熱時間は変更されうるものであつて特
に使用されうる温度に依存する。

アルカリ溶液処理を行わないとそこへ“固定さ
れた物質が除かれた担体”を再含浸させることが
極めて難しいことがわかる。

失活した担体からそこへ固定されている種々の
物質を除くには種々の技法が使用されうる。適当
な方法は、失活した担体を酸化剤、更に詳細には
次亜塩素酸ナトリウムで処理し、所望によつては
続いてそのように処理された担体を洗浄すること
からなる。

次亜塩素酸ナトリウム処理は種々の既知方法例
えば担体の溶液内浸漬、随意に流動化、或は担体
上への溶液の流通によつて行われうる。使用され
る次亜塩素酸ナトリウムの水溶液は通常１〜50重
量％、最も屡々５〜40重量％の次亜塩素酸ナトリ
ウムを含む。良好な結果は20重量％の次亜塩素酸
ナトリウムを含む溶液で得られている。この処理
の時間は変更されうるもので一般には１分間〜５
時間、最も屡々２分間〜２時間である。次亜塩素
酸塩処理の後に溶液を既知方法例えば重力下での
排液、強制排液及び過によつて担体から除く。

所望によつては担体を１回又は数回水で濯ぎう
る。濯ぎは少量の亜硫酸ナトリウム（一般には
0.001〜１モル／溶液である）を含む水溶液を
用いて有利に行われ、続いて水で濯いでもよい。

この再生処理はチタンスポンジを損失なくそし
て劣化させることなく回収することを可能にす
る。したがつて担体は極めて多数回連続して含浸
と再生操作とにかけられしかも本質的な変性を受
けることがない。

以下の諸例は本発明を例示する。

例 １ グルコースイソメラーゼのチタンスポンジ上で
の不動化 生成物Ａ 用量0.01モル／のリン酸塩緩衝剤と0.005モ
ル／のMgSO₄とを含む１のPH7.0の溶液に対
し31.5ｇの活性タンパク物質を溶解してグルコー
スイソメラーゼ溶液を製造する。

用量360マイクロリツトルの、0.02モル／の
リン酸塩緩衝剤を含むPH6.88の溶液、860マイク
ロリツトルの上記のタンパク物質溶液及び80マイ
クロリツトルの0.2モル／のMgSO₄含有溶液を
順次に125mgの粉末オボ（卵）アルブミンに添加
する。

アルブミンが完全に溶解してから75mg／mlのグ
ルタルアルデヒドと0.02モル／のリン酸塩緩衝
剤を含むPH6.88の600マイクロリツトルの溶液を
添加する。

均質した後に予め洗浄された２ｇのチタンスポ
ンジを添加する。使用されるチタンスポンジは
0.5〜１mmの寸法、0.130m²／ｇの比表面積、0.28
cm³／ｇの多孔度、63ミクロンの平均空腔直径及び
その空腔群の全容積の約95％が直径５〜100ミク
ロンである空腔群からなるような空腔寸法分布を
もつ粒子群からなる。

こうして得られた混合物をそこに包み込まれた
空気の除去のために真空に曝し、大気圧に戻した
後にそれを−35℃に少くとも４時間保つ。

生成物を次に外囲温度に戻し、続いてグリシン
溶液とリン酸塩緩衝溶液とで洗う。

得られた複合粒子群において、卵アルブミン濃
度は56.9mg／ｇ、グルコースイソメラーゼ濃度は
12.3mg／ｇ、チタン濃度は910mg／ｇである。

生成物Ｂ 用量0.01モル／のリン酸塩緩衝剤と0.005モ
ル／のMgSO₄とを含むPH7.0の溶液の１に対
し26.3ｇのタンパク質を溶解してグルコースイソ
メラーゼ溶液を製造する。

用量600マイクロリツトルの、0.02モル／の
リン酸塩緩衝液を含むPH6.88の溶液、１mlの上述
のタンパク質溶液、及び150マイクロリツトルの、
250mg／mlのグリセロールと、0.02モル／のリ
ン酸塩緩衝液とを含むPH6.88の溶液を順次125mg
の粉末卵アルブミンに添加する。

卵アルブミンが完全に溶解した後、75mg／mlの
グルタルアルデヒドと0.02モル／のリン酸塩緩
衝剤を含むPH6.88の溶液150マイクロリツトルを
添加する。

均質化した後に生成物Ａに使用したものと同じ
性質を持つ２ｇのチタンスポンジを添加する。

この混合物を真空に曝してそこに包み込まれた
空気を除き、大気圧に戻した後にそれを少くとも
２時間25〜30℃に加熱された換気された環境の中
へおく。

次にその生成物を順次にグリシン溶液、リン酸
塩緩衝溶液で洗う。

得られた複合粒子群中の卵アルブミン濃度は
57.8mg／ｇ、グルコースイソメラーゼ濃度は12.2
mg／ｇ、チタン濃度は925mg／ｇである。

グルコースのフラクトースへの異性化 上記の触媒を内径14mmの管状反応槽内に固定床
として配置する。反応槽を70℃の温度に保ち連続
的に15〜16ml／時の速度で2.4モル／のグルコ
ース、0.02モル／の亜硫酸塩緩衝剤、0.005モ
ル／のMgSO₄及び0.75ｇ／のパラオキシ安
息香酸メチルを含む水溶液を供給する。パラオキ
シ安息香酸メチルは微生物の発生と生育とを阻止
するために用いられる。PHは7.5であり、滞留時
間は20分間である。

それぞれ生成物Ａ（実験１）及び生成物Ｂ（実験
２）を用い、２回の実験を行つた。双方の場合に
おいてグルコースの観測された転化度は１時間当
り、１mlの触媒当り１ｇのフラクトースが生成さ
れるものであつた。触媒の半減期は実験１で15.5
日、実験２で16.5日であつた。

触媒として生成物Ａに示されたように処理され
たがチタンを加えなかつたグルコースイソメラー
ゼからなるホーム（foam）を用いて同一実験を
行つたところ数時間の操作後に反応槽が閉塞し
た。

例 ２ グルコースオキシダーゼのチタンスポンジ上で
の不動化 生成物Ｃ カタラーゼ活性をもつ11ｇの活性タンパク質を
0.02モル／のリン酸塩緩衝剤を含むPH6.88の溶
液の１に溶解してグルコースオキシダーゼ溶液
を製造する。

用量0.02モル／のリン酸塩緩衝剤を含む４cm³
の、PH6.88の溶液と3.2cm³の上記のタンパク質溶
液とを順次に640mgの粉末ボビン（牛）アルブミ
ンに添加する。

アルブミンの完全溶解後に15ｇ／のグルタル
アルデヒドと0.02モル／のリン酸塩緩衝剤とを
含む４cm³の、PH6.88の溶液を添加する。

均質化した後に予め洗浄された18ｇのチタンス
ポンジを加える。使用されるチタンスポンジは１
〜２mmの粒径、0.130m²／ｇの比表面積、0.28
cm³／ｇの多孔度、63ミクロンの平均空腔直径、空
腔群の全容積の約95％が５〜100ミクロンの直径
をもつ空腔群からなるような空腔寸法分布をもつ
粒子群からなる。

こうして得られた混合物を真空に曝し、包み込
まれた空気を除き、大気圧に戻した後にそれを−
35℃に少くとも４時間保つ。

その生成物を次に外囲温度に戻し、順次にグリ
シン溶液、リン酸塩緩衝溶液で洗浄する。

得られた複合粒子群においてアルブミン濃度は
34mg／ｇ、グルコースオキシダーゼ濃度は1.87
mg／ｇ、チタン濃度は961mg／ｇである。

グルコースのグルコン酸への酸化 上記の触媒を100cm³の、40ｇ／のグルコース
を含む溶液に懸濁させる。温度を25℃に保ち、
1N水酸化ナトリウム水溶液の連続添加によつて
PHを6.88に保つ。ガラスフリツトによつて精製空
気をその溶液中に通気する。10時間の操作後に25
ｇのグルコースがグルコン酸に転化された。

例 ３ イオン交換体で変改されたチタンスポンジ上で
のグルコースイソメラーゼの不動化 担体の製造 アガロースの８ｇを500mlの丸底フラスコ中の
100mlの水に加え120℃で10分間加熱して溶解させ
る。この溶液を95℃に冷却し、例２におけると同
じ性質をもつ140ｇのチタンスポンジを添加する。
全体を120℃に10分間加熱してから次に外囲温度
に16時間保つ。240ｇが残つており、見掛けの容
積が200mlであるこの混合物を１の丸底フラス
コ内の100mlの水に分散させ、次にこの分散液に
200mlの1N NaOH溶液、４mlのエピクロロヒド
リン及び１ｇのホウ水素化ナトリウムを加え、全
体を撹拌しながら60℃で１時間加熱する。そこで
この交差結合されたアガロースを含む粒子群を傾
瀉法で分離し、洗液がPH７になるまで水洗する。

交差結合された全ての粒子群を500ml丸底フラ
スコに入れ、そこへ33ｇの２−クロロ−Ｎ，Ｎ−
ジエチルアミンと33mlの水とを加え、全体を外囲
温度で30分間撹拌する。そこで130mlの2.5N
NaOH溶液を導入し撹拌を更に60分間継続する。
粒子群を傾瀉法で分離し、洗液がPH７になるまで
５％NaCl溶液で洗い、次に洗液中に塩化物が存
在しなくなるまで水で洗う。この生成物を殺菌剤
の存在下に湿潤状態に保つ。

グルコースイソメラーゼの固定 上述のようにして製造された担体の1.8mlを内
径14mmの管状カラム中に配置し、そこへ12mg／ｇ
のタンパク質を含む５mlのグルコースイソメラー
ゼ溶液を閉鎖サイクルで循環させる。

このタンパク質は３時間後にはこの担体に固定
されるに至つた。

グルコースのフラクトースへの異性化 上述のようにして得られた活性粒子群を含み、
65℃に加熱されたカラムに2.4モル／のグルコ
ース、0.02モル／の亜硫酸塩緩衝剤、0.005モ
ル／のMgSO₄及び0.5ｇ／の殺菌剤としての
パラオキシ安息香酸メチルを含む水溶液を連続的
に供給する。PHは7.2〜7.4であり流速はグルコー
スのフラクトースへの転化度が42％になるように
５ml／時の程度の値に調整される。

経過60日後に2.3Kgの固形物が製造され、転化
度を42％に保つために必要な流速は最初の値の半
分に減少することが見出される。

長時間運転法の本例は担体として金属を含む本
発明の粒子群はそこに固定される酵素に影響を与
えないことを示している。

例 ４ 粒子群への酵素の再負荷 その活性が最初の値の約25％に低下した酵素を
含む例２の粒子群を、それらが存在する反応槽中
で冷却後に0.2〜0.4NNaOH水溶液で処理する。
続いて洗液のPHが７になるまで５％NaCl溶液で
洗い、次に塩化物が消失するまで水洗し、続いて
例２に記載したように酵素を固定する。

連続して２〜３週間70℃で行われた７回の再生
及び使用サイクルの後においても、例２の操作に
従うならば担体の性質に関しても、イオン交換能
に関しても何らの変性は認められなかつた。

従つて上記の諸例と同様に本例は本発明の粒子
群に使用される不活性担体としての金属の性質の
保有性を示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ チタンスポンジ担体に固定ささた酵素を含有
   する複合粒子群において、平均寸法５〜200ミク
   ロンの空腔群が大部分を占める該空腔群を粒子構
   造の内部に有する粒子群から成ること、及び該複
   合粒子群がポリサツカライド並びにアルブミンか
   ら成る群から選ばれる不活性重合性構成分をも含
   有することを特徴とする前記の複合粒子群。 ２ 空腔群の平均寸法が20〜100ミクロンである
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の粒
   子群。 ３ 比表面積が１m²／ｇ以下であることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項又は２項記載の粒子
   群。 ４ チタンスポンジ担体の水への溶解度が0.1重
   量％以下であることを特徴とする特許請求の範囲
   第１〜３項のいずれか１項に記載の粒子群。 ５ 空腔群の全容積の少なくとも70％が５〜200
   ミクロンの寸法の空腔群から成ることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項〜４項のいずれか１項に
   記載の粒子群。 ６ 酵素がグルコースオキシダーゼ及びグルコー
   スイソメラーゼから成る群から選ばれることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の粒子群。 ７ ポリサツカライドがアガロースであることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載の粒子群。 ８ アルブミンがオボアルブミンであることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の粒子群。 ９ 酵素とポリサツカライド及びアルブミンから
   成る群から選ばれる不活性重合性構成分とをチタ
   ンスポンジ担体に含浸させた後にアルデヒド及び
   エポキシドから成る群から選ばれる交差結合剤に
   よつて交差結合させることを特徴とするチタンス
   ポンジ担体に固定された酵素を含有する複合粒子
   群であつて平均寸法５〜200ミクロンの空腔群が
   大部分を占める該空腔群を粒子構造の内部に有す
   る空腔群から成る該複合粒子群の製造方法。 １０ アルデヒドがグルタルアルデヒドである特
   許請求の範囲第９項記載の方法。 １１ エポキシドがエピクロロヒドリンである特
   許請求の範囲第９項記載の方法。 １２ ポリサツカライド及びアルブミンから成る
   群から選ばれる不活性重合性構成分をチタンスポ
   ンジ担体に含浸させた後にアルデヒド及びエポキ
   シドから成る群から選ばれる交差結合剤によつて
   交差結合させ、さらに酵素とイオン結合可能な官
   能基を導入した後に酵素をイオン結合せしめるこ
   とを特徴とするチタンスポンジ担体に固定された
   酵素を含有する複合粒子群であつて平均寸法５〜
   200ミクロンの空腔群が大部分を占める該空腔群
   を粒子構造の内部に有する空腔群から成る該複合
   粒子群の製造方法。 １３ アルデヒドがグルタルアルデヒドである特
   許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４ エポキシドがエピクロルヒドリンである特
   許請求の範囲第１２項記載の方法。 １５ 該官能基がジエチルアミノエチル基、カル
   ボキシメチル基、ホスフオ基、トリエチルアミノ
   エチル基及びエピクロロヒドリントリエタノール
   アミン基から選ばれた官能基である、特許請求の
   範囲第１２項記載の方法。