JPS58198300A - 分析方法 - Google Patents
分析方法Info
- Publication number
- JPS58198300A JPS58198300A JP8053482A JP8053482A JPS58198300A JP S58198300 A JPS58198300 A JP S58198300A JP 8053482 A JP8053482 A JP 8053482A JP 8053482 A JP8053482 A JP 8053482A JP S58198300 A JPS58198300 A JP S58198300A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- immobilized
- enzymes
- added
- cellulose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は分析方法とくに酵素の触媒作用が利用された分
析方法に関する。
析方法に関する。
従来において、有機物質とくに生体物質例えば胆汁酸を
分析するＫは特装＠５６−３９１９９号公報等に見られ
る如く、該胆汁酸とニコチン酸アミドアデニンジヌクレ
オチド（以下ＮＡＤと略す）との反“応を酵素３ａ−ヒ
ドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（以下３ａ−Ｈ５
Ｄと略す）の触媒作用により行わせて、上記ＮＡＤをＮ
ＡＤＨＫ還元させ、該ＮＡＤＨをレサズリンの共存下に
＃索ジアホラーゼの作用によりＮＡＤＫ酸化させると同
時にレデズリンを還元させてレゾルフィンを生成させ、
該レゾルフィンの蛍光を測定することにより、試料中の
胆汁酸を定量することが行われていた。
分析するＫは特装＠５６−３９１９９号公報等に見られ
る如く、該胆汁酸とニコチン酸アミドアデニンジヌクレ
オチド（以下ＮＡＤと略す）との反“応を酵素３ａ−ヒ
ドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（以下３ａ−Ｈ５
Ｄと略す）の触媒作用により行わせて、上記ＮＡＤをＮ
ＡＤＨＫ還元させ、該ＮＡＤＨをレサズリンの共存下に
＃索ジアホラーゼの作用によりＮＡＤＫ酸化させると同
時にレデズリンを還元させてレゾルフィンを生成させ、
該レゾルフィンの蛍光を測定することにより、試料中の
胆汁酸を定量することが行われていた。
同様に、コレステロールの測定においては酵素コレステ
ロールエステラーゼが、過酸化脂質の測定においては酵
素グルタチオンベルオキシターゼを利用することが知ら
れている。
ロールエステラーゼが、過酸化脂質の測定においては酵
素グルタチオンベルオキシターゼを利用することが知ら
れている。
しかしながら、上記の様な従来法においては、試料中に
酵素が溶液状で加えられており、回収の困難性もあって
、殆んどの場合は高価々酵素が一回だ杜の使用で使い捨
てにされていた。
酵素が溶液状で加えられており、回収の困難性もあって
、殆んどの場合は高価々酵素が一回だ杜の使用で使い捨
てにされていた。
本発明は上記の如き現状にかんがみ、高価な酵素を使い
捨てにすること々く何回も繰り返して有効に使用するこ
との出来る分析方法を提供す。
捨てにすること々く何回も繰り返して有効に使用するこ
との出来る分析方法を提供す。
ることを目的としてなされたものであり、その要旨は、
試料液中のｌｓ、分を定量するに際して酵索による触媒
作用を利用する方法において、上記触媒作用を行わせる
ために球状のセルロース支持体に固定化した酵素を試料
液中に加えることを特徴とする分析方法に存する。
試料液中のｌｓ、分を定量するに際して酵索による触媒
作用を利用する方法において、上記触媒作用を行わせる
ために球状のセルロース支持体に固定化した酵素を試料
液中に加えることを特徴とする分析方法に存する。
本発明において用いられるセルロース支持体は球状のも
のであり、ビンセット等で挾んで使用する等の取扱い上
の観点から１〜１０■程度の粒径のものが好適に用いら
れる。
のであり、ビンセット等で挾んで使用する等の取扱い上
の観点から１〜１０■程度の粒径のものが好適に用いら
れる。
又、本発明分析方法は、酵素による触媒作用を利用した
分析に適用されるので、試料液中の分析対象となる成分
の種類によって該成分の分析に利用される酵素が選定さ
れる。例えば胆゛汁酸の分析においては３α−Ｈ３Ｄや
ジアホラーゼが、コレステロールの分析においてはコレ
ステロールエステラーゼが、過酸化脂質の分析において
はグルタチオンペルオキシクーゼが用いられ得る。
分析に適用されるので、試料液中の分析対象となる成分
の種類によって該成分の分析に利用される酵素が選定さ
れる。例えば胆゛汁酸の分析においては３α−Ｈ３Ｄや
ジアホラーゼが、コレステロールの分析においてはコレ
ステロールエステラーゼが、過酸化脂質の分析において
はグルタチオンペルオキシクーゼが用いられ得る。
酵素をセルロース支持体に固定化するには、該支持体表
面に酵素を化学的に結合させるいか々る方法も採用する
ことが出来、例えばＩ・ロゲン化シアンを用いる方法や
エポキシドを用いる方法々どが採用出来、又、固定化す
る酵素の性質によって、へキサメチレンジアミンなどの
適当なスペーサーを導入したのち固定化してもよい。
面に酵素を化学的に結合させるいか々る方法も採用する
ことが出来、例えばＩ・ロゲン化シアンを用いる方法や
エポキシドを用いる方法々どが採用出来、又、固定化す
る酵素の性質によって、へキサメチレンジアミンなどの
適当なスペーサーを導入したのち固定化してもよい。
そしてセルロース支持体に酵素が固定化された彼は、そ
の酵素が安定に保たれ得るＰＨＫ調整された緩衝液中で
４℃前後の温度条件で保存す防止剤をａ１％以下の割合
で、エチレンジアミン４１１酸ナトリクムをＱＯ５％以
下の割合で、アジ化ナトリクムなどの防腐剤をａ１％以
下の割合でそれぞれ含有させるのが保存性の点でより好
ましい。
の酵素が安定に保たれ得るＰＨＫ調整された緩衝液中で
４℃前後の温度条件で保存す防止剤をａ１％以下の割合
で、エチレンジアミン４１１酸ナトリクムをＱＯ５％以
下の割合で、アジ化ナトリクムなどの防腐剤をａ１％以
下の割合でそれぞれ含有させるのが保存性の点でより好
ましい。
上記セルロース支持体に固定化された酵素を使用する際
には、該酵素の保存容器からビンセット等で取シ出して
、好ましくけ分析に使用する緩衝液で洗浄したのち用い
るのであるが、分析における該同定化酵素の使用は、従
来の分析法において溶液状酵素を添加する段階で該溶液
状酵素の代りに酵素が固定化されたセルロース支持体を
ビンセット等で適当個数加えることにより行われる。試
料中に加えられると、セルロース支持体に固定化された
＃素の触媒作用によって、従来法において試料中に溶液
状酵素を加えた場合と同様に目的とする所定の反応が進
行する。例えば胆汁酸の分析において３α−Ｈ３Ｄとジ
アホラーゼがそれぞれ固定化されたセルロース支持体が
試料液中に加えられた場合は、３α−Ｈ３Ｄの作用によ
って、試料液中の胆汁酸と絃試料液中に予め加えられて
いるＮＡＤとが反応して３−ケト型胆汁酸及びＮＡＤＨ
が生成し、さらにジアホラーゼの作用によって、上記Ｎ
ＡＤＨがＮＡＤに酸化されると共に、試料液中に予め加
えられているレサズリンが還元されて試料液中の胆汁酸
と等モルのレゾルフィンが生成するのであり、こうして
生成したレゾルフィンの蛍光を測定することにより胆汁
酸の定量分析が行われるのである。
には、該酵素の保存容器からビンセット等で取シ出して
、好ましくけ分析に使用する緩衝液で洗浄したのち用い
るのであるが、分析における該同定化酵素の使用は、従
来の分析法において溶液状酵素を添加する段階で該溶液
状酵素の代りに酵素が固定化されたセルロース支持体を
ビンセット等で適当個数加えることにより行われる。試
料中に加えられると、セルロース支持体に固定化された
＃素の触媒作用によって、従来法において試料中に溶液
状酵素を加えた場合と同様に目的とする所定の反応が進
行する。例えば胆汁酸の分析において３α−Ｈ３Ｄとジ
アホラーゼがそれぞれ固定化されたセルロース支持体が
試料液中に加えられた場合は、３α−Ｈ３Ｄの作用によ
って、試料液中の胆汁酸と絃試料液中に予め加えられて
いるＮＡＤとが反応して３−ケト型胆汁酸及びＮＡＤＨ
が生成し、さらにジアホラーゼの作用によって、上記Ｎ
ＡＤＨがＮＡＤに酸化されると共に、試料液中に予め加
えられているレサズリンが還元されて試料液中の胆汁酸
と等モルのレゾルフィンが生成するのであり、こうして
生成したレゾルフィンの蛍光を測定することにより胆汁
酸の定量分析が行われるのである。
セルロース支持体に固定化された酵素は上記の如き触媒
作用によって消費されることはないから、使用後におい
て反応系より取出して洗浄し、保存しておけば、同じ目
的で何回も繰り返して使用可能である。
作用によって消費されることはないから、使用後におい
て反応系より取出して洗浄し、保存しておけば、同じ目
的で何回も繰り返して使用可能である。
本発明の分析□方法は上述の通りの方法であり、特に酵
素による触媒作用を利用する分析方法において球状のセ
ルロース支持体に固定化した酵素を試料液中に加える方
法であるから、従来の試料液中に溶液状の酵素を加える
分析法に比して、高価な酵素を使い捨てｋすることなく
繰り返して使用することが出来、従って経済性にすぐれ
ているのである。
素による触媒作用を利用する分析方法において球状のセ
ルロース支持体に固定化した酵素を試料液中に加える方
法であるから、従来の試料液中に溶液状の酵素を加える
分析法に比して、高価な酵素を使い捨てｋすることなく
繰り返して使用することが出来、従って経済性にすぐれ
ているのである。
又、支持体がセルロースであり、試料中の物質誉非特異
吸着することが少なく、そして広いＰＨ９斌でも安定で
あるので、固定化酵素の寿命も長い。
吸着することが少なく、そして広いＰＨ９斌でも安定で
あるので、固定化酵素の寿命も長い。
以下、実施例にもとづいて説明する。
実施例１
セルロース粒°子（粒径約３ ｓｍ ）を支持体として
用い、該セルロース粒子３Ｆに２Ｍ＃２酸すトリウム水
溶液３０厘ｌを加え撹拌後、これに予めシアン化ブロマ
イド３Ｆを溶解したアセトントリル３ ｍｌを加え、激
しく撹拌しつつ９０秒間反応させた。こうして活性化さ
せたセルロース粒子をすげやくｏ、ＩＭ炭陵緩衝液（Ｐ
Ｈ９，ｓ ）で洗浄した後、３α−Ｈ３Ｄ５０岬を溶解
させたＱＩＭ炭駿緩衝液（Ｐ Ｈ９，５）２０厘ｔを加
え、室温で１時間撹拌して反応させた。次に上記の処理
により、３ａ−Ｈ５Ｄを同定化したセルロース粒子状に
なお存在する活性点をグロックするため、α０５％２−
メルカプトエタノールを含むα１Ｍ）リス−塩酸緩衝液
（ＰＨ＆Ｏ）中で４℃で２時間反応させた。かくして得
られた３ ａ −ＨＳ Ｄが固定化されたセルロース粒
子をＱ５Ｍの塩化＼ ナトリウムを含むＱＩＭ酢酸緩衝液ＣＰＨ翫０）、イオ
ン交換水及びＱ５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ訳
駿緩衝ｔ／ｌ（ｐ Ｈ９，５＞で繰り返し洗浄したのち
、α０５％２−メルカプトエタノールとα１ ｍ Ｍエ
チレンジアミン４酢駿２ナトリクムとａＯ２％アジ化ナ
トリクムを含むへＩ Ｍ ） ＩＪスス−酸緩衝液（Ｐ
Ｈ７，６）Ｋ浸漬して４℃で保存する。
用い、該セルロース粒子３Ｆに２Ｍ＃２酸すトリウム水
溶液３０厘ｌを加え撹拌後、これに予めシアン化ブロマ
イド３Ｆを溶解したアセトントリル３ ｍｌを加え、激
しく撹拌しつつ９０秒間反応させた。こうして活性化さ
せたセルロース粒子をすげやくｏ、ＩＭ炭陵緩衝液（Ｐ
Ｈ９，ｓ ）で洗浄した後、３α−Ｈ３Ｄ５０岬を溶解
させたＱＩＭ炭駿緩衝液（Ｐ Ｈ９，５）２０厘ｔを加
え、室温で１時間撹拌して反応させた。次に上記の処理
により、３ａ−Ｈ５Ｄを同定化したセルロース粒子状に
なお存在する活性点をグロックするため、α０５％２−
メルカプトエタノールを含むα１Ｍ）リス−塩酸緩衝液
（ＰＨ＆Ｏ）中で４℃で２時間反応させた。かくして得
られた３ ａ −ＨＳ Ｄが固定化されたセルロース粒
子をＱ５Ｍの塩化＼ ナトリウムを含むＱＩＭ酢酸緩衝液ＣＰＨ翫０）、イオ
ン交換水及びＱ５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ訳
駿緩衝ｔ／ｌ（ｐ Ｈ９，５＞で繰り返し洗浄したのち
、α０５％２−メルカプトエタノールとα１ ｍ Ｍエ
チレンジアミン４酢駿２ナトリクムとａＯ２％アジ化ナ
トリクムを含むへＩ Ｍ ） ＩＪスス−酸緩衝液（Ｐ
Ｈ７，６）Ｋ浸漬して４℃で保存する。
陶様にして、セルロース粒子（粒径的３ ｗ ）ＳＰＫ
ジアホラーゼ１００４を固定化し、保存する。
ジアホラーゼ１００４を固定化し、保存する。
ＮＡＤ６０岬を１０−の水に溶かし、これに１００μＭ
のレナズリンーＮｍ水溶液４ ｍｌ ’に加えて試薬Ａ
とする。
のレナズリンーＮｍ水溶液４ ｍｌ ’に加えて試薬Ａ
とする。
人血１１（ｌｌｓ／およびＱＩＭ）リス（ビトロキシメ
チル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ＰＨ亀５）２０ゴを
加え混合して、６５℃で３゛０分間加熱した後冷却する
。これに試薬Ａを１０ｍ加え、さらに、上記の３ａ−Ｈ
５Ｄを固定化したセルロース粒子とジアホラーゼヲ固定
化したセルロース粒子とをα０６Ｍのトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ＰＨ＆、５）で
洗浄した後、それぞれのセルロース粒子を８個づつ加え
、３０℃で４０分間保持する。こうして得られた試料を
励起波長５６０ｎｍ、蛍光波１ｃ ５８０ ｎ ｍで上
記操作により生成したレゾルフィンの蛍光を測定し、試
料中の胆汁酸の濃度を算出する。
チル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ＰＨ亀５）２０ゴを
加え混合して、６５℃で３゛０分間加熱した後冷却する
。これに試薬Ａを１０ｍ加え、さらに、上記の３ａ−Ｈ
５Ｄを固定化したセルロース粒子とジアホラーゼヲ固定
化したセルロース粒子とをα０６Ｍのトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ＰＨ＆、５）で
洗浄した後、それぞれのセルロース粒子を８個づつ加え
、３０℃で４０分間保持する。こうして得られた試料を
励起波長５６０ｎｍ、蛍光波１ｃ ５８０ ｎ ｍで上
記操作により生成したレゾルフィンの蛍光を測定し、試
料中の胆汁酸の濃度を算出する。
１回の測定が終了した後、セルロース粒子を取り出して
ＱＯ６Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−
塩酸緩衝液（ＰＨ＆５）でよく洗浄したものを用いて再
び上記測定を繰り返す。こうして得られた結果が、第１
表である。
ＱＯ６Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−
塩酸緩衝液（ＰＨ＆５）でよく洗浄したものを用いて再
び上記測定を繰り返す。こうして得られた結果が、第１
表である。
第１表
第１表に示される結果から分る様に、３ａ−Ｈ５Ｄが固
定化されたセルロース粒子及びジアホラーゼが固定化さ
れたセルロース粒子は、繰り返し使用してもその性能が
低下することなく胆汁酸を精度よく定置出来るのである
。
定化されたセルロース粒子及びジアホラーゼが固定化さ
れたセルロース粒子は、繰り返し使用してもその性能が
低下することなく胆汁酸を精度よく定置出来るのである
。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 Ｌ 試料液中の区分を定量するに際して酵素による触媒
作用を利用する方法において、上記触媒作用を行わせる
ために球状のセルロース支持体に同定化した酵素を試料
液中に加えることを特徴とする分析方法。 ２ 球状のセルロースが直！！１〜１０鱈のものである
第１項記載の分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8053482A JPS58198300A (ja) | 1982-05-12 | 1982-05-12 | 分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8053482A JPS58198300A (ja) | 1982-05-12 | 1982-05-12 | 分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58198300A true JPS58198300A (ja) | 1983-11-18 |
Family
ID=13721006
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8053482A Pending JPS58198300A (ja) | 1982-05-12 | 1982-05-12 | 分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58198300A (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5596095A (en) * | 1979-01-12 | 1980-07-21 | Solvay | Composite particle group containing active protein substance * production * use and regeneration thereof |
-
1982
- 1982-05-12 JP JP8053482A patent/JPS58198300A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5596095A (en) * | 1979-01-12 | 1980-07-21 | Solvay | Composite particle group containing active protein substance * production * use and regeneration thereof |
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