JPH02264664A - 抗血栓性材料およびその製造方法 - Google Patents
抗血栓性材料およびその製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、抗血栓性材料、特にヒルジンまたはヒルジン
誘導体゛が共有結合する重合性材料に関する。本発明は
更にこのような抗血栓性材料を製造するための新規な方
法に関する。
誘導体゛が共有結合する重合性材料に関する。本発明は
更にこのような抗血栓性材料を製造するための新規な方
法に関する。
血栓症は、血液採集および処理システムのような医療機
器の開発、使用における主なる問題である。血液が異質
の表面に接触するときに、体液および細胞の変化が起こ
る。そのような機器の使用のための材料の生体適合性を
改善するために、研究は、抗凝固剤の固定化と、重合体
表面上に生物学的に活性な抗凝血性物質を固定化するこ
とに集中した。抗凝固剤の一つであるヘパリンは、種々
の血栓症状を処置するために臨床実務で広範囲に使用さ
れてきたムコ多糖である。ヘパリンの治療上の使用では
、しばしば、出血時間の延長のような副作用により面倒
になる。ヘパリンおよびその誘導体は、生体適合性表面
を与え、ヘパリンの体系的投与量を減少させる目的で、
重合体に結合されてきた。しかしながら、これらの生体
適合材料の長期間の効果は知られていない。
器の開発、使用における主なる問題である。血液が異質
の表面に接触するときに、体液および細胞の変化が起こ
る。そのような機器の使用のための材料の生体適合性を
改善するために、研究は、抗凝固剤の固定化と、重合体
表面上に生物学的に活性な抗凝血性物質を固定化するこ
とに集中した。抗凝固剤の一つであるヘパリンは、種々
の血栓症状を処置するために臨床実務で広範囲に使用さ
れてきたムコ多糖である。ヘパリンの治療上の使用では
、しばしば、出血時間の延長のような副作用により面倒
になる。ヘパリンおよびその誘導体は、生体適合性表面
を与え、ヘパリンの体系的投与量を減少させる目的で、
重合体に結合されてきた。しかしながら、これらの生体
適合材料の長期間の効果は知られていない。
例えば、米国特許、番号３．５１１．６８４３．５８５
，６４７．４，２５４，１８０．４，６７６．９７５．
４、６７８．６６０は、表面にヘパリンを吸着、イオン
結合する方法を開示する。米国特許、番号４．５２６，
７１４．４，６３４，７６２．４，６７８，６７１は、
表面にコーティング（被覆物）を作るために蛋白質にヘ
パリンを共存結合する方法を開示する。
，６４７．４，２５４，１８０．４，６７６．９７５．
４、６７８．６６０は、表面にヘパリンを吸着、イオン
結合する方法を開示する。米国特許、番号４．５２６，
７１４．４，６３４，７６２．４，６７８，６７１は、
表面にコーティング（被覆物）を作るために蛋白質にヘ
パリンを共存結合する方法を開示する。
米国特許、番号４．４１５．４９０は、重合物質に共有
結合したヘパリンからなる非凝血性材料を開示する。米
国特許、番号４．３２６．５３２は、抗血栓症剤を付加
されたキトサンでコート（被覆）された重合物質からな
る抗凝血性表面を有する医療材料を開示する。米国特許
、番号４．５２１．５６４．４．６（１６）．６５２．
４．６４２．２４２は、抗凝血性材料が共有結合するポ
リウレタン材料からなる抗凝血性ポリウレタン重合体を
開示する。
結合したヘパリンからなる非凝血性材料を開示する。米
国特許、番号４．３２６．５３２は、抗血栓症剤を付加
されたキトサンでコート（被覆）された重合物質からな
る抗凝血性表面を有する医療材料を開示する。米国特許
、番号４．５２１．５６４．４．６（１６）．６５２．
４．６４２．２４２は、抗凝血性材料が共有結合するポ
リウレタン材料からなる抗凝血性ポリウレタン重合体を
開示する。
特開昭５６−１５０５４９は、ヒドロゲルからなる抗凝
血性医療材料を開示する。−の実施態様では、その材料
は、非共有結合的に結合したヘパリンを含むヒドロゲル
からなる。また、ヒルジンは、抗凝固剤として参照され
ている。
血性医療材料を開示する。−の実施態様では、その材料
は、非共有結合的に結合したヘパリンを含むヒドロゲル
からなる。また、ヒルジンは、抗凝固剤として参照され
ている。
欧州特許出願、番号０．２（１６）．６５５は、表面が
、パラジウムまたはロジウム塩の湿潤溶液で処理され、
次いでイオン結合したコーティングを形成するペプチド
水素イオン化を生起する条件の下でヘパリンまたはヒル
ジンのような抗凝固剤で処理される、医療機器での使用
のための材料を処理する方法を開示する。
、パラジウムまたはロジウム塩の湿潤溶液で処理され、
次いでイオン結合したコーティングを形成するペプチド
水素イオン化を生起する条件の下でヘパリンまたはヒル
ジンのような抗凝固剤で処理される、医療機器での使用
のための材料を処理する方法を開示する。
ヘパリンに対する代替的抗凝固剤は、薬効性蛭の唾液腺
から元来分離される天然に生じる抗凝固剤であるヒルジ
ンである。ヒルジンは、約１０−１１Ｍへのに、を有す
る効能ある特殊なトロンビン阻害剤である。生化学的お
よび薬学的に、ヒルジンは、ヘパリン以上の実質的利点
を表す。抗凝固活性のために、ヘパリンは、補因子とし
て抗トロンビン■またはヘパリン補因子Ｈの存在を要す
る。
から元来分離される天然に生じる抗凝固剤であるヒルジ
ンである。ヒルジンは、約１０−１１Ｍへのに、を有す
る効能ある特殊なトロンビン阻害剤である。生化学的お
よび薬学的に、ヒルジンは、ヘパリン以上の実質的利点
を表す。抗凝固活性のために、ヘパリンは、補因子とし
て抗トロンビン■またはヘパリン補因子Ｈの存在を要す
る。
ヘパリンは、血小板因子４の存在により中和され、血小
板を活性化し、通常長期的な出血と血小板減少症と関連
する。他方、ヒルジンは、補因子を要さず、血小板因子
４により中和されず、血小板を活性化せず、めったに長
期的な出血と関連せずかつ血小板減少症を引き起こさな
い。加えて、ヒルジンは、血栓症を防止するのにヘパリ
ンの５〜１０倍効果的であることが知見されている。
板を活性化し、通常長期的な出血と血小板減少症と関連
する。他方、ヒルジンは、補因子を要さず、血小板因子
４により中和されず、血小板を活性化せず、めったに長
期的な出血と関連せずかつ血小板減少症を引き起こさな
い。加えて、ヒルジンは、血栓症を防止するのにヘパリ
ンの５〜１０倍効果的であることが知見されている。
抗凝血性、非凝血性、または抗血栓性の材料の形成のた
めにヒルジンを使用する試みは、表面にヒルジン分子を
イオン結合することに現在まで限られていた。これらの
工程は本質的に不利である。
めにヒルジンを使用する試みは、表面にヒルジン分子を
イオン結合することに現在まで限られていた。これらの
工程は本質的に不利である。
なぜなら、ヒルジン分子は、材料の長期間の抗血栓性を
減する比較的短期間で表面から分離するからである。
減する比較的短期間で表面から分離するからである。
本発明では、ヒルジンまたはヒルジン誘導体が、得られ
る材料がヒルジンと同じ生物学的活性を実質的に有する
ように共有結合する、官能基を有する支持材料からなる
抗血栓性材料が提供される。
る材料がヒルジンと同じ生物学的活性を実質的に有する
ように共有結合する、官能基を有する支持材料からなる
抗血栓性材料が提供される。
支持材料は、膜、組織、器官と同様な天然、合成的に生
ずる重合体であり得る。ヒルジン又はヒルジン誘導体は
、アミノ酸残基の官能基を通じて支持材料の官能基に直
接結合し得、あるいは結合基を使用して直接結合し得る
。そのような結合基の例は、二重作用的試薬であろう。
ずる重合体であり得る。ヒルジン又はヒルジン誘導体は
、アミノ酸残基の官能基を通じて支持材料の官能基に直
接結合し得、あるいは結合基を使用して直接結合し得る
。そのような結合基の例は、二重作用的試薬であろう。
本発明の抗血栓性材料は、無水または水性結合反応を使
用して適当な支持材料の官能基にヒルジン又はヒルジン
誘導体を直接結合することにより製造される。また、抗
血栓性材料は、まず支持材料またはヒルジンもしくはヒ
ルジン誘導体の何れかに結合基を付加し、次いでヒルジ
ンもしくはヒルジン誘導体または支持材料に結合基を通
じて修飾された材料または蛋白質を結合することによっ
ても製造され得る。ヒルジンもしくはヒルジン誘導体の
活性部位は、得られる材料の活性の減少を防止するよう
に結合反応の間保護される。加えて、支持材料の官能基
、またはヒルジンもしくはヒルジン誘導体のアミノ酸の
官能基は、結合反応の効率もしくは選択性を高めるよう
に修飾され得る。
用して適当な支持材料の官能基にヒルジン又はヒルジン
誘導体を直接結合することにより製造される。また、抗
血栓性材料は、まず支持材料またはヒルジンもしくはヒ
ルジン誘導体の何れかに結合基を付加し、次いでヒルジ
ンもしくはヒルジン誘導体または支持材料に結合基を通
じて修飾された材料または蛋白質を結合することによっ
ても製造され得る。ヒルジンもしくはヒルジン誘導体の
活性部位は、得られる材料の活性の減少を防止するよう
に結合反応の間保護される。加えて、支持材料の官能基
、またはヒルジンもしくはヒルジン誘導体のアミノ酸の
官能基は、結合反応の効率もしくは選択性を高めるよう
に修飾され得る。
本明細書の目的に対して、生物学的活性は、抗凝血活性
を意味するように定義されるであろう。
を意味するように定義されるであろう。
抗凝血活性は、トロンビンが触媒するフィブリンの凝固
形成を阻害する能力、トロンビンの結合によるトロンビ
ンのアミトール活性、または両方を含み得るが、それに
限定されない。ヒルジンと同じ生物学的活性を実質的に
有する抗血栓性材料は、非結合性の天然ヒルジンの抗凝
血活性の少なくとも約１０％を示す何らかの材料を意味
する。
形成を阻害する能力、トロンビンの結合によるトロンビ
ンのアミトール活性、または両方を含み得るが、それに
限定されない。ヒルジンと同じ生物学的活性を実質的に
有する抗血栓性材料は、非結合性の天然ヒルジンの抗凝
血活性の少なくとも約１０％を示す何らかの材料を意味
する。
この論文は、ヒルジンおよび本発明で得られる材料の抗
凝血活性の言葉で主として言い表されるが、ヒルジンは
、抗炎症的、抗生物質的、排尿促進的性質も同様に有す
るように知見されていることが理解されるべきである。
凝血活性の言葉で主として言い表されるが、ヒルジンは
、抗炎症的、抗生物質的、排尿促進的性質も同様に有す
るように知見されていることが理解されるべきである。
また、本発明の抗血栓性材料は、抗炎症的、抗生物質的
でもあり得、排尿促進的性質も有し得、それゆえ、その
ような性質を通常利用する生体適合性材料としての利用
もまた可能である。
でもあり得、排尿促進的性質も有し得、それゆえ、その
ような性質を通常利用する生体適合性材料としての利用
もまた可能である。
本発明の抗血栓性材料は、ヒルジンもしくはヒルジン誘
導体が、ヒルジンもしくはヒルジン誘導体の生物学的活
性を実質的に保つように共有結合的に付加される表面を
有する支持材料から成る。
導体が、ヒルジンもしくはヒルジン誘導体の生物学的活
性を実質的に保つように共有結合的に付加される表面を
有する支持材料から成る。
支持体として本発明で有用である材料は、医療的な物質
、システムおよび機器の製造および使用に有用な材料を
含む。支持材料は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、
アミノ基、アルデヒド、アミド、および＄１１基のよう
な官能基を含む何れかの材料、またはこのような官能基
を含むように修飾され得る何れかの材料、またはこのよ
うな官能基が付加され得る何れかの材料を含む。このよ
うな材料は、天然に生じる材料、遺伝学的に誘導される
材料、合成的な材料を含む。天然に生じる材料は、組織
、膜、器官および天然に生じる重合体を含み得るが、そ
れらに限定されるものではない。
、システムおよび機器の製造および使用に有用な材料を
含む。支持材料は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、
アミノ基、アルデヒド、アミド、および＄１１基のよう
な官能基を含む何れかの材料、またはこのような官能基
を含むように修飾され得る何れかの材料、またはこのよ
うな官能基が付加され得る何れかの材料を含む。このよ
うな材料は、天然に生じる材料、遺伝学的に誘導される
材料、合成的な材料を含む。天然に生じる材料は、組織
、膜、器官および天然に生じる重合体を含み得るが、そ
れらに限定されるものではない。
遺伝学的に誘導された材料の一例は、ポリ−β−ハイド
ロキシブチレートである。合成的な材料は、重合体およ
び共重合体を含み得るが、それらに限定されるものでは
ない。
ロキシブチレートである。合成的な材料は、重合体およ
び共重合体を含み得るが、それらに限定されるものでは
ない。
天然に生じる重合体、遺伝学的に誘導される重合体、合
成的な重合体は、論理的および適当な組合せで次の中の
１またはそれ以上から誘導される同種の重合体および共
重合体を含むが、それらに限定されない。それらの重合
体は、エチレン、プロピレン、４−メチル−１−ペンテ
ン、テトラフルオロエチレン、へ二トサフルオロブロビ
レン、ヒ゛ニリデン ジフルオリド等のようなｌ−才レ
フィン類；塩化ビニノペ酢酸ビニル、スチレン、無水マ
レイン酸、メチルメタクリレート、スルホン酸ビニル、
アクリロニトリノペ炭酸ビニレン、アクリルアミド等の
ようなビニル単量体類：メチレン、エチレン、プロピレ
ン、テトラメチレン、２．６−シメチルー１．４−フェ
ニレン等のエーテル頚； エチレン−テレフタレート、
ブチレン−テレフタレート、Ｔ−カプロラクトン、β−
ブチロラクトン、エチレン−アジペート、ビスフェノー
ルＡ−テレ／イソフタレート等のようなエステル類；ビ
スフェノールＡ、４．４−ジヒドロキシビフヱニレン等
のような炭酸塩類：ナイロン、蛋白質等のようなアミド
類（尿素、ウレタンを含む）； グルコサミン、グルク
ロン酸、プロテオグリカン、硫酸塩を含む糖類等のよう
な糖類ニジメチル シロキサン、ジフェニル シロキサ
ン、トリフルオロプロピルシロキサン、３−アミノプロ
ピル シロキサン、カルボキシプロピル シロキサン、
ポリエチレンイミノプロピル シロキサン等のようなシ
ロキサン類である。
成的な重合体は、論理的および適当な組合せで次の中の
１またはそれ以上から誘導される同種の重合体および共
重合体を含むが、それらに限定されない。それらの重合
体は、エチレン、プロピレン、４−メチル−１−ペンテ
ン、テトラフルオロエチレン、へ二トサフルオロブロビ
レン、ヒ゛ニリデン ジフルオリド等のようなｌ−才レ
フィン類；塩化ビニノペ酢酸ビニル、スチレン、無水マ
レイン酸、メチルメタクリレート、スルホン酸ビニル、
アクリロニトリノペ炭酸ビニレン、アクリルアミド等の
ようなビニル単量体類：メチレン、エチレン、プロピレ
ン、テトラメチレン、２．６−シメチルー１．４−フェ
ニレン等のエーテル頚； エチレン−テレフタレート、
ブチレン−テレフタレート、Ｔ−カプロラクトン、β−
ブチロラクトン、エチレン−アジペート、ビスフェノー
ルＡ−テレ／イソフタレート等のようなエステル類；ビ
スフェノールＡ、４．４−ジヒドロキシビフヱニレン等
のような炭酸塩類：ナイロン、蛋白質等のようなアミド
類（尿素、ウレタンを含む）； グルコサミン、グルク
ロン酸、プロテオグリカン、硫酸塩を含む糖類等のよう
な糖類ニジメチル シロキサン、ジフェニル シロキサ
ン、トリフルオロプロピルシロキサン、３−アミノプロ
ピル シロキサン、カルボキシプロピル シロキサン、
ポリエチレンイミノプロピル シロキサン等のようなシ
ロキサン類である。
医療的な物質、システム、機器に利用される重合体は、
次記のものを含むが、それらに限定されない。それらの
重合体は、管、カテーテル、血液袋に使用され、可塑剤
（３０〜４０％エチル−ヘキシル フタレート）を混合
したポリ塩化ビニル（ＰＶＣ） ； カテーテルに使用
されるポリエチレン；使い捨て材料及びシリンジに使用
されるポリプロピレン；血液透析に使用される膜、中空
繊維に使用されるポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）；
コンタクトレンズに使用されるポリ（ヒドロキシエチ
ルメタクリレート）、血管プロテーゼ法に使用されるポ
リテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ） 、ポリエチレ
ンテレフタレートおよびポリアミド類；人工心臓および
カテーテルに使用されるポリウレタン；プロテーゼ法、
腹式酸素供給器、カテーテル、成形外科に使用されるポ
リジメチルシロキサン；血液透析膜に使用されるセルロ
ースおよび酢酸セルロースのような多糖類である。
次記のものを含むが、それらに限定されない。それらの
重合体は、管、カテーテル、血液袋に使用され、可塑剤
（３０〜４０％エチル−ヘキシル フタレート）を混合
したポリ塩化ビニル（ＰＶＣ） ； カテーテルに使用
されるポリエチレン；使い捨て材料及びシリンジに使用
されるポリプロピレン；血液透析に使用される膜、中空
繊維に使用されるポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）；
コンタクトレンズに使用されるポリ（ヒドロキシエチ
ルメタクリレート）、血管プロテーゼ法に使用されるポ
リテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ） 、ポリエチレ
ンテレフタレートおよびポリアミド類；人工心臓および
カテーテルに使用されるポリウレタン；プロテーゼ法、
腹式酸素供給器、カテーテル、成形外科に使用されるポ
リジメチルシロキサン；血液透析膜に使用されるセルロ
ースおよび酢酸セルロースのような多糖類である。
本発明に有用な重合体は、微生物分解可能な重合体、部
分的に微生物分解可能な重合体、および微生物分解可能
でない重合体を含み得る。支持材料は、酸化され、次い
でジエチレントリアミン無水五酢酸のような試薬を用い
て官能化される金属をも含むことができる。支持材料と
して利用され得る他の材料は、セラミック、ガラスを含
むがそれらに限定されない。
分的に微生物分解可能な重合体、および微生物分解可能
でない重合体を含み得る。支持材料は、酸化され、次い
でジエチレントリアミン無水五酢酸のような試薬を用い
て官能化される金属をも含むことができる。支持材料と
して利用され得る他の材料は、セラミック、ガラスを含
むがそれらに限定されない。
使用されるべき材料の選択は、通常、製造される医療機
器または物質の機能に主として依存する。
器または物質の機能に主として依存する。
合成重合体が利用される場合、重合体の選択は、ヒルジ
ンの好適な結合部位、結合方法、および重合体の官能基
にも影響される。例えば、水酸基を含む重合体は、ポリ
ビニルアルコール共重合体、ガラス、シリカ、およびポ
リヒドロキシエチレンメタクリレートを含むが、それら
に限定されない。カルボキシル基を含む重合体は、無水
マレイン酸共重合体およびカルボキシメチルセルロース
を含むが、それらに限定されない。アミノ基を含む重合
体は、修飾シリカゲル、ポリ−Ｐ−アミノスチレン、ポ
リエチレンイミン、および直線状で交差結合（ｃｒｏｓ
ｓｌｉｎｋｉｎｇ） Ｌ高度に分岐した重合体を含むが
、それらに限定されない。アルデヒド基を含む重合体は
、グルタルアルデヒドで処理した重合体、および過沃素
酸塩で処理した多糖類を含むが、それらに限定されない
。ＳＨ基を含む重合体は、アセチルメルカプトコハク酸
で修飾した重合体を含むが、それらに限定されない。他
の有用な重合体は、フルオロ重合体、ポリアクリロニト
リル、およびシランのような修飾された重合体を含むが
、それらに限定されない。
ンの好適な結合部位、結合方法、および重合体の官能基
にも影響される。例えば、水酸基を含む重合体は、ポリ
ビニルアルコール共重合体、ガラス、シリカ、およびポ
リヒドロキシエチレンメタクリレートを含むが、それら
に限定されない。カルボキシル基を含む重合体は、無水
マレイン酸共重合体およびカルボキシメチルセルロース
を含むが、それらに限定されない。アミノ基を含む重合
体は、修飾シリカゲル、ポリ−Ｐ−アミノスチレン、ポ
リエチレンイミン、および直線状で交差結合（ｃｒｏｓ
ｓｌｉｎｋｉｎｇ） Ｌ高度に分岐した重合体を含むが
、それらに限定されない。アルデヒド基を含む重合体は
、グルタルアルデヒドで処理した重合体、および過沃素
酸塩で処理した多糖類を含むが、それらに限定されない
。ＳＨ基を含む重合体は、アセチルメルカプトコハク酸
で修飾した重合体を含むが、それらに限定されない。他
の有用な重合体は、フルオロ重合体、ポリアクリロニト
リル、およびシランのような修飾された重合体を含むが
、それらに限定されない。
本発明で使用されるヒルジンは、天然に生じるヒルジン
、合成的に製造したヒルジン、および組み換え技術を利
用して製造されたヒルジンを含む。
、合成的に製造したヒルジン、および組み換え技術を利
用して製造されたヒルジンを含む。
本発明で有用なヒルジン誘導体は、実質的にヒルジンと
同一の抗凝血的生物学的活性を示す何れかの蛋白質また
はポリペプチドを含む。このような誘導体は、安定性を
増加し、抗凝血活性を増加し、トロンビン結合活性を増
加し、または得られる材料の抗凝血性を高めるように化
学修飾されたヒルジン蛋白質を含むことができる。ヒル
ジン誘導体は、ヒルジン分子、および本発明にとって便
利な結合部位を与えるように更に修飾されたような誘導
体をも含み得る。ヒルジンの構造に対するそのような化
学修飾は、好適には、分子の生物学的活性を実質的に減
少させないようになされ、下記に述べるように分子のＮ
−末端領域内またはＣ−末端でなされる。そのような誘
導体は、天然に生ずるヒルジンから誘導され、合成的に
製造され、組み換え技術を使用して製造され、または生
物学的および化学的製造方法の組合せを使用して製造さ
れ得る。
同一の抗凝血的生物学的活性を示す何れかの蛋白質また
はポリペプチドを含む。このような誘導体は、安定性を
増加し、抗凝血活性を増加し、トロンビン結合活性を増
加し、または得られる材料の抗凝血性を高めるように化
学修飾されたヒルジン蛋白質を含むことができる。ヒル
ジン誘導体は、ヒルジン分子、および本発明にとって便
利な結合部位を与えるように更に修飾されたような誘導
体をも含み得る。ヒルジンの構造に対するそのような化
学修飾は、好適には、分子の生物学的活性を実質的に減
少させないようになされ、下記に述べるように分子のＮ
−末端領域内またはＣ−末端でなされる。そのような誘
導体は、天然に生ずるヒルジンから誘導され、合成的に
製造され、組み換え技術を使用して製造され、または生
物学的および化学的製造方法の組合せを使用して製造さ
れ得る。
本発明では、ヒルジンまたはヒルジン誘導体は、ヒルジ
ンの生物学的活性が実質的に減少しない方法で材料の表
面に共有結合的に付加される。
ンの生物学的活性が実質的に減少しない方法で材料の表
面に共有結合的に付加される。
天然ヒルジンは、６５のアミノ酸を含み、次のアミノ酸
連鎖を有する蛋白質である。
連鎖を有する蛋白質である。
１２３４５６７８９１Ｏ
Ｎｌ１２−Ｖａｔ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−八５ｐ−
Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｇｌｙｌｌ １２
１３ １４ １５ １６ １７ １８ １９ ２０Ｇ
ｉｎ−八５ｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｔ−八５ｎ−２１２２２３２４２５２
６２７２ｇ ２９ ３０ ３１Ｖａ ｌ −Ｃｙｓ−
Ｇ Ｉ ｙ−Ｇ Ｉ ｎ−Ｇ １ ｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ
−Ｃｙｓ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇ １ ｙ−Ｓｅｒ−Ａｓ
ｐ−Ｇ １ｙ−Ｇ ｌ ｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇ Ｉ
ｎ−Ｃｙｓ−Ｖａ ｌ−Ｔｈ ｒ −Ｇ １ｙ− Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ
−３ｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇ Ｉ ｙ−Ａｓ
ｐ−Ｐｈｅ−Ｇ １ｕ−Ｇ Ｉ ｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ
−Ｇ ］ ｕ−Ｇ １ｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃ
ＯＯＨ 蛭から抽出された天然ヒルジンは、６３位のチロシン残
基に付加された硫酸塩基を有する。ヒルジンの構造研究
で、３つの主たる作用領域があることが知見されている
。第１の領域は、４０位のアミノ酸からＣ−末端までの
付近の高度に陰イオン性の領域であり、ヒルジンとトロ
ンビン間のイオン相互作用を許容する分子の本質的部分
である。第２の領域は、６〜４０位のアミノ酸残基を含
む分子の高度に交差結合した領域であり、トロンビンに
対するヒルジンの増加した結合親和力の一因となるもの
と信じられる。第３の領域は、Ｎ−末端の５つのアミノ
酸であり、ヒルジンの生物学的活性にとって重要でない
かもしれない。これは、ヒルジンの材料に対する結合の
ための好適な領域である。
Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｇｌｙｌｌ １２
１３ １４ １５ １６ １７ １８ １９ ２０Ｇ
ｉｎ−八５ｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｔ−八５ｎ−２１２２２３２４２５２
６２７２ｇ ２９ ３０ ３１Ｖａ ｌ −Ｃｙｓ−
Ｇ Ｉ ｙ−Ｇ Ｉ ｎ−Ｇ １ ｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ
−Ｃｙｓ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇ １ ｙ−Ｓｅｒ−Ａｓ
ｐ−Ｇ １ｙ−Ｇ ｌ ｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇ Ｉ
ｎ−Ｃｙｓ−Ｖａ ｌ−Ｔｈ ｒ −Ｇ １ｙ− Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ
−３ｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇ Ｉ ｙ−Ａｓ
ｐ−Ｐｈｅ−Ｇ １ｕ−Ｇ Ｉ ｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ
−Ｇ ］ ｕ−Ｇ １ｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃ
ＯＯＨ 蛭から抽出された天然ヒルジンは、６３位のチロシン残
基に付加された硫酸塩基を有する。ヒルジンの構造研究
で、３つの主たる作用領域があることが知見されている
。第１の領域は、４０位のアミノ酸からＣ−末端までの
付近の高度に陰イオン性の領域であり、ヒルジンとトロ
ンビン間のイオン相互作用を許容する分子の本質的部分
である。第２の領域は、６〜４０位のアミノ酸残基を含
む分子の高度に交差結合した領域であり、トロンビンに
対するヒルジンの増加した結合親和力の一因となるもの
と信じられる。第３の領域は、Ｎ−末端の５つのアミノ
酸であり、ヒルジンの生物学的活性にとって重要でない
かもしれない。これは、ヒルジンの材料に対する結合の
ための好適な領域である。
ヒルジン誘導体の類似の領域は、好適な結合領域を与え
る。
る。
材料に蛋白質を結合するのに使用される最も一般的なア
ミノ酸は、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基
、およびＳＨ基を含む。カルボキシル基結合は、本発明
では比較的好適ではないであろう。なぜなら、Ｃ−末端
領域が、ヒルジン分子の活性部位と関連しているからで
ある。アミノ基は、Ｎ−末端バリンおよび２７．３６．
４７位の３つのリジンに存在する。４７位のリジンは、
主たる活性中心であると報告されている。幾つかの結合
反応では、リジン残基は結合の間保護されることが好ま
しい。
ミノ酸は、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基
、およびＳＨ基を含む。カルボキシル基結合は、本発明
では比較的好適ではないであろう。なぜなら、Ｃ−末端
領域が、ヒルジン分子の活性部位と関連しているからで
ある。アミノ基は、Ｎ−末端バリンおよび２７．３６．
４７位の３つのリジンに存在する。４７位のリジンは、
主たる活性中心であると報告されている。幾つかの結合
反応では、リジン残基は結合の間保護されることが好ま
しい。
ヒルジンの好適な結合部位は、Ｎ−末端バリンである。
５１位のヒスチジン残基及び３．６３位のチロシンは、
可能性のある結合部位でもある。ヒスチジンの使用は、
活性中心のリジンに近接しているため、比較的好適では
ない。４つのセリンおよび４つのトレオニンにおける８
つのヒドロキシル基は、官能基への結合にも利用される
。これらの８つのアミノ酸は分子中に散在しているため
、そのような結合では、結合の特異性および生物学的活
性の大きな変化が少ない。
可能性のある結合部位でもある。ヒスチジンの使用は、
活性中心のリジンに近接しているため、比較的好適では
ない。４つのセリンおよび４つのトレオニンにおける８
つのヒドロキシル基は、官能基への結合にも利用される
。これらの８つのアミノ酸は分子中に散在しているため
、そのような結合では、結合の特異性および生物学的活
性の大きな変化が少ない。
上述したように、分子の生物学的活性を傷つけずに結合
部位を与えるヒルジン誘導体が調製される。例えば、も
しＮ−末端付近のジスルフィド結合の変化が実質的に活
性に影響を及ぼさなければ、システィン残基は、修飾さ
れ材料に結合しえる。
部位を与えるヒルジン誘導体が調製される。例えば、も
しＮ−末端付近のジスルフィド結合の変化が実質的に活
性に影響を及ぼさなければ、システィン残基は、修飾さ
れ材料に結合しえる。
ヒルジンまたはヒルジン誘導体は、支持材料の官能基に
直接か、または結合基により結合し得る。
直接か、または結合基により結合し得る。
そのような結合基は、例えば、二重作用的な試薬のよう
な化学的基、ポリ−リジン、蛋白質および蛋白質切片の
ようなポリペプチド、ならびに支持材料およびヒルジン
またはヒルジン誘導体に共有結合する他の分子を含む。
な化学的基、ポリ−リジン、蛋白質および蛋白質切片の
ようなポリペプチド、ならびに支持材料およびヒルジン
またはヒルジン誘導体に共有結合する他の分子を含む。
本発明の抗血栓性材料を製造する方法は、通常、支持材
料の活性な官能基に対してアミノ酸残基の官能基により
ヒルジンまたはヒルジン誘導体を結合することから構成
される。結合の方法は、支持材料の有用な官能基、蛋白
質の結合部位、得られる材料の生物学的活性、および結
合反応の選択性と効率を含む幾つかの要因に依存する。
料の活性な官能基に対してアミノ酸残基の官能基により
ヒルジンまたはヒルジン誘導体を結合することから構成
される。結合の方法は、支持材料の有用な官能基、蛋白
質の結合部位、得られる材料の生物学的活性、および結
合反応の選択性と効率を含む幾つかの要因に依存する。
例えば、もし蛋白質の結合部位、即ちアミノ酸残基が、
蛋白質の活性部位、即ちトロンビン結合領域にきわめて
接近し、支持材料が適当な活性官能基を含むならば、蛋
白質は、当業者に知られた反応を利用して支持材料に直
接結合し得るかもしれない。そのような結合の例は、官
能基としてＮ−スクシンイミドエステルを含む寒天ゲル
に対するＮ−末端残基のアミノ基の結合である。結合反
応は、無水または水性の条件の下でなされ得る。
蛋白質の活性部位、即ちトロンビン結合領域にきわめて
接近し、支持材料が適当な活性官能基を含むならば、蛋
白質は、当業者に知られた反応を利用して支持材料に直
接結合し得るかもしれない。そのような結合の例は、官
能基としてＮ−スクシンイミドエステルを含む寒天ゲル
に対するＮ−末端残基のアミノ基の結合である。結合反
応は、無水または水性の条件の下でなされ得る。
選択的に、蛋白質は、結合基により支持材料に結合され
得る。本発明で使用できる結合基の例は、二重作用的な
蛋白質交差結合試薬のような二重作用的な試薬、ポリペ
プチド、蛋白質、蛋白質切片、およびポリエチレンイミ
ンまたは樹枝状重合体のような多機能重合体。結合基の
選択は、結合部位、支持材料の官能基、得られる材料の
生物学的活性、および結合反応の選択性と効率に依存し
得る。例えば、チロシンのフェノール基は、活性なアミ
ン基を有する支持材料との結合のためのＳＨ基を付加す
るために、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジ
チオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のような二重作用的
な試薬を使用して修飾することができる。５ＰＤＰに加
えて、アセチルメルカプト無水コハク酸が、アミノ基を
含む表面にＳ）ＩＭを導入するために使用され得る（Ｋ
ｌｏｔｚ Ｉ、Ｍ、、 ５ｔｒｙｋｅｒ Ｖ、ｔｌ、、
日ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、 第
１巻。
得る。本発明で使用できる結合基の例は、二重作用的な
蛋白質交差結合試薬のような二重作用的な試薬、ポリペ
プチド、蛋白質、蛋白質切片、およびポリエチレンイミ
ンまたは樹枝状重合体のような多機能重合体。結合基の
選択は、結合部位、支持材料の官能基、得られる材料の
生物学的活性、および結合反応の選択性と効率に依存し
得る。例えば、チロシンのフェノール基は、活性なアミ
ン基を有する支持材料との結合のためのＳＨ基を付加す
るために、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジ
チオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のような二重作用的
な試薬を使用して修飾することができる。５ＰＤＰに加
えて、アセチルメルカプト無水コハク酸が、アミノ基を
含む表面にＳ）ＩＭを導入するために使用され得る（Ｋ
ｌｏｔｚ Ｉ、Ｍ、、 ５ｔｒｙｋｅｒ Ｖ、ｔｌ、、
日ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、 第
１巻。
１１９〜１２３頁、 １９５９年）。
ヒルジンと支持材料の結合は、様々な二重作用的な蛋白
質交差結合試薬を使用してなされ得る。
質交差結合試薬を使用してなされ得る。
そのような試薬の例は、ＳＦ’ＤＰ、ジメチルアジピミ
デートおよびジメチルスベリミデートのようなイミドエ
ステルの二重作用的な誘導体、スペリン酸ジスクシニミ
ジルのような活性エステル頚、グルタルアルデヒドおよ
びグリコールアルデヒドのようなアルデヒド類、ビス−
（Ｐ−アジドベンゾイル）−ヘキサンジアミンのような
ビス−アジド化合物、ビス−（Ｐ−ジアゾニウムベンゾ
イル）−エチレンジアミンのようなビス−ジアゾニウム
誘導体、トリレン−２，６−ジイソシアネートおよびト
リレン−２，４ジイソシアネートのようなジイソシアネ
ート類、ならびに、１．５−フルオロ−２，４−ジニト
ロベンゼンのようなビスー活性フルオリン化合物および
エチレングリコール／ビス−［スクシンイミジルスクシ
ネート］、ｍ−マレイミド ベンゾイル スルファスク
シンイミド、ジエチレン トリアミン 無水五酢酸のよ
うな他の試薬を含む。
デートおよびジメチルスベリミデートのようなイミドエ
ステルの二重作用的な誘導体、スペリン酸ジスクシニミ
ジルのような活性エステル頚、グルタルアルデヒドおよ
びグリコールアルデヒドのようなアルデヒド類、ビス−
（Ｐ−アジドベンゾイル）−ヘキサンジアミンのような
ビス−アジド化合物、ビス−（Ｐ−ジアゾニウムベンゾ
イル）−エチレンジアミンのようなビス−ジアゾニウム
誘導体、トリレン−２，６−ジイソシアネートおよびト
リレン−２，４ジイソシアネートのようなジイソシアネ
ート類、ならびに、１．５−フルオロ−２，４−ジニト
ロベンゼンのようなビスー活性フルオリン化合物および
エチレングリコール／ビス−［スクシンイミジルスクシ
ネート］、ｍ−マレイミド ベンゾイル スルファスク
シンイミド、ジエチレン トリアミン 無水五酢酸のよ
うな他の試薬を含む。
蛋白質の生物学的活性が、Ｃ−末端残基での結合または
支持材料にたいする蛋白質の付着のような立体障害のた
めに直接結合により極めて減少する場合、支持材料から
蛋白質を隔てるように機能する結合基を使用することが
望ましい。そのような結合基の例は、ポリペプチド、蛋
白質および多機能性重合体を含むが、それらに限定され
ない。そのような結合基は、結合効率を増加させるため
にヒルジンまたはヒルジン誘導体の付加のだめの多数の
部位を提供することも可能である。
支持材料にたいする蛋白質の付着のような立体障害のた
めに直接結合により極めて減少する場合、支持材料から
蛋白質を隔てるように機能する結合基を使用することが
望ましい。そのような結合基の例は、ポリペプチド、蛋
白質および多機能性重合体を含むが、それらに限定され
ない。そのような結合基は、結合効率を増加させるため
にヒルジンまたはヒルジン誘導体の付加のだめの多数の
部位を提供することも可能である。
結合工程の間、・該領域のアミノ酸残基の活性な官能基
を保護することにより、蛋白質の活性領域、即ちトロン
ビン結合領域を保護することも可能である。例えば、４
７位のりジン残基がヒルジンの生物学的活性を伴う可能
性が提案される。それゆえ、この残基は、ｐＨを調製す
ることによりアミノ基に陽子を付加するか、無水シトラ
コン酸、３．４．５．６テトラヒドロ無水フタル酸、も
しくは当業者に知られた他の試薬のような試薬で逆にア
ミノ基をブロック（封鎖）することの何れかにより保護
し得る。
を保護することにより、蛋白質の活性領域、即ちトロン
ビン結合領域を保護することも可能である。例えば、４
７位のりジン残基がヒルジンの生物学的活性を伴う可能
性が提案される。それゆえ、この残基は、ｐＨを調製す
ることによりアミノ基に陽子を付加するか、無水シトラ
コン酸、３．４．５．６テトラヒドロ無水フタル酸、も
しくは当業者に知られた他の試薬のような試薬で逆にア
ミノ基をブロック（封鎖）することの何れかにより保護
し得る。
［例１］
天然ヒルジン（約７（１６） ＡＴＬＩ／ ｍｇ、 英
国Ｂｉｏｐｈａｒｍ社）が、８〜１０ ｍｇ／ ｍｅ
（約６（１６）０ ＡＴ［Ｉ／ｄ ）を含む溶液を形
成するようにＩＩ Ｅ Ｐ Ｅ Ｓ緩衝液（Ｎ−２−ヒ
ドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エクンースルホ
ン酸、 ０．１Ｍ、 ｐｌ＋ ７゜２）に溶解された。
国Ｂｉｏｐｈａｒｍ社）が、８〜１０ ｍｇ／ ｍｅ
（約６（１６）０ ＡＴ［Ｉ／ｄ ）を含む溶液を形
成するようにＩＩ Ｅ Ｐ Ｅ Ｓ緩衝液（Ｎ−２−ヒ
ドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エクンースルホ
ン酸、 ０．１Ｍ、 ｐｌ＋ ７゜２）に溶解された。
ヒルジン溶液は使用するまで４℃に保たれた。
誘導、交差結合された寒天ゲルビーズ支持体（Ａｆｆｉ
−Ｇｅｌ １５． Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に対するヒルジ
ンの水性結合は、所望量の寒天ゲルスラリー（約２ｍｇ
）を小さな焼結ガラス漏斗を通すことにより行われた。
−Ｇｅｌ １５． Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に対するヒルジ
ンの水性結合は、所望量の寒天ゲルスラリー（約２ｍｇ
）を小さな焼結ガラス漏斗を通すことにより行われた。
過剰の上澄み液は除去され、ゲルは３倍量の冷たい（４
℃）脱イオン水で洗浄された。湿潤ゲル０．５ｍｌ！が
、約０．４艷ゲル対１−ヒルジン溶液の比、即ちゲル１
−当たり約２０−２５ ｍｇヒルジンの冷ヒルジン溶液
１ｍｊ！を含む試験管内に移された。
℃）脱イオン水で洗浄された。湿潤ゲル０．５ｍｌ！が
、約０．４艷ゲル対１−ヒルジン溶液の比、即ちゲル１
−当たり約２０−２５ ｍｇヒルジンの冷ヒルジン溶液
１ｍｊ！を含む試験管内に移された。
このゲル−ヒルジン混合物は、４℃で静かに攪拌し一晩
培養された。培養後、ゲル−ヒルジン錯体は、５分間６
（１６）０回転での遠心分離により採取された。ゲル−
ヒルジン錯体は、１０倍量のｐｌ＋７．０±０、ｌＯ，
１Ｍ燐酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄された。
培養された。培養後、ゲル−ヒルジン錯体は、５分間６
（１６）０回転での遠心分離により採取された。ゲル−
ヒルジン錯体は、１０倍量のｐｌ＋７．０±０、ｌＯ，
１Ｍ燐酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄された。
残存する活性なエステルは、ｐＨ７，８、ＩＭのグリシ
ンエチルエステルで処理することによりブロックされた
。室温での１時間培養の後、過剰のグリシンエチルエス
テルは除去され、ゲルは１０倍量のＰＢＳで３回洗浄さ
れた。最後に、ゲルは５０％Ｗ／Ｖの懸濁液としてＰ［
ｌＳ中に再懸濁され、生物学的アッセイに供されるまで
４℃で貯蔵された。
ンエチルエステルで処理することによりブロックされた
。室温での１時間培養の後、過剰のグリシンエチルエス
テルは除去され、ゲルは１０倍量のＰＢＳで３回洗浄さ
れた。最後に、ゲルは５０％Ｗ／Ｖの懸濁液としてＰ［
ｌＳ中に再懸濁され、生物学的アッセイに供されるまで
４℃で貯蔵された。
［例２コ
無水結合は、１ｄヒルジン溶液対約０．５ｍｉ！ゲルの
比で、ＤＪ、１ＳＯ（ジメチルスルフォキサイド）中の
例１のヒルジン溶液（８−１０ｍｇ／ ｍｌ）の所望量
を、寒天ゲルＡｆｆｉ −Ｇｅｌ １５に混合すること
により行われた。ゲル−ヒルジン混合物は、静かに攪拌
し４℃で４時間培養された。反応完了後、過剰のヒルジ
ンは除去され、残存する活性なエステルは例１で述べら
れたようにグリシンエチルエステルによりブロックされ
た。最後に、ゲルは洗浄され、５０％ＩＩＩ／Ｖの懸濁
液としてＰＢＳ中に再懸濁され、４℃で貯蔵された。
比で、ＤＪ、１ＳＯ（ジメチルスルフォキサイド）中の
例１のヒルジン溶液（８−１０ｍｇ／ ｍｌ）の所望量
を、寒天ゲルＡｆｆｉ −Ｇｅｌ １５に混合すること
により行われた。ゲル−ヒルジン混合物は、静かに攪拌
し４℃で４時間培養された。反応完了後、過剰のヒルジ
ンは除去され、残存する活性なエステルは例１で述べら
れたようにグリシンエチルエステルによりブロックされ
た。最後に、ゲルは洗浄され、５０％ＩＩＩ／Ｖの懸濁
液としてＰＢＳ中に再懸濁され、４℃で貯蔵された。
［例３コ
チロシンのフェノール基によりアミノ基を含む表面にヒ
ルジンを固定化するために、ヒルジンは３段階の手順で
二重作用する試薬を使用してポリマーに結合された。
ルジンを固定化するために、ヒルジンは３段階の手順で
二重作用する試薬を使用してポリマーに結合された。
第一に、ＳＨ基が、アミノ基を含むポリスチレン表面に
導入された。アミツバは、異なる二重作用の試薬５ＰＤ
Ｐを使用して化学修飾された。二硫化２−ピリジル構造
が該試薬のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとポ
リマーのアミ７基の反応によりポリスチレンのアミノ基
に導入された。特に、ポリスチレン−ＮＨ２微粒子（ｌ
ｒｎ！、５％ｗ／ｖ）は、Ｐｌｕｓ テ洗浄され、５０
％Ｗ／Ｖの懸濁液としてＰＢＳ中に再懸濁された。ＳＰ
ＤＰ（８ｍｇ／ ｍｌ）ＯＪ−が、ｇ濁液に加えられた
。該混合物は、室温で２時間培養された。
導入された。アミツバは、異なる二重作用の試薬５ＰＤ
Ｐを使用して化学修飾された。二硫化２−ピリジル構造
が該試薬のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとポ
リマーのアミ７基の反応によりポリスチレンのアミノ基
に導入された。特に、ポリスチレン−ＮＨ２微粒子（ｌ
ｒｎ！、５％ｗ／ｖ）は、Ｐｌｕｓ テ洗浄され、５０
％Ｗ／Ｖの懸濁液としてＰＢＳ中に再懸濁された。ＳＰ
ＤＰ（８ｍｇ／ ｍｌ）ＯＪ−が、ｇ濁液に加えられた
。該混合物は、室温で２時間培養された。
反応は、３０分間３（１６）０回転の遠心分離により粒
子を採集することにより終了し、引き続き、２０％エタ
ノールで２回、ｐＨ５，０，０，１Ｍ酢酸塩緩衝液で１
回線粒子を洗浄した。化学修飾された粒子は、５％ｗ／
ｖ溶液として酢酸塩緩衝液中に再懸濁された。
子を採集することにより終了し、引き続き、２０％エタ
ノールで２回、ｐＨ５，０，０，１Ｍ酢酸塩緩衝液で１
回線粒子を洗浄した。化学修飾された粒子は、５％ｗ／
ｖ溶液として酢酸塩緩衝液中に再懸濁された。
反応完了後、ポリスチレンー二硫化ピリジル構造は、５
ＱｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ） （Ｃａｒｌｓｏ
ｎ Ｊｌ等、バイオケミカル・ジャーナル１７３巻、７
２３−７３７頁（１９７８））で還元された。
ＱｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ） （Ｃａｒｌｓｏ
ｎ Ｊｌ等、バイオケミカル・ジャーナル１７３巻、７
２３−７３７頁（１９７８））で還元された。
第２の段階では、ヒルジンは、チロシンのフェノール環
にマレイミド基を導入するために、Ｎ−（４−ジアゾベ
ンゾイル）−Ｎ’−（３−マレイミドプロピオニル）−
ヒドラジン−テトラフルオロボレート（［］！、ｌ１ｌ
Ｔ）を使用して化学修飾された。この化学修飾は、第１
段階で調整されたＳｌｌ基をもつポリスチレンへのヒル
ジンの結合を許容した。この結合は、Ｄｕｎｃａｎ等の
方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ
ａｌＭｅｔｈｏｄ、 ８０巻、１３７−１４０頁（１９
８５年））により達成された。要約すれば、ＤＭＨＴは
ＤＭＳＯ中に溶解された。
にマレイミド基を導入するために、Ｎ−（４−ジアゾベ
ンゾイル）−Ｎ’−（３−マレイミドプロピオニル）−
ヒドラジン−テトラフルオロボレート（［］！、ｌ１ｌ
Ｔ）を使用して化学修飾された。この化学修飾は、第１
段階で調整されたＳｌｌ基をもつポリスチレンへのヒル
ジンの結合を許容した。この結合は、Ｄｕｎｃａｎ等の
方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ
ａｌＭｅｔｈｏｄ、 ８０巻、１３７−１４０頁（１９
８５年））により達成された。要約すれば、ＤＭＨＴは
ＤＭＳＯ中に溶解された。
得られた［］ＭｌｌＴ溶液（３０ｍｇ／ ｍＡ’）は、
次いで、ヒルジン溶液１ｍｌ！当たり［１ＭＨＴ １０
μＡの比で、４℃、ｐｔｌ？、 ８．５０ｍＭの燐酸
塩緩衝液１ ｍｌ、当たりヒルジン８−１０ｍｇの溶液
に加えられた。４℃、１時間の培養後、化学修飾された
ヒルジンは、ゲル濾過、即ちｐＨ６、５，燐酸塩緩衝液
５０ ｍ ！Ａで平衡化されたセファデックス（Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘ） Ｇ−２５により、反応混合物から分離さ
れた。化学修飾されたヒルジンを含む分画は、プールさ
れ、凍結乾燥により濃縮された。
次いで、ヒルジン溶液１ｍｌ！当たり［１ＭＨＴ １０
μＡの比で、４℃、ｐｔｌ？、 ８．５０ｍＭの燐酸
塩緩衝液１ ｍｌ、当たりヒルジン８−１０ｍｇの溶液
に加えられた。４℃、１時間の培養後、化学修飾された
ヒルジンは、ゲル濾過、即ちｐＨ６、５，燐酸塩緩衝液
５０ ｍ ！Ａで平衡化されたセファデックス（Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘ） Ｇ−２５により、反応混合物から分離さ
れた。化学修飾されたヒルジンを含む分画は、プールさ
れ、凍結乾燥により濃縮された。
最後の段階では、化学修飾されたヒルジンは、Ｓｌｌ基
を含むポリスチレン表面に結合された。凍結乾燥された
ヒルジン３ ｍｇは、脱イオン水０．５ｍＥで再生され
た。燐酸塩緩衝液（０，５〜１．Ｏｍｅ）中のＤＩＡｌ
ｌ’ｌ’修飾されたヒルジンとポリスチレン−３１１ビ
ーズ（０，１〜０．２ ｍ、 ５％ｌ！ｌ／Ｖ）を含む
混合物は、−晩室温で静かに攪拌された。洗浄後、ヒル
ジンがコートされたポリスチレンは、Ｉ ＸＷ／Ｖ懸濁
液として燐酸緩衝液（５ＱｍＭ、 ｐＨ７，８）中で貯
蔵された。
を含むポリスチレン表面に結合された。凍結乾燥された
ヒルジン３ ｍｇは、脱イオン水０．５ｍＥで再生され
た。燐酸塩緩衝液（０，５〜１．Ｏｍｅ）中のＤＩＡｌ
ｌ’ｌ’修飾されたヒルジンとポリスチレン−３１１ビ
ーズ（０，１〜０．２ ｍ、 ５％ｌ！ｌ／Ｖ）を含む
混合物は、−晩室温で静かに攪拌された。洗浄後、ヒル
ジンがコートされたポリスチレンは、Ｉ ＸＷ／Ｖ懸濁
液として燐酸緩衝液（５ＱｍＭ、 ｐＨ７，８）中で貯
蔵された。
［例４］
ヒルジンは、サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメ
チル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭ
ＣＣ）という試薬により、Ｓｌｌ基を含むポリマーに、
該アミノ基を通じて固定化された。ｐＨ７，２，Ｏ，１
ＭＨＥＰＥＳ １ ｒｎ１当たりヒルジン１ ｍｇのヒ
ルジン溶液を、室温で１時間、ヒルジン対ＳＭＣＣが１
対１０のモル比で、ＳλＩｃｃ（１Ｍｇ／ＤＭＳＯ１ｍ
ｆ） と反応させた。ＳλＩＣＣの残存する活性部位
は、ｐＨ７，８のグリシンエチルエステル０．１Ｍで処
理してブロックされた。ヒルジンに結合していない５ｈ
ＩＣ口は、ゲル濾過（Ｈ８ＰＥ５緩衝液で平衡化された
セファデックスＧ−２５）により除去され、化学修飾さ
れたヒルジンは、０．５ｍｌ中約８（１６）．＾−゛Ｕ
に濃縮された。ＳＭＣＣ活性化ヒルジン０．５ｎＩ２は
、Ｓ１１末端の交差結合した寒天ゲル、ＡｆｆｉＧｅｌ
４（１１５ｕｌｆｈｙｄｒｙｌ Ｇｅｌ、０．３ｍｌ
のマトリックスに固定化された。この結合反応は、４℃
で一晩１１８ＰＩＥｓ緩衝液中で行われた。該試薬は、
例３で既に述べたように、緩衝液で３回洗浄することに
より除去された。
チル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭ
ＣＣ）という試薬により、Ｓｌｌ基を含むポリマーに、
該アミノ基を通じて固定化された。ｐＨ７，２，Ｏ，１
ＭＨＥＰＥＳ １ ｒｎ１当たりヒルジン１ ｍｇのヒ
ルジン溶液を、室温で１時間、ヒルジン対ＳＭＣＣが１
対１０のモル比で、ＳλＩｃｃ（１Ｍｇ／ＤＭＳＯ１ｍ
ｆ） と反応させた。ＳλＩＣＣの残存する活性部位
は、ｐＨ７，８のグリシンエチルエステル０．１Ｍで処
理してブロックされた。ヒルジンに結合していない５ｈ
ＩＣ口は、ゲル濾過（Ｈ８ＰＥ５緩衝液で平衡化された
セファデックスＧ−２５）により除去され、化学修飾さ
れたヒルジンは、０．５ｍｌ中約８（１６）．＾−゛Ｕ
に濃縮された。ＳＭＣＣ活性化ヒルジン０．５ｎＩ２は
、Ｓ１１末端の交差結合した寒天ゲル、ＡｆｆｉＧｅｌ
４（１１５ｕｌｆｈｙｄｒｙｌ Ｇｅｌ、０．３ｍｌ
のマトリックスに固定化された。この結合反応は、４℃
で一晩１１８ＰＩＥｓ緩衝液中で行われた。該試薬は、
例３で既に述べたように、緩衝液で３回洗浄することに
より除去された。
例工から例４で調製した４つの物質は、共有結合したヒ
ルジンの生物学的活性試験により、抗血栓性を試験され
た。
ルジンの生物学的活性試験により、抗血栓性を試験され
た。
表面結合したヒルジンによるトロンビンのアミトール活
性阻害性が、発色アッセイにより測定された。このアッ
セイでは、ヒルジンがコートされた種々の量の粒子が、
所定量のヒトα−トロンビン（Ｉ Ｎ１１ｌ単位） と
反応することを許容された。残余のトロンビンは、発色
反応における合成ペプチド基質を結合する能力により定
量される。逆に、ヒルジンがコートされた粒子の量は、
この反応で生成した強度に相関される。
性阻害性が、発色アッセイにより測定された。このアッ
セイでは、ヒルジンがコートされた種々の量の粒子が、
所定量のヒトα−トロンビン（Ｉ Ｎ１１ｌ単位） と
反応することを許容された。残余のトロンビンは、発色
反応における合成ペプチド基質を結合する能力により定
量される。逆に、ヒルジンがコートされた粒子の量は、
この反応で生成した強度に相関される。
表面結合ヒルジンの生物学的活性を決定するために、ヒ
ルジンがコートされた種々の量の粒子（２〜５０μｍ〉
が、９６ウエル（ｗｅｌｌ）のミクロ滴定プレートのウ
ェル中に置かれた。ウェルは、５０ｍＭ ト！Ｊｘ （
７ｒｉｓ）、１５μｌＭ Ｎａ［’ｌ 、 ０．（１１
％ヒト血清アルブミンを含む緩衝液で５０μｌに満たさ
れた。ヒルジンがコートされた粒子は、室温で１時間、
ヒトα−トロンビン（２ＮＩＨ単位）５０μβで培養さ
れた。
ルジンがコートされた種々の量の粒子（２〜５０μｍ〉
が、９６ウエル（ｗｅｌｌ）のミクロ滴定プレートのウ
ェル中に置かれた。ウェルは、５０ｍＭ ト！Ｊｘ （
７ｒｉｓ）、１５μｌＭ Ｎａ［’ｌ 、 ０．（１１
％ヒト血清アルブミンを含む緩衝液で５０μｌに満たさ
れた。ヒルジンがコートされた粒子は、室温で１時間、
ヒトα−トロンビン（２ＮＩＨ単位）５０μβで培養さ
れた。
−連のヒトα−トロンビン標準（０〜２ＮＩＨ単位／−
）が、コントロールとしてアッセイに含まれた。
）が、コントロールとしてアッセイに含まれた。
過剰のトロンビンは、発色基質（１〜２＋ｎＭ／水Ｉｆ
）２５μ矛を加えることにより測定された。該反応は、
室温（あるいは３７℃）で１０分間行われた。該反応は
、氷酢酸２５μｌを加えることにより停止された。
）２５μ矛を加えることにより測定された。該反応は、
室温（あるいは３７℃）で１０分間行われた。該反応は
、氷酢酸２５μｌを加えることにより停止された。
各ウェルの上澄み液が採集され、色強度が０、０．４０
５ ｎｍで測定された。各試料の残余のトロンビン活性
は、標準曲線から計算された。
５ ｎｍで測定された。各試料の残余のトロンビン活性
は、標準曲線から計算された。
表面結合ヒルジンによるトロンビン誘導のフィブリノゲ
ン血液凝固活性の阻害性は、トロンビン血液凝固時間に
より評価された。トロンビン血液凝固時間は、トロンビ
ンによるフィブリノゲンのフィブリンへの直接変換を測
定する。ヒト標準化通常血漿（［］ａｘｔｅｒ １Ｉｅ
ａｌｔｌ＋ｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｄａ
ｃｌｃ部門）０，１ｒｎ１．が、５０ｍＭ ）リス、１
５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８，０）を含む緩衝液０．１
５ｍ１で、２分間３７℃まで予め加温された。２分間の
培養後、ヒトα−トロンビン（１２ＮＩＨ単位／ ｍｆ
ｆ）５０ μｉが加えられ、血液凝固時間が、フィブロ
メーク（ｆ ｉｂｒｏｍｅｔｅｒ）を使用して測定され
た。試験試料のために、ヒルジンがコートされた種々の
量の粒子が、室温で１０分間、ヒトα−トロンビン（１
２ＮＩＨ単位ノー〉５０μｌで予め培養された。培養後
、ヒルジン／ トロンビン混合物は、ヒト標準化通常血
漿０．１−を含む予め加温された血漿溶液に加えられた
。トリス／ＮａＣｌ緩ＩＩ？液が、最終体積０．３ｍｌ
になるように加えられた。トロンビン血液凝固時間が、
フィブロメータにより記録された。
ン血液凝固活性の阻害性は、トロンビン血液凝固時間に
より評価された。トロンビン血液凝固時間は、トロンビ
ンによるフィブリノゲンのフィブリンへの直接変換を測
定する。ヒト標準化通常血漿（［］ａｘｔｅｒ １Ｉｅ
ａｌｔｌ＋ｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｄａ
ｃｌｃ部門）０，１ｒｎ１．が、５０ｍＭ ）リス、１
５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８，０）を含む緩衝液０．１
５ｍ１で、２分間３７℃まで予め加温された。２分間の
培養後、ヒトα−トロンビン（１２ＮＩＨ単位／ ｍｆ
ｆ）５０ μｉが加えられ、血液凝固時間が、フィブロ
メーク（ｆ ｉｂｒｏｍｅｔｅｒ）を使用して測定され
た。試験試料のために、ヒルジンがコートされた種々の
量の粒子が、室温で１０分間、ヒトα−トロンビン（１
２ＮＩＨ単位ノー〉５０μｌで予め培養された。培養後
、ヒルジン／ トロンビン混合物は、ヒト標準化通常血
漿０．１−を含む予め加温された血漿溶液に加えられた
。トリス／ＮａＣｌ緩ＩＩ？液が、最終体積０．３ｍｌ
になるように加えられた。トロンビン血液凝固時間が、
フィブロメータにより記録された。
最後に、トロンビンがヒルジンと１対１の極めて安定な
錯体を形成するという事実に基づいて、直接結合アッセ
イが、表面結合ヒルジンを検出するために採用された。
錯体を形成するという事実に基づいて、直接結合アッセ
イが、表面結合ヒルジンを検出するために採用された。
ヒトα−トロンビンは、ｌＪａｒｋｗｅｌ Ｉｋ
の手用頁（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｂｅｍ
ｉｓｔｒｙ。
の手用頁（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｂｅｍ
ｉｓｔｒｙ。
１２５巻、４２７〜４３２頁、 １９８２年）によるヨ
ー素−ビーズ法を使用してヨウ化された。ヒルジンがコ
ートされた粒子の懸濁液（５０μβ）が、ｐｌ＋７．２
の０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む燐酸緩
衝液中の１２５＋−）ロンビン（特有活性： ２．６Ｘ
１０６ｃｐｍ／μｇ）の所望量で培養された。４℃での
少なくとも４時間の培養後、遊離の＋２Ｊ−）ロンビン
が除去され、とルジンがコートされた粒子は、同じ緩衝
液で大量に洗浄された。表面結合＋１１５１− ）ロン
ビンが測定された。適当なコントロールが、１Ｓ１−
）ロンビンの非特定吸着を訂正するために各アッセイに
含められた。これらのコントロールは、Ａｆｆｉ−Ｇｅ
ｌ １５−ＢＳＡ 、 Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １５（ブロ
ックされたもの、即ち利用可能な反応性基が無いもの）
、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １５（ブロックされていないもの
、即ち反応性基をもつもの） 、Ａｆｆｉ−Ｇｅｔ ４
（１１−３ＭＣＣ−ＢＳＡ 。
ー素−ビーズ法を使用してヨウ化された。ヒルジンがコ
ートされた粒子の懸濁液（５０μβ）が、ｐｌ＋７．２
の０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む燐酸緩
衝液中の１２５＋−）ロンビン（特有活性： ２．６Ｘ
１０６ｃｐｍ／μｇ）の所望量で培養された。４℃での
少なくとも４時間の培養後、遊離の＋２Ｊ−）ロンビン
が除去され、とルジンがコートされた粒子は、同じ緩衝
液で大量に洗浄された。表面結合＋１１５１− ）ロン
ビンが測定された。適当なコントロールが、１Ｓ１−
）ロンビンの非特定吸着を訂正するために各アッセイに
含められた。これらのコントロールは、Ａｆｆｉ−Ｇｅ
ｌ １５−ＢＳＡ 、 Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １５（ブロ
ックされたもの、即ち利用可能な反応性基が無いもの）
、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １５（ブロックされていないもの
、即ち反応性基をもつもの） 、Ａｆｆｉ−Ｇｅｔ ４
（１１−３ＭＣＣ−ＢＳＡ 。
Ｎ１（２−ポリスチレン−ＢＳＡ、およびＮｉ＋２−ポ
リスチレン−ヒルジン、である。
リスチレン−ヒルジン、である。
第１の試験の結果は、例１から４の抗血栓性物質の表面
結合ヒルジンが、トロンビンとの錯体を形成し、それに
よりトロンビン触媒フィブリンの凝固形成を阻害する能
力を維持することを示す（第１表）。コントロールと比
較して、表面結合ヒルジンは、トロンビンが触媒するフ
ィブリノゲンからフィブリンへの変換を阻害する。少な
くとも二倍に延長されたトロンビン凝固時間が、Ａｆｆ
ｉ−Ｇｅｌ １５ ヒルジン（５０％ｌツ／Ｖの２０
μＡ） 、Ａｆｆｉ−Ｇｅ１４（１１ ＳＭＣＣＩｌ：
ＪＬ、ジン（３０％Ｗ／Ｖ）１０ μｍ＞ およびポリ
スチレンＤ Ｍ ＨＴ ヒルジン（１％Ｗ／Ｖの２．５
μβ）がヒトα−トロンビンの所定量と予め培養され
たときに、観察された。同様に、表面結合ヒルジンは、
第１図に示されるように発色アッセイにより評価される
ようなアミトール活性を阻害した。
結合ヒルジンが、トロンビンとの錯体を形成し、それに
よりトロンビン触媒フィブリンの凝固形成を阻害する能
力を維持することを示す（第１表）。コントロールと比
較して、表面結合ヒルジンは、トロンビンが触媒するフ
ィブリノゲンからフィブリンへの変換を阻害する。少な
くとも二倍に延長されたトロンビン凝固時間が、Ａｆｆ
ｉ−Ｇｅｌ １５ ヒルジン（５０％ｌツ／Ｖの２０
μＡ） 、Ａｆｆｉ−Ｇｅ１４（１１ ＳＭＣＣＩｌ：
ＪＬ、ジン（３０％Ｗ／Ｖ）１０ μｍ＞ およびポリ
スチレンＤ Ｍ ＨＴ ヒルジン（１％Ｗ／Ｖの２．５
μβ）がヒトα−トロンビンの所定量と予め培養され
たときに、観察された。同様に、表面結合ヒルジンは、
第１図に示されるように発色アッセイにより評価される
ようなアミトール活性を阻害した。
Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １５ ヒルジン（５０％Ｗ／Ｖ）ま
たはＡｆｆｉ−Ｇｅ１４（１１ ヒルジン（３０％Ｉ
ｌｉ／ｖ）ノ１０μｌカトロンヒン活性を中和するよう
に使用されたとき、約９０％の阻害性が観察された。ポ
リスチレンＤ ！、Ｉ ＩＩ Ｔヒルジン（１％Ｗ／Ｖ
）のｌＯμｌが使用されたとき、５０％の阻害性が観察
された。この試験で観察されたポリスチレンＤＭＨＴヒ
ルジンの低い阻害活性は、アッセイに使用された懸濁液
中の物質の低い濃度に起因するものということができる
であろう。表面結合ヒルジンは、第２表に示されるよう
に １２５■−）ロンビンにより直接結合することによ
りモニターされる。コントロールと比較して、約２倍、
３倍の１２Ｓ１放射能の増加が、各々、＾ｆｆ１−Ｇｅ
ｔ １５ ヒルジン（無水結合による）、他の表面結合
ヒルジンから得られた。これらの試験の結果は、表面結
合ヒルジンがその生物学的活性を保持したことを示す。
たはＡｆｆｉ−Ｇｅ１４（１１ ヒルジン（３０％Ｉ
ｌｉ／ｖ）ノ１０μｌカトロンヒン活性を中和するよう
に使用されたとき、約９０％の阻害性が観察された。ポ
リスチレンＤ ！、Ｉ ＩＩ Ｔヒルジン（１％Ｗ／Ｖ
）のｌＯμｌが使用されたとき、５０％の阻害性が観察
された。この試験で観察されたポリスチレンＤＭＨＴヒ
ルジンの低い阻害活性は、アッセイに使用された懸濁液
中の物質の低い濃度に起因するものということができる
であろう。表面結合ヒルジンは、第２表に示されるよう
に １２５■−）ロンビンにより直接結合することによ
りモニターされる。コントロールと比較して、約２倍、
３倍の１２Ｓ１放射能の増加が、各々、＾ｆｆ１−Ｇｅ
ｔ １５ ヒルジン（無水結合による）、他の表面結合
ヒルジンから得られた。これらの試験の結果は、表面結
合ヒルジンがその生物学的活性を保持したことを示す。
第１表、トロンビン凝固時間に係る表面結合ヒルジンの
効果０ 第２表 １２５１− ）ロンピンとの直接結合による
表面結合ヒルジンのモニタリング 零：ヒトα−トロンビン２０／ＭＬが凝固アッセイに使
用された。
効果０ 第２表 １２５１− ）ロンピンとの直接結合による
表面結合ヒルジンのモニタリング 零：ヒトα−トロンビン２０／ＭＬが凝固アッセイに使
用された。
１）懸濁液母体の５０μＬ
２） ＡＦＦＩ−Ｇ８Ｌ−１５寒天ゲルが、反応部位を
ブロックするためにｐＨ７，８，１λ１のグリシンエチ
ルエステルで処理された。
ブロックするためにｐＨ７，８，１λ１のグリシンエチ
ルエステルで処理された。
３）通常（無処理）のＡＦＦＩ−ＧεＬ−１５寒天ゲル
［例５コ ヒルジン分子のジスルフィド（ｄ ｉｓｕ Ｉｆ １ｄ
ｅ）域の潜在的な結合部位（例えば６〜１４．１６〜２
２．２８〜３９の残基）の可能性を調査するために、ヒ
ルジンは、種々の濃度のＤＴＴで還元された。ヒルジン
溶液４５ μｍ （５０ＡＴＵ）が、３７℃で５時間、
Ｏ〜１５ｍＭの範囲の種々の量のＤＴＴで培養された。
［例５コ ヒルジン分子のジスルフィド（ｄ ｉｓｕ Ｉｆ １ｄ
ｅ）域の潜在的な結合部位（例えば６〜１４．１６〜２
２．２８〜３９の残基）の可能性を調査するために、ヒ
ルジンは、種々の濃度のＤＴＴで還元された。ヒルジン
溶液４５ μｍ （５０ＡＴＵ）が、３７℃で５時間、
Ｏ〜１５ｍＭの範囲の種々の量のＤＴＴで培養された。
培養の終点で、１０倍過剰量のヨード酢酸が各試料に加
えられた。整数倍の試料が、凝固および発色アッセイに
よりヒルジンに対して試験された。
えられた。整数倍の試料が、凝固および発色アッセイに
よりヒルジンに対して試験された。
ヒルジン活性に係る還元の効果は、第２図に示された。
ヒルジンの抗トロンビン活性は、３つのジスルフィド結
合の内、１以上の構造的な無欠さに少なくとも部分的に
は依存することが明らかである。それにもかかわらず、
ジスルフィド結合の部分的な還元、即ち３つのジスルフ
ィド結合全部より少ない結合の還元は、ヒルジン分子上
の潜在的な結合部位を作り出す可能性がある。
合の内、１以上の構造的な無欠さに少なくとも部分的に
は依存することが明らかである。それにもかかわらず、
ジスルフィド結合の部分的な還元、即ち３つのジスルフ
ィド結合全部より少ない結合の還元は、ヒルジン分子上
の潜在的な結合部位を作り出す可能性がある。
Ｅ例６コ
４７位の活性なりジン残基を保護するために、ヒルジン
は、無水シトラコン酸で修飾された。
は、無水シトラコン酸で修飾された。
ｐＨ８，５，１０ｍＭ燐酸塩で構成される緩衝液０．２
ｒｄ中にヒルジン０．１４ｍＭを含むヒルジン溶液が調
製された。
ｒｄ中にヒルジン０．１４ｍＭを含むヒルジン溶液が調
製された。
無水シトラコン酸１１μＭが、室温で一定時間に渡りヒ
ルジン溶液に滴下的に加えられた。反応混合物のｐＨは
、ＬＭ ＮａＯＨの添加により維持された。反応は、室
温で２時間以内に完了した。過剰の無水シトラコン酸は
、ゲル濾過により除去された。修飾されたヒルジンから
シトラコニル基を除去するために、無水シトラコン酸で
修飾されたヒルジン溶液のｐＨが、ｐＨ４，２の１０ｍ
Ｍ酢酸塩、５０ｍＭＮａＣ１を含む緩衝液１．９−で２
０ μｌを希釈することによりｐＨ４，２に調節され、
反応混合物が、４５℃で５時間培養された。
ルジン溶液に滴下的に加えられた。反応混合物のｐＨは
、ＬＭ ＮａＯＨの添加により維持された。反応は、室
温で２時間以内に完了した。過剰の無水シトラコン酸は
、ゲル濾過により除去された。修飾されたヒルジンから
シトラコニル基を除去するために、無水シトラコン酸で
修飾されたヒルジン溶液のｐＨが、ｐＨ４，２の１０ｍ
Ｍ酢酸塩、５０ｍＭＮａＣ１を含む緩衝液１．９−で２
０ μｌを希釈することによりｐＨ４，２に調節され、
反応混合物が、４５℃で５時間培養された。
Ｎ−末端バリンおよびリジン基のアセチル化による無水
シトラコン酸を用いるヒルジンの化学修飾は、コントロ
ール（ｐＨ４，２のヒルジン、ｐＨ４，２のヒルジン／
無水シトラコン酸）と比較して、ヒルジンの生物化学的
活性を可逆的にブロックした（第３図）。無水シトラコ
ン酸を用いるヒルジンの化学修飾は、第３図に示される
ように、ヒルジンの生物化学的活性を破鳩した。緩衝液
のｐＨをｐＨ４，２まで低下させることによりシトラコ
ニル基を除去した場合、４５℃で５時間の培養の後、約
８０％の活性が回復した。この手順は、固定化工程の間
、ヒルジンの活性アミノ基を保護するのに使用され得る
。
シトラコン酸を用いるヒルジンの化学修飾は、コントロ
ール（ｐＨ４，２のヒルジン、ｐＨ４，２のヒルジン／
無水シトラコン酸）と比較して、ヒルジンの生物化学的
活性を可逆的にブロックした（第３図）。無水シトラコ
ン酸を用いるヒルジンの化学修飾は、第３図に示される
ように、ヒルジンの生物化学的活性を破鳩した。緩衝液
のｐＨをｐＨ４，２まで低下させることによりシトラコ
ニル基を除去した場合、４５℃で５時間の培養の後、約
８０％の活性が回復した。この手順は、固定化工程の間
、ヒルジンの活性アミノ基を保護するのに使用され得る
。
本発明は以上の如く述べられたが、同一の発明が多くの
態様に変形し得ることは明らかであろう。
態様に変形し得ることは明らかであろう。
そのような変形例は、本発明の思想、範囲から逸脱する
ものとみなされるべきではなく、且つそのような変形は
すべて特許請求の範囲内に含まれるように意図されてい
る。
ものとみなされるべきではなく、且つそのような変形は
すべて特許請求の範囲内に含まれるように意図されてい
る。
第１図は、表面結合ヒルジンによるトロンビンのアミト
ール活性の阻害性を示すグラフ、第２図は、ヒルジンの
生物学的活性に関する還元の効果を示すグラフ、第３図
は、無水シトラコン酸の処理を用いるヒルジンの抗凝血
活性の可逆的なブロックの効果を示すグラフである。
ール活性の阻害性を示すグラフ、第２図は、ヒルジンの
生物学的活性に関する還元の効果を示すグラフ、第３図
は、無水シトラコン酸の処理を用いるヒルジンの抗凝血
活性の可逆的なブロックの効果を示すグラフである。
Claims (37)
- （１）支持材料に共有結合したヒルジンと実質的に同一
の生物学的活性を有する蛋白質から構成される実質的に
ヒルジンと同一の生物学的活性を有する抗血栓性材料。 - （２）蛋白質が、天然ヒルジンまたは天然ヒルジンの誘
導体である請求項１記載の抗血栓性材料。 - （３）蛋白質が、合成ヒルジンまたは合成ヒルジンの誘
導体である請求項１記載の抗血栓性材料。 - （４）蛋白質が、ＤＮＡ組み換え技術を使用して誘導さ
れる請求項１記載の抗血栓性材料。 - （５）支持材料が、重合体である請求項１記載の抗血栓
性材料。 - （６）重合体が、天然に生じる重合体、遺伝学的に誘導
される重合体、または合成重合体もしくは合成共重合体
である請求項５記載の抗血栓性材料。 - （７）重合体が、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリ
プロピレン、ポリアクリロニトリル、ポリ（ヒドロキシ
エチルメタクリレート）、ポリテトラフルオロエチレン
、ポリエチレンテレフタレート、ポリアミド類、ポリウ
レタン類、ポリメトキシシロキサン、多糖類から成る群
から選択される請求項５記載の抗血栓性材料。 - （８）重合体が、ポリビニルアルコール共重合体、ガラ
ス、シリカ、ポリヒドロキシエチレンメタクリレート、
無水マレイン酸共重合体、カルボキシメチルセルロース
、修飾シリカゲル、ポリ−Ｐ−アミノスチレン、ポリエ
チレンイミン、グルタルアルデヒドで処理した重合体、
過沃素酸塩で処理した多糖類、アセチルメルカプトコハ
ク酸で修飾した重合体、フルオロ重合体、ポリアクリロ
ニトリル、およびシランから成る群から選択される請求
項５記載の抗血栓性材料。 - （９）重合体が、微生物分解可能であるもの、部分的に
微生物分解可能であるもの、微生物分解可能でないもの
である請求項５記載の抗血栓性材料。 - （１０）支持材料が、膜、組織、器官である請求項１記
載の抗血栓性材料。 - （１１）支持材料が、金属である請求項１記載の抗血栓
性材料。 - （１２）支持材料が、セラミックである請求項１記載の
抗血栓性材料。 - （１３）支持材料が、ガラスである請求項１記載の抗血
栓性材料。 - （１４）蛋白質が、結合基により支持材料に結合される
請求項１記載の抗血栓性材料。 - （１５）結合基が、二重機能的な蛋白質交差結合試薬、
ポリヘプチド、蛋白質、蛋白質切片、および多機能性の
重合体からなる群から選択される請求項１４記載の抗血
栓性材料。 - （１６）蛋白質が、Ｎ−末端領域のアミノ酸残基により
支持材料に結合する請求項１記載の抗血栓性材料。 - （１７）蛋白質が、Ｃ−末端残基により支持材料に結合
する請求項１記載の抗血栓性材料。 - （１８）活性な官能基を有する支持材料に、ヒルジンと
実質的に同一の生物学的活性を有する蛋白質を結合する
ことから構成されるヒルジンと実質的に同一の生物学的
活性を有する抗血栓性材料の製造方法。 - （１９）蛋白質が、天然ヒルジンまたは天然ヒルジンの
誘導体である請求項１８記載の製造方法。 - （２０）蛋白質が、合成ヒルジンまたは合成ヒルジンの
誘導体である請求項１８記載の製造方法。 - （２１）蛋白質が、ＤＮＡ組み換え技術を利用して誘導
される請求項１８記載の製造方法。 - （２２）支持材料が、重合体である請求項１８記載の製
造方法。 - （２３）重合体が、天然に生じる重合体、遺伝学的に誘
導される重合体または合成の重合体もしくは共重合体で
ある請求項２２記載の製造方法。 - （２４）重合体が、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポ
リプロピレン、ポリアクリロニトリル、ポリ（ヒドロキ
シエチルメタクリレート）、ポリテトラフルオロエチレ
ン、ポリエチレンテレフタレート、ポリアミド類、ポリ
ウレタン類、ポリメトキシシロキサン、多糖類から成る
群から選択される請求項２２記載の製造方法。 - （２５）重合体が、ポリビニルアルコール共重合体、ガ
ラス、シリカ、ポリヒドロキシエチレンメタクリレート
、無水マレイン酸共重合体、カルボキシメチルセルロー
ス、修飾シリカゲル、ポリ−Ｐ−アミノスチレン、ポリ
エチレンイミン、グルタルアルデヒドで処理した重合体
、過沃素酸塩で処理した多糖類、アセチルメルカプトコ
ハク酸で修飾した重合体、フルオロ重合体、ポリアクリ
ロニトリル、およびシランから成る群から選択される請
求項２２記載の製造方法。 - （２６）重合体が、微生物分解可能であるもの、部分的
に微生物分解可能であるもの、微生物分解可能でないも
のである請求項２２記載の製造方法。 - （２７）支持材料が、膜、組織、または器官である請求
項１８記載の製造方法。 - （２８）支持材料が、金属である請求項１８記載の製造
方法。 - （２９）支持材料が、セラミックである請求項１８記載
の製造方法。 - （３０）支持材料が、ガラスである請求項１８記載の製
造方法。 - （３１）蛋白質が、結合基により支持材料に結合される
請求項１８記載の製造方法。 - （３２）結合基が、先ず蛋白質に共有結合し、次いで得
られた蛋白質−結合基が、支持材料の官能基に対して、
蛋白質−結合基の結合基末端の官能基により共有結合す
る請求項３１記載の製造方法。 - （３３）結合基が、先ず支持材料の官能基に共有結合し
、次いで得られた支持材料−結合基が、蛋白質に対して
、支持材料−結合基の結合末端基の官能基により共有結
合する請求項３１記載の製造方法。 - （３４）結合基が、二重機能的な蛋白質交差結合試薬、
ポリヘプチド、蛋白質、蛋白質切片、および多機能性の
重合体からなる群から選択される請求項３１記載の製造
方法。 - （３５）蛋白質が、Ｎ−末端領域のアミノ酸残基により
支持材料に結合される請求項１８記載の製造方法。 - （３６）蛋白質が、Ｃ−末端残基により支持材料に結合
される請求項１８記載の製造方法。 - （３７）更に、支持材料に結合する前に、蛋白質のトロ
ンビン結合領域の活性部位を保護することから構成され
る請求項１８記載の製造方法。
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- 1997-08-21 JP JP9224746A patent/JPH10151193A/ja active Pending
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