JPH04500802A - ヒルジンペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

見ｔＬｔ　９７≦１土工 １豆血１歪盈Ｉ この発明は、ヒルジンの抗凝固剤活性を示す新規な生物学的に活性なペプチドに 関する。特に、これは、ヒルジンの少なくともカルボキシ末端２６アミノ酸の部 分に相同であるペプチドに関する。この種のペプチドは改変されたチロシン残基 によっても特徴付けることができる。更にこの発明は、抗凝固剤活性を示すこれ らのペプチドのペプチドミメティックおよび共有結合性アナログに関する。また この発明は、治療、予防または診断を目的としてこの種のペプチドまたはアナロ グを使用する組成物、組合せ並びに方法に関する。更にこの発明は、ペプチドま たはポリペプチドに含まれるチロシン残基を硫酸化する新規な方法に関する。 ｉ見韮且 心筋梗塞、鼓動、肺塞栓症、深部血管血栓症、末梢動脈閉塞並びに他の血液系の 血栓症のような血管疾患は、健康に対する主要な危険を構成する。この種の疾患 は、フィブリンよりなる血液クロットによる血液導管の一部または全部の閉塞に よって起こる。 血栓疾患を処置し予防する最近の方法には、２つの異なる様式の１つに作用する 治療法が含まれる。治療法の第１の種類は、トロンビン活性またはトロンビン形 成を阻害するもので、これによってクロット形成を回避する。またこれらの薬剤 は、血小板の活性化および凝集を阻害する。治療法の第２の範鴫のものは、血栓 溶解を促進し血液凝固を溶解するものであり、これにより血液導管からこれを除 去し、血液の流れの遮断を解除する［ジェー・ビー・カゼナベら、＾ｇｅｎｔ＾ ｃｔｉｏｎ、　１５．５ｕｐｐ１．、　ｐｐ、　２４−４９　（１９８４）］　 。 前者の種類であるヘパリンは、静脈血栓栓塞症のような処置条件に広く使用され ており、この場合トロンビン活性は血栓の進展または伸張に対応する。有効では あるが、ヘパリンは多くの望ましくない副作用を与え、これには出血および血小 板減少が含まれる。このため、より特異的でより毒性の低い抗凝固剤が研究され ている。 ヒルジンは天然に存在するポリペプチドであり、吸血ヒル（旧ｒｕｄｏ信ｅｄｉ ｃｉｎａｌｉｓ）によって産生される。この化合物はヒルの唾液腺内で産生され 、公知の最も有効な天然凝固阻害剤である。ヒルジンは、１：１の化学量論複合 体をなしてトロンビンと強固に結合することにより（Ｋ−〜２Ｘ１０−”Ｍ）血 液が凝固するのを阻害する［ニス・アール・ストーンとジェイ・ホフスティング 、「ヒルジンによるトロンビンの阻害の動力学Ｊ　、ＢｉｏｃｈｅＩＩｉｓｔｒ ｙ、　２５．　ｐｐ、　４６２２−２８　（１９８６）］。 これは次に、トロンビンがフィブリノーゲンのフィブリン（クロット）への変換 を触媒するのを阻害する。 ヒルジンはトロンビンに対する選択的かつ特異的な阻害剤であると考えられてお り、他の凝固因子に対しては阻害活性を全く示さない、しかしながら、ヒルジン は、因子Ｘの因子ＩＸａ活性化およびプロトロンビンの因子Ｘａ活性化の両方を 阻害することが示唆されている［イー・ダブリュ・ディビーら、「血液凝固」、 ＾ｄｖ、　ＥｎＺＶｌｏｌ、、　４８．　Ｄｌｌ、　２７７−３１８（１９７９ ）　、ジェイ・ニス・ローゼンベルグら、「ヒトアンチトロンビンの存在下にお ける高度に精製されたヒト因子ＶおよびＸａによるヒト１０トロンビンの活性化 Ｊ　、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｗ、、　２５０．　ｐｐ、　１６０７１６１７　（１９７５）］　、最近 、精製されたヒルジンが培養内皮細胞からの１２１１ラベルした因子Ｘａの置換 を促進することが示された。すなわち、ｌ１ｌ　！ラベルされたヒルジンは因子 Ｘａに結合し、精製されたヒルジンは小色原体物質Ｓ　−２２２２の因子Ｘａ開 裂を阻害しない［アール・シー・フリードベルグら、［因子Ｘａ副制御おける内 皮の役割：血漿プロテイナーゼ阻害剤およびヒルジンの効果Ｊ　、　Ｂｌｏｏｄ 。 ７１、　Ｅ）Ｅ）、　１３２１−２８　（１９８ｇ）］　。 しかしながら、これらのヒルジンの研究は、因子Ｘａ阻害活性の蛋白質夾雑物が 使用した調製物中に存在する可能性を示していない、よって今日まで、ヒルジン またはヒルジン関連構造が因子ＩＸａおよびＸａを阻害するという結論的な証拠 はない、先に研究されたヒルジン調製物中の１つの可能な夾雑物はアンチスタチ ンの等個物であり、これはメキシコのヒルＨａｅｒｌｅｎｔｅｒｉａ　ｏｆｆｉ ｃｉｎａｌｉｓから精製された蛋白質であって、因子Ｘａを選択的に阻害する［ ジー・ビー・ラスジンスキーら、［アンチスタチンの単離と特徴Ｊ　、Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。 ２６２、　ｐ、　９７１８　（１９８７）　］　、　Ｌかしながら、アンチスタ チンはヒルジンと異なり、因子ＸａによるＳ　−２２２２の開裂を阻害する。こ れは、ヒルジンによる因子Ｘａの阻害は、アンチスタチンによる因子Ｘａ阻害と は興なる機構を介して起こることを示す。 ヒルジンとトロンビンとの実際の結合は２段階のプロセスである。最初に、ヒル ジンは、触媒部位から離間したトロンビン分子の「低い」親和力部位（Ｋ、〜ｌ Ｘｌ０−”Ｍ＞に結合する。低い親和力による結合に続いて、ヒルジンは構造変 化を起こし、その後トロンビンの「高い」親和力部位に結合する。この後者の部 位はトロンビンの活性部位に対応する。 ヒルジンの単離、精製並びに化学組成は当業界で公知である［ビー・ウォルスマ ンとエフ・マークワード、［トロンビン阻害剤ヒルジンの生物学的および薬学的 観点」、Ｐｈａｒｎａｚｉｅ、　３６．　Ｉ）Ｉ）、　６５３−６０　（１９８ １）］　、更に最近では、このポリペプチドの全アミノ酸配列が解明されている ［ジェイ・ドツトら、「ヒルジンの全共有結合構造ニジスルフィド結合の局在化 Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、　ＨＯＩ）ｌｌｅ−Ｓｅ）Ｉｌｅｒ、　３６ ６、　ｔ）Ｌ　３７９−８５（１９８５）　；ニス・ジエイ・ティ・マオら、「 ヒルジンの迅速精製および訂正したアミノ酸配列：吸血ヒルの特異的なトロンビ ン阻害剤Ｊ　、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１６１．　ｌ１ｌ）、　５１４− １８　（１９８７）　；並びにアール・ビー・ハーベイら、［吸血ヒル旧ｒｕｄ 。 ｍｅ　１ｃｉｎａｌｉｓに由来する抗凝固剤ヒルジンをコードするｃＤＮＡのク ローン化と発現Ｊ　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。 ＵＳＡ、　８３．　ｐＩ）、　１０８４−８８　（１９８６）　］　。 少なくとも２つのヒルジンの異性特異的な形態、ＨＶ−１およびＨＶ−２が配列 決定され、僅かに異なるアミノ酸配列が示されている［アール・ビー・ハーベイ ら、前記文献］。 両方の形態のヒルジンは６５アミノ酸を含有する１つのポリペプチド鎖蛋白質か らなり、そのアミノ末端は主として疎水性アミノ酸からなり、カルボキシ末端は 極性アミノ酸からなる。更に詳しくは、、全ての形態のヒルジンは、１−２．３ −５並びに４−６の半シスチニルパターンにおける３つのジスルフィド橋によっ て安定化されたＮ−末端ドメイン（残基１−３９）および高度に酸性のＣ−末端 断片（残基４０　６５）を特徴とする。更に、ヒルジンのＣ−末端断片は、硫酸 化されたアミノ酸位置６３のチロシン残基の存在を特徴どする。 動物についての研究では、ヒルから精製されたしルジンは、血管血栓、血管転流 閉塞並びにトロンビンにより誘導された転移住血管内凝固を回避するのに有効で あることが示された。 更に、ヒルジンは毒性が低く、抗原性が全くまたは殆どなく、循環系からのクリ アランス時間が極めて短い［エフ・マークワードら、「実験動物におけるヒルジ ンの抗血栓作用の薬学的研究Ｊ　、　Ｔｈｒｏｉｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ＋＊ 、　４’／、　ｐｐ、　２２６−２９　（１９８２）］　−しかしながら７、ヒ ルジンの有効性にも拘らず、研究によればヒルジンは薬量に依存する様式で出血 時間を延長することが示され、このため適切な薬量を決定し℃投薬することが非 常に重要となっている。更に、天然に存在する生成物のコストは高く供給は少な いため、その広範な使用が妨げられている。 ヒルジンの供給の□増加を実現する努力として、組換えＤＮＡ技術によりこのポ リペプチドを生産する試みがなされている、天然ヒルジンにおける〇−硫酸化チ ロジン残基の存在および微生物は同様の蛋白質修飾を行うことは不可能であるこ とから、組換えによる生物学的に活性なヒルジンを生産する観点は非常に疑わし いものとなっている。しかしながら、硫酸化されていないヒルジンは硫酸化され たものと殆ど同様に活性であるという観察［米国特許第４，６５４，３０２号］ により、イー・コリ［ヨーロッパ特許出願第１５８，５６４号、１６８，３４２ 号並びに１７１．０２４号］および酵！［ヨーロッパ特許出願第２００．８５５ 号］におけるヒルジンのクローン化および発現の道が開かれた。これらの進展に も拘らず、ヒルジンの生産はまだなお高価であり、広く市販されるに至っていな い。 最近性われた努力により、凝固時間の低減に同様に有効な天然ヒルジンのペプチ ド断片が同定された。ヒルジンの硫酸化されていない２１アミノ酸のＣ−末端断 片、Ｎ’−アセチルヒルジン４％−４８は試験管内でクロット形成を阻害する。 更に、ヒルジンのＣ−末端１１または１２アミノ酸に対応する幾つかの他の小さ い硫酸化されていないペプチド（残基５５−６５および５４−６５）も試験管内 でクロット形成を阻害するのに有効であることが示された［ジェイ・エル・クル ステナンスキーら、「合成非硫酸化Ｎ１−アセチルヒルジン４　Ｓ　−６％を使 用するヒルジンのＣ−末端の抗血栓特性」、ＦＥＢＳ　Ｌ８ｔｔ、　２１１．　 ｐｐ、　１０−１６　（１９８７）］　、　Ｌかしながらこの種のペプチド断片 は、進行しつつある治療処方において血液クロットを溶解するには十分に満足し 得るものではない０例えば、Ｎ１−アセチルヒルジン４．−０は、天然ヒルジン より４桁低い比活性を有する。 フィブリンクロットの形成を触媒することに加えて、トロンビンは幾つかの他の 生物制御を行う役割を有する［ジエイ・ダブリュ・フェントン、ＩＩ、「トロン ビンの生物制御作用」、＾ｄｖ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　６．　ｐ ｐ、　１８６−９３　（１９８８）　］　、例えば、トトロピンは血小板の凝集 および放出反応を直接活性化する。これは、トロンビンが急性血小板依存性血栓 において中心的な役割を果たすことを意味する［ニス・アール・ハンソンとエル ・ニー・バーカー、「合成アンチトロンビン、Ｄ−フェニルアラニル−し−プロ リル−し−アルギニルクロロメチルケトンによる急性血小板依存性血栓の遮断」 、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８５．　Ｉ）Ｅ） 、　３１８４−８８　（１９８８）］　。 また、トトロピンは、内皮細胞による血小板活性化因子（ＰＡＦ）の合成を刺激 することにより、炎症応答を直接活性化することができる［ニス・エム・プレス コツトら、「ヒト培養内皮細胞は、トロンビンによって刺激された場合、血小板 活性化因子（１−アルキル−２−アセチル−５ｎ−グリセロ−３−ホスホコリン ）を生産するＪ　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８１．　ＤＤ、　３５３４−３８　（１９８４）］　、　 ＰＡＦは内皮細胞の表面に露呈され、ニュートロフィルの吸着および後続する顆 粒消失のリガンドとして働＜［ジー・エム・ベルコレティち、［血小板活性化因 子はアゴニストに対するニュートロフィル応答を用意する：ニュロフィルに媒介 された内皮損傷促進における役割Ｊ　、　Ｂｌｏｏｄ、　７１．　Ｏｐ、　１１ ００−０７　（１９８８）　］　。 トトロピンが血小板および内皮細胞を活性化する機構にはレセプタが関与し、フ ィブリノーゲンの開裂に要求されるものより低い濃度で有効である［ジエイ・テ ィ・ハーモンとジー・ニー・ジャミージン、「糖蛋白質１ｂのグリコカルジン部 分は、トロンビンに対する高および中程度の親和力のレセプタ部位を発現するＪ 　、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｉ、、　２８．　Ｄｌｌ、１３２２４−２９（１ ９８６）］　、ヒルジンのようなトロンビンの活性部位を遮断する試薬は、血小 板および内皮細胞の活性化を停止させる［シー・エル・クヌップ、［トロンビン により誘導された放出および凝集に対するトロンビン阻害剤の効果Ｊ　、Ｔｈｒ ｏｒ＃ｂｏｓｉｓＲｅｓ、、　４９．　Ｊｌ、　２３−３６　（１９８８）］　 、　Ｌかしながら、単にトロンビンとレセプタとの結合を遮断するのみでその活 性化を阻害するのに十分であるという証拠はない。 よって、今日までのこれらの発展にも拘らず、クロット形成、トロンビンにより 誘導された血小板活性化または内皮細胞活性化を増加された効率で阻害すること を特徴とする小さな合成ペプチドであって、商業的に適切な量で製造され得るも のに対する要求が存する。 ｌ匪立皿ｊ 本発明は、本来のヒルジンの生物学的活性を特徴とするペプチドを提供すること により、前記した問題点を解決するものである。特に、この発明のペプチドおよ びアナログ、並びにこれらを含有する組成物および組合せの両方は、血液凝固時 間の増加を生起する抗凝固剤として有効である。低薬量でこれらのペプチドは、 トロンビンにより誘導された血小板凝集および血小板放出（「血小板活性化」と 後記する）並びに内皮細胞からの炎症物質の放出（「内皮活性化」と後記する） を阻害し、凝固時間の原著な増加を伴うことはない、これらのペプチドは比較的 小さな大きさく約８〜２６アミノ酸）であるため、有利にはこれらを合成的に製 造することができる。 よって、これらは極めて高い収量で製造でき、本来のヒルジンまたはその全長の 組換え物と比較すると容易に精製することができる。 有利には、本発明のペプチドは、ヒルジンとは興なり、凝固時間に対して十分な 効果を示す、よって、これらのペプチドを治療および予防に使用することにより 、ヘパリンのような従来の抗凝固剤に随伴した過剰投与による危険かつ潜在的に 重篤な結果が回避される。またこの発明のペプチドの大きさは小さいため、これ らによって処置を受けた患者の逆行的な抗原応答の可能性が低減される。 後記する開示から理解されるように、この発明のペプチド、組成物、組合せ並び に方法は、トロンビンの所望としない効果に起因する血管疾患の処置、予防また は診断、並びに試験管内診断アッセイに有用である。 １直立１呈皇盈Ｊ 第１図は、逆相ＨＰＬＣによるスルホ−Ｔｙｒ、、ヒルジン５ｍ−１６４の精製 を示す。 第２図は、大量のペプチドを処理するに際し、従来の硫酸化方法（第２ａ図、２ ｂ図）と比較したこの発明（第２ｃ図）の硫酸化方法の相対的な効率を表すＨＰ ＬＣクロマトグラムを示す。 第３図は、スルホニル−Ｔｙｒｏヒルジン５Ｍ−６４およびスルホ−Ｔ　ｙ　ｒ 　４１ヒルジンｌｌｌ−６４の混合物のＨＰＬＣクロマトグラフによる溶出プロ フィールを示す。 第４図は、一定範囲のペプチド濃度におけるヒルジン＠５−４４およびスルホ− Ｔ　ｙ　ｒ　ａｓヒルジンラド６４の抗凝固剤活性を示す。 第５図は、この発明によるしルジンペプチドの共有結合構造、並びにこれらの抗 凝固剤活性を示す表である。この図において、次の単一文字コードによってアミ ノ酸を示す：Ｐｈｅ：Ｆ　Ｌｅｕ：Ｌ　Ｉｌｅ：Ｉ　Ｍｅｔ：ＭＶａｌ：Ｖ　Ｓ ｅｒ：Ｓ　Ｐｒｏ：Ｐ　Ｔｈｒ；ＴＡｌａ：Ａ　Ｔｙｒ：Ｙ　Ｈｌｓ：ＨＧｉｎ ：ＱＡｓｎ：Ｎ　Ｌｙｓ：Ｋ　Ａｓｐ：Ｄ　Ｇｌｕ：ＢＣｙｓ：ＣＴｒｐ：Ｗ　 Ａｒｇ：ＲＧｌｙ：Ｇ第６図は、本来のヒルジンおよびスルホ−Ｔｙｒ４）ヒル ジン５ｊ−４４の変動する量によるトロンビンタイムの阻害を示す。 第７図は、ウシトロンビンタイムおよびヒトトロンビンタイムに対する変動する 量のスルホ−Ｔ　ｙ　ｒ　４）ヒルジン＄３−６４の効果を示す。 第８図は、変動する量のヘパリン単独、スルホ−Ｔｙｒｓ＊ヒルジンラド、４単 独、並びにヘパリンとスルホ−Ｔｙｒ、ｓヒルジン５トロ４との１＝１の組合せ の活性化された部分的トロンビンタイムに対する効果を示す。 第９図は、Ｂａ１ｂ／ｃマウスにおける薬量応答についての研究におけるスルホ −Ｔｙｒ＊ｓヒルジン５Ｎ−４４の試験管内抗凝固剤活性を示す。 第１０図は、スルホ−Ｔｙｒｏヒルジン５Ｎ−６４による因子Ｘの因子ＩＸａ活 性化の阻害を示す。 第１１図は、スルホ−Ｔｙｒｏヒルジン＊Ｍ−６４によるプロトロンビンの因子 Ｘａ活性化の阻害を示す５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを示す。 第１２Ａ〜１２Ｃ図は、ヒルログ−１、ヒルログ−２並びにヒルログ−３、この 発明によるペプチドのペプチドミメティックアナログの合成を示す。 第１３Ａ図は、ヒルログ−４、この発明によるペプチドのペプチドミメティック アナログの合成を示す。 第１４Ａおよび１４Ｂ図は、ヒルログ−５およびヒルログ−６、この発明による ペプチドのペプチドミメティックアナログの合成を示す。 第１５図は、ヒルログ−７、この発明によるペプチドのペプチドミメティックア ナログの合成を示す。 第１６図は、トロンビンにより誘導された血小板凝集および凝固時間に対する低 薬量スルホ−Ｔｙｒ４％しルジン５トロ４の効果を示す。 第１７図は、ＡＤＰおよびコラーゲンにより誘導された血小板凝集に対するＡｒ ｇｓｉ−ヒルジン５Ｓ−４４の効果を示す。 九１へ１１鼠盈泗 本発明は、ヒルジンのカルボキシル末端部分のアミノ酸配列に対応し本来のヒル ジンの生物学的活性を示すペプチドに関する。更に詳しくは、この発明のペプチ ドは、少なくとも本来のヒルジンのカルボキシ末端２６アミノ酸部分に相同であ る。この発明の１つの態様によれば、この種のペプチドは、負に荷電した側鎖基 を付加することにより単一のチロシン残基において誘導される。 この発明のしルジンペプチドには、限定されるものではないが、実質的に次の式 ：Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉ　１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌ ｕ、−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｘおよび、二のＤ−レトロ型（式中、ＸはＣ０ＯＨ，Ｌ ｅｕ並びにＬｅｕ−Ｇｉｎよりなる群から選択される）よりなるアミノ酸の配列 を特徴とするペプチドが包含される。更に、この発明によるヒルジンペプチドに は、実質的に次の式：％式％ Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−ＺおよびこのＤ−レトロ型（式中、ＹはＮｌ２　、アミノ保護 基、アミノ酸配列：Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈ、ｒ−Ｐｒ ｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒ。 −Ｇｉｎ−３ｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐの少なくともＣ− 末端部分、並びにアミノ酸配列：Ｖａｌ−Ｔｂｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔ ｈｒ−Ｐｒ。 −Ａｓｎ　−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｓ　ｎ−Ｇ　１　ｙ −Ａｓ　ｐの少なくともＣ−末端部分よりなる群から選択され、ＺはＣ０ＯＨ， Ｌｅｕ並びにＬｅｕ−Ｇｌｎよりなる群から選択され、チロシン残基は負に荷電 したｒｐＪ鎖基の存在を特徴とする）よりなるアミノ酸の配列を特徴とするもの が包含される。この種のペプチドにおいて、負に荷電した側鎖基は、スルフニー 用・、ボスフェート、カルボキシレート、スルホネート・、ホスホネ−１〜、カ ーボネート、メチルスルホネ−■・、メチルホスホネート並びにこれらの改変物 よりなる群から選択することができる。この発明の１つの態様によれば、この種 のペプチドには、ＹがＡ　ｓ　ｒｌ−Ｇｌｙ−ｆｉ、ｒ＞ｐであり、２がＬｅｕ であり、チロシン残基が硫酸化されたものが包含される。更に、本発明のペプチ ドは、アミノ末端アミノ酸におけるＮ−アセチル基の存在を特徴とし得る。 この発明のベグゴドの生産は、当業界で公知の種々の方法によっ°〔行うことが できる。例えば、特定のエンドペプチダーゼをエンドペプチダーゼ、エドマン分 解または両者と組合せて使用する蛋白質分解によりて、このペプチドを元のしル ジン分子から誘導することができる。一方この元のヒルジン分子は、従来の方法 を使用してその天然起源であるｔｌ、　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓから精製するこ とができる。その他、しルジンは、ｃＤＮＡを使用する公知の組換えＤＮＡ技術 技術−アールー・ハーベイら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ｔｌｓＡ、　８３゜１）ｌ）、　１０８４−８８　（１９８６）；ジェイ・ド ツトら、１−アルカリ性ホスファターゼシグナル配列を使用するイー・コリにお けるヒルジンの発現分泌およびプロセシングＪ　、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、　 ２０２゜ｐｆ）、　３７３−７７　（１９８６）　］　、または化学合成遺伝子 ［シー・バーブマンら、［ヒルジン、ヒルＨｉｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎ　Ｉｉ ｓに由来するトロンビン特異的阻害剤をコードする遺伝子の化学合成および発現 Ｊ　、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌ、　ＨＯＤＤｅ−８Ｑｙ１ｅｒ、　３６７、　Ｄ９ ．７３１−４０（１９８６）］によって製造することができる。 好ましくは、本発明のペプチドは直接製造され、したがって全ヒルジン分子を出 発材料として必要とすることが回避される。これは周知のＤＮＡ技術によって行 うことができ、その際、所望のペプチドをコードするようなりＮＡ配列のみを形 質転換宿主中で発現させる。 その他、この発明のペプチドは、従来の化学合成技術によって製造することがで きる。この発明の好適な態様では、溶液相または固相ペプチド合成によってヒル ジンペプチドを合成し、必要に応じてカルボキシペプチダーゼにより消化するか （Ｃ−末端アミノ酸を除去するため）または手動エドマン分解によって分解する （Ｎ−末端アミノ酸を除去するため）。 このようにして製造したペプチドを、その後当業界で広範に知られた分離技術に よって精製するが、好ましくは逆相ＨＰＬＣを利用する。有利には溶液相合成を 使用することにより、誘導されたアミノ酸を成長するペプチド鎖に直接付加する ことができる。これにより、この発明のペプチドのチロシン残基を修飾する後続 する誘導工程の必要性が除去される。 この明細書全体および請求の範囲において、アミノ酸およびその残基について略 号を使用するが、これは命名法の一般的に許容された規則に準拠し、Ｌ−型のα −アミノ酸およびその残基に関する。しかしながら、本発明は、ここに記載する ペプチドのＤ−レトロ型にも関するものである。これらは、Ｌ型のカルボキシ末 端アミノ酸から開始して、反対方向にＤアミノ酸を用いて合成を行うことにより 製造される。 この発明のしルジンペプチドの誘導には、単一のチロシン残基の遊離フェノール 性ヒドロキシルまたはベンジルメタ炭素に対し、負に荷電した側鎖基を付加する ことを包含し得る。 この誘導は、当業界で公知の種々の負に荷電した側鎖基の付加を含む、誘導方法 には、限定されるものではないが、チロシン水酸基の硫酸化、メチルスルホン化 、リン酸化、メチルリン酸化並びにカルボキシル化、並びにチロシンベンジルメ タ炭素のスルホン化１．リン酸化並びに炭酸塩化が包含される。 これらの反応を行う技術も当業界で周知である。 最も好ましくは、この発明のペプチドはｉＫｉ！化によって誘導される。この発 明の好適なペプチドはスルホ−Ｔｙｒｏヒルジンラド６４（下付きの数は本来の ヒルジン分子における対応するアミノ酸位置を示す）であり、これは１２アミノ 酸のペプチドであって、硫酸化された千ロジン残基を有し、本来のヒルジンの残 基５３−６４と相同である。他の好適なペプチドはスルホニル−Ｔｙｒｅｓヒル ジン！３−４４であり、これはスルポン化されたチロシン残基を有する。このス ルホン化ペプチドは、その硫酸化されたものより長い生物学的半減期を有し得る 。 この発明のヒルジンペプチドの硫酸化は、生物学的（酵素的）方法によっても化 学的方法によっても行うことができる。 この発明の好適な態様では、この発明の精製したペプチドを、有機溶剤中でジシ クロへキシルカルボジイミドおよび硫酸と共に同時に反応させる。メタ炭素のス ルホン化は、この硫酸化プロセスの副反応同様の結果となる。 大スケールの硫酸化のため、硫酸化方法を改変し、ダラム量のペプチドを有機溶 媒（好ましくはジメチルホルムアミド）に最初に溶解し、その後脱水Ｍ（好まし くはジシクロへキシルカルボジイミド）と反応させる。ペプチドの脱水されたチ ロシン残基をその後硫酸によって硫酸化する。この反応は、不溶性のジシクロヘ キシル尿素塩の形成によって完了する。 この改変により、大スケールで高収量の硫酸化されたペプチドが結果的に与えら れる。この新規な硫酸化技術は、単離され精製された場合であっても、粗製調製 物として存在する場合であっても、全ゆるペプチドまたはポリペプチドのチロシ ン残基のに酸化に使用することができる。いずれかの硫酸化反応の後、硫酸化ペ プチドは、ＨＰＬＣ，ＤＥＡＲクロマトグラフィまたは幾つかの他の従来の分離 技術のいずれかにより、全ゆるスルホン化ペプチド並びに未反応のペプチドから 分離することができる。 硫酸化は、ピリジン中でこの発明のペプチドと二酸化イオウ−トリエチルアミン 塩とを反応させることによっても行うことができる。更に、チロシルトランスフ ェラーゼ活性（粗製調製物でも精製酵素でもいずれでもよい）を使用して、チロ シン残基を硫酸化することができる［アール・ダブリュ・エッチ・リーとダブリ ュ・ビー・フットナー、ｒＰｃ−１２フエオクロモサイトーマ細胞のチロシン０ 硫酸化蛋白質およびチロシル蛋白質スルホトランスフェラーゼによるその硫酸化 −＋　、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２５８．　ｐｐ、　１１３２６−３ ４　（１９８３）］　、この発明のしルジンペプチドのリン酸化またはカルボキ シル化は、硫酸化について前記したものと類似する反応によって行うことができ 、硫酸をそれぞれリン酸またはギ酸で置換する。これらの反応において、リン酸 化または炭酸化は、それぞれ副反応として生起する。その他、この発明のしルジ ンペプチドのカルボキシル化またはリン酸化に酵素的方法を用いることができる 。 この発明のしルジンペプチドのメチルスルホン化およびメチルリン酸化は当業界 で周知の方法によって行うことができ、これには、限定されるものではないが、 それぞれクロロスルホン酸またはタロロリン酸を用いるアルキル化が包含される 。 ［酸化の程度は、分光光度計によって追跡することができる。硫酸化されたペプ チドの吸収スペクトルは、約２７５ｎｒｒｔから約２５０〜２６５ｎｍへの最大 吸収の移動を示す。 ６０℃で３０分間３０％トリフルオロ酢酸を用いてペプチドを脱硫酸化すること により誘導の確認を得ることができる。 これは結果的に２７５　ｎｍへ戻る最大吸収の増加を与える。 この発明の他の態様によれば、ヒルジンペプチドは、Ｎ−アセチル基を付加する ことにより、そのアミノ末端において誘導することもできる。Ｎ−アセチル化は 、当業者に公知の多数の技術のいずれかによって行うことができる。好ましくは 、アセチル化は、この発明のペプチドの合成において、Ｎ−アセチルアミノ酸誘 導体を使用することにより行うことができる。その他、Ｎ−アセチル化は、ペプ チドと無水酢酸とを反応させることにより行うことができる。この発明のＮ−ア セチル化しルジンペプチドは、有利にはアセチル化されていない対応するべ１チ ドのものと比較すると増加した生物学的安定性を示す。 この発明のしルジンペプチドの抗凝固剤活性は、いずれかの従来技術を使用して アッセイすることができる。好ましくはこのアッセイはペプチドのトロンビン阻 害活性の直接決定を含む、この種のアッセイは、発色性物質のトロンビン触媒に よる開裂の阻害、または更に好ましくは活性化部分トロンビンタイム（ＡＰＴＴ ）の増加およびトロンビンタイム（ＴＴ）の増加を測定するものである。後者の アッセイは、凝固の「固有の」経路の因子を測定するものである。その他、用い 得るアッセイでは精製したトロンビンおよびフィブリノーゲンを使用することが でき、ラジオイムノアッセイまたはＥＬＩＳＡによってフィブリノペプチドＡま たはＢの放出の阻害を測定する。 この発明のペプチドの抗凝固剤効力は、ある部分その生体内半減期に依存する。 よって、この発明は、共有結合または非共有結合のいずれもの薬学的組成物にも 関し、これはこれらのペプチドの生物学的半減期を増加させる薬学的に許容し得 る重合体と共役したしルジンベブチドからなる０例えば、この発明のヒルジンペ プチドは、従来の技術を使用して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の活性化 誘導体と共役させることができる。好ましくは、ＰＥＧＮ−スクシニミジルスク シネートをこのペプチドのα−アミノ部分に付着させる。 この種の付着は、有機溶剤または約７．０より大きいＰＨを有する緩衝液中でペ プチドとＰＥＧＮ−スクシニミジルスクシネート試薬（ＳＳ−ＰＥＧ）とを反応 させることにより行う、最も好ましくは、約５０倍モル過剰の５Ｓ−ＰＥＧ（平 均ＭＷ＝５，０００ダルトン）とペプチドとを、ｐＨ９，０の２０ｍＭホウ酸ナ トリウム緩衝液中で反応させる。 この発明のしルジンペプチドは単独、組成物、組合せとして、また血液系血栓に 起因する血管疾患を処置または予防する方法に有用である０例えば、この発明の ペプチド、組成物並びにこれらを含有する組合せは、予防を目的としたヘパリン 置換、血小板減少症の処置におけるヘパリン置換、転移血管向凝固の処置並びに いずれかの疾患状態で起こる血管血栓の処置に使用することができる。この発明 のヒルジンペプチド、並びにこれらを含有する組成物および組合せは、哺乳動物 、特にヒトを含む患者の血管疾患の処！または予防に使用することができる。 その他、この発明のヒルジンペプチドは、ヘパリンまたは低分子量ヘパリンと組 合せて投薬することができる。この種の組合せは、いずれかの化合物を単独で使 用する場合に所望の抗凝固剤効果を得るのに要求される＾、バリンまたは低分子 蓋ヘパリンの薬量を有利に減少させる。更に、これらの組合せ゛は、ヘパリンの 使用にしばしば随伴する出血性併発症の可能性を有利に低減させる。またこの種 の組合せは背くべきことに、個々の成分のいずれかを基剤とする単独治療で示す ものより大きい抗凝固剤活性を示す、ここに特定するように、「組合せ」という 用市は、本発明の少なくと＃Ｊ１つのペプチドおよびヘパリンまたは低分子ｌヘ パリンを含有する単独投与形態、２つの薬剤を別々にただし同時に投薬する多段 投与形態、または２つの薬剤を別々にただし順次に投薬する多段投与形態を包含 する。 この発明のしルジンペプチドは、薬学的に有用な組成物および組合せを開裂する 従来の方法を使用して処方することができる。この種の組成物は、好ましくは少 なくとも１つの薬学的に許容し得るキャリヤを含む０例えば、レミントンズ・フ ァルマシューティカル・サイエンス（イー・ダブリュ・マーチン）を参照すると よい０本発明の薬学的組成物は、典型的には、しルジンベブチドに加えて、薬学 的に許容し得る緩衝液、好ましくはリン酸ｔＩｌ衝塩類、更に浸透圧を調整する 薬学的に許容し得る化合物、例えば塩化ナトリウム、マンニトールまたはソルビ トールを含有する。また本発明の組成物は、前記成分に加えて、低薬量のヘパリ ンまたは低分子１ヘパリンを、好ましくは約２．５００〜５，０００単位含有す ることができる。 種々の投与形態を用いて、この発明のヒルジンペプチド含有組成物および組合せ を投薬することができる。これらには、限定されるものではないが、腸管投与、 経

【］投与並びに局所適用が包含される。投与および投薬の速さは、特定の組成 物、処置の目的、すなわち治療または予防、並びに処置担当医の判断のような種 々の因子に依存し得る。 注射用組成物は凍結乾煉物または溶液の形態とすることができる０局所適用に処 方する組成物は、例えば水性ゼリー、油状懸濁物または乳化軟膏の形態とするこ とができる。結果的に得られる処方物は、血液凝固を予防または低減するのに有 効な量のヒルジ〉・ベブチｆ　を含有するものである。 注射による投薬のためには、ｈ療五の、二の発明のペプチドは、通常は約０．２ へ−７５１ｎ　ｇ　／　ｋ　ｇ体重、好ましくはり（）、５〜１０　ｍ　ｇ　／ 　ｋ　ｇ体重の１日の薬量範囲とし得る。有効な薬量を決定する方法は、当業者 に公知である。しかしながら、こノ１らの薬量は、はぼ他の血栓溶解剤について か、近使用されたしの、例えば約３−５　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ体重以下とし、そ の後維持薬員を約７・−１０口について７ｍｇ／ｌｖｒ　ｉ　、ｖ。 とする。この発明のＰＥＧ誘導】；ルミ、−二ベグチドは、本来のしルジン並び に非誘導ペプチドと比較するとより長い半減期を示すため、これらの投＋ｉは、 有利には非誘導ペプチドについて前記特定し、たものより十分低いものである。 この発明の組成物および組合せは、フィブリン溶解治療に有効な他の成分を更に 含有する。これらには、限定されるものではないが、ティシュ・プラスミノーゲ ン・アクナベータ、ウロキナーゼ並びにス）・レプトキナービが包含される６、 ：れらの他の化合物は２、ｉの発明のヒルジ〉゛ベプチ１シ含有組成物中て゛、 別の成分とｌ、′ξ存在し得る。その他２．−のしルジンベブチドはこの種のフ ィブリン溶解剤と共Ｖさぜるごとがで゛きる。共役は当業界で公知のいずれかの ｊ〕−法によ−フて行）ことができる、しルジンベプヂドおよびクイプリン溶解 １４４Ｊ　（Ｉ、単独分子として、ずなわぢ紐換えＤＮＡ技術または試＠管内合 戒によって製造される融合蛋白質の形態で存在し得る。 またこの発明は、この発明のしルジンペプチドを含有する組成物、およびこの種 の組成物を腫瘍転移の処置に使用する方法に関する。転移性生育の阻害を介する 腫瘍転移の処置に対するこの発明のヒルジンペプチドの有効性は、ある種のガン 細胞中に存在する予備凝固酵素の存在に基く［ニー・ファ　゛ランガとニス・ジ ー・ゴートン、「ガン予備凝固剤の単離と特徴：悪性組織に由来するジスティン グロチアーゼ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２４．　ｐｐ、　５５５８−６ ７　（１９８５）；ニス・ジー・ゴートンら、［アミニオンーコリオンに由来す るシステインプロテイナーゼ予６１凝固剤Ｊ　、Ｂｌｏｏｃｔ、　６６、　ｐｐ 、　１２６１−６５　（１９８５）　；並びにニー・ファランゲら、［急性ロイ ケミアにおける新しい予備凝固剤Ｊ　、Ｂｌｏｏｄ、　７Ｌ　ｐｐ、　８７０− ７５　（１９８８）］　、この酵素は、凝固カスケードにおいて因子Ｘの因子Ｘ ａへの変換を活性化し、この結果フィブリンが沈澱し、次に腫瘍生育の基質とし て働く、シ、たかって、因子）（ａ、トロンビンまたは両者の阻害を介してフィ ブリンの沈澱を阻害することにより、。 本発明のしルジンベブチドは、有効な抗転移腫瘍剤として働く。この発明のペプ チドによって処置され得る転移性腫瘍の例には、限定されるものではないが、脳 のカルシノーマ、肝臓のカルシノーマ、肺のカルシノーマ、骨カルシノーマ並ひ ゛に新生ブラスマ細胞カルシノーマが包含される。 またこの発明は、低薬量のこの発明のペプチドおよびアナログを用いてトロンビ ン誘導血小板活性化およびトロンビン誘導内皮細胞活性化を阻害する方法および 組成物に関する。 この発明の方法および組成物によって行われる内皮細胞活性化の阻害には、これ らの細胞による血小板活性化因子（ＰＡＦ）合成の抑制が包含される。この阻害 の機構は、トロンビン誘導炎症（ＰＡＦによって媒介されると考えられている） を特徴とする疾患の処置において重要な意味を有する。 また本発明は、低薬量のこの発明のペプチドおよびアナログからなる組成物、お よびトロンビン誘導炎症を特徴とする疾患に罹患した患者の処置にこれらを用い る方法に関する。この種の疾患には、限定されるものではないが、成人呼吸困難 症、敗血ショヅク、敗血症並びに局所再潅流障害が包含される。 低薬量のヒルジンペプチドを使用することにより、驚くべきことに期せずして、 抗凝固剤活性を最少としつつ、前記した阻害活性を処置した患者において達成す ることができる。 よつζ、ヒルジンペプチドの低薬量の使用は、血小板および内皮細胞の活性化の 阻害またはトロンビン誘導炎症を特徴とする疾患の処置が、随伴する抗凝固剤効 果を伴うことなく望ましい状況の場合に有利である。 この発明による血小板および内皮細胞活性化を阻害する好適な組成物は、約０． ０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約０．０９９ｍｇ／ｋｇ体重からなる。更に好ましく は、これらの組成物は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ体 重からなる。 またこの発明は、体外血液の抗凝固剤として、ヒルジンペプチドまたはこれらを 含有する組成物の使用に関する。この出願で使用されるように、用語「体外血液 」には２．導管を介して患者から除去され、体外処置に供せられ、その後透析手 順または血液ろ過または手術の際の血液バイパスのような方法で患者に戻される 血液が包含される。またこの用語には、患者に対する最終的な投与のため体外に 保存される血液製品も包含される。この種の製品には、全血、血漿または凝固が 望まれるいずれかの血液画分が包含される。この種の組成物は、前記した注射し 得る調製物に類似するものである。これらの種類の活性ペプチドの量または濃度 は、処置される血液の容量、またはより好ましくはそのトロンビン含量を基礎と し得る。 まなこの発明は、ヒルジンペプチドの生物分析的使用、または血液サンプルにお いて因子ＩＸａ、因子Ｘａ、トロンビン、またはこれらの混合物を測定するため のこれらを含有する組成物に関する。これらのペプチドおよび組成物は、従来の アッセイにおいて用いられた試薬に類似する様式で使用することができる。更に 、この発明のペプチドは、因子ＩＸａ、因子Ｘａ、トロンビン、またはこれらの 混合物を検出するために設計された現在利用可能な方法およびキットに利用する ことができる。 更に、本発明のペプチドは、ヒトおよび他の動物における生体外血栓イメージン グに使用することができる。この発明の１つの態様では、しルジンペグチドをラ ジオアイソトープにより放射能ラベルする。ラジオアイソトープの選択は、周知 の多数の因子、例えば毒性、生物学的半減期並びに検出性に基く、好適なラジオ アイソトープには、限定されるものではないが、Ｉ２％ｌ、Ｉ”Ｉ並びに１１１ 　Ｉｎが包含される。ペプチドをラベルする技術は当業界で周知である。最も好 ましくは、ラジオアイソトープを１２３１とし、１２１１−ポルトン・フンター 試薬を使用してラベルを行う、好ましくは静脈内経路によりラベルしたペプチド を患者に投与し、フイブリンクロヴトに含有されるトロンビンに対する結合を行 う、このクロッ１〜を、その後周知の検出手段、例えばコンピュータ・イメージ ング・システムに接続した放射活性を検出し得るカメラを利用することにより観 察する。またこの技術は、血小板結合）・ロンビンおよびメイゾトロンビンのイ メージを与える。 またこの発明は、ここに記載するしルジンペプチドのペプチドミメティックアナ ログに関する。ペプチドミメティックアナログは、親ペプチドに含有される活性 部位の三次元構造を模倣するものである。これらのアナログは、その対応するペ プチドと同様の活性を示すと考えられる０本発明のＷ様によれば、しルジンペプ チドのアナログは、性状において半ペプチド性または非ペプチド性とすることが できる。これらのペプチドミメティックアナログは、親化合物と比較した場合、 有利には増加した保存寿命および生物学的安定性を示す、更に、本発明のペプチ ドミメティックアナログの生物学的利用性は、経口または局所経路で投薬した場 合、対応するペプチドより大きいものとなり得る。更に、これらのアナログは、 増加した抗凝固剤活性を示す。 またこの発明は、トロンビンと共有結合を形成し得るこの発明のしルジンペプチ ドのアナログに関する。１つの態様によれば、これらのアナログは、ペプチドの アミノ末端に付着したジニトロフルオロベンジル基の存在を特徴とする。他のＷ ！Ａ様によれば、これらのアナログは、チロシンまたは誘導チロシンの置換、並 びに他のいずれかのよりカルボキシ末端残基にトロアニソールによる）を特徴と する０両方のアナログの種類は、トロンビンと共有結合を形成する能力を有し、 したがってその分子についてより大きい親和力を有する。このより大きい親和力 の結果として、これらのヒルジンペプチドアナログは、イオン性相互作用を介し てトロンビンに結合するこの発明の他のヒルジンペプチドより実質的に大きい効 力を有する。 この発明のペプチドミメティックおよび共有結合アナログは、ここに記載するヒ ルジンペプチドのものと同様の生物学的活性を特徴とすることを理解すべきであ る。よって、この発明のペプチドと同一の様式で、これらのアナログを組成物、 組合せ並びに診断、治療および予防の方法に用いることができる。 まなこの発明は、アルギニン残基につきに５ｐｑｓまたはＡｓｎ５ｉの置換を特 徴とする以外は前記したペプチドと同一のヒルジンペプチドに関する。これらの ペプチドは、血小板表面糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａに結合し、阻害するＡＩ−ｇ ｓ３−Ｇ　１　ｙ　ｓじ−ＡＳｐｓｓ配列を含有する。これらのペプチドは、驚 くべきことに期せずして、全ゆるアゴニストによって誘導された血小板活性化に 対する阻害活性、並びに抗凝固剤活性の両方を示す、更に、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａ ｓｐ配列の存在は、血小板が豊富なりロットの部位に対しこれらのペプチドを標 的とするよう働く、ペプチドがこの標的に一旦到達したならば、これらは付加的 な血小板凝集およびフィブリンの生成の両方を阻害する。この作用により、血液 クロットの仲襲が回避され、この結果増加したクロット溶解が有効に与えられる 。 これらの新規なペプチドは、凝固時間を増加させ血小板活性化を阻害する二元的 な効果を達成する組成物および方法に用いることができる。 本発明の他の態様によれば、ヒルジンペプチドまたはアナログの１つまたはいず れかの組合せを、患者に挿入する侵入器具を被覆する組成物および方法に使用す ることができる。 これらの組成物および方法は、結果的にこの種の器具を受容する患者の血栓合併 症の危険を低減する。この発明の方法および組成物によって被覆され得る表面と して、プロテーゼ、人工バルブ、血管移植片、ステント並びにカテーテルのもの が例示される。これらの表面の被覆を行う技術は当業界で公知である。これらに は、しルジンベブチドまたはアナログ含有組成物の器具表面への化学的架橋結合 または物理的吸着が包含される。 この発明がより十分に理解されるべく、以下の実施例を記載する。これらの実施 例は説明の目的のためのみであり、如何なる様式によってもこの発明を限定する ものとして解釈すべきでないことを理解すべきである。 後記するペプチド合成の全ての例において、合成ペプチドのアミノ酸分析を行っ た。アミノ酸加水分解物は、６Ｎ塩酸中真空下にて１１０℃で２４時間処理し、 そめ後ベックマン・システム６３００アナライザを用いるイオン交換クロマミー グラフィを行うことによって調製し、た。 通常は逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃにより合成ペプチドの純度を分析し、た。 特に示さない限り、それぞれベックマン液体クロマトグラフシステムまたはアプ ライド・バイオシステムス１５０Ａクロマトグラフシステムを使用し１、バイダ ックＣ４カラム（０，４６Ｘ２５ｃｒｎ）＊たはアクアボアＲＰ　−３００Ｃ＠ カラム（０，４６Ｘ３．Ｏｃｍ＞に対し、ペプチドサンプル（２０・〜１００μ ｇ）を適用した。バイダックＣ４カラムは、ｏ、ｉ９５トリフルオロ酢酸（ＴＦ Ａ）を含有する水中で平衡化し、同一のＴＦＡ含有溶媒中における０〜８０％の 増加するアセトニトリル濃度によるグラジェントを用いて展開した。 このグラジェントは、１．０ｍｌ／分の流速で３０分間に渡って展開した。溶出 流は吸光度について２１５ｎ、ｍでモニタ１７た。アクアボアＣ８カラムは０． １％ＴＦＡを含有する水中で平衡化し、０．０８５％ＴＦＡ溶媒中のＯ・〜７０ ％のアセトニトリルの増加するグラジェント・を用いて展開した。このグラジエ ンＩ−は、０．５ｍＪ−／分の流速で４５分間に渡って展開１２な、その後溶出 流は吸光度について２１４　ｎ　ｒｒｔでモニタ１．た。 犬■皿−１ 亘、ルジン５！−６４およびヒル吐４１−４４　（工鉦或ヒルジンＳ！１−４４ はアミノ酸式：　Ｈ２Ｎ−Ａｓ　ｎ−Ｇ　１　ｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌ　ｕ− Ｇｌ　ｕ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇ　ｉ　ｕ　−’ｒｙ　ｒ−Ｌ　ｅ　 ｕ　−ＣＯＯＨを有する。 ヒルジンクト、、はアミノ酸式；Ｈ＞　Ｎ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｈｉ　ｓ　−Ａ、 　ｓ　ｎ　−Ａ　ｓ　ｎ　−Ｇ　ｌ　ｙ　−Ａ　ｓ　ｐ　−Ｐ　ｈ　ｅ　−Ｇ　 ｌ　ｕ−Ｇｉｕ−・Ｔ　ｍｅ−Ｐｒｏ−ＧＸｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌ　ｅ　ｕ　 −Ｃ，００Ｈを有する。ごれ１．、のペプチドを単一合成の部分と）、７て、ア プライド・バイオシステムス４３０Ａペプチド合成装置（アプライド・バイオシ スｊムス、フォスター・シティ、シーニー・）を用いる固相ペプチド合成によっ て調製した。 特に、０．２５９ｍｅｑのＢｏａ−Ｌｅｕ−０−樹脂（１％ジビニルベンゼン樹 脂（ＤＶＢ））を順次に２ｍｍｏｌの保護アミノ酸と反応させた。　ｉ　ｉ、　 ？イクルの合成の後、０．４２ｇの湿潤樹脂を反応容器から除去した。残留する ０、４３ｇの湿潤樹脂の両分な・１サイクルについで２ｍｍｏｌの保護アミノ酸 と２回反応させた。このように［２て合成したヒルジン。１４およびＩニルジン ４１１−６４は十分Ｃ：脱保護され、無ホＨＦ：Ｐ−クレゾール：エチルメチル 硫酸（１０：　１　：　ｉ、ｖ／ｖ、’ｖ）を用いる処理によ−フて樹脂から開 裂された。ペプチドの収量は、；ｆｉｌ−ぞれしルジン４？−４４およびピルジ ン５ト。４について５６％および５３％であっ、た。 ペプチドを別個にＨＰ　Ｌ　Ｃ分析することにより、高度の純粋性およびそれぞ れヒルジン４１−６４およびヒルジン’Ｊ）−１！４について、１６．１分およ び１６．３分に溶出する２１４ｎｍＫ１且ユ ース　Ｔｒ＝Ｌｅｕ　ヒルジン５トロ２の４デス（Ｔｙｒ−Ｌｅｕ）ヒルジン９ Ｍ−６２はアミノ酸式二Ｈ２Ｎ−Ａ、５ｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ　Ｐｈｅ−Ｇｌｕ− Ｇｌｕ−Ｘ　Ｉｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−ＣＯＯＨを有する。デス（Ｔｙｒ −Ｌｅｕ）ヒルジン１１−６２を次のようにして調製した： 最初に、カルボキシペプチダーゼＡを調製した。主としてアール・ビー・アンブ ラー、［カルボキシペプチダーゼによる酵素的加水分解Ｊ　、Ｈｅｔｈｏ、ｄｓ 　ＥｎｚｙＩｌｏｌ、、　２５．パートＢ、ｐｐ、　１４３−５４によった。酵 素（１，Ｏｎｎｇ）４℃で１．Ｑｍｌの脱イオン水に懸濁し、ミクロ遠心装置で 遠心分離した。上澄を排液し、１００μｍの１％重炭酸ナトリウムを沈澱に加え た。その後、沈澱が溶解するまで０．ｌＮＮａＯＨを滴下した。その後０．１． ＮＨＣｌを滴下添加することによりＰＨを８．０に調整した。０．１ＭＮ−エチ ルモルフォリン酢酸、ｐＨ８，２５を添加することにより酵素の濃度を１ｍｇ／ ｍ１に調整した。 実施例１で調製した１、３ｍｇのヒルジン５３−６４を２５０μｌのＮ−エチル モルフォリン酢酸、ｐＨ８，２５（１，０ＭＮａＣｌを含有する）に溶解した。 その後前記調製した３０μｍ（３０μｇ）のカルボキシペプチダーゼＡを添加し 、反応系を２時間３７℃でインキュベートした。 アクアボアＲＰ　３００Ｃ＊カラム（０，４６ｘ３．Ｏｃ　ｍ　）およびアプラ イド・バイオシステムス１５０Ａ液体クロマトグラフィツクシステムを用いる逆 相ＨＰＬＣによってペプチド断片を精製した。０．１％ＴＦＡを含有する水中で カラムを平衡化し、０．０８５％ＴＦＡ含有溶媒中で０．５ｍｌ／分の流速で４ ５分間に渡り０〜３５％の増加するアセトニトリル濃度のグラジェントを用いて 展開した。溶出流は２１４　ｎｍの吸光度についてモニタした０手動で両分を集 め、真空下で乾燥し、アミノ酸組成およびヒト血漿の凝固時間に対する効果につ いて分析した。デス（Ｔｙｒ−Ｌｅｕ）ヒルジン％５−６２は、残留する元のヒ ルジンラド鴫、のいずれよりも先に溶出することが認められた。 衷豊■ユ ヒルジン、７４４のム ヒルジン５７−４４はアミノ酸式：Ｈ２Ｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉ　１ｅ−Ｐｈｅ −Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＣＯＯＨを有する。ヒルジンＳ？−６４を 合成するため、実施例１に概説した手順に従った。ただし、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−０ −樹脂（１％ＤＶＢ）の代りに０．５５ｍｍｏｌのＢｏｃ−Ｌｅｕ　０ＣＨ２Ｐ ＡＮ樹脂（１％ＤＶＢ）（アプライド・バイオシステムス）を使用した。その後 、共役のそれぞれのサイクルで２ｍｍｏ　１の保護アミノ酸を添加した。粗製ペ プチドの収量は１７．９％であった。ＨＰＬＣ分析により、グラジェントにおい て１４．２分で溶出する単一の主要ピークが明らかとなった。 Ｘ豊［４ ヒルジン４５−４４二査羞 ヒルジン４％−６４はアミノ酸式：Ｈｔ　Ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ −Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｈｌ　５−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌ ｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ　−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＣＯＯＨを 有する。０．２５９ｍｅｑのＢｏｃ−Ｌｅｕ−０−樹脂（１％ＤＶＢ）を使用し てヒルジンＡ％−４４を合成した２実施例１に概説した手順に従った。ただし、 最初の１３サイクルの合成につき、それぞれの共役工程で２ｍｍｏ　１の保護ア ミノ酸を使用した。残る６サイクルの合成につき、２ｍｍｏｌの保護アミノ酸を ２回使用した。無水ＨＦ：ｐ−クレゾール：エチルメチル硫酸（１０：１：１、 ｖ　／　ｖ　／　ｖ　）で処理することにより、ペプチドを十分に脱保護し、Ｄ ＶＢ樹脂から脱共役させた。３０％酢酸で樹脂を抽出することにより約１００ｍ ｇのペプチドを回収した。ヒルジン４％−１６４の収率は１７％であった。 ＨＰＬＣ分析により、生成物における高度の純度（〉９０％）およびアセトニト リルグラジェントにおける１４．４分の２１４ｎｍ吸収物質の単一の主要ピーク が明らかとなった。 尺１五二 ヒルジン％％−６４のム ヒルジンｓ％−６４はアミノ酸式：Ｈｚ　Ｎ−ＡｓＰ−Ｐｈｅ−Ｇｌ　ｕ−Ｇｌ ｕ−Ｉ　１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌ　ｅ　ＩＩ−ＣＯＯＨを有 する。実施例１に概説した手順によってヒルジン５Ｓ−６４を調製した。０．０ ２５９ｍｅｑのＢｏｃ−Ｌｅｕ−０−樹脂（１％ＤＶＢ）を使用した。その後、 それぞれの共役サイクルで成長するペプチドに２ｍｍｏｌの保護アミノ酸を添加 した。先の例と同様にして脱保護および樹脂からの開裂を行った。このペプチド の回収率は３０％であった。 ＨＰＬＣ分析により、サンプルにおける高度の純度（〉９５％）およびアセトニ トリルグラジェントにおける１６．１分の単一主要ピークが明らかとなった。 尺腹■玉 ヒルジン６４−４％の４ ヒルジン６４−４５はアミノ酸式：Ｈｔ　Ｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ −Ｐｒｏ−Ｉ　１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓ ｎ−Ｈｉｓ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨを有 する。実施例１に概説した手順によってヒルジン６４−４８を合成した。ただし 、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−０−樹脂（１％ＤＶＢ）の代りに０．２５９ｍｅｑのＢｏｃ −０−ベンジル−し−Ｔｈｒ−０−樹脂（１％ＤＶＢ）を使用した。最初の６サ イクルの合成について、それぞれの共役工程にお（１て２ｍｍｏｌの保護アミノ 酸を使用した０合成の残りのサイクルについて、２ｍｍｏｌの保護アミノ酸を２ 回使用した。ペプチドは、十分に脱保護し、無水ＨＦを用いる処理によってＤＶ Ｂ樹脂から脱共役させた。３０％酢酸を用いる抽出の後、１２０ｍｇのペプチド を回収し、ヒルジン６４−４１の収率は１９．９％であった。 ペプチドのＨＰＬＣ分析により、調製物中の高程度の純度（〉９０％）およびア セトニトリルグラジェントにおいて１３．７分で溶出する単一の主要ビークが明 らかとなった。 この発明の種々のペプチドの抗凝固剤活性を測定する対照としてヒルジン４４− ４％を使用した。 Ｘ１孤ｌ ヒルジン＄４−４４のム ヒルジン５４−６４はアミノ酸式：　Ｈ２Ｎ−Ｇ　１　ｙ−Ａｓ　ｐ　−Ｐｈｅ −Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉ　１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＣＯ ＯＨを有する。実施例１に概説したのと同様の手順によりヒルジン５４−６４を 合成した６合成のそれぞれの共役サイクルにおいて２ｒｎｍｏ　Ｉの保護アミノ 酸を使用した０合成後、ペプチドを十分に脱保護し、先の例と同様にＤＶＢ樹脂 から脱共役させた。 ＨＰＬＣ分析により、生成物における高程度の純度（〉６０％）および２１４　 ｎｍ吸収物質の単一主要ビークが明らかとなった。 火ｌ自Ｉ旦 ＨＰＬＣによるヒルジンベプ　ドの　を活性分析の目的のため、前記調製したヒ ルジン４％−６４、ヒルジン４９−６４並びにヒルジンｌ５−６４を、ウォータ ーズ・アソシエート（ミルフォードＭＡ＞液体クロマトグラフィシステムを用い 、調製用逆相ＨＰＬＣによって均一にまで精製した。 粗製ペプチド（それぞれ２５ｍｇのヒルジン４％−６４、ヒルジン４９−６４お よび３０ｍｇのヒルジン５Ｍ４４　）を水中の０．１％ＴＦＡの２．０ｍｌに溶 解した。更に１．０ｍｌの６Ｍ塩、化グアニジウムをヒルジンｌｌ−４４および ヒルジン５３−４４の粗製サンプルに添加して溶解度を増加させた。予め水中の ０．１％ＴＦＡ中で平衡化したバイダックＣ１，カラム（２２ｍｍＸ２５ｃｍ） にサンプルを別々に注入した。４．０ｍ１Ｚ分の流速で同一のＴＦＡ含有溶媒中 にて４５分間に渡り０〜８０％の増加するアセトニトリル濃度のりニヤグラジェ ントを用いてカラムを展開した。溶出流を２２９　ｎｒｎでモニタし、手動で画 分を集めた。 この発明による他のヒルジンペプチドも同様に調製し精製することができる。 尺施１Ｊ。 Ｎニー乙セチノしζ四ニ２ｚ上ヒ幻−ヱと含羞この発明のしルジンベグチドのＮ −アセチル化は、ペプチド合成の際に直接行った０例えば、Ｎ−アセチルヒルジ ン９％−１６４は、実施例１に記載したヒルジン＄１−４４を合成するのに使用 した基本的手順によって合成した。しかし、Ｎ−アセチル化を行うため、手順を 改変し、ペプチド合成の最終サイクルにおいて２ｍｍ、ｏｌのアスパラギ〉・に つき２ｍｍｏｌのＮ−アセチルアスパラギン１ｌｌｆ換を行った０本発明の他の ペプチドは、同様に、ペプチド合成の最終サイクルにおいて非アセチル化形態に つきアミノ末端アミノ酸のＮ−アセチル形態に置換することによって行うことが できる。 Ｘ凰正」１ 見肚乏ヱ△１１−二タ１Ｊ自Ｌ ヒルジン＄３−１１４をチロシン残基で〇−硫酸化してスルホ−Ｔｙｒ、、ヒル ジン＄３−４４を調製した。タナ力ら、「非硫酸化ペプチド前駆体からのチロシ ン−〇　［）ＩＳ］硫酸化コレシストカイニンオクタペプチドの調製Ｊ　、　Ａ ｎａｉ、　Ｂｉｏｃｈｅｉ、。 １５４、　ｐＩ）、　１９４−９９　（１９８６）の化学修飾手順を使用した。 実施例９で調製した１、５ｍｇのヒルジン５ｊ−４４を５０μｌのジメチルボル ムアミドに溶解し、この溶液をＮ２下で乾燥し２だ。 その後ペプチドを、２Ｘ１０−’モルの硫酸を含有する４０μｌのジメチルボル ムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、た、Ｓれに、４０μＩＤＭＦ　（７，０ＸＩＯ− ’モル）中に５０μｇのＮ。 Ｎ−ジシクロへＡジルカルボジイミドを含有するＩ　Ｑ　）ｉ、　ｌの溶液を添 加した。約５〜１０分間２５℃て′反応を行わせた後、７５０μｍの脱イオン水 を添加した。更に精製する前に、ミクロ遠心装置を用いる遠心分離によって全ゆ る不溶性反応生成物を除去し、た７ スルホーＴｙｒ、ｚヒルジン１１−４４を他のペプチドおよび反応成分から精製 した。バ、イダックＣ１，カラム（４，６Ｘ２５ｃｍ）およびアプライド・バイ オシステムス社液体クロマトグラフシステムを用いるＨＰＬＣによった。カラム を０，１％ＴＦＡ−水溶媒で平衡化１２．０．０８５％ＴＦＡ含有溶媒を用い、 ０．８ｍ！／分の流速で、９０分間に渡り０〜３５％の増加するアセト二ｌ・リ ル潰度のりニヤグラジェントによって展開した９両分を集め、スピード・バック 装置で乾燥し、脱イオン水に再懸浬した。第１図に示すように、２１４ｎｒｎ吸 収物質の多数のビークが解析された。 抗凝固剤活性についてビークのアッセイを行うことにより、２つの有効なスルホ −Ｔ　ｙ　ｒ　ｓｓヒルジン、、−〇含有画分くビークＡおよびＢ、第１０）を 同定した。中性ｐ、　ＨにおけるビークＡ、の紫外線スベクＩ−ル分析により、 ２５８〜２６４ｎｍの最大吸収が明らかとなり、修飾されたチロシン残基の存在 が示されたやビークＡのペプチドのアミノ酸分析により、ヒルジン！１Ｂ−１４ の補遺が確認された。データは、ビークＡがスルホ−Ｔｙｒ、、ヒルジン、４． を含有することを示１７た。 スルボー・Ｔ　ｙ　ｒ　＆！ヒルジン’３＄−６４の存在を確認した、ビークＡ のペプチドを、３０％ＴＦＡで６０’Ｃにて１時間処理して硫酸基を除去するこ とによった６ぞの捗ペプチドを乾燥し、これを水に再懸濁し、逆相ＨＰＬＣに供 した７脱硫酸化スルボーＴ　３’　ｒ　ｉｉ、’Ｌヒルジンｍ−６４のＨＰ　Ｌ 　Ｃ分析を行った。アクアボアＲＰ−３００Ｃ，カラム（０−４−６Ｘ　３−　 Ｏｃ　ｍ　）およびアプライドバイオシステムス１５０ＡＨＰＬＣ装置を使用し た。０．１％ＴＦＡを含有する水中でカラムを平衡化し、０．０８５％ＴＦＡ含 有溶媒中で０．５ｍｌ／分の流速で４５分間に渡り０〜７０％の増加するアセト ニトリル濃度のグラジェントを用いて展開した。このペプチドは、非硫酸化ヒル ジン１Ｂ−４４のものと同一のＨＰＬＣクロマトグラフ挙動を示した。更に、処 理したペプチドのピーク吸収は２７５〜２８０ｎｍに戻り、これは非修飾チロシ ン残基を含有するペプチドに典型的なものであった。 その後前記した硫酸化手順を、対応する大量のＮ−アセチル化ペプチドに適用し た。第２ａ図のＨＰＬＣクロマトグラムに示すように、ナカハラ法による２５ｍ ｇのＮ−アセチル−ヒルジンラド４４（実施例９で調製）の処理によって、８０ ．１％の収率で所望のＴｙｒ−ＫＨ化主生成物製造した。 しかしながら、反応を比例的に５０ｍｇのＮ−アセチル−ヒルジンラド６４に広 げる試みは、結果的に４８．５％の収量でよって、ナカハラ法の化学を顕著に改 変し、大スケール硫酸化反応において高収量のＴｙｒ−ＩＦＥｎ化誘導体を達成 した。 更に詳しくは、５．０ｍｌのＮ、Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミド（０，２ ｇ１０．１６ｍ１ジメチルホルムアミド）の存在下で４０ｍ１のジメチルホルム アミド中に１ｇのＮ−アセチル−ヒルジン５３−４４を溶解した。この混合物を Ｏ’Ｃで攪拌し、０．５ｍｌの濃硫酸を、沈澱が生成するまで反応混合物に滴下 添加した。５分後、４０ｍ１の水を添加することにより反応を停止した０反応混 合物の逆相ＨＰＬＣ分離（第２ｃ図）により、８１．７％の収量の硫酸化ペプチ ド、スルホ−Ｔ　ｙ　ｒ　ｏ−Ｎ−アセチル−ヒルジン９ｓ−６４が示された。 ！ｕ化しルジンペプチドの大スケール精製をその後、１工程の陰イオン交換クロ マトグラフィによって行った。詳しくは、粗製スルホ−Ｔ　ｙ　ｒ　ｉｊ−Ｎ− アセチル−ヒルジン１ｊ−４４を、ＤＥＡＥセファ０−ス（２５０ｍｌ湿潤樹脂 １５ｇ粗製ペプチド）上で精製した。カラムを予備平衡化し、２０ｍＭ酢酸ナト リウム、ｐＨ５，０中でサンプルを装填した。リニヤＮａＣｌグラジェント（０ 〜０．４Ｍ）によりカラムを展開した。スルホ−Ｔ７ｒａｓＮ−アセチル−ヒル ジン９Ｂ−６４は、約０．２〜０．３ＭＮａＣ１に溶出し、非硫酸化ペプチドの 後、ただし硫酸化副生物スルホ−Ｔｙｒｅｓ−Ｎ−アセチル−ヒルジン５ｓ−６ ４の前であった。 この発明の他のしルジンペプチドは、前記したのと同一の手順により、硫酸化し 精製し分析することができる。 Ｎ−アセチル−ヒルジン５Ｎ−６４を修飾して、実施例１０に記載したように、 スルホ−Ｔｙｒ、、−Ｎ−アセチル−ヒルジンラド４４の調製の際に、そのＴｙ ｒ−スルホン化誘導体、スルホニル−ＴｙｒｓｓＮ−アセチル−ヒルジン５ト４ ４とした争スルホニルー’ｒｙｒ、、Ｎ−アセチル−ヒルジン！＋１−４４は、 その実施例に記載した大スケール硫酸化反応の際に得られる副反応生成物である 。よって、スルホニル−Ｔ’５’ｒ＊ｓＮ−アセチル−ヒルジン１，４４は３０ 〜４０％の収率で得られ、逆相ＨＰＬＣ分Ｍ（第３図参照）においてスルホ−Ｔ 　ｙ　ｒ　ｉｓ−ヒルジン＄３−６ｆｆの前に溶出することが認められる。 犬１部［Ｌｌ ゞ　の−アッセイ この実施例は、この発明のヒルジンペプチドのトロンビンに対する阻害活性を示 す、活性化部分的トロンビンタイム（ＡＰＴＴ）の阻害により測定するものとす る。抗凝固剤活性は、コアグーＡ−メタ２００１装置（ジェネラル・ダイアグノ スティクス社、モリス・ブレインス、ニュー・シャーシー）を用い、プールした 正常ヒト・血漿（ジョージ・キング・バイオケミカル社、オーバーランド・パー ク、カンサス）（４：１、ｖ　／　ｖ、血漿：水で希釈）のＡＰＴＴをアッセイ することにより測定した。詳しくは、希釈した血漿をヒルジンペプチドの保存溶 液と混合した。濃度は水中にて７５０ＪＪ、ｇ／ｍｌ（非硫酸化ヒルジンペプチ ドについて）〜水中にて３５μｓ／ｍｌ（［酸化したヒルジンペプチドについて ）の範囲とした。血漿とヒルジンペプチドとを、それぞれのＡ　Ｐ　Ｔ　Ｔ測定 の前に最終容量１２５μｌで混合した。 ＡＰＴＴ測定毎にコアグーＡ−メタディツシュ（ジェネラル・ダイアグノスティ クス）のそれぞれの穴に対し、９２ｔｘ　ｌの粗製トロンポプラスティン溶液（ ジェネラル・ダイアクノスティクス）および１００μｌの０．３Ｍ塩化カルシウ ム試薬を添加することによりＡＰＴＴアッセイを開始した。 塩化カルシウムは、それぞれのアッセイの前に新鮮なものを調製した。活性化時 間は１８０秒で一定とした。ヒルジン５３−６４およびスルホ−Ｔ　ｙ　ｒ　ｉ ｓ−ヒルジン＠Ｍ−４４のＡＰＴＴを比較するこのようなアッセイの結果を第４ 図に示す、第４図は、硫酸化したしルジンベブチドは、対応する非硫酸化ペプチ ドより増加した凝固におけるより高いレベルの活性を有利に示すことを示す、ス ルホン化したペプチド、スルホニル−’ｒｙｒ、、ヒルジン１Ｂ−４４は、スル ホ−Ｔｙｒ、、ヒルジン５トロ４について認められたもめど同様のＡＰＴＴを示 した。 第５図は、この発明の種々のヒルジンペプチドのＭ　ＣＴ　ｓ　。 （凝固時間をＡＰＴＴアッセイにおいて観察される最大正味増加の５０％に増加 させるのに要求される１２５μｌの希釈血漿当りのペプチドのｎｍｏ　１　）の 比較を示す、ヒルジン５ト、４は０．７７のＭ　ＣＴ　ｓ　ｏを示す、このペプ チドの硫酸化対応物、スルホ−７３’　ｒ　ｏヒルジン５１−６４は、Ｍ　ＣＴ 　ｓ。における約１０倍の増加を有利に生起した。アスパラギン残基（ＡＳｎｓ ｓ）を欠損する非硫酸化ペプチド、ヒルジン５γ−６４は、陰性対照ペプチドし ルジン６４−４５と比較すると、増加する凝固時間に対して効果はなかった。同 様に、チロシン残基を含有しないペプチド、デス（Ｔｙｒ　Ｌｅｕ）しルジン■ −６２は、凝固時間において比較し得る増加を示さなかった。 アスパラギン残基の存在（公開されたＨＶ−２配列のＡ　Ｓ　ｉｌ　ｓｓに対応 する）および千ロジン残基（ヒルジン配列のＴｙｒ６ｓに対応する）は、この発 明のペプチドの抗凝固剤活性に重要であると考えられる。 Ｍ　ＣＴ　ｓｏの減少を生起するしルジンペプチドの全ては、二相薬量依存様式 で同様の挙動を示し、この場合、第１に狭い範囲のペプチドの濃度によりＡＰＴ Ｔの２０秒の増加が与えられ、第２により広い範囲のペプチドの濃度により凝固 時間において１かに付加的な１０〜１５秒の増加が結果的に与えられた。 トロンビンに対するこの発明のしルジンペプチドの特異性を解析するため、トロ ンビンタイム（Ｔ　Ｔ　）の増加に対するその効果を検討し、た、トロンビンタ イムはチルトチューブ法を使用して測定した。詳しくは、２．５Ｕ／ｍｌの濃度 で０゜ｉ　５ＭＮａＣ！および１０　ｍ　Ｍ　Ｃａ　Ｃｌ　２を含有する０、０ １Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ’７゜４中にヒトα−ニトロンビン（ダイ°アゲ、７ ノヌテイカ・スタガ、アスニエレ、フランス）を溶解し、た、　Ｏ”□　１０　 μｇ　／　ｍ　ｈのスルホ−Ｔｙｒｅｓヒルジン５Ｎ−藝４　（）’ロンビンの ０．８Ｕ／ｍｌ最終濃度）と予備混合しｌ′：＝２００μＩの正常ヒト血漿（ジ ョーシア・キング・バイオメディカル社、ＫＡ）と１００μｌのトＵンビン溶液 とを混合した７正常血漿のトロンビンタイムは典型的には１５秒であった。 算６図は、しルジン（シグマ、セン１−ルイス、ＭＯ）およびスルホ−Ｔｙｒ４ ｓヒルジン□−□によるトロンビンタイムの増加の比較を示す。３．３ｘｔｏ− ”Ｍスルホ−Ｔ　ｙ’　ｒ　ｉｓヒルジン５１〜６．の濃度はＴ　Ｔを１Ｓ〜５ ５秒増加させた。しルジンに対する比較により、スルホ−Ｔ’ｙｒ＊ｓヒルジン ５１−６４は、トロンビンに対する約５０倍大きいモル特異的阻害活性を示した 。これらは、ＡＰＴＴアヅセイにおいて認められた相対阻害活性と同じである。 前記したように、アッセイした非硫酸化ペプチドの最大抗凝固剤能力はヒルジン ５４−４４によって示された。ｉｋ少の２倍の阻害活性における減少は、ＡＳｎ ｓ３に対応するアスパラギン残基の除去に際して結果的に得られたものである。 ヒルジンｌｆｆ−４４からＣ−末端１”ｙｒおよびＬｅｕ残基を除去すると、妥 当な阻害活性を有さないペプチド、ヒルジン５トロ２が与えられた・硫酸化しル ジン９Ｎ−６４＜スルホ−Ｔｙｒｅｓヒルジン５ｍ−６４）は、その非硫酸化対 応物と比較すると１０倍の凝固時間の増加を示し、た３ これらの観察に基き、９元のしルジンペプチドのＣ−末端アミノ酸残基は、少な くとも一部は２蛍白質の抗トロンビン活性において作用すると考えられる。また 、元のヒルジンにおいでごれらのＣ−末端残基内に含有される断片（ヒルジンペ プチド鎖に対して反対方向、すなわちＣ００１−ｆからＮ１（２末端）は、ヒト のトロンボモチニリンの提案されなト・ロンンビン結合ドメイン内に含有される 断片と相同であることを認めた「ディ・ウェンら、［シトの）　ｃＺンボモデ、 ２す〉・′：仝二ｃＤＮＡ配列および遠伝子の染色体＠在化Ｊ　、　Ｂｉｎｃｈ ｅｆｆｉｓ↑ｒｙ。 ２Ｇ、　ＤＩ］、　４３０５−５７　（１９８７）］　。 トロンボモモチリンは内皮細胞人血糖蛋白質であり、こ７′（はトｔ：Ｚンビン と化Ｔ量論複合体を形成するＬシー　・アイ・ニスマン、「自然抗凝固経路の制 御Ｊ　、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３５．　ｐｐ。 １３４８−５２　（１９８７川、ヒルジンにおけるＣ−末＠断片とトロンボカデ ユリン前駆体の残基１５０〜１５５との相同性の同定は、このトロンボカルモデ ユリン中の断片はトロンビンとの複合体形成に寄与することを示唆する。しルジ ンートロンビン［ジエイ・エル・クルステナンスキイとニス・ジエイ・テ／−７ オ、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、　２１１．　ｉｌ＋）、　１０−１６　（１９８７ ）　：ｌおよびトロンボカルモデユリン−１へロンビン複合体形成の両者は、触 媒部位によりプロテイナーゼを与えることが先に示された。 また、これらの観察は、フィブリノペプチド（生産モードにおける）および１− ロンボモデコ６りンおよびヒルジンの両者（阻害モードにおける）の構造成分は 、トロンビンにおいて基質認識部位と相互作用し、これによりフィブリノーゲン の結合が適合されることを示唆する。しルジンペプチドのトロンビンへの結合が 蛋白質Ｃの活性化を生起し２、これにより更に（の因子Ｖａおよび■ａの蛋白質 Ｃを介する生体内抗凝固剤特性が促進されると考えられる。またヒルジンはトロ ンビンの触媒活性を低減させるため、これがこの特性を共有する可能性は低い、 よって、この発明のしルジンベグチドの抗凝固剤活性は、トロンビンの非触媒的 部位に対するペプチドの結合から誘導され得、したが−Ｊてフィブリノーゲンの トロンビン触媒加水分解についての増加したに、、が与えられると考えられる。 艮菫遭」ユ ヒト１へ旦乙互−２刃」ｊ」已ｄ１とヒ五乙九上９−竺１１しトα−トロナビン に対するしルジンペプチドの特異性を、ＴＴアッセイにおけるし！・α−トロン ビンおよびウシα−トロンビンの両方に対するその相対阻害活性を比較すること により測定した。第７図は、スルホ−Ｔ　ｙｒ　＆！ビーＮ−アセチルーヒルジ ンＳ！１−４４は、ウシα−トｌ′２ンビンよりヒトα−トロンビンの阻害剤と して４〜．５倍活性である、−とを示す。しトα−トロンビンおよびウシα−・ トロンビンは構造においては極めて類似し２ている。Ｉ、二だし７、ヒト分子の β−鎖の１．４９位丁の独特のりジン残基の存在は別て゛ある。この残基は、７ ・−自己触媒分解の部位を特定しでいも。ヒトα−トランビンのＬｙｓ・−１４ ９は、この発明のしルジンペプチドがトロンビンに結合する重要な構造決定基で あると考え八〆する。 火見、１４ ヒルジンとトロンビンとの相互作用は、ヘパリン／アンチトロンビンＩＩＩＩＴ によって返断されることが示されている［ニス・アール・スト・−・ンとジエイ ・ホフステリツジ、１トロンビンとしルジンとの間の相互作用に対するヘパリン の効果Ｊ、Ｅ旧′１．．ｉ、　Ｂ１０ＣｈｅｌＩ１．、１６９．　Ｄ！］、　３ ７３−３−／６．　（’ｔ９８７）］　１．この結果は、ヒルジンおよびヘパリ ン／アンチトロンビンＸＮＩの双方がその酵素の触媒部位を遮断ずεトロンビン と複合体を形成することに帰せら４する。この発明のヒルジンペプチドは、トロ ンビシのフィブリノーゲン溶解性は阻害するが、アミド溶解性活性は阻害し、′ ｆＪ、いことが認められた。よつて、ヒルジンペプチドが、抗凝固ヒト血漿に対 しヘパリンと付加的または共同的いずれに作用するか決定するアッセイを行った 。プールした正常ヒト血漿を使用し、ＡＰＴＴアッセイにおいて、しルジンペプ チドとヘパリンとの共同作用が認められた。 第８図は、しルジンペプチドスルホーＴ　ｙ　ｒ　ａｓヒルジン＄３−４４単独 、ヘパリン単独、またはこのペプチドとヘパリンとの組合せを使用した投与量依 存性ＡＰＴＴアッセイの結果を示す、ＡＰＴＴアッセイは、実施例１２と同様に して行った。ヘパリン（シグマ、セントルイス、ＭＯ）およびスルホＴｙｒａｓ ヒルジンｌ５−６４　（実施例１０と同様に調製）の両者を１０μｇ／ｍｌの濃 度で使用した。結果は、スルホ−Ｔｙｒ、、ヒルジン１１−１４およびヘパリン の組合せは、いずれかの分子単独またはこれらを組合せた抗凝固剤活性の予想合 計効果より大きい正味の凝固時間の増加を与えたことを示す。 ヘパリン使用は出血合併症を伴うため、この種の組合せは、低薬量のヘパリンを 使用し抗凝固剤効果を達成するのに有利である。 犬ｌ」ＬＬ旦 トロンビンゝ　の トリペプチジルｐ−ニトロアニリド基質トシル−Ｃ，ＩＪ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ　ｐ −ニトロアニリド（クロモシムＴＨ、ベーリンガー・マンハイム、インディアナ ポリス、Ｉｎ）のトロンビン触媒加水分解の阻害について、この発明のピルジン ペプチドを、キャリイ２１９ダブルビーム分光光度計により４２０ｎｍで分光光 学的に分析した。１０μｌのトロンビン溶液（ウシ血漿トロンビン、カルビオゲ ム、ベージング・ダイアグノスティクス、ラジョラ、ＣＡ、Ｏ，１Ｍトリス−Ｈ Ｃｌ、ｐＨ７，４，０，１５ＭＮａＣ１中、Ｏ，１ｍｇ／ｍｌ）と１．０ｍｌの ０．１Ｍ）リス−）（ＣＩ、ｐＨ１，４，０，１５ＭＮａＣ１１衝液とを混合す ることにより反応物を調製した。その後２５μｍの基質溶液（前記緩衝液中の４ ｍｇ／ｍｌトシルーＧｌ　ｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐ−ニトロアニソール）および １．０ｍｇ／ｍｌ保存溶液から変動する量のヒルジン４１６４　（実施例４と同 様に調製）を添加し、最終固定容量を１．０３５ｍ１、トロンビンおよび基質の 最終濃度をそれぞれ２．８Ｘ１０−”Ｍおよび１．４Ｘ１０−’Ｍとした。 ４．２Ｘ１０−’Ｍ〜２．ｌＸ１０−’Ｍの濃度で、ヒルジン４１−４４は、人 工基質のトロンビン触媒加水分解に対して測定し得る阻害効果を示さなかった。 これに対し、１．２および２．４Ｘ１０−”Ｍ濃度の元のヒルジンは、４８％お よび７３％の阻害効果を与えた。これらの観察に基き、ヒルジンのＣ−末端２１ アミノ酸に対応するペプチド、およびその類似する誘導体は、小さい合成基質の トロンビン開裂を阻害しないと考えられる。これは、本発明のペプチドはトロン ビンの触媒部位に結合しないという我々の考えと完全に合致する。よって、この 発明のペプチドによって示される凝固時間に対する阻害効果は、触媒部位以外の トロンビンの部位に対するその親和力によるものと考えられる。 Ｋ腹且１互 ゝの その後、スルホ−Ｔｙｒ、ｊビルジ２９Ｍ−６４のＢ　ａ　Ｉ　ｂ　／　ｃマウ ス（チャーレス・リバー・ラボラトリイス、ボストン、マス）への静脈注射によ り、この発明のしルジンベブチドの生体内における凝固時間の投与依存性の増加 を測定した。 １０．１００並びに２５０μｇのスルホＴｙｒａｓヒルジン！３−４４を含有す る投与物を動物に注射した。５分後、動物から採血した。クエン酸処理した容器 に血液を集め、遠心分離によって血漿を単離した。実施例１２に記載した方法に より、活性化部分トロンビンタイム（ＡＰＴＴ）についてマウス血漿をアッセイ した。第９図は、スルホ−Ｔ’ｙｒｓｓヒルジン５Ｍ−６４はマウス血漿のＡＰ ＴＴにおいて生体内で投与依存性増加を与えることを示す。 Ｋ１豆工ｌ スルホＴ　ｒ６．ヒルジン５ｊ−６４のポリエ　ジングリコ：」」１文量−α皿 ｌこの発明のヒルジンペプチドと薬学的に許容し得る重合体とを共役させ、ペプ チドの半減期の増加を図った。更に詳しくは、ポリエチレングリコール、ポリエ チｌ／ングリコールＮ−スクシンイミドスクシネート（ＳＳ−ＰＥＧ、平均ＭＷ ＝５．０００）の誘導体を調製した。従来の方法［アブチョウスキイら、Ｃａｎ ｃｅｒ　Ｂｉｏｃｈｅｉ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　７．　ｏｐ、　１７５−８６ （１９８４）］によった、その後、実施例１０で調製した１００μｇのスルホ− Ｔｙｒｏヒルジン５Ｂ−６４を２００μｌの２０ｍＭホウ酸ナトリウム、ＰＨ９ ，０に溶解し、これを５０倍モル過剰Ｓ　Ｓ−Ｐ　Ｅ　Ｇと反応させた０反応系 を室温で一夜放置し、その後逆相ＨＰＬＣに装填して精製および特徴付けを行っ た。 逆相ＨＰＬＣは、アプライド・バイオシステムス１５０Ａクロマトグラフィクシ ステムを使用し、アクアボアＲＰ−３００Ｃａカラム（０，４６Ｘ３．Ｏｃｍ） を使用して行った。０．１％ＴＦＡを含有する水中でカラムを平衡化し、０．５ ｍｌ／分の流速で４５分間に渡り０．０８５％ＴＦＡ溶媒中で０〜５０％の増加 するアセトニトリルのグラジェントを用いて展開した。溶出流は吸光度につき２ １４ｎｍでモニタした。スルホ−Ｔ　Ｖ　ｒ　＊ｓシルジン５トロ４の５Ｓ−Ｐ ＥＧ誘導体は、非誘導形態より前に溶出され、ブロードなピークに含有されてい ることが認められた。スルホ−Ｔｙｒｉｓヒルジン８３−６４の誘導および非誘 導形態の両者の抗凝固剤活性の比較により、ＡＰＴＴの増加における同一の投与 依存性が明らかとなった。よって、８３−ＰＥＧ−スルホ−Ｔｙｒ＊ｓヒルジン ５ト４４は、その非誘導対応物と比較した場合、循環半減期における予想された 増加を有利に示す本発明のペプチドの活性誘導体である。 尺１皿１１ ａお　ａの　へ二二皇ま 因子ｒＸａは因子Ｘの因子Ｘａへの活性化を触媒し、スルホＴｙｒｏヒルジン＄ １−４４は因子Ｘａによる小さい発色基質Ｓ　−２２２２のｒＷｉ裂を阻害しな いというｉｓに基き、スルホ−′Ｉ″Ｖｒ６ｊヒルジン５ｊ−４４による因子Ｉ Ｘａの阻害を測定した。 コアデスト・ファクター■アッ七イキット（カビビトルム、ヘレナ・ラボラ）− リイス、ビ、ｌ−モンＹ・、′ｒＸ）により因子ＩＸ　ａ　／因子Ｘ　、／リン 脂質混合物を調製した。製造業者の指示により、実施例１０で調製した種々の濃 度のスルホ−Ｔ′、ｒｒｓｓヒルジン９３−６４　（０−６６−７μｓ／　ｍ、 　１　）の存在下とした。製造業者によって推奨されたようにして、２５＋ｎＭ ＣａＣ１２および正常し１′・血漿の内分を添加することにより、ｉの混合物を 活性化した。サンプルを３７℃で１０分間インキュベートした後、それぞれのサ ンプルに１００μｍのＳ　２２２２ｆ４’４（カビビトルム、ヘレナ・ラボラト リイス、ビューモント、′「Ｘ）を添加１−２な、酸性にすることにより５分後 に反応髪停止１．た。Ｓ−２２２２開裂の程度は４０５ｒｔ　ｍで分光光度的に 追跡しな。、 第１０図は、スルホ−”　’１’　ｙｒ　６３ヒルシ゛ン、ｊ−□は、このア・ ・Ｉセイにおいて投与依存性Ｓ−２２２２開裂の阻害を示ずことを示ず、このペ プチドは３−２２２２の因’Ｆ　Ｘ　ａ開裂を阻害しないため、この結果は、ペ プチドの増加する里により因子Ｘａの減少する生産が起ることを示す。したがっ て、スルボーＴ　ｙ　ｒ　＊ｓヒルジン５ｍ−４４は因子Ｘの因子ＩＸａ活性化 を阻害する筈である。因子ｌＸａの阻害は、ペプチドの６×１０″６濃度で完全 であった。 ５ＤＳ−ＰＥＧＥを使用し、スルホＴｙｒｅｓヒルジン５ト４４によるプロトロ ンビンの因子Ｘａ活性化の阻害をアッセイした。先のアッセイ同様、カルシウム リン脂質および希釈血漿の存在下に因子ＩＸ　ａ　／　Ｘから因子Ｘａを生成し た。このようにして謝製した因子Ｘａを、スルホ−Ｔ）ｒｒａｓヒルジン８１− ６４　（０〜９５μｓ／ｍ貞）またはしルジン（０〜２５ｔ、Ｊ　／　ｍ　１　 ）を含有する３　１５　ｉｔ　１の０．０５Ｍ＋−リス−ＨＣｌ、ｐｉ（，７， ５，０，１ＭＮａＣ１中で、ニー・・アール・トンプソン、）、　Ｃｌ１ｎ、１ ｎｖｅｓｔ、、　５９．　Ｄｏ、　９００−ｉ）５　（ｉ９７７）の方法により 、ｊ１常し３ト血漿から精Ｉｉ！！、たプロ１−ロンビン（１３０μｇ／ｍｌ＞ とイン六ユベー１−シた。３７℃“での６０分のインキュベートの後、３０μｌ の両分を取り、これを４ＸＸ非凡ＳＤＳナンプル綬衝液ど混合［７、Ｓ　１’） 　５−ＰＡＧＥによりごのザ゛／グルを１０％アクリルアＳドゲルで分析した、 電気′Ａ肋の後５、このゲＡ。・をコーマシー・ブリリアント・ブルーで染色し た１、グ１コｌ−ｒｘンビンの因子）（ａ活性化の＠宵は、ゲル土、で反Ｖ）生 成物を＠討ζる。：、とにより視覚的に評価）−４ノζ。第１１図は、増加す“ るｆ４度のスルボーＴ、　３’　ｒ　６！１１；ルジン、５Ｍ−１４による７− ｏンビンノ＼のＩ−電”２′ピ〉の変換の投手依存性阻害を示す。 その他、前記したように副製しまたサンプルを、基質と１゜、てクロモシム゛ｒ Ｊ４（ベーリンガー・マンハイム、・インディアナポリス、ＸＮ）を使用し、結 果的に得らノするト・ロンピン活性について分析しｊ二。それぞれの→ｊノンル の５　）ｔ　１の両分を、１．０ｍｌのトリス−ＭＣＩ、ＰＨ７，５，０，１５ ＭＮａＣｌ並びに４μｇ　／　ｒｎ　ＫクロモシムＴＨを含有するキコベ・ソト に添加した。トロンビン活性は４２０　ｒｉ　ｍで連続的にモニタした。この様 式によるトロンビン活性の分析は、１′０ノＪｇ　／　ｍ　ｘのスルボーＴ　３ ｒｒ　４ｍヒルジン、−６，濃度でプロト１７ンビンの因子Ｘａ活性化を介して 生成されるエステル分解活性の４倍の減少を示した。 また、こｔ′Ｌらのデ・−夕は、スルホ−Ｔ　５’　ｒ　６ｓ１：、ルジン５ｍ −６４は、因子Ｘの因子ＩＸ　ｔ４活性化、４並びにプロトロンビンの因子Ｘａ 活性化を、共に両者の場合非触蝋部位との相互作用により阻害することを示す、 しかしながら、因子■ａおよびＸａの阻害のレベルは、トロンビンの阻害より約 １０倍少ない。これらの結果は、因子ＩＸａおよびＸａと相互作用するしルジン の構造は、Ｃ−末端断片に局在する、すなわち、阻害は非触媒部位との相互作用 を介した後に起ることを示唆する。またこれらは、硫酸化Ｔｙｒｇｓ残基を欠損 する種々の形態のし、ルジンは、天然し、ル蛋白質のノンアンチトロンビン抗凝 固剤特性を示し得ないことを意味する。 ヒルジンペプチド、好ｉｔ、＜はスルボー’！’　３’　ｒ　ａｓヒルジ／リエ ー、、の抗転移活性は、ザルコーマ’ｉ”　’、ｒ　４　’、ｉ糾胞［エル・コ ニ−・リオッタら、Ｎａｔｕｒｅ、　２８４．　ｐｐ、　６７−６８　（１９８ ０）　］および共同作用Ｃ５７Ｂ　Ｉ、７７６マウス（ジャクソシ・ラボラトリ イスる。実施例１０により調製したＯ・−２５０ｇ　／　ｋ　ｆｉｃのスルホＴ ’１ｒｉｓヒルジン５Ｎ−４４を用いてマウスを静脈まかは皮下注射し、その後 １０４〜１０’Ｔ２４１腫痛細胞の静脈注射を行った。１５日後。動物を層殺し 、肺腫瘍コ！ノニーを計量１．７な。ヒルジンペプチドの抗転狂・活性は、ブラ シーボ処置対暇と比較した＃癌コロニーの％減少として測定した。 大Ｊ１例２０ 堕と旦至、ン二１−一じＲイＳ、二こ九、Ｆ　；　＞仁土ユニ乙≦ζ二２：ｊＪ ス」乙゛この発明のペプチド、舒マ１１、くけスルホ−Ｔｙｒｓｓヒルジン、ト 、、を使用１．で、半ベプチ１ζ性または非ペプチド性ペプチドミメティックア ナログ、アンチトロンビンおよび抗凝固剤活性を示す合成分子を製造することが できる。これ溝、のペプチドミメティックアナログは、この発明のヒルジンペプ チドを特徴＋１けるフィブリノ−タンのトロンビン加水分解、因子Ｘの因子ＩＸ ａ活性化並びにブ′ｏ）−ロンビンの目子Ｘａ活性化に対する阻害活性を示ゴ。 「ヒルログ」と＠記するこの発明のペプチドミメテイツクアＦログは、次の化学 梢遣によって示される：ｈ」−１グーニス １丑」し乙ニュ ＣｏｏＦ！　Ｃｏ０ＦＥ 見垂ｊし乙二ヱ この発明のしルジンペプチドの半ペプチド性ペプチドミメティックアナログは、 親ペプチドのループ、ターン、または螺旋構造を安定化すべく調製することがで きる０例えば、ループｍ造は、ネルホーＴｙｒｅｓヒルジン＄トロ、のＮ−およ びＣ−末端端部の両者でシステイニルまたはリジル残基を付加することによって 作製する。末端システイニル残基を架橋結合するが、酸化によってヒルログ−１ （第１２ａ図）を製造し、脂肪族ジチオールによる酸化によってヒルログ−２を 製造しく第１２ｂ図）、または脂肪族ジハロアセテートまたはプロピオネートに よるアルキル化によってヒルログ−３を製造する（第１２ｃ図）、末端リジル残 基を架橋結合するが、スペーサの長さが異なる多数のイミデート試案のいずれか を用いるか、またはジヒドロキシスクシニミジル脂肪族試薬を用い、この結果と してヒルログ−４を製造する（第１３図）。 スルホ−ＴＶｒ４ｓヒルジン、ト、、のＰｒｏ−３の周囲の構造に対し、クロロ アラニンを用いるｌ１ｅ−７の置換を行い、（Ｌ）または（Ｄ）−七リンを用い るＧｌｕ−９またはＧｌｕ−１０の随伴する置換を行うがまたは行わない、クロ ロアラニン単独を含有するペプチドミメティックアナログは、ゲトン結合により Ａｔａ−７に対するＧｌｕ−９またはＧｌｕ−１０の架橋結合を生成し、ヒルロ グ−５を生成し得る（第１４ａ図）０位置９または１０におけるセリンを用いる 誘導体は、エーテル結合を介して架橋結合を与えることができ、ヒルログ−６を 生成する（第１４ｂ図）。 この発明のペプチドミメティックアナログの螺旋構造は、ヒルジンペプチドの位 置（ｎ）および（ｎ＋３）のシステイニル残基を置換し、直接酸化、脂肪族ジチ オールを用いる酸化、または脂肪族ジハロアセテートを用いるアルキル化による 架橋結合により行うことができる０例えば、システイニルを用いるスルホ−Ｔｙ ｒ６ｓヒルジン！！−４４のＡ　ｓ　ｎ、　−１およびＰｈｅ−４の置換および エタンジチオールを介する酸化（第１５図）は、誘導体のＮ　Ｈ２−末端側にお ける螺旋ターンを与え、これによりペプチド誘導体における安定な螺旋構造に寄 与する。これはヒルログ−７によって例示される。 この発明に属する完全非ペプチド性ペプチドミメティックアナログも製造するこ とができ、与えられたペプチド化合物に関する前記した戦略を考慮する。 尺土呵ｌユ 血栓イメージングニ扛番るヒルジンベプ　ドのスルホ−ＴｙｒａｓヒルジンＳ％ −６４のようなヒルジンペプチドを、＋２３１．１２１　ｉまなはｌ１ｌｉｎ含 有化学基の共有結合付着により改変することができる１例えば、（実施例１０で 調製された）スルホ−Ｔｙｒ６ｓヒルジンラド４４のα−アンモニウム基をＯ， ＩＭホウ酸ナトリウム、ＰＨ９，０中で１２５■−ポルトン・フンター試薬（二 ニー・イングランド・ヌクレア、ボストン、ＭＡ）と反応させることができる。 その後１２５■ラベルしたペプチド（〉５μＣ１／μｇの比放射能を有する）を リン酸緩衝塩類で平衡化したバイオゲルＰ２のカラムにより脱塩する　１２５　 ■ラベルしたペプチドを、その後抗トロンビン活性におけるいずれかの損失をモ ニタするトロンビンタイムおよびＡＰＴＴアッセイで試験することができる。 実験血栓の生体外イメージングは、主としてティ・エム・パラブリ力ら、「活性 化血小板の外膜蛋白質に特異的な抗体を用いる初歩モデルによる血栓イメージン グＪ　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８６．　ｌ）０．１０３６−４０　（１９８ ９）に提出された原稿に記載されたようにして行う、詳しくは、イメージングは ししにおいて大腿部動脈と大腿部静脈との間の外部チコフレックス分流を用いて 行う、実験血栓は、予備凝固した分流におけるダクロン移植片の断片の置換によ って形成する　Ｉ２’Ａ　Ｉラベルしたスルホ−’ｒ３’ｒ、３ヒルジン５．− 〇をチコフレックス分流の静脈部分に注射する。その後一連の前方イメージを０ ．５〜１時間について得る。ＰＤＰ−１１／３４コンピユータを備えたオハイオ ・ヌクレア・シリーズ１００ガンマ・カメラを使用する。移植片および血液プー ルにより１．２８■−しルジンペプチドの取り込みの動力学は、このようにして 得られた放射性核種イメージから誘導される。 同じ技術を使用し７て、ヒヒの大腿部静脈の血行停止によって得られる深部静脈 血栓の生体外イメージを得ることができる。スルホ−Ｔｙｒｂｓヒルジン５ｊ− ６４は高い特異性でトロンビンと結合するため、放射能ラベルしたヒルジンペプ チドを使用することにより、実験血栓の正確な生体外イメージが可能となる。ま た、元のしルジンまたはトロンビンに対する抗体に対して小さい大きさのしルジ ンベブチドは、放射能ラベルしたペプチドが、血小板結合トロンビンおよびメイ ゾトロンビン並びにブイプリンクロットに含有されるトロンビンのイメージを与 え得る可能性を提供する。 尺土旦２２ 膨五欠■」ユＩＩＩ豆二旦並１玉 匹匪圧２−へブユー上−（Ｆ）　−＋ニル碧血小板豊富血票および血小板欠乏血 漿を調製しな。ジェイ・エイ・ジャクボウスキイどエヌ・ジー・ア・−ドリー、 ［飽和またはポリ不飽和脂肪における食餌富化によるヒト血小板作用の改変Ｊ　 、　ＡｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒＯｓｉｓ、　３１．　ｌ１１１．３３５−４４　（ １９７Ｂ）ノ方法にＪっか、詳しくは、２１ゲージのバタフライカニユーレを介 し、て健康なヒト志願者から血液を３．８％クエン酸三すトリウムの１／１０最 終容量に集めた。全ての供与者は、血液採梨の前少なくと＜１２週間は全ゆる種 類の治療の使用を行わなかった。血小板豊富化血漿は、ツルバール・ローター内 で１１００Ｘで１５分間クエン酸処理全血の室温遠心分離Ｃごよって調製した。 血小板に乏しい血液は、クエン酸処理全血を１２．ＯＯＯＸｇで１５分間遠心分 離することによって１製［、た。 ０〜０．５５μｇ　／　ｍ　ｉの濃度範囲に渡り、スルポーＴｙｒａｓＮ−アセ チル−しルジン＠９．−６４の抗凝固剤および抗血小板活性の両者を分析した。 抗凝固剤活性は、実施例１２に記載したようにＡＰＴＴを測定することによって ′Ｔ・ツセイした。血小板凝集は、０．０５ｍ１の水を含有するスルホ−Ｔｙｒ 、ｊ　Ｎ−アセチル−ヒルジン５，１４を３７℃に予め加温した０、４ｍｌの血 小板豊富血漿に添加することにより測定した。混合物を３７℃で１分間撹拌り２ 、その後トロンビンを添加し°〔最終濃度を０．４１Ｊ、／ｍｌとｌ〜た。バイ オデータＰＡＰ４の４−チャンネル血小板分析装置（バ・ｆオデータ、ハツトボ ロ、ＰＡ）を使用し、４分間に渡り濁度的にモニタした。 このアッセイで使用しノ゛こスルホ−Ｔ　ｙｒ　６ｓ　Ｎ−アセチル−しルジン ５１−６４の最も高い濃度の抗凝固剤活性は、通常の血清のものより１２５％少 ないＡ　Ｐ　ｒＴ値を饗えた。これに対し、スルホ−Ｔ　ｙ　ｒ　ｓｓ−’Ｐ” ｌ−アセチル−ヒルジン５ｍ−４４は、０．１５〜０６２５μｇ／爪１（第１６ 図）の濃度て゛租小板凝集を５０％阻害した。、：ｉは、この発明のしルジンペ ７″チドの低投与量は、治療的に凝固を行わない条件干て′血小板活性化を遮断 するのに有効であるこＳ；を示す（すなわち１、夕′４照の１５０−２００％） ＼のＡ　Ｐ　Ｔ　Ｔの増加）。 ｘ１例−２，、−３、 ｄ−にｎ−ｔｉ−’：−イ；−ミニーー二、ｚ＝、、；４ルｔ−７７二ｎ、、　 ６５見配延乙１３−６４　”Ｉ：、’ｔＦり一に±、オｉ、ｓ４１ユ月−１左力 １．立比玉培養しｈ　Ｉｉ！！Ｉｎｉ内皮ｔｔＭ胞（ＨＵ　Ｖ　Ｅ　Ｃ）　ヲ（ を用Ｌ、ｍｌ　小板活性化因子（ＰＡＦ）のトロンビン誘導合成を阻害するヒル ジン＄３−６４またはスルホＴｙｒｅｓヒルジン＄３−４４の能力をアッセイし た。確立された手順に従いコラ−ゲナーゼ消化によりヒト鯛の緒からＨＵＶＥＣ を抽出しな［エム・ニー・ギンブロー・ン・ジュニア、［血管内皮細胞の培＊１ ．　Ｐｒｏｇ。 Ｈｅ１ｏｓｔ、　Ｔｈｒｃｉｂ、、　３．　ｐｐ、　１−２８　（１９７６）　 ］。［］’Ｈ］−アセ７−１の存在下に９６穴マイクロタイタブレート中でＨｔ 、Ｊ　Ｖ　Ｅ　Ｃを群集に生育させた７この様式で培養した細胞は［３Ｈ］−ア セチル−ＰＡＦを生産し、これはＨＵ　Ｖ　Ｅ　ＣＪｌｌリン脂質の抽出によっ て定量することができる。 ヒルジン（０〜Ｉ　ＪＪｇ　／　ｒｒ＋、　１　）　、ヒルジン５ｓ−ａ４（０ ”２００μｇ／ｍｌ）またはスルホ−Ｔｙｒａｉヒルジン＄３−４４（０〜・８ μｇ／ｍｌ）を、トロンビンの添加（最終濃度はＩＵ／ｍｌ）の１分前に、［’ 　Ｈ］−アセテート担持ＨＵ　Ｖ　Ｅ　Ｃに添加した。細胞を５分間インキュベ ートシ、その後上澄を除去した６その後ＨＵ　Ｖ　Ｅ　Ｃに対し、０．１％ゼラ ーナン、メタノール中の５０ｍＭ酢酸（２：ｌ　ｖ／ｖ）を含有する培地を添加 した。標準的技術を使用してＰＡＦを抽皐し定量Ｉ、た［ティ・エム・マクイン チ１／ら、「培養内皮細胞は１、ヒスタミン、ブラジカイニン並びにアデノシン トリリン酸に応答して血小板活性化因子およびプロスタサイクリンの両者を合成 する＋　１．Ｊ、　Ｃ１１ｒ＋、　１ｎｖｅｓｔ、、　７Ｇ、　ｐｐ、　２７１ −８０（１９８５）］　、　３つの阻害剤についてのＩＣ５ｏ値は次のように与 ノられる： １豊ｌ　上二二ＬＬ１Ｍニー しルジン　１４ しルジンＳフ−，４ｉｌ、３６４ スルホ−Ｔ：Ｙｒ＊ｓヒルジン＝、５−ｔｈ４２８１；上た、ＨｌＪＶＥＣへの トロンビン誘導多形態核白血球（ＰＭＮ）付着に対重るスルホ−”ｒ　Ｖ　ｒ　 ６墨−Ｎ−アセチル−ヒルジン９３−ｔｈ４の効果を検討した。１２６子つ゛シ 血清を含有するＭ　Ｅ　Ｍ中でＨＵ　Ｖ　Ｅ　Ｃを２４人培養グレー訃に′（群 集になるまで生育させた３培地を除去し、新鮮な血清を含有しない培地で細胞を ２回洗浄し、同じ培地中で３７℃で１０〜・３０分間インキュベートシて血清生 成物を除去した。それぞれの穴に、予め３７℃で平衡化しな１ｒｎｌのＰＭＮ　 （２，５Ｘｉ　Ｏ’　、／　ｒｎ　ｌ　）を添加した。ｉ（Ｕ　Ｖ　Ｅ　Ｃモ、 ルイヤに２分間Ｐ　Ｍ　Ｎを沈降させた。その後、それぞれの穴にスルホ−Ｔ３ ’ｒａ３　Ｎ−アセチル−”ヒルジンｓｓ−＊４＜　５　ＪＡ　ｇ　／　ｍ、　 １　）または塩類を添加し１、その後直ちに１ヘロンビン（０，１または１゜Ｏ Ｕ／ｒｎｌ）を添加した。ａｍを５分間３７℃でイン吉ユベー■・シ、２回洗浄 しｔ−後、位相差頴微鏡て゛検討した。 付着したＰＭＮを直接計数した。結果は、Ｐ　Ｍ　Ｎ付着は、２天ルホーＴ　ｙ Ｙ６ｓ　Ｎ−アセ・ブルーヒルジン’１１１−４１４および０、ＩＵ／ｒｎｌ） ロンビンを含Ｍするナンブルでは完全に除去され、ｉ　、　Ｏｔ、Ｊ／ｍ　ｔ　 ト１ｔン・ビンを含有するナンブルでは７５％阻害されたことを示しな。 犬、ｔｆ！！Ａ−■λ」。 且ｊ　」ｍｚｔ−久１１人男ユｊ Ｎ−アセ　ルーＡｒ５ｓ−しルジンラト６４のＮ−アセチル−Ａｒｇｓｓヒルジ ン％ｍ−６４を面相ペプチド合成によって調製し、実施例１に記載した手順によ り〉９５％純度に単離した。このペプチドは、血小板糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａ と相互作用する多数の付着性蛋白質においても優勢なＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配 列を含有する［エム・ディ・ピエルシュハッヘルとイー・ルオスラチ、「フィブ ロネクチンの細胞付着活性は分子の小さい合成断片によって倍増される」Ｍａｔ ｕｒｅ、　３０９．　ＥＩＥｌ、　３０−３３　（１９８４）　］　。 実施例１２に記載したＡＰＴＴアッセイを使用して、Ｎ−アセチル−Ａｒｇ＠ｍ ヒルジンｍ５−ｍ５の抗凝固剤活性を評価した。Ｎ−アセチル−Ａｒｇｓｓヒル ジン＄ト４４は、Ｎ−アセチル−ヒルジンラド６４の７８．９％の抗凝固剤活性 を示した。 また、実施例２２に記載したのと同一のアッセイを使用し、Ｎ−アセチル−Ａｒ ｇｓｓヒルジン５Ｍ−６４による血小板活性化の阻害を測定した。ただし、血小 板凝集を、コラーゲン（４０μｇ／ｍｌ）またはＡＤＰ（１０μｌ）の添加によ って刺激した。第１７図は、Ｎ−アセチル−Ａｒｇｓｓヒルジン５トロ４は投与 量依存様式で血小板凝集を阻害し、コラーゲン誘導凝集について約１９０μｇ　 ／　ｍ　１のＩｃｅ。およびＡＤＰ誘導凝集について４９０μｇ　／　ｍ　１を 有することを示す。 これらの結果は、Ｎ−アセチル−Ａｒｇｓｓしルジンラト４４はトロンビン媒介 血栓を遮断でき、これはフィブリノーゲンの開裂または血小板の活性化のいずれ かを介し、また、コラーゲン、ＡＤＰ、エピネフリン、トロンボキサンＡ２また は血小板を活性化する他のいずれかの化合物についても同様であることを示す、 更に、Ａｒｇ　Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列は、このペプチドが血栓を標的とするよう作 用することができ、これによりその部位におけるトロンビン阻害剤の局所濃度を 増加させる。 Ｋ１且１１ 化学量論量のスルホ−Ｔｙｒｅｓヒルジン！４−１４とジニトロジフルオロベン ゼン（ＤＮＤＦＢ）とをジメチルホルムアミド中で反応させることにより、ヒル ジンアナログジニトロフルオロベンジル−スルホ−Ｔｙｒ、、ヒルジン１４−６ ４（ＤＮＦＢ−スルホＴｙｒ、、ヒルジン５４−６４　）を合成した。 反応混合物を２４時間２２℃でインキュベートし、その後これを真空下で乾燥し 、水中の０．１％ＴＦＡに再溶解した。 アクアボアＲＰ　３００　Ｃ＃オクタシリルカラム（０，４６Ｘ３．Ｏｃｍ）を 用い、得られた生成物をＨＰＬＣクロマトグラフィによって分離した。最初にカ ラムを水中の０．１％ＴＦＡ　（溶１ＸＡ）で平衡化した。サンプルを装填後、 ４５分間に渡り０〜５０％の溶媒Ｂ　（０，０８５％ＴＦＡ／７０％アセトニト リル）のりニヤグラジェントによりカラムを展開した。流出流は２１４ｎｍの吸 収についてモニタした。 ＤＮＦＢ−スルホ−Ｔｙｒ６ｓヒルジン５．−〇は４８％溶媒Ｂで溶出した。 ２工程の方法でヒルジンアナログニトロアニソール４ｓヒルジン５５−ｍ５を合 成した。最初に、実施例１に記載したように、固相合成技術によりメトキシチロ シル、、しルジン５ト４１を合成した０合成において、Ｂｏｃ−０−Ｌｅｕ樹脂 をＢｏｃ−０−メトキシチロシン樹脂に代えた。ＷＭ脂からペプチドを取り、第 １図に示したようにバイダック０４カラムによるＨＰ［、Ｃによッテ精製した０ 次に、２０ｍＭトリス−ＨＣ１、ｐＨ８，０中でこれに過剰のテトラニトロメタ ンを添加することにより、精製したメトキシチロシル、Ｓヒルシフ８％−４５を ニトロ化した０反応物を２７℃で４時間インキュベートした。 得られた生成物を凍結乾燥し、２０ｍＭの重炭酸アンモニウムに再溶解し、予め 平衡化したバイダック０４カラム（ＩＸ３０ｃｍ）により脱塩し、２０ｍＭ重炭 酸アンモニウムにより溶出させた。ニトロアニソール４ｓヒルジン５ト４ｓの分 離は、前記したようにアクアボアＲＰ−３００Ｃ８オクタシリルカラム（０，４ ６Ｘ３．Ｏｃｍ）によるＨＰＬＣによって行った。 Ｋ立■ユ玉 トロンζ乙り四虹りしニシヒ辷二りヨ二バ」」シュ、１との　ム　ム　り　の一 実施例２５に記載した手順に従い、ＤＮＦＢ−［′ｓＳ］　−スルホＴｙｒ、、 しルジンロ−６４を調製した。出発物質として、硫酸化手順（実施例１ｏ参照） の際にＨｔ　［”Ｓ］　０４を使用して硫酸化したスルホ−Ｔｙｒ、ｓヒルジン ラド−４４を使用した。 １０倍モル過剰のＤＮＦＢ−［”Ｓ］−スルホＴｙｒ、、ヒルジン！４−４４を 、リン酸緩衝塩類中に０．３５ｎｍｏｌのヒトトロンビンを含有する溶液に添加 した。この混合物を３時間インキュベートした後、サンプル上で５ＤＳ−ポリア クリルアミドゲル電気泳動（１２，５％アクリルアミド）を行った。オートラジ オグラフィの後、トロンビンの大きさに対応するバンドを視覚化した。５０ｔた け５００倍過剰の非ラベルＮ−アセチル−スルホ−Ｔｙｒｂｓヒルジン！４−４ ４の存在下で結合工程を行うと、共有結合複合体の形成は遮断された。 この発明の多数の態様を前記したが、その基本的な構成を改変して、この発明の 方法および生成物を利用する他の態様を提供し得ることは明らかである。したが って、この発明の範囲は、ここに添付する特許請求の範囲の記載により特定され 、例として前記した特定の態様によらないことが理解されよう。 ２ざ　ア−ｔ：ｔ＝ｎｌｔｙ Ｆ７θ　２どσノ　Ｆ／θ　２とｂノ ＦＩＧ、２とＣノ ＦＩｏ、　３ Ａ、ｃ＞ｒｒ（ｓ’。 Ｎ　吐 十子信−ｒ五ム（４ｂａ＆”ｊか尿 ＦＩ６．９ １０　１００　７５０２００２５０　ＸＸ）ヌ＋ｂｄ−吾／６３　ヒルノン　ｓ ：ｔ−ｂ４　（メツ９）ｌｚ（１＞ｔ　・１４　（％） Ｉ：ｌ（′：１２ Ｌｙｓ−ｋｓｎ４１ｙ−ｋｓｐ−ｔｈｅ−Ｇｌｕ−にＬｕ−！１ｍ−Ｐｒｏ−（ ：１ｕ−Ｇｉｓｓ−丁ｙｒ（５０３）−Ｌ＊ｕ−Ｌｙｓ＾５ｎ−Ｇｌｙ−＾５ｐ −ｙｈ＊−０１ｕ−Ｇｌｕ−人１ａｌ（：１）−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−丁ｙ ｒｌｓＯ３）−Ｌ＊ｕ入ａｎ−Ｇｌｙ−人５ｐ−Ｐｈ＊−Ｇｌｕ−ＧＬｕ−人１ ａ（ＣＬ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−５ａｒ−テｙｒ（５口、）−ＬｅｕＣｙｓ−Ｇｌ ｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＧＬｕ−ＧＬｕ４Ｌｅ−Ｐｒｏ−Ｃ１ｕ−（Ｌｕ−丁ｙｒ （Ｓｏ、）−ＬｅｕＦＩＧ　／６ 〃−凡七し　−　スＪ、−７）’／”６３　Ｅ：＋ｋ）’＞　５３−５４（Ｂ１ ７ｇ＜９′４″７５３　ヒ１しジ°’５３−６４　（ｐＭ）国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．抗凝固剤活性を示すペプチドであって、前記ペプチドが、（ａ）実質的に次 の式： 【配列があります】 よりなるアミノ酸の配列を特徴とするペプチド、および（ｂ）（ａ）のペプチド のＤ−レトロ型（式中、ＸはＣＯＯＨ、Ｌｅｕ並びにＬｅｕ−Ｇｌｎよりなる群 から選択される） よりなる群から選択される抗凝固剤活性を示すペプチド。 ２．抗凝固剤活性を示すペプチドであって、前記ペプチドが、（ａ）実費的に次 の式： 【配列があります】 よりなるアミノ酸の配列を特徴とするペプチド、および（ｂ）（ａ）のペプチド のＤ−レトロ型（式中、ＹはＮＨ２、アミノ保護基、アミノ酸配列Ｖａ１【配列 があります】 の少なくともＣ末端部分、並びに アミノ酸配列【配列があります】 の少なくともＣ 末端部分よりなる群から選択され、ＺはＣＯＯＨ、Ｌｅｕ、並びにＬｅｕ−ＧＩ ｎよりなる群から選択され、かつチロシン残基は負に荷電した側鎖基を合有する ）よりなる群から選択される抗凝固剤活性を示すペプチド。 ３．負に荷電した側鎖基が、スルフェート、ホスフェート、カルボキシレート、 スルホネート、ホスホネート、カーボネート、メチルスルホネート並びにメチル ホスホネートよりなる群から選択される請求項２記載のペプチド、４．負に荷電 した側鎖基が、スルフェートおよびスルホネートよりなる群から選択される請求 項２記載のペプチド。 ５．ＹがＡｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐであり、ＺがＬｅｕであり、前記負に荷電した 側鎖基がスルフェートであり、前記ペプチドがスルホ−Ｔｙｒ６３ヒルジン５３ −６４である請求項４記載のペプチド。 ６．ＹがＡｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐであり、ＺがＬｅｕであり、前記負に荷電した 側鎖基がスルホネートであり、前記ペプチドがスルホニル−Ｔｙｒ６３ヒルジン ５３−６４である請求項４記載のペプチド。 ７．アミノ末端アミノ酸がＮ−アセチル化された請求項１または２記載のペプチ ド。 ８．前記ペプチドが、スルホ−Ｔｙｒ６３−Ｎ−アセチル−ヒルジン５３−６４ およびＮ−アセチル−スルホニル−Ｔｙｒ６３ヒルジン５３−６４よりなる群か ら選択される請求項７記載めペプチド。 ９．アミノ末端アミノ酸がジニトロフルオロベンジル化された請求項１または２ 記載のペプチド。 １０．抗凝固剤活性を示すペプチドであって、前記ペプチドはトロンビンと共有 結合を形成することができ、前記ペプチドが、 （ａ）主として次の式： 【配列があります】 よりなるアミノ酸の配列を特徴とするペプチド、および（ｂ）（ａ）のペプチド のＤ−レトロ型（式中、ＹはＮＨ２、アミノ保護基、アミノ酸配列【配列があり ます】少なくともＣ末端部分、並びに アミノ酸配列【配列があります】 の少なくともＣ 末端部分よりなる群から選択され、Ｗはニトロアニソールである） よりなる群から選択される抗凝固剤活性を示すペプチド。 １１．抗凝固剤および抗血小板活性を示すペプチドであって、前記ペプチドが、 （ａ）主として次の式： 【配列があります】 よりなるアミノ酸の配列を特徴とするペプチド、および（ｂ）（ａ）のペプチド のＤ−レトロ型（式中、ＶはＮＨ２、アミノ保護基、アミノ酸配列【配列があり ます】の少なくともＣ末端部分、並びにアミノ酸配列【配列があります】の少な くともＣ末端部分よりなる群から選択され、ＺはＣＯＯＨ、Ｌｅｕ並びにＬｅｕ −Ｇｌｎよりなる群から選択され、チロシン残基は負に荷電した側鎖基を合有す る）よりなる群から選択される抗凝固剤および抗血小板活性を示すペプチド。 １２．前記ペプチドが薬学的に許容し得る重合体と共役する請求項１、２、１０ または１１のいずれかに記載のペプチド。 １３．前記重合体が、ポリエチレングリコールＮ−スクシニミジルスクシネート である請求項１２記載のペプチド。 １４．前記ペプチドがフィブリン溶解剤と共役する請求項１、２、１０または１ １のいずれかに記載のペプチド。 １５．請求項１または２記載のペプチドのペプチドミメティックアナログであっ て、前記アナログがフィブリノーゲンのトロンビン加水分解を阻害し、かっ抗凝 固剤活性を示すペプチドミメティックアナログ。 １６．前記アナログが、ヒルログ−１、ヒルログ−２、ヒルログ−３、ヒルログ −４、ヒルログ−５、ヒルログ−６並びにヒルログ−７よりなる群から選択され る請求項１５記載のペプチドミメティックアナログ。 １７．前記ペプチドきメテイックアナログがフィブリン溶解剤と共役した請求項 １５または１６記載のペプチドミメティックアナログ。 １８．愚者または体外血液における血液凝固時間を増加させる薬学的に許容し得 る組成物であって、請求項１乃至１４いずれかに記載のペプチドおよび請求項１ ５乃至１７いずれかに記載のペプチドミメティックアナログよりなる群から選択 される薬学的に有効量の少なくとも１つの成分からなる薬学的に許容し得る組成 物。 １９．ヘパリンおよび低分子量ヘパリンよりなる群から選択される化合物を更に 含み、前記ヘパリンまたは低分子量ヘパリンの薬量が、前記ヘパリンまたは低分 子量ヘパリンを単独治療で投薬する場合に所望の結果を達成するのに要求される ものより少ない請求項１８記載の組成物。 ２０．前記ヘパリンまたは低分子量ヘパリンの薬量が約２，５００〜５，０００ 単位未満である請求項１９記載の組成物。 ２１．前記組成物が、薬学的に有効な量のフィブリン溶解剤を更に含む請求項１ ８乃至２０いずれかに記載の組成物。 ２２．患者または体外血液における血液凝固時間を増加させる方法であって、請 求項１８乃至２１いずれかに記載の組成物を用いて薬学的に許容し得る様式で前 記患者または前記体外血液を処置する工程からなる方法。 ２３．愚著の血管疾患を予防または処置する方法であって、請求項１８〜２１い ずれかに記載の組成物を用いて薬学的に許容し得る様式で前記愚者を処置する工 程からなる方法。 ２４．血管疾患の予防または処置のための、請求項１８乃至２１いずれかに記載 の組成物の使用。 ２５．生物学的サンプル中で因子ＩＸａ、因子Ｘａ、トロンビンまたはこれらの 混合物の濃度を決定する組成物であって、前記組成物が、請求項１乃至６いずれ かに記載の少なくとも１つのべプチドからなる組成物。 ２６．生物学的サンプル中で因子ＩＸａ、因子Ｘａ、トロンビンまたはこれらの 混合物の濃度を決定する方法であって、前記方法が、前記サンプルと請求項２５ 記載の組成物とを接触させる工程からなる方法。 ２７．生物学的サンプル中で因子ＩＸａ、因子Ｘａ、トロンビンまたはこれらの 混合物の濃度を検走する診断キッ下であって、前記キットが、請求項１乃至６い ずれかに記載の少なくとも１つのペプチドからなる診断キツド。 ２８．転移性腫瘍の生育を阻害する薬学的に許容し得る組成物であって、前記組 成物が、請求項１乃至１４記載のペプチドおよび請求項１５乃至１７記載のペプ チドミメティックアナログよりなる群から選択される薬学的に有効量の少なくと も１つの成分からなる組成物。 ２９．患者の転移性腫瘍の生育を阻害する方法であって、前記許方法が、請求項 ２８記載の組成物を用いて薬学的に許容し得る様式で前記患者を処置する工程か らなる方法。 ３０．前記転移性腫瘍が、臓のカルシノーマ、肺のカルシノーマ、肝臓のカルシ ノーマ、骨カルシノーマ並びに新生組織細胞カルシノーマよりなる群から選択さ れ石請求項２９記載の方法。 ３１．前記ペプチドが、１２３Ｉ、１２５Ｉ並びに１１１Ｉｎよりなる群から選 択されるラジオアイソトープによりラベルされた請求項１、２、７、９、１０ま たは１１いずれかに記載のペプチド。 ３２．請求項３１記載のペプチドからなる患者のフィブリンまたは血小板血栓の 生体外イメージング用組成物。 ３３．患者のフィブリンまたは血小板血栓の生体外イメージング方法であって、 （ａ）前記患者に請求項３２記載の組成物を投薬し、（ｂ）前記組成物を監視す る検出手段を使用する工程からなる方法。 ３４．患者に挿入される侵入器具の表面を被覆する組成物であって、前記組成物 が、請求項１乃至１４いずれかに記載のペプチドおよび請求項１５乃至１７いず れかに記載のペプチドミメティックアナログよりなる群から選択される少なくと も１つの成分からなる組成物。 ３５．患者に挿入される侵入器具の表面を被覆する方法であって、前記方法が、 前記表面と請求項３４記載の組成物とを接触させる工程からなる方法。 ３６．血液凝固時間を増加させ患者の血小板活性化を阻害する薬学的組成物であ って、前記組成物が、薬学的に有効量の請求項１１記載のペプチドからなる薬学 的組成物。 ３７．血液凝固時間を増加させ患者の血小板活性化を阻害する方法であって、前 記血小板活性化が全ゆるアゴニストによって誘導され、前記方法が、請求項３６ 記載の組成物を用いて前記患者を処置する工程からなる方法。 ３８．患者のトロンビンにより誘導された血小板活性化およびトロンビンにより 誘導された内皮細胞活性化を阻害する薬学的組成物であって、前記組成物が請求 項１乃至８いずれかに記載の薬学的に有効な低薬量のペプチドからなり、前記低 薬量が約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体着〜約０．０９９ｍｇ／ｋｇ体重である薬学 的組成物。 ３９．患者のトロンビンにより誘導された血小板活性化およびトロンビンにより 誘導された内皮細胞活性化を阻害する方法であって、前記方法が、請求項３８記 載の組成物を用いて前記患者を処置する工程からなる方法。 ４０．患者のトロンビンにより誘導された炎症を処置する薬学的に許容し得る組 成物であって、前記組成物が請求項１乃至８いずれかに記載の薬学的に有効な低 薬量のペプチドからなり、前記低薬量が０．０００１ｍｇ／ｋｇ体着〜約０．０ ９９ｍｇ／ｋｇ体着である組成物。 ４１．患者のトロンビンにより誘導された炎症を処置する方法であって、前記方 法が、請求項４０記載の組成物を患者に投薬する工程からなる方法。 ４２．前記トロンビンにより誘導された炎症が、成人呼吸困難症、敗血性ショッ ク、敗血症並びに局所再灌流傷害よりなる群から選択される疾患によって生起さ れる請求項４１記載の方法。 ４３．ペプチドまたはポリペプチドのチロシン残基を硫酸化する方法であって、 前記方法が、 （ａ）前記ペプチドまたはポリペプチドを有機溶媒に溶解し、 （ｂ）前記溶解したペプチドまたはポリペプチドと脱水剤とを反応させて前記ペ プチドまたはポリペプチドのチロシン残基を脱水し、 （ｃ）沈澱形態に至るまで前記溶解したペプチドまたはポリペプチドに硫酸を滴 下して添加することにより前記脱水したチロシン残基を硫酸化する 工程からなる方法。 ４４．前記ペプチドをＮ−アセチル−ヒルジン５３−６４およびヒルジン５３− ６４よりなる群から選択する請求項４３記載の方法。 ４５．前記有機溶剤をジメチルホルムアミドとし、前記脱水剤をジシクロヘキシ ルカロジイミドとする請求項４３記載の方法。