JPH02264792A

JPH02264792A - オリゴヌクレオチド誘導体及びその合成原料

Info

Publication number: JPH02264792A
Application number: JP8545689A
Authority: JP
Inventors: Eiko Otsuka; 栄子大塚; Hideo Inoue; 英夫井上
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1989-04-04
Filing date: 1989-04-04
Publication date: 1990-10-29

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＬＬ上立且ユ±１本発明は、有用な遺伝子のクローニングに際し、通常行
なわれているｍＲＮＡの分離操作を効率化することに用
いることができるヌクレオチドの誘導体、その合成原料
であるヌクレオチドオリゴマー及び更にその合成原料で
あるヌクレオチドに関する。これらの物質は、いずれも
、新規化合物である。

監迷Ｊとｌ五有用遺伝子をりｌ」−ニングする際、−殻内にはその遺
伝子が発現している生物材料より全ｍＲＮＡを分離し、
そのｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、クローニングした
侵、目的遺伝ｆをスクリーニングすることが行われてい
る。ｍＲＮＡを分離する操作においては、ｍＲＮＡがポ
リ（Ａ＞テール（ｐｏｌｙ（Ａ）−ｍＲＮＡ）を有すル
コとを利用し、ポリ（Ａ）に相補的なオリボアオキシチ
ミジル酸をセルロース等に固定化したいわゆるオリゴ（
ｄＴ）−セルロースカラムを使用して、ハイブリダイゼ
ーシジン効果を利用してポリ（Ａ）を持たないＲＮＡ　
（ｐｏｌｙ（Ａ＞　−ＲＮＡ）との分離を行っている。

しかし、この操作におけるｐｏｌｙ（Ａ）　−ｍＲＮＡ
の単離収率が必ずしも充分でなく、クローニングの効率
を向上させる為にはポリ（Ａ）部分と更に安定なハイブ
リッドを作るオリゴマーの発見が強く望まれでいた。

発明が解決しようとする問目的有用遺伝子をクローニングする上で、その効率に大
きくかかわるｐｏｌｙ（Ａ）−ｍＲＮＡ単離操作におい
て、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムに代り収率がよ
り向上できる技術、すなわちポリ（Ａ）とより安定なハ
イブリッドを形成しうる性質を有する新規オリゴマーの
開発が￥１請されている。

の　　　よび本発明者は、上記問題を解決するため鋭意研究を重ねた
結果、デオキシリボヌクレオチドに比べ、オリゴ（２°
−０−メチルリボヌクレオチド）が相補鎖オリゴリボヌ
クレオチドとより安定なハイブリッドを形成することを
見い出し、ハイブリダイゼーションプローブとして有用
であることを報告した（Ｈ，Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｉｔｅｓ、ｊ５（１５）６１３１頁
、　１９８／年）。更に、ハイブリッドの安定性におけ
るオリゴマーの構造上の寄与を詳細に検討した結果、２
°−０−メチルウリジル酸の代りに２゜−〇−メブ・ル
ー５−メチルウリジル酸をオリゴマーの構成ユニットに
用いることにより、相補鎖中のアデニル酸ユニットと強
固に結合しオリゴリボヌクレオチドとの熱的安定性が増
大することを見い出した。この知見に基づいて、デカリ
ボアデニル酸とその相補鎖であるデオキシリボチミジル
酸。

２°−０−メチルウリジル酸及び２°−０−メチル−５
−メチルウリジル酸のそれぞれのデカマーを合成して熱
的安定性（Ｔｍ値）をそれぞれ測定したところ、デカ２
°−０−メチル−５−メヂルウリジル酸が著しくすぐれ
た性質を有することを見出し、本発明を完成するに至っ
た。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明は、次の一般式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオ
チド誘導体に関する。

式中、Ｒは、水素原子、０Ｍセルロース、ラテックス粒
子などのカルボニル残基等のアシル基、ホスホリル基、
又は置換基を有していてもよいホスホリル基例えばセル
ローズなどの水酸基を有する化合物とＩＦ５酸とのエス
テル結合を有するホスホリル基を表し、■は、チミン−
１−イル基を表し、Ｙｌ、Ｙ２及びＹ３は、相互に同一
であってもよく文具なっていてもよくて、水素原子、ヒ
ドロキシル基、メトキシ基、エトキシ基等の低級アルキ
ルオキシ基又は低級アルキルシリル基を表し、Ｂは、チ
ミン−１−イル基、アデニン−９−イル基。

グアニン−９−イル基、シトシン−９−イル基。

ウシシル−１−イル基又はヒボキサンチン−９−イル基
を表し、ｎは１〜１００の整数を表すが、実用的には平
均鎖長がｎ−１０〜４０のものを用いることができる。

因みに、一般式ＣＩ）の誘導体において、Ｒが上記のよ
うなアシル基（これは担体と称されることもある）又は
置換Ｕ＜これも担体と称されることがある）を有するホ
スホリル基であるものは、ｍＲＮＡの分離操作に直接使
用される化合物であり、Ｒが水素原子又は置換基を有し
ないホスホリル基である化合物（オリゴヌクレオチド）
は、前者の化合物の合成原料となりうるばかりでなく、
前者の化合物をどのような方法で合成したにしろ、１１
者の化合物は前者の化合物の構成部分としてその中心的
機能を果たすのである。

本発明は、又、次の一般式（Ｉ）で表されるヌクレオチ
ド誘導体にも関する。

式中、Ｘは、モノメトキシトリプル基、ジメトキシトリ
チル基又は例えば０−クロルフェニル基等の置換基を有
していでもよいホスホリル基を表し、Ｙは、水素原子、
０−クロルフェニル燐酸、−１〕（ＯＣＩ−１３）　　
　−Ｎ−＜ＣＦ＋　　　（ＣＨ３）　　２　　）　　２
　　。

−Ｐ　（ＯＣ８２ＣＩ−１２ＯＮ）−Ｎ−（ＣＨ（ＣＨ
３）２　’）２　又Ｇｔ−ＧＯ−（ＣＨ，）。

Ｃ０ＮＨ−（ＣＨ２’）、−（ＣＰＧＩＩ体）（コこに
、ｍ及びｎは、それぞれ、１〜１ｏの整数である）を表
わす、ただし、Ｘが置換基を有していてもよいホスホリ
ル基のときは、Ｙは水素原子である。一般式（Ｉ［）の
化合物は、一般式（１）の化合物の合成原料として使用
することができる。

次に、これらの化合物の合成法の例を説明する。

本発明のオリゴ（２°−Ｏ−メチル−５−メチルウリジ
ル酸）部分を一合成する為には、先ずその構成ヌクレオ
シドである２°−０−メチル−５−メヂルウリジン（化
合物３）を後述する様に合成し（第１図）、次に常法に
より（例えば、Ｈ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　１ｅｔｔ、、　５０６５
（１９６７））、５’位水酸基に直接リンＬ２基を導入
し２゛−〇−メチルー　５−・メチル−５゛−ウリジル
酸を得、それをジシク「」ヘキシルカルボジイミド（Ｄ
ＣＣ）等の縮合剤を用いて重合する方法を採用すること
ができる。または、化合物３を後述する様に３°−フォ
スホロアミデート誘導体（化合物５）とし、公知の方法
に従い（Ｓ、５ｈｉｂａｒａｈａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｈ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｃｓ、、　１５（１１）、
　４４０３　（１９８７））、ＤＮＡ自動合成りｉ（ア
プライドバイオシステム社製、モデル３８ＯＡ　）を用
いて容易に合成することができる。

一方、オリゴ（２°−０−メチル−５−メチルウリジル
酸）誘導体を製造する為には、先に述べた２°−〇−メ
チルー５−メチルー５°−ウリジル酸のＤＣＣによる重
合反応において、公知の方法（Ｐ、　Ｔ、　Ｇｉ　Ｉｈ
ａｍ、　ＪＡＣ５，８８，４９８２（１９６４））に従
い、セルロース等を同時に反応させ、セルロース誘導体
等とすることが簡便である。また一方、先に述べた自動
合成機により合成した５°末端水Ｒｊ４を有するオリゴ
（２°−０−メチル−５−メチルウリジル酸）の５′末
端水ｗｉ基に燐ｗＩＷを導入した後に、同様にセルロー
ス等と反応させることもできる。

また一方、５゛末端水Ｍｉｌｋを有したオリゴ（２゛−
〇−メチルー５−メチルウリジル酸）とＣＭ−セルロー
スまたはラテックス粒子等とを縮合剤（ＤＣＣ等）を用
いて結合させ、セルロースあるいはラテックス誘導体（
に、にｕｒｉｂａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、。

ＮｕＣｌｅｉＣＡｃ１ｄｓ　５ＶｌｌｐＯ３ｉｕｌ　５
ｅｒｉｅｓ、に１９．６１（１９８８）参照）等とする
ことも可能である。

化合物３の製造は、リボチミジンを出発原料として例え
ば先ず化合物１を得た後合成できる（第１図及び実施例
１〜３参照）。因みに、化合物１の合成は、リボチミジ
ンの３’、５’水酸基を公知の方法（ｔｌ、Ｉｎｏｕｃ
　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｃｉｃ　ＡｃｉｄｓＳｙｍｐ
ｏｓｉｕｎ　５ｅｒｉｅｓ、　　Ｎ（１１６，１６５（
１９８５）、獣■。

Ｈａｒｋｉｅｗｉｃｚ、Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｉｔｅ、；（Ｓ
）　２４−２５　　（１９７９））に準じて、テトライ
ソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル基で保護した
後、公知の方法（Ｈ，ｒｎｏｕｃ　ｅｔａｌ、の前出の
電文（１９８７）　）に準じて、適当な溶媒中トリエチ
ルアミンの存在下塩化ベンゾイルで処理することにより
３Ｎ位を選択的に保護することにより得ることができる
。

また、２°−〇−メチルー５−メチルウリジンー３°−
フォスフォロアミダイト誘導体（化合物５）及び２°−
〇−メヂルー　５−メチルウリジン−３゛−ＣＰＧ誘導
体（化合物６）の製造は、公知の方法（Ｓ、５ｈｉｂａ
ｈａｒａ　ｅｔ　ａｔ、の前出の電文、Ｌ、Ｊ、ＨｃＢ
ｒｉｄ１３　ｅｔ　ａｔ、、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
　Ｉｅｔｔ、、２４，２４５（１９８３）参照）に従い
合成できる（第２図並びに実施例４及び５参照）。また
、ここで合成したフォスフォロアミダイト誘導体（化合
物５）の他に、亜ｇ４ｒ１１の保護基としてシアノエチ
ル基を有する化合物も、同様の方法（Ｓ、５ｈｉｂａｈ
ａｒａ　ｅｔ　ａｔ、の前出の電文、Ｎ、Ｄ、５ｈｉｎ
ｈａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ＱＳ、、　　１２゜４５３９（１９８４）６照）に従い
合成することができる。

本発明に関して肝要な点は、従来より一般に使用されて
いるオリゴ（ｄＴ）−セル［］−スのオリゴ（ｄＴ）に
比べて、オリゴ（２°−〇−メチルー５−メチルウリジ
ルＭ）−がオリゴリボアデニル酸（オリゴ（ｒＡ））と
著しく安定なハイブリッドを形成する性質を有すること
を発見したことにある。

以下、この点について詳述する。すなわち、それらのハ
イブリッドの熱的安定性（Ｔｍ値）を実際に測定する為
に、デカリボアデニル酸を公知の方法（ｐ、に１ｅｒｚ
ｅｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２
５．７８４０（１９８Ｂ）参照）に従い合成しく実施例
６）、またデカ（２°−０−メチル−５−メチルウリジ
ル酸）は、実施例４及び５により製還した化合物５及び
６を用いてＤＮＡ自動合成機により常法通り（Ｓ、５ｈ
ｉｂａｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ、の前出の電文参照）合成
した（実施例７）、一方、比較実験用のオリゴマーであ
るデカデオキチミジル酸は常法により市販試薬を用いて
、デカ（２°−０−メチルウリジル酸）は公知の方法（
Ｓ、５ｈｉｂａｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ、の前出の電文参
照）に従い、それぞれ、ＤＮＡ自動合成機を用いて合成
した。

それぞれのオリゴヌクレオチドは常法により定ゴした後
に、熱的安定性測定用試料とした。それぞれのハイブリ
ッドのＴｍ値の測定は常法に従い、ベックマンＤＵ−８
Ｂ型分光光度計を用いて測定した（第３図及び実施例８
参照）。この結果、それぞれのハイブリッドのＴｍ値は
、１８．９℃、　２１．０”Ｃ，３１，１℃となり、デ
カ（２°−０−メチフレー５−メチルウリジル酸）とデ
カリボアデニル酸とのハイブリッドが他のハイブリッド
と比べて、Ｔｍ値が約１０℃も高く、著しく安定である
ことを発見した。

以上のことより、オリゴ（２°−０−メチル−５−メチ
ルウリジル酸）は、そのセルロース結合体として、現在
市販されているオリゴ（（ｆＴ）−セルロースに代わる
新規ｐｏｌｙ（Ａ）　−ｍＲＮＡ単離用担体として使用
できることが充分期待される。

以下、実施例により本発明を具体例的に説明する。

１塵旦以下、実施例により本発明を更に説明する。

実施例１（Ｎ３−Ｂｅｎｚｏｙｌ−５−ｓｅｔｈｙｌ−３’　、
　　５’　−０−（ｔＱｔｒａｉｓｏｌ）ｒｏｔ）ｙｌ
−ｄｉｓｉｌＯＸａｎｅ　−１，３−ｄｌｌ／Ｉ）ｕｒ
ｉｄｉｎｅ（化合物１）の合成）５−１４ｅｔｈｙｌ−１，３−Ｏ−（ｔｅｔｒａｉｓＯ
Ｉ）Ｉ’０ＤＶｌｄｉＳｉ　１ＯＸａｎｅ−１，３−ｄ
ｉｙｌ）　ｕｒｉｄｉｎｅ（ＩＧ、６７　ｇ　、３３．
３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン２５０ｄに溶解し、トリエ
チルアミン（６，３ｄ、　４５．２ｍａ＋ｏｆ）を加え
、水冷撹拌ド、塩化ベンゾイル（４，４ｄ、　３７．９
ｎ＋ｍｏｌ）を滴下した。室温で一晩世拌１ノ、原料の
消失を確認後、０．０１　ＮＨＣｌ、水、ＮａＨＣＯ３
水溶液、水の順で反応溶液を洗浄した。有ｔＩＩＩ＠Ｎ
ａ　ＳＯ４で乾燥後、溶媒を減圧トで留去し、残漬をシ
リカゲルクロマトグラフィー（Ｃ−２００、４００９、
ＣＨＣｌ３＞で精製し、化合物１を泡状物質として１３
．６９９（６７、９％）得た。

ＩＪＶ　（ＭｅＯＨ）　：λｗａｘ　２５６ｒｖ、λｓ
ｉｎ　２２５ｎｅ。

１Ｈ−川（ｃｏｃｔ３＞δＥ）ｌ）ｌニア、９９−７．
２９（１，６Ｈ，ｂｌＺＯＶＩ　ＱｒＯＩｊｌ）、　Ｃ
６−Ｈ）。

５．７６（ｄ、　ＩＨ，Ｊ−１１１Ｚ。

Ｃ１°−Ｈ）、　１．９７（ｄ、３１１．Ｊ＝１．２Ｈ
２゜Ｃ５−ＣＨ３）。

１．１２−１．０６　（ｍ、２８Ｈ，ＴＩＰＤＳ　　ａ
ｒｏｕｐ）。

実施例２（Ｎ３−Ｂｅｎｚｏｙｌ−５−ｎｅｔｈｙｌ−２’−０
−ｍｅｔｈｙｌ−３’５’　−０−（ｔｅｔｒａｉｓｏ
ｐｒｏｐｙｌｄｉｓｉｌｏｘａｎｅ−１，３−ｄｉｙｌ
）ｕｒｉｄｉｎｅ　（化合物２）の合成〉実施例１で得
た化合物１　（１３，６９７，２２，６ｍｍｏ　ｌ　）
をベンゼン８０ｍに溶解し、酸化銀（１４，７ｇ、６３
．３ｕｏ　ｌ　）を加え、５ＯｎｉＣａｔＯｒに約１０
分かけた。ヨウ化メチル（６５，Ｏｄ、１０４５ｍｍｏ
ｌ　）を加え、４５℃で３日間撹拌した１反応混合物を
Ｐ退し、溶媒を減圧下留去後、ＣＨＣ１３＝Ｈ２０’ｔ
’分液し、有ａｍをＮａ２ＳＯ４で乾燥後、シリカゲル
カラムクロマトグラフィー（Ｃ−２００，３００ｇ、Ｃ
ＨＣｌ３）で精製し、化合物２を泡状物質として６．７
５９（４８，２％）得た。さらに、分離できなかったフ
ラクションを染め、シリカゲル力ラムク口マトグラフィ
ー（Ｃ−２００，２Ｇ０３、ヘキサン：酢酸エチル−４
：１）でｆ６賀し、泡状物質（化合物２）を３．９６　
！？　（２８，４％）得た。

ＵＶ（ＨｅＯＨ）：　λｍａｘ　２５２ｔｖ、λｗｉｎ
　２２５ｎｔ実施例３（５−Ｎｅｔｈｙｌ−２’−０−ｓｅｔｈｙｌｕｒｉｄ
ｉｎｅ（化合物３）の合成）化合物２　（６，９９ｒＪ、　１１．３ｍｍｏｌ）をジ
オキサン１００ｄ　ニ溶解し、ｃＮＨ４０Ｈ（１２，２
ｍｌり　ｅ加え、空温で５時間撹拌した。原料の消失を
確認し、反応溶液を濃縮し、ＣＨＣｌ３−８２０で分液
した。

有機層を、水、ＮａＨＣＯ３水溶液、水の順に洗浄した
後、Ｎａ　　ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧下留去後、ヘ
キナンから結晶し、５．４６９　（９３，９％）の結晶
性化合物を得た。

ｍ、ｐ、：１１６．５〜１１８．０℃ ｍａｓｓ　ｍ／ｅ：　４７１　（１４＋−１ｓｏｐｒｏ
ｐｙｌラジカル）元素分析：　　Ｃ２３＋＋４２８２　
０７　Ｓ１２としての、計算値：　Ｃ，５３，７０；Ｈ
，８，１７；Ｎ、５．４ｂ実験値：　Ｃ，５４，５３，
Ｈ，８，１３；Ｎ、５．６８この化合物（４，００す、
７．８１１１０１）をテトラヒドロ７ラン５０−１に溶
解し、Ｔ　０ｔｒａｂｕｔＶＩａｌｌｌＯｎｉｕｌｆｌ
ｕｏｒｉｄｅ（３，２ｍ、　　３．１ｗ５ｏｌ）加え、
空温で４．５時間撹拌した。ピリジン：水：　Ｍ　ｅ　
０１−Ｉ　Ｊ３：１：１（ｖ／Ｖ）の溶液を１００ｍ！
入れて反応溶液を希釈し、これにＯｏｗｃｘ　５０　　
（ピリジニウム型）を３０ａｅ加え、中和した。樹脂を
濾過後、反応溶液を濃縮し、ＣＨＣｌ３−１−１２０で
分液した。水層を濃縮乾固した後、エタノールから結晶
化を行い、化合物３を１．８５９　（８７，２％）を得
た。

ＵＶ　（Ｈｅ’ｌｌ　）　：　λｗａｘ　２６６ｎｍ、
λｓｉｎ　２３３ｎｍ。

１、ｐ、　　　　　：１９７．Ｏ〜１９８．０　　℃ｍ
ａｓｓ　　ｍ／ｅ：　　　２γ２（１４”　　）元素分
析”　　Ｃ１１’１６　’２　０Ｇとしての、計算値：
　Ｃ，４８，５３；Ｈ，５，８８；Ｈ，１０，２９実験
値：　Ｃ，４８，３６；Ｈ，５，９６；Ｎ、１０．３７
’ＩＩ−ＮＨＲ（ＤＨ３Ｏ−ｄ６）δｐｐ１７．７８（
ｄ、１１１．Ｊ−１，２Ｈｚ、ＣＢ　　−Ｈ）。

５、８６（ｄ、　１１１．　Ｊ−５，４Ｈｚ、　ＣＩ’
−Ｉｔ）。

３．３３　（ｓ、３１１．０２’−ＣＨ３）。

１．７８（Ｓ、３Ｎ、Ｃ５−ＣＨ３）。

因みに、化合物３は、・尿から単離されたとの報告があ
るが（Ｃ，Ａ、　、　Ｖｏｌ、１Ｇ１，６８６５４ａ（
１９８４）、尿からの単離では単離できる量に自ら制限
があり、上記の実施例１〜３によって製造するのが極め
て有利である。

実施例４（メトキシ−５′−ジメトキシトリチル−２′−〇−メ
チルー５−メチルーウリジン−３１０−（Ｎ、Ｎ−ジイ
ソプロピルアミノ）フォスフイン（化合物５）の合成）化合物３　（０，５４４ｔＪ、　　２．０ｍｍｏｌピリ
ジン共沸後、５−のピリジンに溶解しジメトキシトリチ
ルク１］ライド（０，８２９，２，４ｍｍｏ　ｌ　）加
え、空温で４時間撹拌した。原料の消失を確認し、メタ
ノール１１１１を加え、反応を停止させた。溶媒を減圧
］；留去し、ＣＨＣ１３−Ｈ，２０で分液し、有ｔ１層
をＮａ　　ＳＯ４乾燥俊、シリカゲルカラムクロマトク
ラ）イー　（Ｃ−２００、４０７、〜４％ＭｅＯＨ／Ｃ
ＨＣｌ３）で精製した後、ｎ・−ヘキサンから粉末化し
、化合物４を０．９２ｇ（８０％）得た。

この化合物４　（２８１１９１０，４９霞■０１）をピ
リジン共Ｓ侵、蒸留メチレンクロライドに溶解し、ジイ
ソプロピルエチルアミン（０，３５ａｄ！、２．０ｍｍ
ｏｌ）を加えた。密栓した侵、雰囲気をアルゴン置換し
、そこへｃｈｌｏｒｏ−Ｎ　、　Ｎ　−ｄｉｉｓｏｐｒ
ｏｐｙｌａｉｉｎｏｉｅｔｈｏｘｙｐｈｏｓｐｈｉｎｅ
　（０，１２ａｄ、０．６１１０１）を約１分かけて滴
下した。室温で約６０分放置し、原料の消失を確認し、
（シリカゲルＴＬＣ法：移ＦＩＪ　Ｆｎ、酢酸エチル、
原料Ｒ（Ｗｉ　Ｏ，４３、ＩＩ！ｉ部Ｒ，値０．７）、
酢酸エチル約１５ｍを加え、反応溶液を希釈した。

飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和食塩水ぐ洗浄した後、無
水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、残渣を得た。更に
、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｃ−３００，
２，５ｇ、酢酸エチル）でｍ製し、泡状物質として化合
物５を０．３４９　（９４％）を得た。

実施例５（ヌクレオシド樹脂の合成）化合物４　（０，１７９，３，０１１０１）をピリジン
共沸した侵、塩化メチレン３ｍに溶解し、無水コハク酸
（４７，８■、４．５ｕｏｌ）とジメチルアミノピリジ
ン（５５，５ｑ、　　０．４６ｉｍｏりを加え、変温で
２時間撹拌した。ＴＬＣで原料の消失を確認した後、反
応液を０．５Ｍ　　ＫＨＰＯ４水で洗浄した。溶媒を減
圧上留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ
ー（Ｃ−３００、１０９）で精製し、ノルマルへ４−サ
ンで粉末化し、０．１８　ｇ　（０，１７ｍ１ｏｌ、８
８．９％）の３’　−（２’−０−Ｈｅｔｈｌ／＋−５
’　−０−ｄｉｍｃｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ　−５−１
ｃｔｈｙｌｕｒｉｄｉｎｙｌ）　−ｍｏｎｏｓｕｃｃｔ
ｎａｔｅを得た。

全量をＤＭＦ３ａｅに溶解し、ペンタクロロフェノール
（８７，１１１Ｉ！Ｆ、約１．２当量）、ジシクロへキ
シルカルボジイミド（６６，０■、約１．２当量）を加
え、室温で一晩撹拌した。ＴＬＣで原料の消失を確認し
、生じた沈澱をＰ別した後、溶媒を減圧ド留去した。さ
らに、残渣にベンゼンを加え、析出した不溶物をＰ別し
、Ｐ液を濃縮した後、ｎ−ヘキサンから粉末化し、ｐｅ
ｎｔａｃｈ＋ｏｒｏｐｈｅｎｙ＋　−３’（２’　　−
０−ｍｅｔｈｙｌ−５’　　−０−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ
ｔｒｉｔｙｌ＝　５−１８ｔｈｙＩＬＩｒｉｄｉｎｙ１
）−３ｕＣＣｉｎａｔｅを得た。収ｇＬ０．２３　ｇ、
０．２４９ｍｇ＋ｏ　Ｉ、収率９２．３％。

コノ化合物（７５，３Ｉ！ｒｇ、８２μｍｏｌ）をＣＰ
Ｇ樹脂（１００μ１ｉｏｌ　　ＮＨ２／ｇ、０．２４Ｉ
Ｊ）のトリエチルアミン（１５Ｊ１１）−ＤＭＦ　（３
ｍ）の懸濁液中へ加え、室温で一晩振とうした。反応液
を一過し、樹脂をＤＭＦ、ピリジン、塩化メチレンで順
次洗浄した後、減圧乾燥した。

常法により定量し、ローディング量１μｍ０１／２９．
４■であることを確認した。

０．１Ｍジメチルアミノピリジン／ピリジン４．５−と
無水酢酸０．５ｍを加えて１０分！ｆｆｉ振とうした。

反応液を濾過し、樹脂をピリジン、塩化メチレンで順次
洗浄した後減圧下乾燥し、化合物６を得た。

実施例６（デカリボアデニル酸（γＡ　　１０ｗｅｒ）の合成）
公知方法（Ｅ　、　Ｏｈｔｓｕｋａ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、　４０．４７（１９８４）参
照）に従い合成したＮ６−ペンゾイルー５′−〇−ジメ
トキシトリチルー２’−０−テトラヒドロピラニルアデ
ノシンを公知方法（Ｌ　、　Ｊ　、　Ｍ　ｃ　Ｂ　ｒｉ
ｄｅ　ｃｔａｌ、。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２４．
２４５（１９８３）参照）従い３’　−０−（Ｎ、Ｎ−
ジイソプロピルアミノ）−メトキシホスホアミダイト誘
導体に導いた。

即ち、Ｎ６−ペンゾイルー５′−〇−ジメトキシトリチ
ルー　２’−０−テトラヒドロピラニルアデノシン（５
７６，３ｑ、　　７６６．５μｍｏｌ）をピリジン共沸
により無水にした後、ジクロルメタン１ａｉ！に溶解し
た。この溶液に窒素ガス気流「ｆジイソプロピルエチル
アミン（０，４９ｒｄ＞を加えた後、水冷下クロロ・−
メトキシ−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフィン（
０，１７ｄ）を徐々に加えた。１時間放置後、薄層りＯ
マドグラフィーにより原料の消失を確認した後、酢酸エ
チル１０ｄを加え希釈した。この希釈液を飽和炭酸水素
ナトリウム水溶液、次いで飽和食塩水で洗浄し、酢酸エ
チル層を減圧下濃縮乾固した。得られた残渣を酢酸エチ
ルに溶解し、１０ｇのシリカゲル（Ｃ−３００）を充填
したカラムクロマトグラフィー（移動相：酢酸エチル）
により精製した。溶出されたＮＧ−ペンゾイルー５′−
〇−ジメトキシトリエチルー２′−〇−テトラヒドロピ
ラニルアデノシン−３’−０−（Ｎ。

Ｎ−ジイソプロピルアミノ）メトキシホスホアミダイト
（化合物７）の純粋画分を集め濃縮乾固し、０．６７　
ｇ（７３３，９μｍｏｌ　）の化合物７を９５．７％の
収率で得た。

次に、ＮＧ−ベンゾイル−２′−〇−テトラヒドロピラ
ニルアデノシン（１μ１０１）を結合した固相担体（Ｒ
、Ｋ　１ｅｒｚｅｋ　ｅｔａｌ、、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ。

２５、７８４０〜７８４６　（１９８６）を出発原料に
用い、２０μｍｏｌ　／　１４０ＩＩｉの濃度になるよ
うに溶解した化合物７のアセトニトリル溶液とともにＤ
ＮＡ自動合成ｍ＜７プライドバイオシステムズ社製、モ
デル３８０Ａ　＞にて鎖長延長反応を行なった。各縮合
サイクルに先立つ脱ジメトキシトリチル化反応は、１％
ジクＬ１ル酸／メチレンクロライド溶液を用いた。反応
後の固相担体より切り出された部分的に保１ｍ３を有す
るデカアデニル酸のアンモニア水溶液は、６０℃で５時
間加温した。次いで、この溶液を濃縮し、逆相シリカゲ
ル（Ｐｒｅｌ）　Ｆ’ＡＫ−５００／Ｃ−１８、ウォー
タース社製）を詰めたカラムク０マドグラフイーを行な
うことにより精製した。

即ち、移動相として５％から３５％のアセトニトリルの
直線濃度勾配をかけた５０１Ｍ　ｔ’リエチルアミンー
炭酸緩衝液（１）Ｈ７，５、以ドＴＥＡＢと略す。）を
用いて溶出し、５′末端にジメトキシトリチル基及び２
′位水ｗ１基にテトラヒドロピラニル基を有するデカア
デニル酸の純粋画分を集め、濃縮乾固した０次に、この
、残渣を０．０１　Ｎの塩酸水溶液１０ｄに溶かしてｐ
ｉ−１２，０に調整し、室温に２４時間放置した。反応
液は希釈したアンモニア水で中和後、酢酸エチルにて洗
浄したのち濃縮し、セファデックスＧ−２５を詰めたゲ
ルー過カラムクロマトグラフィー（移動相：　　０．Ｉ
Ｍ　　ＴＥＡＢ）を行なうことにより脱塩した。

完全に脱保護されたデカアデニル酸は、最後に逆相シリ
カゲル（ＹＭＣＰａｃｋ　ＯＤＳ、Ｃ−１８（山村科学
社製））を用いた高速液体クロマトグラフィーにより精
製し、６．５７００ユニツト、約５０ｎＩＯ＋のデカア
デニル酸を５％の通算収率で単離した。

得られたデカアデニル酸は、陰イオン交換カラム（ＤＥ
ＡＥ−２８Ｗ）を用いた高速液体クロマトグラフィーで
分析を行い、はぼ単一なピークを与えることを確認した
。

実施例７（デカ（２’−０−メチル−５−メチルウリジル酸）す
なわちｍ５［Ｊｍ　１０ｍａｒ　（Ｄ合成＞実施例５で
得た２’−０−メチル−５−メヂルウリジン（１μ５ｏ
ｌ）を結合した固相担体を出発原料にして、実施例４・
で得た化合物５のアセトニトリル溶液（２０μｍｏｆ／
１４０　ｌ１１）を用いて、常法に従い実施例６と同様
に（この場合は説ジメチルトリチル化は、３％トリクロ
ル酢酸ジクロメタン溶液を用いた）鎖長延長反応を行っ
た。反応後の固相担体より切り出された５′末端にジメ
トキシトリチル基を有するデカ（２’−０−メチル−５
−メチルウリジル酸）を実施例６と同様に逆相シリカゲ
ルカラムを用いて分ｍｍ製した。

次に、この一部をとり溶媒を減圧留去した後、８０％酢
酸水溶液１ｄを加え、室温で１０分間放直置た６反応液
を減圧留去した後、更に水と減圧共沸することにより酢
酸を除去した。残渣を水に溶解し酢酸エチルで洗浄侵減
圧留去し、実施例６で用いた逆相シリカゲルによる高速
液体クロマトグラフィーによりＩＩＩＪＬ／、７．２８
００ユニツトのデカ（２’−０−メチル−５−メチルウ
リジル酸）を得た。

得られたオリゴマーは陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ−
２８Ｗ）を用いた高速液体クロマトグラフィーで分析を
行い単一なピークを与え、純粋であることを確認した。

また、同様の方法により、デカデオキシチミジル１ｌ（
ｄＴ　１０ｍｅｒ）ヲ２０．８４００−Ｌニット、７　
カ（２’−〇−メチルウリジル酸）　　（Ｕｓ　１０ｍ
ａｒ　）を１５．４７００ユニツト得た。

実施例８（Ｔｉ測定実験）実施例６及び７により得たそれぞれのデカオリゴヌクレ
オチド量は、次のε値（計算値）により定値した。

ｍ−」ニー順− γＡ　１０１１１Ｏｒ　　　（相補鎖）　：　　１２３
４００ｄ丁１０ｍｅｒ　　　（対　照）　：　　８１６
００ｍ　　Ｕｎ　１０ｍｅｒ　　（本発明）　：　　　
９６８００ＵｍｌＯｍｅｒ　　　（対　照”）　：　　
９６８００７Ａ　１０ａ＋ｅｒ（０，２０ＴＯＤ、　１
．６ｎｍｏｌ）とｄＴｌｏｍｅｒ、１５Ｕ１１１０１ｍ
＋３ｒ　、ＬＪＩ　１０１１ｅｒ　（７）ソれぞれ１．
６ｔｖｏｌ相当幻をエッペンドルフヂュープにとり、減
圧乾固した。それぞれバッファー（０，０１Ｍカコジル
酸ナトリウム塩、０．ＩＭ　　ＮａＣ１゜１１Ｍ　　Ｅ
ＤＴＡ、　　Ｅ）Ｈ７，０）　　３００ｐ１に溶解し、
ベックマン社ＩＪＤＬＩ−８８分光光度計を用いて、温
度上昇速度を２℃／ｗｉｎとし、吸光度変化を３回測定
し、それらの平均値を求め、これら３種のハイブリッド
それぞれのＴ＋ｅ値とした。

結果は次の第１表の通りであった（第３図）。

第１表化合物５の合成の概要を図示したものである。第３図は
、３種のハイブリッドの温度変化に対する吸光度変化を
示す（実施例８）。

因みに、各ハイブリッドの構造式は次の通りである。

式中、Ｎは５−　Ｍ　ｅｔＭＩｕｒａｃｉｌを意味する
。

へイア１ノッ１：（１）　：　　５’　ｒ　（ＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡ）、　　３’３’　　（ＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴ）ｄ　５’ハイブリッド■、　　５’　ｒ（ＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡＡ）　　３’３’　　（ＵｔｌＵＵＵＵＵ
ＵＬｔＵ）ｉ　５’ハイフリット■：５’　　ｒ（ＡＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡ）　　３’３’　　（ＮＨＮＮＮＨＮ
ＮＮＮ）ｍ　５’

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、それぞれ、実施例１〜３１（埋入
弁理士　霜　越　正　夫

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下記一般式（ I ）で表されるオリゴヌクレオチ
ド誘導体。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ）式中、Ｒは、水素原子、アシル基、又は置換基を有して
いてもよいホスホリル基を表し、Ｔは、チミン・１−イ
ル基を表し、Ｙ＿１、Ｙ＿２及びＹ＿３は、相互に同一
であってもよく又異なつていてもよくて、水素原子、ヒ
ドロキシル基、低級アルキルオキシ基又は低級アルキル
シリル基を表し、Ｂは、チミン−１−イル基、アデニン
−９−イル基、グアニン−９−イル基、シトシン−９−
イル基、ウラシル−１−イル基又はヒボキサンチン−９
−イル基を表し、ｎは１〜１００の整数を表す。の下記一般式（II）で表されるヌクレオチド誘導体。 ▲数式、化学式、表等があります▼（II）式中、Ｘは、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリ
チル基又は置換基を有していてもよいホスホリル基を表
し、Ｙは、水素原子、ｏ−クロルフエニル燐酸、−Ｐ（
ＯＣＨ＿３）−Ｎ−（ＣＨ（ＣＨ＿３）＿２）＿２、−
Ｐ（ＯＣＨ＿２ＣＨ＿２ＣＮ）−Ｎ−（ＣＨ（ＣＨ＿３
）＿２）＿２又は−ＣＯ−（ＣＨ＿２）＿ｍ−ＣＯＮＨ
−（ＣＨ＿２）＿ｎ−（ＣＰＧ誘導体）（ここに、ｍ及
びｎは、それぞれ、１〜１０の整数である）を表わす。ただし、Ｘが置換基を有していてもよいホスホリル基の
ときは、Ｙは水素原子である。