JP2003292499A - オリゴヌクレオチドの化学的合成法 - Google Patents

オリゴヌクレオチドの化学的合成法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 副反応が回避され、保護基が容易に検出でき
る収率の高いオリゴヌクレオチドの合成方法を提供す
る。 【解決手段】 ＤＮＡおよびＲＮＡの化学的合成および
好適な合成法において、塩基に不安定な５′−ヒドロキ
シル保護基としてのダンシルエトキシカルボニル基を使
用する。これによりダンシル保護基の検出が容易であり
且つ副反応なしにヌクレオチドの糖残基から除去するこ
とが容易であり、これによって極めて少量でオリゴヌク
レオチドを高収率で合成することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】モノヌクレオチドの化学的重縮合は、デオ
キシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の調
製に重要な方法である。
【０００２】ＤＮＡまたはＲＮＡの化学的合成における
基本的な問題は、ヌクレオシド塩基および糖残基上にお
けるアミノおよびヒドロキシル基の好適な保護基を見出
すことである。これらの保護基は、一方においては、重
縮合反応の条件下で、すなわちホスホジエステル結合の
形成の際に安定でなければならず、他方において、ホス
ホジエステル結合を開裂することなく反応の終了時に再
度除去し得るほど十分に不安定でなければならない（エ
イチ・ジー・コーラナ(H.G. Khorana)、Pure Appl. Che
m., 17 (1968), 349）。
【０００３】ＲＮＡの化学的合成は、リボース糖残基が
２個のヒドロキシル基を有しておりこれを両方とも保護
しなければならないので、特に難しい。更に、それぞれ
の重縮合工程の前には、５′−ヒドロキシル基を選択的
に、すなわち２′−ヒドロキシル保護基を除去すること
なく、再度除去されねばならない。他方、２′−ヒドロ
キシル基上の保護基は、ＲＮＡ合成の終了時にのみ、特
にホスホジエステル結合のいかなる開裂も異性化も起こ
さない条件下で、除去しなければならない（シー・ビー
・リーズ(C.B. Reese)、核酸および分子生物学(Nucleic
Acids and Molecular Biology) 、３巻（エフ・エック
シュタイン(F. Eckstein) およびディー・エム・ジェイ
・リレイ(D.M.J. Lilley) 監修、シュプリンガー出版(S
pringer-Verlag) 、ヴァインハイム（Weinheim) ）。
【０００４】２′−ヒドロキシル保護基を除去すること
なく５′−ヒドロキシル保護基を選択的に除去する一つ
の可能性は、塩基に不安定な５′−ヒドロキシル保護基
を酸に不安定な２′−ヒドロキシル保護基と結合させる
ことによって行うことができる（クリスチャン・レーマ
ン(Chr. Lehmann)ら、(1989), Nucleic Acids Res.,17,
2379-2390, 7号）。塩基に不安定な５′−ヒドロキシ
ル保護基を用いることは、ＤＮＡの合成において既に形
成されているホスホジ−および−トリエステル結合の温
和な非酸加水分解条件下では通常は開裂しないので、Ｄ
ＮＡの合成においても有利である。更に、このような温
和な非酸加水分解条件下では、ウー・ソンヴォー(E. So
nveaux) （ウー・ソンヴォー(E. Sonveaux) (1986), Bi
oorganicChemistry, 14, 286 ）によって記載されてい
るようなヌクレオチドの脱プリンが回避される。ＤＮＡ
およびＲＮＡ合成において５′−ヒドロキシル保護基に
よって満たされなければならないもう一つの要件は、保
護基が容易に検出可能であり且つ高感度であることであ
る。この方法では、個々の反応工程の転換率が特に良好
になり、できる限り完全に転換を行うことができる。こ
れにより、特に長いオリゴヌクレオチドを高収率で調製
することができる。また、これはナノモルからピコモル
の範囲の少量の合成混合物をも可能にする。
【０００５】ダンシルエトキシカルボニル基（Ｄａｎｓ
−ＥＯＣ）を化学的オリゴヌクレオチドの合成において
塩基に不安定な５′−ヒドロキシル保護基として用いる
ことができることを、意外にも見出した。
【０００６】したがって、本発明は、下記のことに関す
る。 １． 式(II)
【化１９】 を有する化合物をクロロカルボニル供与体と反応させる
ことを特徴とする、式(I)
【化２０】 を有する化合物の製造法； ２． 式(IIIa)または(IIIb)
【化２１】 （式中、ＤａｎｓＥＯＣは、式
【化２２】 を有する基であり、Ｒ１は、水素または互いに独立に、
式
【化２３】 の基であり、Ｂは、
【化２４】 であり、但し、Ｒ２は、それぞれの場合に互いに独立
に、式
【化２５】 であるか、またはＢは、
【化２６】 であり、但し、Ｒ３は、それぞれの場合に互いに独立
に、水素または
【化２７】 であり、Ｒ４は、それぞれの場合に互いに独立に、式
【化２８】 であるか、またはＢは
【化２９】 であり、但しＲ５は、それぞれの場合に互いに独立に、
−ＯＨ、
【化３０】 であり、Ｙは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、特にＣＨ３
である）を有する化合物； ３． 塩基、好ましくはピリジン、またはテトラヒドロ
フラン、ジオキサン、塩化メチレン、クロロホルムおよ
び／またはアセトニトリルおよび式 ＮＲ20Ｒ21Ｒ22 （式中、Ｒ20、Ｒ21およびＲ22は同一であるかまたは互
いに異なるものであり、水素またはＣ１〜Ｃ４−アルキ
ル基、好ましくはトリメチル、トリエチルまたはジイソ
プロピル基である）を有する化合物から成る混合物の存
在下にて、式(I)を有する化合物を、式(IVa) または(IV
b)
【化３１】 （式中、Ｒ１およびＢは上記と同じ意味である）を有す
る適当な化合物と反応させることを特徴とする、式(III
a)または(IIIb)を有する化合物の製造法； ４． 式(Va)または(Vb)
【化３２】 ［式中、ＤａｎｓＥＯＣ、Ｒ１およびＢは前記の意味を
有し、Ｒ６及びＲ７は、同一であるかまたは互いに異な
るものであり、Ｃ１〜Ｃ８−アルキル、好ましくはイソ
プロピルまたはＣ５〜Ｃ12−シクロアルキル基（好まし
くはＣ８以下）、ベンジルまたはフェニル基であるか、
またはそれらが結合している窒素原子と共に更にヘテロ
原子および置換基を任意に含むことができる飽和または
不飽和の複素環であり、Ｒ８は、式
【化３３】 を有する基であるか、または未置換または１回以上環が
置換されたベンジル基であり、好ましくは未置換であ
り、（１個以上の）置換基は互いに独立にハロゲン、Ｃ
１〜Ｃ４−アルキル、ニトロ、メトキシまたはカルボキ
シル基である］を有する化合物； ５． 式(IIIa)または(IIIb)を有する化合物を、式(VI)
【化３４】 （式中、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は前記の意味を有し、Ｚ
は塩素または臭素であるか、または式−ＮＲ９Ｒ10を有
する基であり、但し、Ｒ９およびＲ10にはＲ６の場合と
同じ基が好適であり、同一であるかまたは互いに異なる
ものである）を有する化合物と、Ｚが塩素であるときに
は、塩基、好ましくはピリジン、またはテトラヒドロフ
ラン、ジオキサン、塩化メチレン、クロロホルムおよび
／またはアセトニトリルのＣ１〜Ｃ４−トリアルキルア
ミン、好ましくはトリメチル−、トリエチル−またはジ
イソプロピルエチルアミンとの混合物の存在下にて、ま
たはＺが式−ＮＲ９Ｒ10を有する基であるときには、式
［ＨＮＲ11Ｒ12Ｒ13］(+) Ｘ (-) （但し、Ｒ11、Ｒ12お
よびＲ13は同一であるかまたは互いに異なるものであ
り、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル基であり、Ｘはハロゲン（特
に塩素）、またはテトラゾールである）を有する化合物
の存在下、好ましくはテトラゾールの存在下にて反応さ
せることを特徴とする、式(Va)または(Vb)の化合物の製
造法； ６． 式(Va)または(Vb)の化合物を、（１） 式(VIIa)
または(VIIb)
【化３５】 （式中、ＢおよびＲ１は前記の意味を有し、ＧはＲ１と
同じ意味を有するかまたは式(VIIa)または(VIIb)の化合
物の２′−ヒドロキシルまたは３′−ヒドロキシル基に
よって結合されている重合支持体である）の化合物と反
応させ、（２） 生成する化合物を酸化し、（３） ダ
ンシルエトキシカルボニル基を除去し、（４） 生成す
る化合物を式(Va)または(Vb)の化合物と反応させ、
（５） 必要な鎖長になるまで反応工程２〜４を繰り返
すことを特徴とする、式(Va)および／または(Vb)の化合
物からオリゴヌクレオチドを製造する方法； ７． 式(VIIIa) または(VIIIb)
【化３６】 （式中、ＤａｎｓＥＯＣ、Ｒ１およびＢは前記の意味を
有し、Ｋ(+) はカチオン、特に［ＨＮ（Ｃ２Ｈ５）３］
(+) である）を有する化合物； ８． 塩基の存在下にて、式(IIIa)または(IIIb)を有す
る化合物を、式(IX) ＰＲ14Ｒ15Ｒ16 (IX) （式中、Ｒ14、Ｒ15およびＲ16は、同一であるかまたは
互いに異なるものであり、水素またはＣ１〜Ｃ８−アル
キル、Ｃ１〜Ｃ８−フルオロアルキルまたはアリール
基、好ましくは２，２，２−トリフルオロエチル、１，
１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロピル、
エチルまたはフェニル基である）を有する化合物と反応
させることを特徴とする、式(VIIIa) または(VIIIb) を
有する化合物の製造法； ９． 塩基の存在下にて、式(IIIa)または(IIIb)を有す
る化合物を、式(X) ＰＲ17Ｒ18Ｒ19 (X) （式中、Ｒ17、Ｒ18およびＲ19は、同一であるかまたは
互いに異なるものであり、塩素、臭素またはＣ１〜Ｃ８
−アルキルアミノまたは１，２，４−トリアゾリル基、
好ましくは１，２，４−トリアゾリル基である）を有す
る化合物と反応させた後、加水分解することを特徴とす
る、式(VIIIa) または(VIIIb) を有する化合物の製造
法； １０． 式(VIIIa) または(VIIIb) を有する化合物を、
（１） 式(VIIa)または(VIIb)の化合物と反応させ、
（２） ダンシルエトキシカルボニル基を除去し、
（３） 生成する化合物を式(VIIIa) または(VIIIb) の
化合物と反応させ、（４） 必要な鎖長になるまで反応
工程２および３を繰り返し、（５） 生成するオリゴヌ
クレオチドを酸化することを特徴とする、式(VIIIa)お
よび／または(VIIIb) の化合物からオリゴヌクレオチド
を製造する方法。
【０００７】ダンシルエトキシカルボニル基をヌクレオ
シド中に導入するため、２−ダンシルエチルクロロホル
メートヒドロクロリドをヌクレオシドと反応させるが、
ヌクレオシドによっては、ヌクレオシド塩基のアミノお
よびヒドロキシル基は好適な基によって保護される。ア
デニンの６−アミノ基に好適な保護基の例は、ｔ−ブチ
ルオキシカルボニル、ベンゾイル、４−（ｔ−ブチル）
ベンゾイルまたはパラ−ニトロフェニルエチルオキシカ
ルボニル基、特にベンゾイルまたはパラ−ニトロフェニ
ルエチルオキシカルボニル基である。
【０００８】グアニンの２−アミノ基に好適な例は、イ
ソブチリル、４−（ｔ−ブチル）フェニルアセチルまた
はパラ−ニトロフェニルエチルオキシカルボニル基、特
にイソブチリルまたはパラ−ニトロフェニルエチルオキ
シカルボニル基である。グアニンの６−ヒドロキシル基
およびウラシルの４−ヒドロキシル基は、いずれも通常
は保護されないままであるかまたはパラ−ニトロフェニ
ルエチル基によって保護される。シトシンの場合には、
４−アミノ基は例えばベンゾイル、４−（ｔ−ブチル）
ベンゾイルまたはパラ−ニトロフェニルエチルオキシカ
ルボニル基、特にベンゾイルまたはパラ−ニトロフェニ
ルエチルオキシカルボニル基によって保護される。チミ
ジンは一般的には保護されないままである。ウリジンの
３−Ｎ基は、例えばＢｏｃまたはアミソイル基によって
保護される。
【０００９】天然のヌクレオシド塩基の代わりに、アミ
ノまたはヒドロキシル基を前記の保護基によって同様な
方法で保護することができる修飾されたヌクレオシドを
用いることも可能である。修飾された塩基を有するヌク
レオシドの例は、イノシン、８−アザ−７−デアザアデ
ノシン、ツベルシジン、ネブラリン、キサントシン、２
−アミノアデノシンまたはピリドピリミジンヌクレオシ
ドである。これらのヌクレオシドは購入することがで
き、個々の保護基の導入は例えばシー・レーマン(C. Le
hmann)ら、(1989)、シー・ビー・リーズ(C.B. Reese(19
89))［「オリゴおよびポリリボヌクレオチドの化学的合
成(The Chemical Synthesis of Oligo andPolyribonucl
eotides)」核酸および分子生物学(Nucleic Acids and M
olecularBiology)、３巻（エフ・エックシュタイン(F.
Eckstein) およびディー・エム・ジェイ・リレイ(D.M.
J. Lilley) 監修、シュプリンガー出版(Springer-Verla
g）、ベルリン、ハイデルベルク］、ウー・ソンヴォー
(E. Sonveaux) (1986)，Bioorganic Chemistry, 14, 27
4-325 、またはイー・ウールマン(E. Uhlmann)およびエ
イ・ペイマン(A. Peyman) (1990), Chemical Reviews 9
0, 543-584, 4 号の方法によって行うことができる。
【００１０】リボヌクレオチドを用いるときには、ヌク
レオチド塩基のヒドロキシルおよびアミノ基に加えて、
リボース残基の２′−ヒドロキシル基を保護することも
必要である。前記のように、ＲＮＡ合成を可能にするに
は、５′−ヒドロキシルおよび２′−ヒドロキシル保護
基の好適な組み合わせを選択して、選択的に、すなわち
２′−ヒドロキシル保護基を脱離することなく５′−ヒ
ドロキシル保護基を除去することが重要である。
【００１１】非酸条件下では、酸に不安定な２′−ヒド
ロキシル保護基の存在下にて５′−ヒドロキシル保護基
としてダンシルエトキシカルボニル基を選択的に脱離さ
せることが可能である。用いることができる酸に不安定
な２′−ヒドロキシル保護基の例は、４−メトキシ−４
−テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、ｔ−
ブチルジメチルシリル、２−ニトロベンジル、１−（２
−クロロ−４−メチルフェニル）−４−メトキシ−４−
ピペリジニルまたは１−（２−フルオロフェニル）−４
−メトキシ−４−ピペリジニル基である。ダンシルエト
キシカルボニル基は、非プロトン性極性溶媒、特にＤＢ
Ｕ（＝１，５−ジアザビシク［５．４．０］ウンデセ
（undec)−５−エン）１〜３モル当量、好ましくは１．
５〜２．５モル当量を有するアセトニトリルまたはピリ
ジン中で好ましく脱離される。代わりに、ＴＭＧ（＝Ｎ
１，Ｎ１，Ｎ２、Ｎ２−テトラメチルグアニジン）のよ
うな塩基、またはトリエチルアミンのようなＣ１〜Ｃ４
−トリアルキルアミンを脱離に用いることも可能であ
る。
【００１２】２−ダンシルエチルクロロホルメートヒド
ロクロリドを、リボースまたはデオキシリボース残基の
５′−ヒドロキシル保護基の出発化合物として、２−ダ
ンシルエタノールを極性の非プロトン性溶媒の存在下に
てクロロカルボニル供与体、例えばトリクロロメチルク
ロロホルメート、（ジホスゲン）および／またはホスゲ
ン、好ましくはトリクロロメチルクロロホルメートと反
応させることによって調製した。好ましい態様では、反
応は単一の極性の非プロトン性溶媒の存在下にて、特に
アセトニトリルの存在下にて行った。２−ダンシルエタ
ノール対クロロカルボニル供与体のモル比は、０．５〜
１対１〜２、好ましくは１対１〜２、特に１対１．５〜
２であった。反応温度は、−２０℃から反応混合物の沸
点までの範囲、好ましくは−５℃〜＋２０℃、特に０℃
〜５℃であった。
【００１３】本発明による方法は、２−ダンシルエチル
クロロホルメートヒドロクロリドを純粋な生成物として
生じ、この組成は元素分析によって確認した。エイ・タ
カダテ(A. Takadate) ら、（エイ・タカダテ(A. Takada
te) ら、(1983)、薬学雑誌、103, 982-966）は、２−ダ
ンシルエタノールをトリクロロメチルクロロホルメート
と反応させて、融点が前記の方法で合成した生成物の融
点より約２０℃低い生成物を得たので、この結果は極め
て驚くべきことである。２−ダンシルエタノールは、例
えばエス・ゴヤ(S. Goya) ら（エス・ゴヤ(S. Goya)
ら, (1981)、薬学雑誌、101, 1164 ）の方法によって調
製することができる。
【００１４】２−ダンシルエチルクロロホルメートヒド
ロクロリドと保護ヌクレオシドの反応は、例えば塩基の
存在下にてシー・レーマン(C. Lehmann)ら、(1989)の方
法による９−フルオレニルメトキシカルボニルクロリド
との反応と同様にして行うことができる。塩基として好
適なものは、有機塩基、特にピリジンまたはテトラヒド
ロフラン、ジオキサン、塩化メチレン、クロロホルムお
よび／またはアセトニトリルおよび式 ＮＲ20Ｒ21Ｒ22 （式中、Ｒ20、Ｒ21およびＲ22は同一であるかまたは互
いに異なるものであり、水素またはＣ１〜Ｃ４−アルキ
ル、好ましくはトリメチル、トリエチルまたはジイソプ
ロピル基である）を有する化合物から成る混合物であ
る。それ故、用いられる基質が２′−保護リボヌクレオ
シドであるときには、ダンシルエチルオキシカルボニル
−リボヌクレオシドと副生成物としてビス−ダンシルエ
チルオキシカルボニル−リボヌクレオシドとから成る生
成物の混合物を生じる。この生成物の混合物は、次のホ
スホリル化反応に直接用いることができる。この混合物
を、例えばフラッシュクロマトグラフィによって精製す
ることも可能であり且つ好ましい。除去されたビス−ダ
ンシルエチルオキシカルボニル−リボヌクレオシドを、
続いて例えばＤＢＵによって開裂して、ダンシル不含リ
ボヌクレオシドとして、これを次にダンシル反応の出発
化合物として用いることができる。
【００１５】２′，５′−結合オリゴリボヌクレオチド
を合成するには、例えばトリ−またはテトラアデニレー
トがタンパク質の生合成を抑制するので（ケール，アイ
・エム(Kerr, I.M.)およびブラウン・アール・イー(Bro
wn, R.E.) (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75,
256-260 ）、前記の説明にしたがって保護され且つ遊離
の２′−ヒドロキシル基を有するヌクレオシドを同様な
方法で２−ダンシルエチルクロロホルメートヒドロクロ
リドと反応させることが可能である。
【００１６】糖残基上の２′−または３′−ヒドロキシ
ル基が遊離のままであるダンシル化ヌクレオシドは、一
般的にはホスフィチル化される。ホスフィチル化試薬と
しては、式(VI)
【化３７】 ［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一であるかまたは互いに
異なるものであり、Ｃ１〜Ｃ８−アルキル、好ましくは
イソプロピル、またはＣ５〜Ｃ12−シクロアルキル基
（好ましくはＣ８以下）ベンジルまたフェニル基である
か、またはそれらが結合している窒素原子と共に更にヘ
テロ原子および置換基を任意に含むことができる飽和ま
たは不飽和の複素環であり、Ｒ８は、式
【化３８】 を有する基であるか、または未置換または１回以上環が
置換されたベンジル基であり、好ましくは未置換であ
り、（１個以上の）置換基は互いに独立に例えばハロゲ
ン、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、ニトロ、メトキシまたはカ
ルボキシル基であり、Ｚは、塩素または臭素であるか、
または式−ＮＲ９Ｒ10を有する基であり、但し、Ｒ９お
よびＲ10は同一であるかまたは互いに異なるものであ
り、Ｃ１〜Ｃ８−アルキル、好ましくはイソプロピルで
あるか、またはＣ５〜Ｃ12−シクロアルキル基（好まし
くはＣ８以下）、ベンジルまたはフェニル基である］を
有する化合物を用いることが可能である。
【００１７】ホスフィチル化試薬として好ましく用いら
れたものは、式(VII) の化合物においてＺが塩素であ
り、Ｒ６およびＲ７はそれぞれイソプロピル基であり、
Ｒ８は式
【化３９】 の基であるものであった。
【００１８】反応は、通常は有機塩基、例えばピリジ
ン、またはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサ
ン、塩化メチレン、クロロホルムおよび／またはアセト
ニトリルおよびＣ１〜Ｃ４−トリアルキルアミン、好ま
しくはトリメチル−、トリエチル−またはジイソプロピ
ルエチル−アミン、特にジイソプロピルエチルアミンと
混合物１〜８モル当量、好ましくは１〜６モル当量、特
に１〜４モル当量の存在下にて、有機溶媒、例えばテト
ラヒドロフランまたは塩化メチレン、好ましくは塩化メ
チレン中で行った。Ｚが式−ＮＲ９Ｒ10を有する基であ
るときには、反応は式［ＨＮＲ11Ｒ12Ｒ13］(+) Ｘ(-)
（但し、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13は同一であるかまたは互
いに異なるものであり、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル基であ
り、Ｘ(-) はハロゲン化物、特に塩化物である）を有す
る化合物またはテトラゾライトまたはテトラゾールの存
在下、好ましくはテトラゾールの存在下で、好ましく行
った。ダンシル化ヌクレオシド対ホスフィチル化試薬の
モル比は、１対１〜４、好ましくは１対２〜４、特に１
対２．５〜３．５であった。
【００１９】この方法で得られた式(Va)または(Vb)の化
合物は、引き続いてオリゴヌクレオチド合成に用いるこ
とができる。ここで、ヌクレオチドの糖残基はＤＮＡ合
成ではデオキシリボースであり、ＲＮＡ合成ではリボー
スであるが、規則的にまたは不規則に配置されたデオキ
シリボースおよびリボース糖残基から成るオリゴヌクレ
オチドの合成にはデオキシリボースとリボースとの混合
物も可能である。更に、オリゴヌクレオチドは式(Va)お
よび(Vb)のモノヌクレオチドから成る規則的または不規
則な構造を有することができる。オリゴ−およびポリヌ
クレオチド合成は、例えばクリスチャン・レーマン(Ch
r. Lehmann)ら (1989) によって記載されたホスホルア
ミダイト法と同様な方法で行うことができる。
【００２０】オリゴヌクレオチドの合成には、原則とし
て２つの可能性がある。一方では、例えばシー・ビー・
リーズ(C.B. Reese)［(C.B.Reese(1989)「オリゴおよび
ポリリボヌクレオチドの化学的合成(The Chemical Synt
hesis of Oligo-and Poly-ribonucleotides)」核酸およ
び分子生物学(Nucleic Acids and MolecularBiology)
（エフ・エックシュタイン(F. Eckstein) およびディー
・エム・ジェイ・リレイ(D.M.J. Lilley) 監修） 3, 16
4-181 ］によって記載された方法によって、溶液中で合
成を行うことができる。
【００２１】他方では、オリゴヌクレオチド合成は、固
相、例えばヌクレオシド官能化ガラス（ケイ・ピー・ス
テンゲル(K.P. Stengele) およびダブリュ・プランデラ
ー(W. Pfleiderer) 、(1989), Nucleic Acids Res. Sym
p. Ser., 21, 101；ケイ・ピー・ステンゲル(K.P. Sten
gele) およびダブリュ・プランデラー(W. Pfleiderer)
、(1989), Tetrahedron Lett., 31, 2549；クリスチ
ン・レーマン(Chr. Lehmann)ら、(1989), Nucleic Acid
s Res., 17, 2379-2390, 7号）上で行うことができる。
一般的には、固相合成が好ましい方法である。
【００２２】このために、下記の反応順序を好ましく選
択した。 １． 式(Va)または(Vb)の化合物と式(VIIa)または(VII
b)のヌクレオシド
【化４０】 （式中、ＢおよびＲ１は前記の意味を有し、ＧはＲ１と
同じ意味を有するかまたは弱酸、例えばテトラゾールま
たはｐ−ニトロフェニルテトラゾールの存在下にて式
（VIIa) または(VIIb)を有する化合物の２′−ヒドロキ
シルまたは３′−ヒドロキシル基によって結合されてい
る重合支持体である）との反応。 ２． 式(VIIa)または(VIIb)の未反応化合物の無水酢酸
等によるトラッピング。 ３． ヨウ素、硫黄またはヨウ素／アミンなどによるホ
スフェート、ホスホールアミデートまたはチオホスフェ
ートへの酸化。 ４． 例えばアセトニトリル中ＤＢＵによるダンシルエ
トキシカルボニル基の脱離。 ５． 生成する支持体結合化合物の式(Va)または(Vb)の
化合物との反応。 ６． 必要な鎖長のオリゴヌクレオチドを与えるための
反応工程２〜６の繰り返し。
【００２３】式(Va)または(Vb)および(VIIa)または(VII
b)の化合物を、好ましくは、たとえば弱酸としてのテト
ラゾールまたはパラ−ニトロフェニルテトラゾールの存
在下にて、−２０〜＋１００℃、特に室温で反応させ
た。酸化は、ヨウ素、硫黄またはアミンの存在下でのヨ
ウ素の存在下にて、−８０〜１００℃、好ましくは−２
０〜＋６０℃の温度で行った（エイ・イェーガー(A. Ja
eger) ら、Biochemistry, 27, 7237 (1988) ）。ヨウ
素、水および有機塩基、例えばルチジンまたはピリジン
の混合物を用いたときには、酸化は好ましくは室温で行
った。一方、元素状硫黄、トルエンおよび有機塩基の混
合物を用いたときには、酸化は好ましくは６０℃で行っ
た。
【００２４】合成されたオリゴヌクレオチドは、一般的
には２〜約２００、好ましくは２〜１００、特に２〜２
０のモノヌクレオチドから成っていた。
【００２５】ホスフィチル化の代わりに、糖残基上に
２′−または３′−ヒドロキシル基を遊離のままで有す
るダンシルヌクレオシドも、式(VIIIa) または(VIIIb)
【化４１】 （式中、ＤａｎｓＥＯＣ、Ｒ１およびＢは前記の意味を
有し、Ｋ(+) はカチオン、特に［ＮＨ（Ｃ２Ｈ５）３］
(+) である）を有するＨ−ホスホネートに転換すること
ができる（アール・シュトレンベルク(R. Stroenberg)
、Chem. Commun.,1987, 1；ビー・シー・フレーラー
(B.C. Froehler) 、ピー・ジー・ヌグ(P.G.Ng) 、エム
・ディー・マテアッチ(M.D. Matteucci)、Nucleic Acid
s Res., 14 (1986), 5399 ；エム・タハル(M. Tahalu)
ら、Chem. Lett., 1988, 1675 ）。
【００２６】これにより、一般的には式(IIIa)または(I
IIb)の化合物を式(IX)または(X） ＰＲ14Ｒ15Ｒ16 (IX) ＰＲ17Ｒ18Ｒ19 (X) （式中、Ｒ14、Ｒ15およびＲ16は同一であるかまたは互
いに異なるものであり、水素またはＣ１〜Ｃ８−アルキ
ル、Ｃ１〜Ｃ８−フルオロアルキルまたはアリール基で
あり、Ｒ17、Ｒ18およびＲ19は、同一であるかまたは互
いに異なるものであり、塩素、臭素またはＣ１〜Ｃ８−
アルキルアミノまたは１，２，４−トリアゾリル基であ
る）を有する化合物と反応される。
【００２７】ダンシル化ヌクレオシドは、好ましくはビ
ス（２，２，２−トリフルオロエチル）Ｈ−ホスホネー
ト、ビス（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−
２−プロピル）Ｈ−ホスホネート、トリエチルホスファ
イト、トリフェニルホスファイト、またはＰＣｌ３、ト
リ（ジアルキルアミノ）ホスフィンまたはトリス（１，
２，４−トリアゾリル）ホスファイト、好ましくはトリ
ス（１，２，４−トリアゾリル）ホスファイトと、特に
好ましくはイミダゾール／トリエチルアミンで活性化し
た後ＰＣｌ３と反応させて、加水分解してＨ−ホスホネ
ートとした。
【００２８】反応は、Ｃ１〜Ｃ４−トリアルキルアミン
またはＮ−Ｃ１〜Ｃ４−アルキルモルホリン、好ましく
はＮ−メチルモルホリンのような有機溶媒１〜５０モル
当量、好ましくは１０〜５０モル当量、特に３０〜５０
モル当量の存在下にて、テトラヒドロフランまたは塩化
メチレン、好ましくは塩化メチレンのような有機溶媒中
で行った。ダンシル化ヌクレオシド対ホスホニル化試薬
のモル比は、１対１〜１０、好ましくは１対２〜８、特
に１対５であった。
【００２９】この方法で得た式(VIIIa) または(VIIIb)
の化合物は、引き続いてオリゴヌクレオチド合成に用い
ることができる。このためには、ヌクレオチドの糖残基
はＤＮＡ合成ではデオキシリボースであり、ＲＮＡ合成
ではリボースであるが、デオキシリボースとリボースと
の混合物を用いて規則的または不規則に配置されたデオ
キシリボースおよびリボース糖残基から成るオリゴヌク
レオチドを合成することもできる。更に、オリゴヌクレ
オチドは、式(VIIIa) および(VIIIb) のモノヌクレオチ
ドから成る規則的または不規則な構造を有することがで
きる。
【００３０】オリゴヌクレオチド合成は、例えばビー・
シー・フレーラー(B.C. Froehler)（フレーラー・ビー
・シー(Froehler, B.C.) (1986), Nucleic Acids Res.,
14,5399-5407, No. 13）によって記載されたＨ−ホス
ホネート法によって行うことができ、この場合には５′
−ヒドロキシル保護基の酸脱離をダンシルエトキシカル
ボニル基の塩基性脱離に代える。
【００３１】この合成は、原則として、たとえばシー・
ビー・リーズ(C.B. Reese) (1989)の方法と同様にして
溶液中でまたはたとえばビー・シー・フレーラー(B.C.
Froehler(1986)) の方法と同様にして固相上で行うこと
ができる。固相合成が、通常は好ましい。
【００３２】このために、下記の反応順序を好ましく選
択した。 １． 酸塩化物、例えばピバロイルクロリドまたはアダ
マントイルクロリドの存在下での式(VIIIa) または(VII
Ib) の化合物とヌクレオシド結合の重合支持体との反
応。 ２． 例えばＤＢＵによるダンシルエトキシカルボニル
基の脱離。 ３． 生成する化合物と式(VIIIa) または(VIIIb) の化
合物との反応。 ４． 必要な鎖長のオリゴヌクレオチドになるまで工程
２および３の繰り返し。 ５． ヨウ素、硫黄、またはアミン／ＣＣｌ４／トリフ
ェニルホスフィンによるホスフェート、ホスホールアミ
デートまたはチオホスフェートへの酸化（イェーガー(J
aeger)ら、前記を参照されたい）。
【００３３】式(VIIIa) または(VIIIb) および(VIIa)お
よび(VIIb)の化合物は、例えば酸としてのピバロイルク
ロリドの存在下にて、−２０℃〜＋１００℃の温度で、
特に室温で好ましく反応させた。酸化は、例えば一般的
にはピリジン、Ｎ−メチルイミダゾール、水、ＴＨＦか
ら成る溶媒混合物中でヨウ素により室温で行った。
【００３４】記載されたＨ−ホスホネート法によって合
成されたオリゴヌクレオチドは、一般的には２〜約２０
０、好ましくは２〜１１０、特に２〜４０個のモノヌク
レオチドから成っていた。
【００３５】ホスホアミダイトまたはＨ−ホスホネート
法によってダンシル化されたモノヌクレオチドからのオ
リゴヌクレオチド合成の利点は、下記の通りである。 ａ） ダンシル基は、５５０ｎｍに強い螢光があるので
検出が容易であり、 ｂ） ポリ−およびオリゴヌクレオチドの合成をピコモ
ルの範囲まで下げられ、 ｃ） ヌクレオチド塩基上または糖残基上の他のヒドロ
キシル保護基を脱離することなく５′−ヒドロキシルダ
ンシル保護基が除去され、 ｄ） オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリ
ボヌクレオチド、特にオリゴリボヌクレオチドが合成さ
れ、 ｅ） 高収率および大鎖長でオリゴヌクレオチドが固相
合成される。
【００３６】ＲＮＡ合成における５′−ヒドロキシルダ
ンシル保護基を用いることのもう一つの利点は、リボー
ス残基の２′−ヒドロキシル基が合成の終了時に保護さ
れたままにすることができることである。この方法で修
飾されたオリゴリボヌクレオチドは、したがって一般的
にはＲＮａｓｅによる加水分解だけでなく異性化反応か
ら保護されるので、長期間安定に保存することができ
る。次いで、２′−ヒドロキシル保護基はＲＮＡの使用
の直前にのみ脱離される。
【００３７】合成されたオリゴヌクレオチド上のアミノ
およびヒドロキシル保護基の支持体からの脱離および開
裂は、公知の方法、例えばエム・ガイト(M. Gait) 監
修：オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthe
sis)、実際的方法(a practicalapproach)；アイアール
エル・プレス(IRL Press) ；オックスフォード、1984年
によって記載された方法によって行った。
【００３８】下記の例により、本発明を更に説明する。
下記の略号を用いた。 Ｂｚ： ベンゾイル、 Ｍｔｈｐ： メトキシテトラヒドロピラニル、 ＤａｎｓＥＯＣ： ダンシルエトキシカルボニル、およ
び ＥＡ： 酢酸エチル。
【００３９】
【実施例】例１ ２−ダンシルエタノールとトリクロロメチルクロロホル
メートとの反応 無水ＣＨ３ＣＮ１０ｍｌ中に、トリクロロメチルクロロ
ホルメート０．８ｍｌ（１．３２ｇ＝６．６４ミリモ
ル）を氷冷および撹拌しながらピペットで加える。次い
で、氷冷および撹拌しながら、無水ＣＨ３ＣＮ５ｍｌに
溶解した２−ダンシルエタノール１ｇ（３．５８ミリモ
ル）を隔壁を通して注射器で少しずつ加える。混合物を
氷浴で更に５時間撹拌する。沈澱した無色固形物を吸引
濾別し、無水テトラヒドロフランで洗浄し、高真空で乾
燥する。融点が１５４〜５５℃の無色固形物が１．１３
５ｇ（３．００ミリモル＝８４％）が得られる。元素分
析は次の通りである：
【００４０】例２ ２′−Ｏ−（４−メトキシテトラヒドロピラニル）−Ｎ
６−ベンゾイルアデノシンと２−ダンシルエチルクロロ
ホルメートヒドロクロリドとの反応 ２′−Ｏ−Ｍｔｈｐ−Ｎ６−Ｂｚ−アデノシン２．４３
ｇ（５ミリモル）を、無水ピリジン３０ｍｌずつで２回
共蒸発させた後、無水ピリジン４０ｍｌに溶解する。次
いで、氷冷および撹拌を行いながら、２−ダンシルエチ
ルクロロホルメートヒドロクロリド２．４６ｇ（６．５
ミリモル＝１．３当量）を固形物の形態で加える。混合
物を氷浴で１時間撹拌すると、ヒドロクロリドは約０．
５時間で溶解する。次いで、グリコール０．５ｍｌ
（８．８ミリモル）を用いて反応を停止し、混合物をロ
ータリーエバポレーターで濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２２００
ｍｌで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液２００ｍｌで洗浄
し、水相をＣＨ２Ｃｌ２１００ｍｌずつで２回抽出し、
纏めた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、ロータ
リーエバポレーターで濃縮する。これをトルエン１００
ｍｌずつで２回、およびＣＨ２Ｃｌ２１００ｍｌずつで
２回共蒸発させる。ＳｉＯ２カラム（１００ｇ、２３×
３．５ｃｍ）上で精製する。フラッシュクロマトグラフ
ィ溶出は、ＣＨ２Ｃｌ２０．５リットル、ＣＨ２Ｃｌ２
／ＭｅＯＨ（１００：１）１リットルおよびＣＨ２Ｃｌ
２／ＭｅＯＨ（１００：２）１．５リットルで行う。そ
れぞれの生成物画分をロータリーエバポレーターで濃縮
し、高真空で乾燥する。５′−置換体２．８６ｇ（３．
６２ミリモル＝７２％）および３′，５′−二置換体生
成物０．４７ｇ（０．４３ミリモル＝９％）が、それぞ
れの場合に黄色の螢光性の高い泡沫として得られる。元
素分析のために、二置換体１００ｍｇをＳｉＯ ２プレー
ト（４０×２０ｃｍ）上でＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１
００：２）を用いて再度精製する。 ２′−Ｏ−（４−メトキシテトラヒドロピラニル）−
５′−Ｏ−ダンシルエトキシカルボニル−Ｎ６−ベンゾ
イルアデノシンの分析データー ａ） 薄層クロマトグラフィ 薄層クロマトグラフィは、シュライヒャー(Schleicher)
およびシュール(Schuell) のシリカゲルＦ１５００／Ｌ
Ｓ ２５４上で、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９５：５）
で行い、Ｒｆ０．４８を計算した。 ｂ） メタノール中でのＵＶ分光分析 ＋λｍａｘ 257 272 339 ｌｏｇεmax 4.42 4.38 3.65 ｄ） ＮＭＲ分光分析 ＣＤＣｌ３中、２５０ＭＨｚ 9.03 s broad (1)NH, 8.81 s (1) H-8, 8.61 d (2)ダン
シル−H-2, 8.35-8.30 m(2)ダンシルH-4,ダンシルH-8,
8.23 s (1) H-2, 8.03 d (2) O-Bzの2H，7.65-7.50 mm
(5) Bz の3H, ダンシルH-3,ダンシルH-7, 7.20 d (1)
ダンシルH-6,6.20 d (1) H-1´, 5.13 t (1) H-2´, 4.
52-4.32 m (6) CH2 OCO, H-3´, H-4´, H-5´, H-5",
3.72 t (2) SO2 CH2 , 3.77-3.43 m (4) CH2 O CH2 (M
thp),約2.90 s broad (1) 3´-OH, 2.89 s (6) NMe2 ,
2.87 s (3) OCH3 , 1.95-1.55m (4) CH2 C CH2 (Mthp)
。 ２′−Ｏ−（４−メトキシテトラヒドロピラニル）−
３′，５′−ビス−Ｏ−ダンシルエトキシカルボニル−
Ｎ６−ベンゾイルアデノシンの分析データー ａ） 薄層クロマトグラフィ 薄層クロマトグラフィは、シリカゲルＦ１５００／ＬＳ
２５４（シュライヒャー(Schleicher)およびシュール
(Schuell) ）上で、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１００：
１）で行い、Ｒｆ０．３５を計算した。 ｂ） メタノール中でのＵＶ分光分析 ＋λｍａｘ 254 278 343 ｌｏｇεmax 4.58 4.37 3.91 ｄ） ＮＭＲ分光分析 ＣＤＣｌ３中、２５０ＭＨｚ 9.05 s broad (1)NH, 8.83 s (1) H-8, 8.69-8.60 2d
(2) 2x ダンシル−H-2,8.35-8.29 m (4) 2x ダンシルH-
4, 2x ダンシルH-8, 8.22 s (1) H-2, 8.03 d (2) O-Bz
の2H，7.68-7.50 m (7) Bzの3H, 2xダンシルH-3, 2x ダ
ンシルH-7,7.24 - 7.18 2d 重複 t(2) 2xダンシルH-6,
6.13 d (1) H-1´, 5.32 t (1)H-2´,5.13-5.11 m (1)
H-3´, 4.60-4.22 m (7) 2x CH2 OCO, H-4´, H-5´,H
-5", 3.77-3.26 m (8) 2x SO2 CH2 , CH2 O CH2 (Mth
p), 2.89 s (6) NMe2 ，2.88 s (6) NMe2 , 2.63 s (3)
OCH3 , 1.78-1.20 m (4) CH2 C CH2 (Mthp) 。
【００４１】例３ ２′−Ｏ−（４−メトキシテトラヒドロピラニル）−
５′−Ｏ−ダンシルエトキシカルボニル−Ｎ６−ベンゾ
イルアデノシンと２−（４−ニトロフェニル）エチル＝
ジイソプロピルホスホールアミドクロリダイトとの反応 ２′−Ｏ−Ｍｔｈｐ−５′−Ｏ−ｄａｎｓＥＯＣ−Ｎ６
−Ｂｚ−アデノシン１ｇ（１．２６４ミリモル）を無水
ＣＨ２Ｃｌ２６ｍｌに溶解した後、ヒューニッヒ（Huen
ig) 塩基０．８６ｍｌ（０．６５ｇ＝５．０３ミリモル
＝４当量）と２−（４−ニトロフェニル）エチルジイソ
プロピルホスホルアミドクロリダイト ０．８４ｇ（２．５２８ミリモル＝２当量）を加える。
混合物を室温で窒素雰囲気下にて撹拌し、アルミ箔に包
んで遮光する。１．２５時間後に、ホスフィチル化試薬
を、更に０．４２ｇ（１．２６４ミリモル＝１当量）を
加える。全部で２．５時間室温撹拌した後、混合物をＣ
Ｈ２Ｃｌ２７５ｍｌで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液７
５ｍｌで洗浄し、水相をＣＨ２Ｃｌ２５０ｍｌずつで４
回逆抽出し、纏めた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、
濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮する。ＳｉＯ
２カラム（３０ｇ、１２×３ｃｍ）上で、 ＣＨ２Ｃｌ２２５０ｍｌ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＥＡ（１０
０：１）１００ｍｌ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＥＡ（１００：
２）１００ｍｌ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＥＡ（１００：３）１
００ｍｌ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＥＡ（１００：５）１００ｍ
ｌ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＥＡ（１００：７）１００ｍｌ、Ｃ
Ｈ２Ｃｌ２／ＥＡ（９：１）１００ｍｌ、ＣＨ２Ｃｌ２
／ＥＡ（４：１）３５０ｍｌ（試薬）、ＣＨ２Ｃｌ２／
ＥＡ（２：１）１００ｍｌ（生成物）、ＣＨ２Ｃｌ２／
ＥＡ（１：１）１００ｍｌ（生成物）、ＣＨ２Ｃｌ２／
ＥＡ（１：２）１００ｍｌ（生成物）およびＥＡ１００
ｍｌ（生成物）で溶出するフラッシュクロマトグラフィ
によって精製する。生成物画分をロータリーエバポレー
ターで濃縮し、高真空で乾燥する。黄色の螢光性泡沫
０．９５５ｇ（０．８７８ミリモル＝７０％）が得られ
る。 分析データー ａ） 薄層クロマトグラフィ 薄層クロマトグラフィは、シリカゲルＦ１５００／ＬＳ
２５４（シュライヒャー(Schleicher)およびシュール
(Schuell) ）上で、トルエン／ＥＡ（１：６）で行い、
Ｒｆ０．５０を計算した。 ｂ） メタノール中でのＵＶ分光分析 ＋λｍａｘ 261 330 339 ｌｏｇεmax 4.54 3.55 3.51 ｄ） ＮＭＲ分光分析 1. 31Ｐ−ＮＭＲ、ＣＤＣｌ３中、１６１．７０ＭＨｚ 151.34 ppm s (31%) 149.47 ppm s (69%)。 ２． 1Ｈ−ＮＭＲ、ＣＤＣｌ３中、２５０ＭＨｚ 9.07 s broad (1)NH, 8.83 および8.82 2s (1) H-8,
8.61 d (1) ダンシル−H-2, 8.35-8.29 m (2) ダンシ
ルH-4,ダンシルH-8, 8.24 および8.22 2s (1) H-2,8.18
-8.13 2d (2) フェニル−NO2 の2HO ，8.03 d (2) O-Bz
からの2H, 7.64-7.49 m (5) Bzの3H, ダンシルH-3,
ダンシルH-7, 7.45-7.38 2d (2) 2H mフェニル−NO2 ,
7.19 d (1) ダンシルH-6, 6.23 および6.15 2d (1) H-
1´, 5.20および5.11 2t (1) H-2´, 4.48 t (2) CH2
OCO, 4.44-4.18 m (4) H-3´, H-4´, H-5´, H-5", 4.
10-3.88 m (2) CH2 OP, 3.84-3.25 m (6) 2xCH(i-Pr).
CH2 O CH2 (Mthp), 3.71 t (2) SO 2 CH2 , 3.06 t
(2) CH2 −フェニルNO2 , 2.88 s (6) NMe2 , 2.66お
よび2.61 2s (3) O CH3 , 2.00-1.45 m(4) CH2 C CH2
(Mthp重複d (12) 2x C(CH3 ) 2 (i-Pr)。
【００４２】例４ ２′−Ｏ−（４−メトキシテトラヒドロピラニル）−
５′−Ｏ−ダンシルエトキシカルボニルホスホルアミダ
イトを用いる自動オリゴリボヌクレオチドの合成。デカ
ヌクレオチド（ｒＡｐ）９Ｔの調製 合成は３８０ Ｂ ＤＮＡシンセサイザー（アプライド
・バイオシステム(Applied Biosystems)）を用いて行っ
た。 使用カラム： ＡＢＩ標準カラム、 使用支持材料：３′−ヒドロキシル基によってヌクレオ
チドに結合しているＬＣＡＭＡ−ＣＰＧ支持体。 （文献：ケイ・ピー・シュテンゲル(K.P. Stengele) 、
ダヴリュ・プライデラー(W. Pfleiderer) 、Nucleic Ac
ids Res. Symp. Ser., 21, 101, (1989); ケイ・ピー・
シュテンゲル(K.P. Stengele) 、ダヴリュ・プライデラ
ー(W. Pfleiderer) 、Tetrahedron Lett., 31, 2549 (1
990)）。 ３′−ヒドロキシル基を介して支持体に結合しているチ
ミジンを装填：１９マイクロモル／ｇ、 バッチサイズ：約０．６マイクロモル（トリチル脱離に
よって決定）。 合成サイクル： １． 下記のパルス順序による無水アセトニトリル中で
の０．５Ｍテトラゾールおよび０．１Ｍ ２′−Ｏ−
（４−メトキシテトラヒドロピラニル）−５′−Ｏ−ダ
ンシルエトキシカルボニル−Ｎ６−ベンゾイルアデノシ
ン−３′−Ｏ−ホスホルアミダイトの縮合 ２． 無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：３）およ
び６．５％ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）／ＴＨ
Ｆ中による未反応ヌクレオチドのキャッピング 流動 ２０秒間 待機工程 ３０秒間。 ３． Ｉ２溶液（１．２６９ｇＩ２／２０ｍｌＨ２Ｏ／
１０ｍｌピリジン／１００ｍｌＴＨＦ） 流動 ３０秒間 待機工程 ３０秒間。 ４． １秒間の逆フラッシュを挿入した２×３０秒間お
よび８×１０秒間のパルス流での０．１Ｍ ＤＢＵ／ア
セトニトリルによるダンシルエトキシカルボニルの脱離 第４工程からの溶出液を集めて、縮合収率を螢光分光分
析法（励起：３６８ｎｍ； 発光：５２６ｎｍ）によっ
て形成された５−ジメチルアミノ−１−ナフチルビニル
スルホンに基づいて測定した。平均の工程ごとの収率は
約９８％であった。それぞれの工程１〜４の間に、アセ
トニトリルによる通常の洗浄工程およびブロックおよび
逆フラッシュを行った。
【００４３】例５ ５′−Ｏ−ダンシルエトキシカルボニルで保護されたＨ
−ホスホネート イミダゾール１０．７５当量を無水塩化メチレン５ｍｌ
に溶解し、次いで氷／塩化ナトリウムで冷却した後、冷
却溶液にＰＣｌ３３．５当量およびトリエチルアミン１
１．２５当量を加える。混合物を冷却しながら１５分間
撹拌した後、２′−Ｏ−（４−メトキシテトラヒドロピ
ラニル）−５′−Ｏ−ダンシルエトキシカルボニル−Ｎ
６−ベンゾイルアデノシン０．２５ミリモル（１等量）
または２′−Ｏ−（４−メトキシテトラヒドロピラニ
ル）−５′−Ｏ−ダンシルエトキシカルボニル−Ｎ６−
パラ−ニトロフェニルエチルオキシカルボニルアデノシ
ン（アセトニトリルで１回共蒸発）０．２５ミリモルを
無水塩化メチレン５ｍｌに溶解したものを撹拌しながら
１０分間を要して滴下して加える。次いで氷浴を取り除
き、混合物を室温で更に１５分間撹拌する。次いで、反
応溶液を１Ｍトリエチルアンモニウムビカーボネート１
０ｍｌで振盪することによって抽出する。相を分離し、
水相をＣＨ２Ｃｌ２１０ｍｌで抽出し、纏めた有機相を
Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレ
ーターで濃縮したところ、黄色の螢光性泡沫を生成す
る。これを、短いシリカゲルカラム（フラッシュクロマ
トグラフィ）上でＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨグラディエン
トを用いて精製する。
【００４４】例６ ２′−Ｏ−（４−メトキシテトラヒドロピラニル）−
５′−Ｏ−ダンシルエトキシカルボニルリボヌクレオチ
ド ３′−Ｏ−Ｈ−ホスホネートを用いる自動オリゴリ
ボヌクレオチド合成。（ｒＡｐ）９Ｔの調製。 合成は３８０ Ｂ ＤＮＡシンセサイザー（アプライド
・バイオシステム(Applied Biosystems)）を用いて行っ
た。 使用カラム： ＡＢＩ標準カラム、 使用支持材料：ＬＣＡＭＡ−ＣＰＧ支持体。 （文献：ケイ・ピー・シュテンゲル(K.P. Stengele) 、
ダヴリュ・プライデラー(W. Pfleiderer) 、Nucleic Ac
ids Res. Symp. Ser., 21, 101, (1989); ケイ・ピー・
シュテンゲル(K.P. Stengele) 、ダヴリュ・プライデラ
ー(W. Pfleiderer) 、Tetrahedron Lett., 31, 2549 (1
990)）。 ３′−ヒドロキシル基を介して支持体に結合しているチ
ミジンを装填：１９マイクロモル／ｇ、 バッチサイズ：約０．６マイクロモル（トリチル脱離に
よって決定）。 合成サイクル： １． 無水ピリジン／アセトニトリル（１：１）で洗
浄、 ２． 無水ピリジン／アセトニトリル（１：１）中での
２′−Ｏ−（４−メトキシテトラヒドロピラニル）−
５′−Ｏ−ダンシルエトキシカルボニル＝Ｈ−ホスホネ
ート（１０ｍＭ）およびピバロイルクロリド（５０ｍ
Ｍ）の反応、 ３． 無水アセトニトリルで洗浄（４５秒間）、 ４． アセトニトリル中０．１ＭＤＢＵによるダンシル
エトキシカルボニル脱離（２分間）、 ５． 必要な鎖長に達するまで工程１〜４を反復、 ６． アセトニトリル中０．１Ｍ ＤＢＵによるダンシ
ルエトキシカルボニル脱離（２分間）および溶出物の収
集、 ７． ピリジン／Ｎ−メチルイミダゾール／水／ＴＨＦ
（５／１／５／９０）中Ｉ２（０．１Ｍ）（２．５分
間）またはトリエチルアミン／水／ＴＨＦ（５／５／９
０）中Ｉ２（０．１Ｍ）（２．５分間）による酸化。 チオホスフェートまたはホスホルアミデートへの酸化
も、ウールマン(Uhlmann) およびペイマン(Peyman) (19
90) に記載の方法で行った。第６工程からの溶出液を集
めて、縮合収率を螢光分光分析法（励起：３６８ｎｍ；
発光：５２６ｎｍ）によって形成される５−ジメチル
アミノ−１−ナフチルビニルスルホンに基づいて測定す
る。平均の工程ごとの収率は約９８％である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｈ 19/14 Ｃ０７Ｈ 19/14 19/167 19/167 19/173 19/173 19/20 19/20 21/02 21/02 21/04 21/04 Ａ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ウォルフガング、プフライデレル ドイツ連邦共和国コンスタンツ、リンダウ エル、シュトラーセ、47 (72)発明者 フランク、ベルクマン ドイツ連邦共和国ワイセンベルク、イム、 バウムガルテン、２ Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA05 CA06 CA11 HA19 4C057 AA21 BB02 BB05 CC03 DD01 LL03 LL09 LL14 LL18 LL19 LL21 LL26 LL41 LL42 LL44 MM02 MM04

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式(IIIa)または(IIIb) 【化３】 （式中、ＤａｎｓＥＯＣは、式 【化４】 を有する基であり、Ｒ１は、水素または互いに独立に、
    式 【化５】 の基であり、Ｂは、 【化６】 であり、但し、Ｒ２は、それぞれの場合に互いに独立
    に、式 【化７】 であるか、またはＢは、 【化８】 であり、但し、Ｒ３は、それぞれの場合に互いに独立
    に、水素または 【化９】 であり、Ｒ４は、それぞれの場合に互いに独立に、式 【化１０】 であるか、またはＢは、 【化１１】 であり、但しＹはＨ、ＣＨ３（またはＣ１〜Ｃ４−ｎ−
    アルキル）であり、Ｒ５は、それぞれの場合に互いに独
    立に、−ＯＨ、 【化１２】 である）を有する化合物。
  2. 【請求項２】式(Va)または(Vb) 【化１４】 ［式中、ＤａｎｓＥＯＣ、Ｒ１およびＢは請求項１に記
    載された意味を有し、Ｒ ６及びＲ７は、同一であるかま
    たは互いに異なるものであり、Ｃ１〜Ｃ８−アルキル、
    好ましくはイソプロピルまたはＣ５〜Ｃ12−シクロアル
    キル基（好ましくはＣ８以下）、ベンジルまたはフェニ
    ル基であるか、またはそれらが結合している窒素原子と
    共に更にヘテロ原子および置換基を任意に含むことがで
    きる飽和または不飽和の複素環であり、Ｒ８は、式 【化１５】 を有する基であるか、または未置換または１回以上環が
    置換されたベンジル基であり、好ましくは未置換であ
    り、（１個以上の）置換基は互いに独立にハロゲン、Ｃ
    １〜Ｃ４−アルキル、ニトロ、メトキシまたはカルボキ
    シル基である］を有する化合物。
  3. 【請求項３】請求項２の式(Va)および／または(Vb)の少
    なくとも一つの化合物から製造されるダンシルエトキシ
    カルボニルで保護されたオリゴヌクレオチド。
  4. 【請求項４】請求項２の式(Va)および／または(Vb)の少
    なくとも一つの化合物から製造されるオリゴヌクレオチ
    ド。
  5. 【請求項５】式(VIIIa) または(VIIIb) 【化１８】 （式中、ＤａｎｓＥＯＣ、Ｒ１およびＢは請求項１に記
    載された意味を有し、Ｋ (+) はカチオン、特に［ＨＮ
    （Ｃ２Ｈ５）３］(+) である）を有する化合物。
  6. 【請求項６】請求項５の式(VIIIa) および／または(VII
    Ib) の少なくとも一つの化合物から製造されるダンシル
    エトキシカルボニルで保護されたオリゴヌクレオチド。
  7. 【請求項７】請求項５の式(VIIIa) および／または(VII
    Ib) の少なくとも一つの化合物から製造されるオリゴヌ
    クレオチド。
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