JPH02265486A - Ｄｎａ断片、微酸性微低温性セルラーゼ及びその製造方法 - Google Patents
Ｄｎａ断片、微酸性微低温性セルラーゼ及びその製造方法Info
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- JPH02265486A JPH02265486A JP1086714A JP8671489A JPH02265486A JP H02265486 A JPH02265486 A JP H02265486A JP 1086714 A JP1086714 A JP 1086714A JP 8671489 A JP8671489 A JP 8671489A JP H02265486 A JPH02265486 A JP H02265486A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はＤＮＡ断片の変異による新規なりＮＡ断片、微
酸性微低温性セルラーゼ及びその製造法に関するもので
ある。
酸性微低温性セルラーゼ及びその製造法に関するもので
ある。
詳しくは、本発明は農産物及び林産物資源であるセルロ
ースを有用物質に変換する絶対嫌気性ルーメン球菌ルミ
ノコッカス・アルプスの生産する中性（ｐＨ６，８）中
温性（３７℃）セルラーゼのアミノ酸配列をコードして
いるＤＮＡ断片の一部を変異せしめたＤＮＡ断片及びこ
の断片を組み込んだプラスミドＤＮＡ、更には、このプ
ラスミドＤＮＡを用いて作られた形質転換菌に関する。
ースを有用物質に変換する絶対嫌気性ルーメン球菌ルミ
ノコッカス・アルプスの生産する中性（ｐＨ６，８）中
温性（３７℃）セルラーゼのアミノ酸配列をコードして
いるＤＮＡ断片の一部を変異せしめたＤＮＡ断片及びこ
の断片を組み込んだプラスミドＤＮＡ、更には、このプ
ラスミドＤＮＡを用いて作られた形質転換菌に関する。
また、この形質転換菌によって生産されたセルラーゼと
その製造方法にも関する。
その製造方法にも関する。
農産・林産資源で地球上に広範、多量に存在するセルロ
ースをセルラーゼによりグルコースにまで加水分解した
後、種々の微生物を使ってエネルギー資源、化学工業原
料、微生物蛋白質に転換する等のセルロースを有効利用
する研究が行われている。現在多くの微生物からセルラ
ーゼが検出され精製されているが、好気性菌や糸状菌が
ほとんどであり、嫌気性菌特にルーメン細菌より検出、
精製されたセルラーゼを改良して利用しようとする報告
はほとんどない。
ースをセルラーゼによりグルコースにまで加水分解した
後、種々の微生物を使ってエネルギー資源、化学工業原
料、微生物蛋白質に転換する等のセルロースを有効利用
する研究が行われている。現在多くの微生物からセルラ
ーゼが検出され精製されているが、好気性菌や糸状菌が
ほとんどであり、嫌気性菌特にルーメン細菌より検出、
精製されたセルラーゼを改良して利用しようとする報告
はほとんどない。
用台等は（特開昭６２−２０８２８３号）ルミノコッカ
ス属に属するセルラーゼ生産菌のセルラーゼ生産に関与
する遺伝情報を担う染色体ＤＮＡ断片を含有せしめてな
る組換えベクター及びこれにより形質転換されたエシェ
リヒア属に属するセルラーゼ生産菌に関して発明を完成
させている。用台等の発明による形質転換菌の酵素生産
の最適ｐＨは６．８、また最適温度は３５℃付近である
。
ス属に属するセルラーゼ生産菌のセルラーゼ生産に関与
する遺伝情報を担う染色体ＤＮＡ断片を含有せしめてな
る組換えベクター及びこれにより形質転換されたエシェ
リヒア属に属するセルラーゼ生産菌に関して発明を完成
させている。用台等の発明による形質転換菌の酵素生産
の最適ｐＨは６．８、また最適温度は３５℃付近である
。
従来公知のルーメン細菌由来のセルラーゼは３７〜４０
℃１中性付近のｐＨに最適活性を持ち、植物細胞内にお
けるような環境条件すなわち微酸性微低温では実用活性
を発現できないものが多い（用台等特開昭６２−２０８
２８３号）、そこで、より低い温度で、またより低いｐ
Ｈ域で高い活性を持つセルラーゼが求められてきた。さ
らに、嫌気性ルーメン細菌由来のセルラーゼによるセル
ロース利用技術を発展させるためには、セルラーゼの酵
素及び蛋白質の化学的性質を解明することが必要である
。
℃１中性付近のｐＨに最適活性を持ち、植物細胞内にお
けるような環境条件すなわち微酸性微低温では実用活性
を発現できないものが多い（用台等特開昭６２−２０８
２８３号）、そこで、より低い温度で、またより低いｐ
Ｈ域で高い活性を持つセルラーゼが求められてきた。さ
らに、嫌気性ルーメン細菌由来のセルラーゼによるセル
ロース利用技術を発展させるためには、セルラーゼの酵
素及び蛋白質の化学的性質を解明することが必要である
。
本発明者等は、セルロース分解能が一般的に優れている
嫌気性菌に属するルミノコッカス・アルプスのセルラー
ゼ遺伝子をコードしているＤＮＡ断片の一部を変異せし
めることにより、微酸性及び微低温で実用活性を発現で
きるセルラーゼを作り出した０本発明によるセルラーゼ
は例えばその成熟蛋白質のアミン末端よりアミノ酸残基
の一部を欠失させている点で用台等による発明と明瞭に
区別される。本発明はこの新知見にもとづき完成したも
のである。
嫌気性菌に属するルミノコッカス・アルプスのセルラー
ゼ遺伝子をコードしているＤＮＡ断片の一部を変異せし
めることにより、微酸性及び微低温で実用活性を発現で
きるセルラーゼを作り出した０本発明によるセルラーゼ
は例えばその成熟蛋白質のアミン末端よりアミノ酸残基
の一部を欠失させている点で用台等による発明と明瞭に
区別される。本発明はこの新知見にもとづき完成したも
のである。
本発明は次の構成から成る。
１、ルミノコッカス・アルプス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃ
ｕｓａｌｂｕｓ）のＤＮＡより分離された中性セルラー
ゼの遺伝情報をコードするＤＮＡ断片の一部を変異せし
めたＤＮＡ断片。
ｕｓａｌｂｕｓ）のＤＮＡより分離された中性セルラー
ゼの遺伝情報をコードするＤＮＡ断片の一部を変異せし
めたＤＮＡ断片。
２、中性セルラーゼの遺伝情報をコードするＤＮＡ断片
の一部を変異せしめたＤＮＡ断片が、該中性セルラーゼ
の成熟蛋白質のアミノ末端から一部のアミノ酸配列を欠
失させた蛋白質をコードするものである上記ｌ記載のＤ
ＮＡ断片。
の一部を変異せしめたＤＮＡ断片が、該中性セルラーゼ
の成熟蛋白質のアミノ末端から一部のアミノ酸配列を欠
失させた蛋白質をコードするものである上記ｌ記載のＤ
ＮＡ断片。
３、中性セルラーゼの成熟蛋白質のアミノ末端から１５
あるいは２４個のアミノ酸を欠失させた蛋白質をコード
するものである上記２記載のＤＮＡ断片。
あるいは２４個のアミノ酸を欠失させた蛋白質をコード
するものである上記２記載のＤＮＡ断片。
４、中性セルラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
断片の一部を変異せしめたＤＮＡ断片が、該中性セルラ
ーゼの成熟蛋白質のカルボキシル末端から一部のアミノ
酸配列を欠失させた蛋白質をコートするものである上記
１記載のＤＮＡ断片。
断片の一部を変異せしめたＤＮＡ断片が、該中性セルラ
ーゼの成熟蛋白質のカルボキシル末端から一部のアミノ
酸配列を欠失させた蛋白質をコートするものである上記
１記載のＤＮＡ断片。
５、微酸性低温性セルラーゼをコードするものである上
記１記載のＤＮＡ断片。
記１記載のＤＮＡ断片。
６、上記１〜５記載のＤＮＡ断片を含むプラスミドＤＮ
Ａ。
Ａ。
７、上記６記載のプラスミドＤＮＡにより形質転換され
た形質転換体。
た形質転換体。
８、ルミノコッカス・アルプス（Ｒｕｓｉｎｏｃｏｃｃ
ｕｓａｌｂｕｓ）のＤＮＡより分離された中性セルラー
ゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の一部を変異
せしめたＤＮＡ断片を翻訳して得られた蛋白質。
ｕｓａｌｂｕｓ）のＤＮＡより分離された中性セルラー
ゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の一部を変異
せしめたＤＮＡ断片を翻訳して得られた蛋白質。
９、ｐＨ５〜７．２０〜３５℃で最大活性を示す微酸性
微低温性セルラーゼ。
微低温性セルラーゼ。
１０、 ５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測
定したとき約３５，０００±５．０００ダルトンの分子
量を持ち、ｐＨ５〜７．２０〜３５℃で最大活性を示し
、３７℃で１時間保持したとき８０％以上の残存活性を
有することを特徴とする微酸性微低温性セルラーゼ。
定したとき約３５，０００±５．０００ダルトンの分子
量を持ち、ｐＨ５〜７．２０〜３５℃で最大活性を示し
、３７℃で１時間保持したとき８０％以上の残存活性を
有することを特徴とする微酸性微低温性セルラーゼ。
１１、上記７記載の形質転換体を培養し得られた培養物
から微酸性低温性セルラーゼを採取することを特徴とす
る微酸性微低温性セルラーゼの製造方法。
から微酸性低温性セルラーゼを採取することを特徴とす
る微酸性微低温性セルラーゼの製造方法。
以下に本発明を更に詳細に説明する。
本発明による微酸性微低温性セルラーゼは中温、中性ｐ
Ｈで好気的条件において大腸菌（ＦＥＲＮ Ｐ−１０６
２４）で製造されるため、経済的制約を受けることが少
ない。本発明者は、酵素蛋白のアミノ酸配列の一部を、
例えばアミノ末端あるいはカルボキシル末端から欠失さ
せた新規な微酸性微低温性セルラーゼのアミノ酸配列を
コードしているＤＮＡ断片を取得することに成功した。
Ｈで好気的条件において大腸菌（ＦＥＲＮ Ｐ−１０６
２４）で製造されるため、経済的制約を受けることが少
ない。本発明者は、酵素蛋白のアミノ酸配列の一部を、
例えばアミノ末端あるいはカルボキシル末端から欠失さ
せた新規な微酸性微低温性セルラーゼのアミノ酸配列を
コードしているＤＮＡ断片を取得することに成功した。
その結果、例えばランナウェイプラスミドのようなハイ
コピープラスミドに組み込むことにより、工業的大量生
産を行うこともできるようになった。本発明で使用する
ルミノコッカス・アルプスは、ルミノコッカス属に属す
る絶対嫌気性細菌であって、 最適増殖温度 ３７℃ 増殖可能温度 ２５〜５０”Ｃ 最適増殖ｐＨ６，８ 増殖可能ｐＨ５〜８ ダラム染色 ダラム陽性 グアニン＋シトシン含量４２．６〜４５．８％である。
コピープラスミドに組み込むことにより、工業的大量生
産を行うこともできるようになった。本発明で使用する
ルミノコッカス・アルプスは、ルミノコッカス属に属す
る絶対嫌気性細菌であって、 最適増殖温度 ３７℃ 増殖可能温度 ２５〜５０”Ｃ 最適増殖ｐＨ６，８ 増殖可能ｐＨ５〜８ ダラム染色 ダラム陽性 グアニン＋シトシン含量４２．６〜４５．８％である。
セルラーゼのアミノ酸配列をコードしているＤＮＡの抽
出に用いる培地は特に限定されない。ルミノコッカス・
アルプスが生育できる培地なら何でも使用できる０例え
ば炭素源としてグルコース（７）代すにセロビオース、
ボールミルセルロース、ホティアオイや稲ワラなどを含
む培地を用いることもできる。不溶性物質を含まないと
いう点でグルコースを用いると後の操作が容易である。
出に用いる培地は特に限定されない。ルミノコッカス・
アルプスが生育できる培地なら何でも使用できる０例え
ば炭素源としてグルコース（７）代すにセロビオース、
ボールミルセルロース、ホティアオイや稲ワラなどを含
む培地を用いることもできる。不溶性物質を含まないと
いう点でグルコースを用いると後の操作が容易である。
組み換え体プラスミド構築と調製に際し、ＤＮＡの切断
法は特に限定されない。ホモジナイザーなどで物理的に
切断してもよい。しかし、あとでベクターに連結するた
めには、同一の制限酵素を用いるのが好ましい。アルカ
リホスファターゼ処理すると効率をあげることができる
。リゲーション反応は、通常１２℃〜１６°ｃ１２０〜
５０分で完了する。
法は特に限定されない。ホモジナイザーなどで物理的に
切断してもよい。しかし、あとでベクターに連結するた
めには、同一の制限酵素を用いるのが好ましい。アルカ
リホスファターゼ処理すると効率をあげることができる
。リゲーション反応は、通常１２℃〜１６°ｃ１２０〜
５０分で完了する。
コンピテントセルは大腸菌に限定されず、枯草菌、酵母
、植物細胞等が使用できる。コンピテントセルの調製法
は、塩化カルシウム処理する。さらに、プロトプラスト
化法やＤＮＡ）ランスフェクシ晋ン（遺伝子導入）法な
ど従来知られている如何なる方法でも可能である。
、植物細胞等が使用できる。コンピテントセルの調製法
は、塩化カルシウム処理する。さらに、プロトプラスト
化法やＤＮＡ）ランスフェクシ晋ン（遺伝子導入）法な
ど従来知られている如何なる方法でも可能である。
セルラーゼを生産する組換菌の検出方法は特に限定され
ない。例えば−膜力ルボキシメチルセルロース（以下、
ＣＭＣと記す）重層−コンゴーレッド法と呼ばれる方法
を用いることができる。培養時間は１０〜１４時間が好
ましく、ＣＭＣ重層後の保持時間も２時間に限定されな
い。染色時間も５〜数１０分間でよい。
ない。例えば−膜力ルボキシメチルセルロース（以下、
ＣＭＣと記す）重層−コンゴーレッド法と呼ばれる方法
を用いることができる。培養時間は１０〜１４時間が好
ましく、ＣＭＣ重層後の保持時間も２時間に限定されな
い。染色時間も５〜数１０分間でよい。
プラスミドｐＵＲＡ Ｉ−ｄｉその他の欠失変異ＤＮＡ
断片のクローニングに用いるプラスミドベクターも特に
限定されない。挿入サイトもセルラーゼの活性が発現で
きるようなサイトであればどのサイトでもよい。
断片のクローニングに用いるプラスミドベクターも特に
限定されない。挿入サイトもセルラーゼの活性が発現で
きるようなサイトであればどのサイトでもよい。
ｐＵＲＡ Ｉ−ｄｉを用いた新規な微酸性微低温セルラ
ーゼの製造において、培地の組成は特に限定されず、コ
ンピテントセルがｐｔｌＲＡ Ｉ−ｄｌを保持して生育
できる培地であればいかなる培地でも使用できる。培地
のｐＨは６〜７が好ましいがｐＨ５，５〜８．０でも１
／３の量の酵素を生産できる。培養時間は１０〜１４時
間が好ましいが増殖速度により適宜変化する。
ーゼの製造において、培地の組成は特に限定されず、コ
ンピテントセルがｐｔｌＲＡ Ｉ−ｄｌを保持して生育
できる培地であればいかなる培地でも使用できる。培地
のｐＨは６〜７が好ましいがｐＨ５，５〜８．０でも１
／３の量の酵素を生産できる。培養時間は１０〜１４時
間が好ましいが増殖速度により適宜変化する。
精製法は特に限定されず、従来公知の方法を組合せて行
うことができる。例えば、オスモチインクショック、イ
オン交換クロマトグラフィーなどの方法の組合せによっ
て精製できる。
うことができる。例えば、オスモチインクショック、イ
オン交換クロマトグラフィーなどの方法の組合せによっ
て精製できる。
本発明で得られる新規の微酸性微低温性セルラーゼの理
化学的性質は次のとおりである。
化学的性質は次のとおりである。
１、作用： ＣＭＣ等のセルロースを分解し粘度低下を
きたす、これと同時に還元糖も少量であるが有意な量を
生成する。
きたす、これと同時に還元糖も少量であるが有意な量を
生成する。
２、基質特異性： ＣＭＣ等のセルロースに対し特異的
に作用する。
に作用する。
３、至適ｐＨ：ｐＨ５，５〜６．０付近でＣＭＣに対す
る作用が至適である。
る作用が至適である。
４、安定ｐＨ範囲：３７℃で１０分間処理した場合、ｐ
Ｈ５〜７においてＣＨＣ分解活性は８０％以上の残存活
性を示す。
Ｈ５〜７においてＣＨＣ分解活性は８０％以上の残存活
性を示す。
５、至適温度：ｐＨ６，８においてＣＭＣを基質とした
場合、２０〜３０″Ｃ付近である。
場合、２０〜３０″Ｃ付近である。
６、熱安定性： ｐＨ６，８において４０℃１１時間処
理した場合、ＣＭＣに対し８０％以上の残存活性を示す
。
理した場合、ＣＭＣに対し８０％以上の残存活性を示す
。
７、分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で測定したとき、３５．０００±５．０００ダルトンの
分子量を有する。
で測定したとき、３５．０００±５．０００ダルトンの
分子量を有する。
本発明で得られる短縮化セルラーゼは簡便で大量に製造
できるうえに短縮化していないセルラーゼに比べ低いｐ
Ｈおよび低い温度で最適活性が発現できるように構築さ
れているうえ、セルロース合成反応も司る。従ってこの
発明は、セルロースを分解利用する工業や林木育種など
のセルロース合成を目的とする産業分野に広く利用でき
、それによってもたらされる経済効果は極めて大きい。
できるうえに短縮化していないセルラーゼに比べ低いｐ
Ｈおよび低い温度で最適活性が発現できるように構築さ
れているうえ、セルロース合成反応も司る。従ってこの
発明は、セルロースを分解利用する工業や林木育種など
のセルロース合成を目的とする産業分野に広く利用でき
、それによってもたらされる経済効果は極めて大きい。
以下実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。
（１）セルラーゼの検定
本実施例におけるセルラーゼの酵素活性はＣＭＣを基質
としたとき、粘度低下による活性を測定することにより
行った。
としたとき、粘度低下による活性を測定することにより
行った。
即ち、１．０％ＣＭＣ（第一工業製薬社製）溶液５−と
酵素溶液１ｊｌｔを混合しコーンプレート型回転粘度計
（東京計器社製Ｅ型粘度計）中にて３７℃で５分間保持
したときの粘度をｖＩとする。なお、ブランクは酵素溶
液１ｄの代わりに水１ｄを用いたときの粘度Ｖ、を用い
る。
酵素溶液１ｊｌｔを混合しコーンプレート型回転粘度計
（東京計器社製Ｅ型粘度計）中にて３７℃で５分間保持
したときの粘度をｖＩとする。なお、ブランクは酵素溶
液１ｄの代わりに水１ｄを用いたときの粘度Ｖ、を用い
る。
１単位−（１／Ｖ、−１／νｓ） Ｘｌ１５生成還元糖
の定量にはソモギーネルソン法を用いた。
の定量にはソモギーネルソン法を用いた。
（２）セルラーゼの遺伝情報をコードしているＤＮＡの
調製 ルミノコツカス・アルプス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ
ａｌｂｕｓＡＴＣＣ２７２１０）よりＤＮＡを調製す
る際には、主炭素源としてグルコースを用いる下に示し
た公知の嫌気性合成培地を用いた。
調製 ルミノコツカス・アルプス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ
ａｌｂｕｓＡＴＣＣ２７２１０）よりＤＮＡを調製す
る際には、主炭素源としてグルコースを用いる下に示し
た公知の嫌気性合成培地を用いた。
嫌気性合成培地の組成
分 １１００ａ！中７．５ ｍｌ
７．５ ｄ
Ｏ，３１１ｄ
Ｏ，１ａｄｔ
Ｏ，Ｉｇ
１．０ｇ
０．５ｇ
１．０Ｉ１１
成
ミネラルＩ
ミネラル■
ＦＡ
０．１χレサズリン溶液
酵母エキス
グルコース
Ｎａ、ＣＯ３
２，５χシステイン溶液
ミネラル■の組成
成
ＪＰＯ４
Ｈ，０
分
５００戚中
３．０ｇ
９７ ｄ
ミネラル■の組成
成 分
ＨｚＰＯｎ
ＮａＣ１
（ＮＨＪｚＳＯ４
ＭｇＳＯ，・７Ｈ２０
ＮａＣ１ｇ
Ｈ，０
ＶＦＡの組成
成 分
酢酸
プロピオン酸
ｎ−酪 酸
１ｓｏ−酪 酸
ｎ−バレリン酸
１ｓｏ−バレリン酸
０Ｌ−２−メチル酪酸
５００ｍｆ中
３．０ｇ
６．０ｇ
６．０ｇ
０．６ｇ
０．６ｇ
４８３．８ ｄ
３１ｄ中
１７ｄ！
ｄ
ａｄｌ
ｄ
ｄ
ｄ
ＩＩｉ
上記培地組成のうち、ＮａｚｃＯｓとシスティン溶液を
除く全成分を添加した後、ｐＨを７．０に調整して、Ｎ
ａ１ＣＯ，とシスティン溶液とを添加した。そして、Ｃ
Ｏｔガスを３０分間通気した後、１１０℃で１０分間オ
ートクレーブして用いた。
除く全成分を添加した後、ｐＨを７．０に調整して、Ｎ
ａ１ＣＯ，とシスティン溶液とを添加した。そして、Ｃ
Ｏｔガスを３０分間通気した後、１１０℃で１０分間オ
ートクレーブして用いた。
得られた菌体を５ａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ （０，５Ｍ
ＮａＣ１，０，１ＭＥＤＴＡ、 ｐ Ｈ８，０）で洗
浄後、０．５ ｄの５ａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡに懸濁し、
１■のりゾチームを加え攪拌後、３７℃で１０分間静置
した。その後、１０ｊｄのトリス−５ＯＳ緩衝液（０，
１Ｍ ＮａＣ１，ｐＨ９，０）を加えて６０℃で５分間
保持し溶菌させた。これにトリス−５ＯＳ−フェノール
（再蒸留フェノールをトリス−５ｏｓ −８１衝液で飽
和させたもの）を１０゜５Ｉ１１加え、０℃で２０分間
静置したのち１．５００Ｘｇで１０分間遠心分離したの
ち溶菌液を得た。この溶菌液に２１ｍの冷エタノールを
加えたのち糸状ＤＮＡを滅菌したガラス棒で巻き取り滅
菌水に溶かした。このＤＮＡ５００μｇ／ｄに対し、１
００℃で１５分間熱しデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮ
ａｓｅ）を失活させたりボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）
Ａを最終濃度５０ｕｇ／ｄとなるよう加え、３７℃で
３０分間保持し、共存するＲＮＡを分解した。
ＮａＣ１，０，１ＭＥＤＴＡ、 ｐ Ｈ８，０）で洗
浄後、０．５ ｄの５ａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡに懸濁し、
１■のりゾチームを加え攪拌後、３７℃で１０分間静置
した。その後、１０ｊｄのトリス−５ＯＳ緩衝液（０，
１Ｍ ＮａＣ１，ｐＨ９，０）を加えて６０℃で５分間
保持し溶菌させた。これにトリス−５ＯＳ−フェノール
（再蒸留フェノールをトリス−５ｏｓ −８１衝液で飽
和させたもの）を１０゜５Ｉ１１加え、０℃で２０分間
静置したのち１．５００Ｘｇで１０分間遠心分離したの
ち溶菌液を得た。この溶菌液に２１ｍの冷エタノールを
加えたのち糸状ＤＮＡを滅菌したガラス棒で巻き取り滅
菌水に溶かした。このＤＮＡ５００μｇ／ｄに対し、１
００℃で１５分間熱しデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮ
ａｓｅ）を失活させたりボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）
Ａを最終濃度５０ｕｇ／ｄとなるよう加え、３７℃で
３０分間保持し、共存するＲＮＡを分解した。
リボヌクレアーＡの反応を止めるためトリス−５Ｏ５−
フェノール処理したのち、沈澱を真空乾燥後、適当量の
滅菌水に溶かし純粋なりＮＡを得る。
フェノール処理したのち、沈澱を真空乾燥後、適当量の
滅菌水に溶かし純粋なりＮＡを得る。
第１図にこのＤＮＡの塩基配列を示す。
図中、−３５と−ＩＯの下線部分はＲＮＡポリメラーゼ
の結合部位と認識部位とをそれぞれ表わし、ＳＤはリボ
ゾーム結合部位を、↓は転写開始部位を、ムはシグナル
配列の開裂部位を、水平方向の→←は回文配列をそれぞ
れ表わす、また停止コドンは３つのアステリックを用い
て示しである。
の結合部位と認識部位とをそれぞれ表わし、ＳＤはリボ
ゾーム結合部位を、↓は転写開始部位を、ムはシグナル
配列の開裂部位を、水平方向の→←は回文配列をそれぞ
れ表わす、また停止コドンは３つのアステリックを用い
て示しである。
（３）組み換えプラスミドの調製
上記（２）で得られたＤＮＡを旧ｎｄｌ［［で３７℃、
１時間完全分解を行った。ＤＮＡの）ｆｉｎ ｄＩ［［
完全分解物は０．８％アガロースゲル電気泳動にて泳動
後４〜１０ｋｂｐの断片を切出し、透析チューブ内にて
溶出後フェノール処理、エタノール沈澱を行った。
１時間完全分解を行った。ＤＮＡの）ｆｉｎ ｄＩ［［
完全分解物は０．８％アガロースゲル電気泳動にて泳動
後４〜１０ｋｂｐの断片を切出し、透析チューブ内にて
溶出後フェノール処理、エタノール沈澱を行った。
別にプラスミドｐＢＩ１３２２も旧ｎｄｕｌで完全分解
を行った。これをアルカリフォスファターゼで処理した
のち、同様にフェノール処理、エーテル処理、エタノー
ル沈澱を行った。リゲーションはＴ４１Ｊガーゼを用い
１６℃の温度で１時間行った。リゲーションが完全に行
われたことはアガロースゲル電気泳動によって確認した
。目的のセルラーゼをコードしているＤＮＡ断片をもつ
プラスミドｐＵＲＡ Ｉよりその断片を切出し、ｐＵｃ
１９に組み込みｐＵＲＡ Ｉを構築し、コピー数を格段
に高めた。
を行った。これをアルカリフォスファターゼで処理した
のち、同様にフェノール処理、エーテル処理、エタノー
ル沈澱を行った。リゲーションはＴ４１Ｊガーゼを用い
１６℃の温度で１時間行った。リゲーションが完全に行
われたことはアガロースゲル電気泳動によって確認した
。目的のセルラーゼをコードしているＤＮＡ断片をもつ
プラスミドｐＵＲＡ Ｉよりその断片を切出し、ｐＵｃ
１９に組み込みｐＵＲＡ Ｉを構築し、コピー数を格段
に高めた。
（４）欠失変異ＤＮＡ遺伝子の調製
アミノ末端を欠失したセルラーゼの遺伝情報をもつＤＮ
Ａ断片を構築するためにデイレ−シラン法を用いた。す
なわち、ｐＵＲＡ Ｉを制限酵素Ａｃｃｌで完全分解し
たセルラーゼ遺伝子を含む１．８ｋｂｐの断片を調製し
た。これにＳＩヌクレアーゼ処理し、末端を平滑化し、
ｐｕｃ １１９のＳｅａ ｌサイトに再クローニングし
た。これをＫｐｎ Ｉと旧ｎｃｌｌ！で切断しセルラー
ゼ遺伝子を含む１．６ｋｂｐ断片を調製した。これをＰ
ｖｕ Ｕで部分分解し、ｐｕｃ １１９の５ｖａａ ｌ
サイトにリゲーションした。形質転換してできたコロニ
ーのうち活性を有するものは４２３ｂ、のＰｖｕ ｌｌ
−１６５６ｂｐの旧ｎｃＩＩの１．２ｋｄｐ断片がフレ
ームの合った形でｌａｃプロモーターにつながったもの
であった。これをｐ［ＩＲＡ−Ｐνとする。
Ａ断片を構築するためにデイレ−シラン法を用いた。す
なわち、ｐＵＲＡ Ｉを制限酵素Ａｃｃｌで完全分解し
たセルラーゼ遺伝子を含む１．８ｋｂｐの断片を調製し
た。これにＳＩヌクレアーゼ処理し、末端を平滑化し、
ｐｕｃ １１９のＳｅａ ｌサイトに再クローニングし
た。これをＫｐｎ Ｉと旧ｎｃｌｌ！で切断しセルラー
ゼ遺伝子を含む１．６ｋｂｐ断片を調製した。これをＰ
ｖｕ Ｕで部分分解し、ｐｕｃ １１９の５ｖａａ ｌ
サイトにリゲーションした。形質転換してできたコロニ
ーのうち活性を有するものは４２３ｂ、のＰｖｕ ｌｌ
−１６５６ｂｐの旧ｎｃＩＩの１．２ｋｄｐ断片がフレ
ームの合った形でｌａｃプロモーターにつながったもの
であった。これをｐ［ＩＲＡ−Ｐνとする。
セルラーゼのアミノ末端を削除するために、ｐＵＲＡ−
Ｐνを、挿入断片中に制限酵素サイトのないマルチクロ
ーニングサイト中のｓｐｈ ＩとＳａｌ ｌで切断し、
プロモーター側に３′突出末端（Ｓρｈｌサイト）、構
造遺伝子側に５′突出末端（Ｓａｌ Ｉサイト）が形成
される。この５′突出末端をエキソヌクレアーゼ■で分
解したのち、ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅで
一本鎖部分を削除し、クレノー酵素で末端を完全に平滑
にした後、Ｔ４リガーゼによりリゲーションし、これを
用いて大腸菌ＪＭ １０３を形質転換した。
Ｐνを、挿入断片中に制限酵素サイトのないマルチクロ
ーニングサイト中のｓｐｈ ＩとＳａｌ ｌで切断し、
プロモーター側に３′突出末端（Ｓρｈｌサイト）、構
造遺伝子側に５′突出末端（Ｓａｌ Ｉサイト）が形成
される。この５′突出末端をエキソヌクレアーゼ■で分
解したのち、ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅで
一本鎖部分を削除し、クレノー酵素で末端を完全に平滑
にした後、Ｔ４リガーゼによりリゲーションし、これを
用いて大腸菌ＪＭ １０３を形質転換した。
なお、形質転換の前に５ａｌＩを作用し、短縮化未反応
の環状プラスミドを切断することにより形質転換効率を
上げた。その結果、ＣＭＣ分解活性を有するもの約１０
０株を得、そのうち５株が短縮化されたＤＮＡ断片をも
っていた。ＤＮＡシークエンスの結果、ＤＮＡ断片のデ
イレ−ジョンの程度により、アミン末端より１５〜６０
アミノ酸を欠失しているセルラーゼの遺伝情報をもつＤ
ＮＡ断片が読み枠の合致した状態でｌａｃのプロモータ
ーに連結していた。またカルボキシル末端よりアミノ酸
を欠失したセルラーゼをコードするＤＮＡ断片を調製す
るためには両端にストップコドンをもつΩフラグメント
をＢａｎ Ｈｌサイト及びＥｃｏＲＩサイトに挿入した
ＤＮＡ断片を構築し、カルボキシル末端より４〜７５ア
ミノ酸を欠失したセルラーゼを調製した。デイレ−ジョ
ンの程度に制限はない。
の環状プラスミドを切断することにより形質転換効率を
上げた。その結果、ＣＭＣ分解活性を有するもの約１０
０株を得、そのうち５株が短縮化されたＤＮＡ断片をも
っていた。ＤＮＡシークエンスの結果、ＤＮＡ断片のデ
イレ−ジョンの程度により、アミン末端より１５〜６０
アミノ酸を欠失しているセルラーゼの遺伝情報をもつＤ
ＮＡ断片が読み枠の合致した状態でｌａｃのプロモータ
ーに連結していた。またカルボキシル末端よりアミノ酸
を欠失したセルラーゼをコードするＤＮＡ断片を調製す
るためには両端にストップコドンをもつΩフラグメント
をＢａｎ Ｈｌサイト及びＥｃｏＲＩサイトに挿入した
ＤＮＡ断片を構築し、カルボキシル末端より４〜７５ア
ミノ酸を欠失したセルラーゼを調製した。デイレ−ジョ
ンの程度に制限はない。
第２図に、各種短縮化されたセルラーゼの構造及びその
酵素活性を示す。図中、ＣＭＣＩはシグナル配例を含む
短縮化されていないセルラーゼを表わし、ＣＭＣＩ−Ｎ
＋１６、Ｃ？ＩＣＩ−Ｎ＋２５、ＣＭＣＩ−Ｎ＋６０は
セＪレラーゼの成熟蛋白のＮ末端より、それぞれ１５．
２４．５９個のアミノ酸を欠失した短縮化セルラーゼを
表わす、また、ＣＭＣＩ−Ｃ＋０５、ＣＭＣＩ−Ｃ＋７
６はセルラーゼのＣ末端よりそれぞれ４．７５個のアミ
ノ酸を欠失した短縮化セルラーゼを表わす。
酵素活性を示す。図中、ＣＭＣＩはシグナル配例を含む
短縮化されていないセルラーゼを表わし、ＣＭＣＩ−Ｎ
＋１６、Ｃ？ＩＣＩ−Ｎ＋２５、ＣＭＣＩ−Ｎ＋６０は
セＪレラーゼの成熟蛋白のＮ末端より、それぞれ１５．
２４．５９個のアミノ酸を欠失した短縮化セルラーゼを
表わす、また、ＣＭＣＩ−Ｃ＋０５、ＣＭＣＩ−Ｃ＋７
６はセルラーゼのＣ末端よりそれぞれ４．７５個のアミ
ノ酸を欠失した短縮化セルラーゼを表わす。
（５）コンピテントセルの調製と形質転換コンピテント
セルとして用いた大腸菌ＨＢ １０１株はＬＢ（Ｌｕｒ
ｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地、ｐＨ７，５で一晩培養し
た。これよりｌｄをとり新たな１００−のＬＢ培地に植
菌した。培養液の濁度がＯＤ＆６ｇ＋＝０．４になった
ところで集菌し、カルシウム処理を行った。組み換えプ
ラスミドｌＯ■をコンピテントセルに加え、氷水中で３
０分間保持した。その後４２℃で１分間保持し、さらに
氷水中で２分間保持した。これにＬＢ培地ＩＩＩＩｌを
加え３７℃で１時間振盪培養した。
セルとして用いた大腸菌ＨＢ １０１株はＬＢ（Ｌｕｒ
ｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地、ｐＨ７，５で一晩培養し
た。これよりｌｄをとり新たな１００−のＬＢ培地に植
菌した。培養液の濁度がＯＤ＆６ｇ＋＝０．４になった
ところで集菌し、カルシウム処理を行った。組み換えプ
ラスミドｌＯ■をコンピテントセルに加え、氷水中で３
０分間保持した。その後４２℃で１分間保持し、さらに
氷水中で２分間保持した。これにＬＢ培地ＩＩＩＩｌを
加え３７℃で１時間振盪培養した。
（６）セルラーゼを生産する組み換え菌の検出方法（４
）で調製した形質転換株を選択圧として、１００μｇ７
ｘｄｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にまいて３７
℃で１２時間培養した。この寒天培地に１％ＣＭＣを含
む１％寒天を重層し、３７℃で２時間保持した。
）で調製した形質転換株を選択圧として、１００μｇ７
ｘｄｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にまいて３７
℃で１２時間培養した。この寒天培地に１％ＣＭＣを含
む１％寒天を重層し、３７℃で２時間保持した。
この寒天培地を１％コンゴーレッドで５分間染色後ＩＭ
ＮａＣ１で洗浄し、この時ハローを形成する菌を選択し
た。その結果約１００個のハローを形成する組み換え菌
を得た。この組み換え菌には、アミノ末端のアミノ酸１
５個を欠失したセルラーゼ（ＣＭＣＩ−Ｎ＋１６）を生
成する遺伝情報が組み込まれているＤＮＡ断片を含むプ
ラスミドを持っていた。このプラスミドをｐＵＲＡ Ｉ
−ｄｉ と名付けた。
ＮａＣ１で洗浄し、この時ハローを形成する菌を選択し
た。その結果約１００個のハローを形成する組み換え菌
を得た。この組み換え菌には、アミノ末端のアミノ酸１
５個を欠失したセルラーゼ（ＣＭＣＩ−Ｎ＋１６）を生
成する遺伝情報が組み込まれているＤＮＡ断片を含むプ
ラスミドを持っていた。このプラスミドをｐＵＲＡ Ｉ
−ｄｉ と名付けた。
（７） ｐＵＲＡ Ｉ−ｄｌを用いる新規なセルラーゼ
の製造方法 プラスミドｐＵＲＡ Ｉ−ｄｉを用い大腸菌ＪＭ １０
３を形質転換した。この形質転換菌は工業技術院微生物
工業技術研究所にＢ、ｃｏｌｉ （ＪＭ １０３／ｐＵ
ＲＡ １−１） （Ｆｆ！ＲＭ Ｐ−１０６２４）とし
て寄託している。この形質転換菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１０
６２４）を下記の培地でｐＨスタット法によりｐＨ６，
５に制御して培養した。
の製造方法 プラスミドｐＵＲＡ Ｉ−ｄｉを用い大腸菌ＪＭ １０
３を形質転換した。この形質転換菌は工業技術院微生物
工業技術研究所にＢ、ｃｏｌｉ （ＪＭ １０３／ｐＵ
ＲＡ １−１） （Ｆｆ！ＲＭ Ｐ−１０６２４）とし
て寄託している。この形質転換菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１０
６２４）を下記の培地でｐＨスタット法によりｐＨ６，
５に制御して培養した。
セルラーゼ生産用培地
バクトドリプトン
酵母エキス
０ｇ
５ｇ
製造は１．５１の培地を用い、２１！の発酵槽で３７℃
、通気量１ ｖｖ＋＋＋（Ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ａｉｒ
ｐｅｒ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆａ＋ｅｄｉｕｏ＋ ｐｅ
ｒ ｓ＋１ｎｕｔｅ）、攪拌速度７５０ｒｐ＋ａの条件
下で７時間行った。培養液を冷却遠心機で１０．０００
Ｘ ｇ 。
、通気量１ ｖｖ＋＋＋（Ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ａｉｒ
ｐｅｒ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆａ＋ｅｄｉｕｏ＋ ｐｅ
ｒ ｓ＋１ｎｕｔｅ）、攪拌速度７５０ｒｐ＋ａの条件
下で７時間行った。培養液を冷却遠心機で１０．０００
Ｘ ｇ 。
１０分間遠心分離後、得られた菌体を浸透圧ショク法で
酵素を抽出し粗酵素液とした。この時得られたセルラー
ゼの収量は１１０単位であった。
酵素を抽出し粗酵素液とした。この時得られたセルラー
ゼの収量は１１０単位であった。
（８）組み換え菌の生産する新規なセルラーゼの精製の
方法 （７）で得られたセルラーゼを次の方法で精製した。
方法 （７）で得られたセルラーゼを次の方法で精製した。
浸透圧ショック法で抽出した粗酵素液をファルマシア社
製のＦＰＬＣを用いＤＥＡＥ−Ｂｉｏ Ｇｅｌ Ａ （
バイオランド社製）の陰イオン交換クロマトグラフィー
を行った。 １０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６，
８で塩化ナトリウムの濃度勾配をかけ溶出した。セルラ
ーゼ活性を有する両分を集め分子量１．０００ダルトン
カツトのＹＭ２膜を取り付けた濃縮器（アミコン社製）
を用いて約１〜２ｄになるまで濃縮した。
製のＦＰＬＣを用いＤＥＡＥ−Ｂｉｏ Ｇｅｌ Ａ （
バイオランド社製）の陰イオン交換クロマトグラフィー
を行った。 １０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６，
８で塩化ナトリウムの濃度勾配をかけ溶出した。セルラ
ーゼ活性を有する両分を集め分子量１．０００ダルトン
カツトのＹＭ２膜を取り付けた濃縮器（アミコン社製）
を用いて約１〜２ｄになるまで濃縮した。
これを５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ＨＲ（ファルマ
シアファインケミカルズ社製）を用いて、ゲル濾過クロ
マトグラフィーを行い、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む
１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６，８で溶出した
。セルラーゼ活性を有する百分を集め１０−Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液ｐＨ６，８で１０倍以上に希釈したのち
、Ｍｏｎｏ Ｑカラム（ファルマシア社製）を用いて陰
イオン交換クロマトグラフィーを行った。 １０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６，８で塩化ナトリウムの濃
度勾配をかけ溶出した。回収されたセルラーゼは５ＯＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一蛋白にまで精
製されていた。
シアファインケミカルズ社製）を用いて、ゲル濾過クロ
マトグラフィーを行い、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む
１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６，８で溶出した
。セルラーゼ活性を有する百分を集め１０−Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液ｐＨ６，８で１０倍以上に希釈したのち
、Ｍｏｎｏ Ｑカラム（ファルマシア社製）を用いて陰
イオン交換クロマトグラフィーを行った。 １０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６，８で塩化ナトリウムの濃
度勾配をかけ溶出した。回収されたセルラーゼは５ＯＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一蛋白にまで精
製されていた。
第１表に形質転換菌Ｅ、ｃｏｌｉ（ＪＭ １０３／ｐＵ
ＲＡ Ｉ −ｄｉ）の生成した短縮化セルラーゼ（ＣＭ
ＣＩ −Ｎ ＋ ２５）の各精製過程における精製度お
よび収率を示す。
ＲＡ Ｉ −ｄｉ）の生成した短縮化セルラーゼ（ＣＭ
ＣＩ −Ｎ ＋ ２５）の各精製過程における精製度お
よび収率を示す。
（本頁以下余白）
（９）精製セルラーゼによるセロオリゴマーの分解精製
セルラーゼを使用してリン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ６
でセロオリゴマーを加水分解し、該分解物を高速液体ク
ロマトグラフィー（カラム：ＵｌｔｒｏｎＮＨｘ 、溶
媒系： ＣＨ３ＣＮ／Ｈ，０＝５５／４５ 、圧カニ４
０ｋｇ／ｄ、流速： ０．７ ｄ／ａ＋ｉｎ）にかけて
分析した。
セルラーゼを使用してリン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ６
でセロオリゴマーを加水分解し、該分解物を高速液体ク
ロマトグラフィー（カラム：ＵｌｔｒｏｎＮＨｘ 、溶
媒系： ＣＨ３ＣＮ／Ｈ，０＝５５／４５ 、圧カニ４
０ｋｇ／ｄ、流速： ０．７ ｄ／ａ＋ｉｎ）にかけて
分析した。
この分析パターンを第５図に示す０図中（Ａ）は２０分
加水分解した場合の、（Ｂ）は１夜加水分解した場合の
分析パターンである。
加水分解した場合の、（Ｂ）は１夜加水分解した場合の
分析パターンである。
これによると、本酵素はセロビオース（Ｇりをほとんど
分解しないが、セロトリオース（Ｇ３）、セロテトラオ
ース（Ｇ４）、セロペンタオース（Ｇ、）およびセロヘ
キサオース（Ｇ６）を良く分解し、生成物としてグルコ
ース（Ｇｔ） 、Ｇ、およびＧ３が１対２対０．５モル
の割合で生成する。Ｇ４の分解の過程でＧ、が生成され
ることが明らかとなったので本精製セルラーゼには、Ｇ
、とＧ４を基質としてＧ、を形成する合成反応が認めら
れた。
分解しないが、セロトリオース（Ｇ３）、セロテトラオ
ース（Ｇ４）、セロペンタオース（Ｇ、）およびセロヘ
キサオース（Ｇ６）を良く分解し、生成物としてグルコ
ース（Ｇｔ） 、Ｇ、およびＧ３が１対２対０．５モル
の割合で生成する。Ｇ４の分解の過程でＧ、が生成され
ることが明らかとなったので本精製セルラーゼには、Ｇ
、とＧ４を基質としてＧ、を形成する合成反応が認めら
れた。
Ｏｏ）精製セルラーゼのｐＨ及び温度特性（ｐＨ特性）
第３図は、本発明における形質転換菌ＪＭ １０３／ｐ
ＵＲＡ Ｉ−ｄｉ由来の短縮化セルラーゼ及び形質転換
菌ＪＭ １０３／ｐＵＲＡ Ｉ由来のセルラーゼの酵素
活性に対するｐＨの影響を示すものである。
ＵＲＡ Ｉ−ｄｉ由来の短縮化セルラーゼ及び形質転換
菌ＪＭ １０３／ｐＵＲＡ Ｉ由来のセルラーゼの酵素
活性に対するｐＨの影響を示すものである。
本発明の短縮化セルラーゼは形質転換菌ＪＭ １０３／
ｐＵＲＡ Ｉ由来のセルラーゼに比較し、明らかに低い
ｐＨ値で最大活性を有する。
ｐＵＲＡ Ｉ由来のセルラーゼに比較し、明らかに低い
ｐＨ値で最大活性を有する。
（温度特性）
第４図は、本発明における上記ＪＭ １０３／ｐＵＲＡ
１由来の短縮化セルラーゼと上記ＪＭ １０３／ ｐ
ＵＲＡ Ｉ由来のセルラーゼの温度に対する酵素活性と
安定性の関係を示すものである。
１由来の短縮化セルラーゼと上記ＪＭ １０３／ ｐ
ＵＲＡ Ｉ由来のセルラーゼの温度に対する酵素活性と
安定性の関係を示すものである。
本発明の短縮化セルラーゼは、上記ＪＭ １０３／ｐＵ
ＲＡＩ由来のセルラーゼに比較し、高い温度での安定性
は低いが酵素活性の至適温度は低（、かつその範囲も広
いという性質を有している。
ＲＡＩ由来のセルラーゼに比較し、高い温度での安定性
は低いが酵素活性の至適温度は低（、かつその範囲も広
いという性質を有している。
第１図は、セルラーゼの遺伝情報をコードするＤＮＡ断
片の構造を示す。第２図はアミノ末端あるいはカルボキ
シル末端を欠失した各種短縮化セルラーゼを示す。第３
図は精製されたアミノ末端を１５個欠失した短縮化セル
ラーゼにおける、酵素活性についてのｐＨ特性を表わす
グラフを示す。 第４図はこの精製セルラーゼにおける酵素活性等につい
ての温度特性を表わすグラフを示す。第５図は精製セル
ラーゼによる基質セロオリゴマーの分解特性を示す高速
液体クロマトグラフィーの分析パターンを示す。
片の構造を示す。第２図はアミノ末端あるいはカルボキ
シル末端を欠失した各種短縮化セルラーゼを示す。第３
図は精製されたアミノ末端を１５個欠失した短縮化セル
ラーゼにおける、酵素活性についてのｐＨ特性を表わす
グラフを示す。 第４図はこの精製セルラーゼにおける酵素活性等につい
ての温度特性を表わすグラフを示す。第５図は精製セル
ラーゼによる基質セロオリゴマーの分解特性を示す高速
液体クロマトグラフィーの分析パターンを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ルミノコッカス・アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃ
ｕｓａｌｂｕｓ）のＤＮＡより分離された中性セルラー
ゼの遺伝情報をコードする第１図のＤＮＡ断片の一部を
変異せしめたＰＮＡ断片。 ２、中性セルラーゼの遺伝情報をコードするＤＮＡ断片
の一部を変異せしめたＤＮＡ断片が、該中性セルラーゼ
の成熟蛋白質のアミノ末端から一部のアミノ酸配列を欠
失させた蛋白質をコードするものである請求項１記載の
ＤＮＡ断片。 ３、中性セルラーゼの成熟蛋白質のアミノ末端から１５
あるいは２４個のアミノ酸を欠失させた蛋白質をコード
するものである請求項２記載のＤＮＡ断片。 ４、中性セルラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
断片の一部を変異せしめたＤＮＡ断片が、該中性セルラ
ーゼの成熟蛋白質のカルボキシル末端から一部のアミノ
酸配列を欠失させた蛋白質をコードするものである請求
項１記載のＤＮＡ断片。 ５、微酸性低温性セルラーゼをコードするものである請
求項１記載のＤＮＡ断片。 ６、請求項１記載のＤＮＡ断片を含むプラスミドＤＮＡ
。 ７、請求項２記載のプラスミドＤＮＡにより形質転換さ
れた形質転換体。 ８、ルミノコッカス・アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃ
ｕｓａｌｂｕｓ）のＤＮＡより分離された中性セルラー
ゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の一部を変異
せしめたＤＮＡ断片を翻訳して得られた蛋白質。 ９、ｐＨ５〜７、２０〜３５℃で最大活性を示す微酸性
微低温性セルラーゼ。 １０、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定
したとき約３５，０００±５，０００ダルトンの分子量
を持ち、ｐＨ５〜７、２０〜３５℃で最大活性を示し、
３７℃で１時間保持したとき８０％以上の残存活性を有
することを特徴とする微酸性微低温性セルラーゼ。 １１、請求項７記載の形質転換体を培養し得られた培養
物から微酸性低温性セルラーゼを採取することを特徴と
する微酸性微低温性セルラーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1086714A JP2928265B2 (ja) | 1989-04-07 | 1989-04-07 | Ｄｎａ断片、微酸性微低温性セルラーゼ及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1086714A JP2928265B2 (ja) | 1989-04-07 | 1989-04-07 | Ｄｎａ断片、微酸性微低温性セルラーゼ及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02265486A true JPH02265486A (ja) | 1990-10-30 |
| JP2928265B2 JP2928265B2 (ja) | 1999-08-03 |
Family
ID=13894566
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1086714A Expired - Fee Related JP2928265B2 (ja) | 1989-04-07 | 1989-04-07 | Ｄｎａ断片、微酸性微低温性セルラーゼ及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2928265B2 (ja) |
-
1989
- 1989-04-07 JP JP1086714A patent/JP2928265B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2928265B2 (ja) | 1999-08-03 |
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