JPH10327873A - プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する微生物並びにその微生物を用いたエンドシアリダーゼの製造方法並びにそのエンドシアリダーゼを用いたシアル酸トリマーの製造方法 - Google Patents
プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する微生物並びにその微生物を用いたエンドシアリダーゼの製造方法並びにそのエンドシアリダーゼを用いたシアル酸トリマーの製造方法Info
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- JPH10327873A JPH10327873A JP9186092A JP18609297A JPH10327873A JP H10327873 A JPH10327873 A JP H10327873A JP 9186092 A JP9186092 A JP 9186092A JP 18609297 A JP18609297 A JP 18609297A JP H10327873 A JPH10327873 A JP H10327873A
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- plasmid
- endosialidase
- producing
- microorganism
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 シアル酸トリマーを効率よく収集するための
エンドシアリダーゼの生産に関与する特定の遺伝情報を
担うＤＮＡ断片を組み込んだ新規なプラスミドとその調
製方法、そのプラスミドを含有する微生物とそれを用い
たエンドシアリダーゼの製造方法とそれを用いたシアル
酸トリマーの製造方法を提供する。 【解決手段】 宿主にエンドシアリダーゼ生産能を与え
るプラスミドであって、その制限サイトのＳｍａＩサイ
トにバクテリオファージのエンドシアリダーゼ生産に関
与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を組み込んだプラスミ
ドと、そのようなプラスミドを制限酵素を用いて調製、
組み換え、抽出して調製する方法と、微生物であるエン
ドシアリダーゼの生産能を有するエシュリヒア・コリＤ
Ｈ５α（pSD18)と、それを用いたエンドシアリダーゼ及
びシアル酸トリマーの製造方法。
エンドシアリダーゼの生産に関与する特定の遺伝情報を
担うＤＮＡ断片を組み込んだ新規なプラスミドとその調
製方法、そのプラスミドを含有する微生物とそれを用い
たエンドシアリダーゼの製造方法とそれを用いたシアル
酸トリマーの製造方法を提供する。 【解決手段】 宿主にエンドシアリダーゼ生産能を与え
るプラスミドであって、その制限サイトのＳｍａＩサイ
トにバクテリオファージのエンドシアリダーゼ生産に関
与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を組み込んだプラスミ
ドと、そのようなプラスミドを制限酵素を用いて調製、
組み換え、抽出して調製する方法と、微生物であるエン
ドシアリダーゼの生産能を有するエシュリヒア・コリＤ
Ｈ５α（pSD18)と、それを用いたエンドシアリダーゼ及
びシアル酸トリマーの製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】 本発明は、シアル酸トリマ
ーを効率よく収集するためのエンドシアリダーゼの生産
に関与する特定の遺伝情報を担うＤＮＡ断片を組み込ん
だ新規なプラスミド及びその調製方法並びにそのプラス
ミドを含有する微生物並びにその微生物を用いたエンド
シアリダーゼの製造方法並びにそのエンドシアリダーゼ
を用いたシアル酸トリマーの製造方法に関するものであ
る。
ーを効率よく収集するためのエンドシアリダーゼの生産
に関与する特定の遺伝情報を担うＤＮＡ断片を組み込ん
だ新規なプラスミド及びその調製方法並びにそのプラス
ミドを含有する微生物並びにその微生物を用いたエンド
シアリダーゼの製造方法並びにそのエンドシアリダーゼ
を用いたシアル酸トリマーの製造方法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】 コロミン酸を分解して得られるシアル
酸トリマーは、例えば医薬品や化学合成の原材料として
の有用性が認められており、近年その製造方法が種々研
究されている。そして、その一つとして塩酸によるコロ
ミン酸の部分分解法があるが、この方法では非特異的な
分解であるために、シアル酸やそのオリゴマー以外に対
しても過分解物を生じ分離精製が複雑になるという問題
点があるうえに、シアル酸トリマーの収率も極めて低い
という問題点があった。
酸トリマーは、例えば医薬品や化学合成の原材料として
の有用性が認められており、近年その製造方法が種々研
究されている。そして、その一つとして塩酸によるコロ
ミン酸の部分分解法があるが、この方法では非特異的な
分解であるために、シアル酸やそのオリゴマー以外に対
しても過分解物を生じ分離精製が複雑になるという問題
点があるうえに、シアル酸トリマーの収率も極めて低い
という問題点があった。
【０００３】 そこで、本発明者らはコロミン酸からシ
アル酸トリマーを効率よく収集することができる新規な
バクテリオファージ、およびエンドシアリダーゼを開発
し、先に特願平７−３６６３６号として出願した。しか
しながら、下水等から前記バクテリオファージを単離し
たり、該バクテリオファージを精製等してファージ由来
のエンドシアリダーゼを得るのは収率に劣るため、より
効率的なエンドシアリダーゼの生産手段が望まれてい
た。
アル酸トリマーを効率よく収集することができる新規な
バクテリオファージ、およびエンドシアリダーゼを開発
し、先に特願平７−３６６３６号として出願した。しか
しながら、下水等から前記バクテリオファージを単離し
たり、該バクテリオファージを精製等してファージ由来
のエンドシアリダーゼを得るのは収率に劣るため、より
効率的なエンドシアリダーゼの生産手段が望まれてい
た。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】 本発明は上記のよう
な従来の問題点を解決して、ポリシアル酸の分解酵素と
して作用しシアル酸トリマーを安定かつ効率的に収集す
るエンドシアリダーゼを生産することができる新規なプ
ラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有
する微生物を提供することを目的として完成されたもの
である。
な従来の問題点を解決して、ポリシアル酸の分解酵素と
して作用しシアル酸トリマーを安定かつ効率的に収集す
るエンドシアリダーゼを生産することができる新規なプ
ラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有
する微生物を提供することを目的として完成されたもの
である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】 上記の課題を解決する
ためになされた本発明は、宿主にエンドシアリダーゼ生
産能を与えるプラスミドであって、その制限サイトのＳ
ｍａＩサイトにバクテリオファージのエンドシアリダー
ゼ生産に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を組み込ん
だプラスミドを第１の発明とし、エンドシアリダーゼ生
産能を与えるバクテリオファージの染色体ＤＮＡ断片を
制限酵素を用いて調製すること、前記染色体ＤＮＡ断片
のエンドシアリダーゼ生産能に関与する遺伝情報を妨害
しない制限酵素を用いてプラスミドのベクターを制限す
ること、制限された前記プラスミドＤＮＡの制限サイト
のＳｍａＩサイトに前記染色体ＤＮＡ断片を組み換える
こと、及び組み換えられたプラスミドを抽出することか
らなるエンドシアリダーゼ生産に関与する遺伝情報を担
うＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドの調製方法を第２
の発明とし、エンドシアリダーゼの生産能に関する遺伝
子ＤＮＡをエシュリヒア(Escherichia) 属に属する微生
物内で複製機能を有するベクタープラスミドに連結した
組み換え体プラスミドで形質転換されたエシュリヒア(E
scherichia) 属に属する微生物を第３の発明とし、この
微生物を培地中に培養して培養物中にエンドシアリダー
ゼを蓄積せしめ、該培養物からエンドシアリダーゼを採
取することを特徴とするエンドシアリダーゼの製造方法
を第４の発明とし、これにより得られたエンドシアリダ
ーゼを用いてα−２，８シアル酸オリゴマーよりシアル
酸トリマーを生産することを特徴とするシアル酸トリマ
ーの製造方法を第５の発明とするものである。
ためになされた本発明は、宿主にエンドシアリダーゼ生
産能を与えるプラスミドであって、その制限サイトのＳ
ｍａＩサイトにバクテリオファージのエンドシアリダー
ゼ生産に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を組み込ん
だプラスミドを第１の発明とし、エンドシアリダーゼ生
産能を与えるバクテリオファージの染色体ＤＮＡ断片を
制限酵素を用いて調製すること、前記染色体ＤＮＡ断片
のエンドシアリダーゼ生産能に関与する遺伝情報を妨害
しない制限酵素を用いてプラスミドのベクターを制限す
ること、制限された前記プラスミドＤＮＡの制限サイト
のＳｍａＩサイトに前記染色体ＤＮＡ断片を組み換える
こと、及び組み換えられたプラスミドを抽出することか
らなるエンドシアリダーゼ生産に関与する遺伝情報を担
うＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドの調製方法を第２
の発明とし、エンドシアリダーゼの生産能に関する遺伝
子ＤＮＡをエシュリヒア(Escherichia) 属に属する微生
物内で複製機能を有するベクタープラスミドに連結した
組み換え体プラスミドで形質転換されたエシュリヒア(E
scherichia) 属に属する微生物を第３の発明とし、この
微生物を培地中に培養して培養物中にエンドシアリダー
ゼを蓄積せしめ、該培養物からエンドシアリダーゼを採
取することを特徴とするエンドシアリダーゼの製造方法
を第４の発明とし、これにより得られたエンドシアリダ
ーゼを用いてα−２，８シアル酸オリゴマーよりシアル
酸トリマーを生産することを特徴とするシアル酸トリマ
ーの製造方法を第５の発明とするものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】以下に、本発明の好ましい実施の
形態を示す。本発明において用いられる宿主微生物は、
プラスミド（ベクターＤＮＡ）に、外来の遺伝子ＤＮＡ
から調製された染色体ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミ
ドを含有するエシュリヒア・コリによって代表されるエ
シュリヒア属に属する微生物である。そして、前記ベク
ターＤＮＡに組み込まれる外来遺伝子ＤＮＡから調製さ
れた染色体ＤＮＡ断片は、バクテリオファージのエンド
シアリダーゼ生産に関与する遺伝情報を担うＤＮＡであ
る。このプラスミドのベクターはエシュリヒア(Escheri
chia) 属に属する微生物内で複製機能を有するベクター
プラスミドのＤＮＡであり、例えばｐＵＣ１８プラスミ
ドのＤＮＡを用いるが、その他、ｐＵＣ１９やｐＢＲ３
２２等を用いることもできる。
形態を示す。本発明において用いられる宿主微生物は、
プラスミド（ベクターＤＮＡ）に、外来の遺伝子ＤＮＡ
から調製された染色体ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミ
ドを含有するエシュリヒア・コリによって代表されるエ
シュリヒア属に属する微生物である。そして、前記ベク
ターＤＮＡに組み込まれる外来遺伝子ＤＮＡから調製さ
れた染色体ＤＮＡ断片は、バクテリオファージのエンド
シアリダーゼ生産に関与する遺伝情報を担うＤＮＡであ
る。このプラスミドのベクターはエシュリヒア(Escheri
chia) 属に属する微生物内で複製機能を有するベクター
プラスミドのＤＮＡであり、例えばｐＵＣ１８プラスミ
ドのＤＮＡを用いるが、その他、ｐＵＣ１９やｐＢＲ３
２２等を用いることもできる。
【０００７】 また、このベクターＤＮＡに染色体ＤＮ
Ａ断片を組み込む方法は、例えば適当な制限酵素（Endo
nuclease）を選択、処理してＤＮＡを特定部位で切断
し、次いで同様に処理したベクターとして用いるＤＮＡ
と混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられ
る。このようにして得られた前記染色体のＤＮＡ断片と
ベクターＤＮＡの結合物を、形質転換法によって受容菌
であるエシュリヒア属の微生物の菌体に導入し、遺伝形
質として安定するまで増殖するとベクターＤＮＡの形質
を併せもつ形質転換株が得られる。
Ａ断片を組み込む方法は、例えば適当な制限酵素（Endo
nuclease）を選択、処理してＤＮＡを特定部位で切断
し、次いで同様に処理したベクターとして用いるＤＮＡ
と混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられ
る。このようにして得られた前記染色体のＤＮＡ断片と
ベクターＤＮＡの結合物を、形質転換法によって受容菌
であるエシュリヒア属の微生物の菌体に導入し、遺伝形
質として安定するまで増殖するとベクターＤＮＡの形質
を併せもつ形質転換株が得られる。
【０００８】 この形質転換株は、ベクターＤＮＡとし
てｐＵＣ１８プラスミドのＤＮＡを用い、これに染色体
ＤＮＡ断片を組み込んで得られた新規ｐＳＤ１８プラス
ミドを用いて形質転換反応により得られる新規微生物
で、エシュリヒア・コリＤＨ５α（pSD18)〔Escherichi
a coliＤＨ５α（pSD18)〕〔生命研菌寄第15833 号（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−15833 ）〕と呼称される。なお、前記エシ
ュリヒア・コリＤＨ５α（pSD18)のｐＳＤ１８プラスミ
ドの制限酵素切断地図は図１に示すとおりである。な
お、ベクターとしてｐＢＲ３２２を用いる場合には、プ
ラスミドｐＢＲ３２２にＳｍａＩサイトがないため、組
み換えプラスミドｐＳＤ１８からEcoRＩ-HindIIIで切断
してファージ由来のＳｍａＩ切断ＤＮＡ断片を含むよう
に切り出し、同様にEcoRＩ-HindIIIで切断したｐＢＲ３
２２と連結することにより、エンドシアリダーゼ生産能
を有するプラスミドを得ることができる。
てｐＵＣ１８プラスミドのＤＮＡを用い、これに染色体
ＤＮＡ断片を組み込んで得られた新規ｐＳＤ１８プラス
ミドを用いて形質転換反応により得られる新規微生物
で、エシュリヒア・コリＤＨ５α（pSD18)〔Escherichi
a coliＤＨ５α（pSD18)〕〔生命研菌寄第15833 号（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−15833 ）〕と呼称される。なお、前記エシ
ュリヒア・コリＤＨ５α（pSD18)のｐＳＤ１８プラスミ
ドの制限酵素切断地図は図１に示すとおりである。な
お、ベクターとしてｐＢＲ３２２を用いる場合には、プ
ラスミドｐＢＲ３２２にＳｍａＩサイトがないため、組
み換えプラスミドｐＳＤ１８からEcoRＩ-HindIIIで切断
してファージ由来のＳｍａＩ切断ＤＮＡ断片を含むよう
に切り出し、同様にEcoRＩ-HindIIIで切断したｐＢＲ３
２２と連結することにより、エンドシアリダーゼ生産能
を有するプラスミドを得ることができる。
【０００９】 また、前記のエンドシアリダーゼ生産に
関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片に関し、Dideoxy ch
ain termination 法を用いて決定した塩基配列は配列番
号１に示すとおりのものであった。
関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片に関し、Dideoxy ch
ain termination 法を用いて決定した塩基配列は配列番
号１に示すとおりのものであった。
【００１０】 前記のエシュリヒア・コリＤＨ５α（pS
D18)の菌学的性質は一般的な大腸菌の性質と同一である
が、他の特性として前記ｐＳＤ１８プラスミドの特性、
即ちバクテリオファージのエンドシアリダーゼ生産に関
与する遺伝情報を担うｐＳＤ１８プラスミドによってポ
リシアル酸を基質として認識し、例えば、α−２，８シ
アル酸テトラマーをシアル酸モノマーとシアル酸トリマ
ーとに分解する酵素を生産する特性を付加している点に
特徴がある。
D18)の菌学的性質は一般的な大腸菌の性質と同一である
が、他の特性として前記ｐＳＤ１８プラスミドの特性、
即ちバクテリオファージのエンドシアリダーゼ生産に関
与する遺伝情報を担うｐＳＤ１８プラスミドによってポ
リシアル酸を基質として認識し、例えば、α−２，８シ
アル酸テトラマーをシアル酸モノマーとシアル酸トリマ
ーとに分解する酵素を生産する特性を付加している点に
特徴がある。
【００１１】 従って、前記のエシュリヒア・コリＤＨ
５α（pSD18)は従来皆無であったバクテリオファージの
エンドシアリダーゼ生産に関与する微生物を創製し、か
つシアル酸トリマーを有利に生産し得る微生物を提供す
る点において、新規性と有用性を具備するものである。
５α（pSD18)は従来皆無であったバクテリオファージの
エンドシアリダーゼ生産に関与する微生物を創製し、か
つシアル酸トリマーを有利に生産し得る微生物を提供す
る点において、新規性と有用性を具備するものである。
【００１２】 以下に、本発明のプラスミドの調製方法
と該プラスミドを含有する前記形質転換株であるエシュ
リヒア・コリＤＨ５α（pSD18)の調製方法、及びその微
生物を用いたエンドシアリダーゼの製造方法並びにその
エンドシアリダーゼを用いたシアル酸トリマーの製造方
法について、実施例により説明する。
と該プラスミドを含有する前記形質転換株であるエシュ
リヒア・コリＤＨ５α（pSD18)の調製方法、及びその微
生物を用いたエンドシアリダーゼの製造方法並びにその
エンドシアリダーゼを用いたシアル酸トリマーの製造方
法について、実施例により説明する。
【００１３】
【実施例】〔実施例１〕 (1) エンドシアリダーゼ生産能の遺伝情報をもつ染色体
ＤＮＡの調製 バクテリオファージの宿主となるＫ1 抗原含有の大腸菌
であるエシュリヒア・コリＫ235 株を１晩培養した液５
mLを５００mLのブイヨン培地（（株）ニッスイ製）に加
え、３７℃で２〜３時間培養し、菌体濃度が１０8 に達
した後、バクテリオファージをm.o.l ＝１となるように
加え、さらに４〜５時間振とう培養を行う。溶菌が確認
されたら培養を止め、遠心分離により菌体破片を取り除
き、上清をファージ溶菌液とした。溶菌液５００mLに３
０％ＰＥＧ・３Ｍ ＮａＣｌ溶液を２５０mL加え、４℃
で１晩静置した。５０００rpm 、２０分間遠心し、沈殿
を５mLの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）・１
０ｍＭ ＭｇＳＯ4 に溶解し、５０μｌのＤｎａｓｅ１
（１０mg/mL)を加え、よく懸濁した。クロロホルム処理
を１回行い、上清をCsCl段階密度勾配溶液（ρ＝1.7 ，
1.5 ，1.45）の上に重層して、36000rpm、１５℃、６０
分間遠心した。CsCl層に形成されたファージのバンドを
注射器で抜き取り、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
７．５）・１０ｍＭ ＭｇＳＯ4 溶液に対して透析し
た。回収後、クロロホルムを一滴加え、４℃に保存し
た。５００mLの培養液から、およそ１〜２×１０13のフ
ァージ粒子が得られた。ファージ粒子を含む水溶液から
フェノール法により、染色体ＤＮＡ０．２５mgを得た。
ＤＮＡの調製 バクテリオファージの宿主となるＫ1 抗原含有の大腸菌
であるエシュリヒア・コリＫ235 株を１晩培養した液５
mLを５００mLのブイヨン培地（（株）ニッスイ製）に加
え、３７℃で２〜３時間培養し、菌体濃度が１０8 に達
した後、バクテリオファージをm.o.l ＝１となるように
加え、さらに４〜５時間振とう培養を行う。溶菌が確認
されたら培養を止め、遠心分離により菌体破片を取り除
き、上清をファージ溶菌液とした。溶菌液５００mLに３
０％ＰＥＧ・３Ｍ ＮａＣｌ溶液を２５０mL加え、４℃
で１晩静置した。５０００rpm 、２０分間遠心し、沈殿
を５mLの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）・１
０ｍＭ ＭｇＳＯ4 に溶解し、５０μｌのＤｎａｓｅ１
（１０mg/mL)を加え、よく懸濁した。クロロホルム処理
を１回行い、上清をCsCl段階密度勾配溶液（ρ＝1.7 ，
1.5 ，1.45）の上に重層して、36000rpm、１５℃、６０
分間遠心した。CsCl層に形成されたファージのバンドを
注射器で抜き取り、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
７．５）・１０ｍＭ ＭｇＳＯ4 溶液に対して透析し
た。回収後、クロロホルムを一滴加え、４℃に保存し
た。５００mLの培養液から、およそ１〜２×１０13のフ
ァージ粒子が得られた。ファージ粒子を含む水溶液から
フェノール法により、染色体ＤＮＡ０．２５mgを得た。
【００１４】(2) 染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入 (1) で得た染色体ＤＮＡ１０μg を取り、制限エンドヌ
クレアーゼＳｍａＩを加え、３７℃で５分、１０分、２
０分、３０分反応させて部分的に切断した。一方、ベク
ターとして用いるアンピシリン抵抗性(Amp）のｐＵＣ１
８プラスミドＤＮＡをＳｍａＩで完全に切断して６５
℃、５分の熱処理後、前者と混合し、Ｔ４ファージ由来
のＤＮＡリガーゼによって１０℃、２４時間、ＤＮＡ鎖
の連結反応を行い、６５℃、５分の熱処理後、反応液に
２倍容のエタノールを加えて染色体ＤＮＡを組み込んだ
プラスミドＤＮＡを沈殿、採取した。外来ＤＮＡ挿入の
有無は、β−ガラクトシダーゼのα相補正を利用してＸ
−Ｇａｌを含むプレート上でプラークが青色（挿入ＤＮ
Ａ無し）か白色（挿入ＤＮＡ有り）かによって判定した
（lac Z ）。
クレアーゼＳｍａＩを加え、３７℃で５分、１０分、２
０分、３０分反応させて部分的に切断した。一方、ベク
ターとして用いるアンピシリン抵抗性(Amp）のｐＵＣ１
８プラスミドＤＮＡをＳｍａＩで完全に切断して６５
℃、５分の熱処理後、前者と混合し、Ｔ４ファージ由来
のＤＮＡリガーゼによって１０℃、２４時間、ＤＮＡ鎖
の連結反応を行い、６５℃、５分の熱処理後、反応液に
２倍容のエタノールを加えて染色体ＤＮＡを組み込んだ
プラスミドＤＮＡを沈殿、採取した。外来ＤＮＡ挿入の
有無は、β−ガラクトシダーゼのα相補正を利用してＸ
−Ｇａｌを含むプレート上でプラークが青色（挿入ＤＮ
Ａ無し）か白色（挿入ＤＮＡ有り）かによって判定した
（lac Z ）。
【００１５】(3) エンドシアリダーゼ生産遺伝子を担う
プラスミドによる形質転換 エシュリヒア・コリＤＨ５αをＬＢ培地（トリプトン１
％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ１％、グルコース
０．１％、pH７．０）１０mLに接種し、３７℃で振とう
培養を行い、対数増殖後期まで生育させた後に集菌し
た。これを氷冷下、最終濃度で０．０３Ｍ ＣａＣl2の
溶液に順次懸濁させてコンピテントな細胞とした。この
懸濁細胞液に(2) で得たプラスミドＤＮＡの溶解液を加
えて氷冷下で６０分反応させ、４２℃、１〜２分間ヒー
トショックを与えて前記プラスミドＤＮＡを細胞内に取
り込ませた。次いで、この細胞懸濁液を別途、前記ＬＢ
培地に接種し、３７℃、３〜５時間振とう培養して形質
転換反応させた後、アンピシリンＮａ ５０mg/Lを含む
ＬＢ寒天プレートに塗布し１晩培養した。形成されたコ
ロニーをピックアップして形質転換株、エシュリヒア・
コリＤＨ５α（pSD18)〔Escherichia coli ＤＨ５α
（pSD18)〕〔生命研菌寄第15833 号（ＦＥＲＭ Ｐ−15
833 ）〕を得た。同様の方法により、ｐＵＣ１９プラス
ミドを用いて形質転換株が得られることは容易に類推す
ることができる。
プラスミドによる形質転換 エシュリヒア・コリＤＨ５αをＬＢ培地（トリプトン１
％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ１％、グルコース
０．１％、pH７．０）１０mLに接種し、３７℃で振とう
培養を行い、対数増殖後期まで生育させた後に集菌し
た。これを氷冷下、最終濃度で０．０３Ｍ ＣａＣl2の
溶液に順次懸濁させてコンピテントな細胞とした。この
懸濁細胞液に(2) で得たプラスミドＤＮＡの溶解液を加
えて氷冷下で６０分反応させ、４２℃、１〜２分間ヒー
トショックを与えて前記プラスミドＤＮＡを細胞内に取
り込ませた。次いで、この細胞懸濁液を別途、前記ＬＢ
培地に接種し、３７℃、３〜５時間振とう培養して形質
転換反応させた後、アンピシリンＮａ ５０mg/Lを含む
ＬＢ寒天プレートに塗布し１晩培養した。形成されたコ
ロニーをピックアップして形質転換株、エシュリヒア・
コリＤＨ５α（pSD18)〔Escherichia coli ＤＨ５α
（pSD18)〕〔生命研菌寄第15833 号（ＦＥＲＭ Ｐ−15
833 ）〕を得た。同様の方法により、ｐＵＣ１９プラス
ミドを用いて形質転換株が得られることは容易に類推す
ることができる。
【００１６】〔実施例２〕実施例１の(3) で得られた形
質転換株エシュリヒア・コリＤＨ５α（pSD18)〔Escher
ichia coli ＤＨ５α（pSD18)〕〔生命研菌寄第15833
号（ＦＥＲＭ Ｐ−15833 ）〕を、ＬＢ培地１００mLを
含む５００mL容のフラスコで３７℃にて１晩振とう培養
した後、遠心分離にて集菌した。菌体を生理食塩水で２
〜３回洗浄後、１０mLの純水に溶解し、超音波により菌
体を破砕した。遠心分離により破砕菌体を取り除き、エ
ンドシアリダーゼ酵素液とした。この酵素液中の蛋白質
量をブラッドフォード法により定量したところ、２２．
４mg/Lであった。コロミン酸水溶液１５mg/mL に前記、
酵素液１mLを添加して５０℃で４８時間インキュベート
し、下記条件の高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に
よりシアル酸オリゴマーの分析をした結果を表１に示
す。同様に本クローニングの起源となったファージと形
質転換前のエシュリヒアでの結果も合わせて示す。この
結果、形質転換株エシュリヒア・コリＤＨ５α（pSD18)
〔Escherichia coli ＤＨ５α（pSD18)〕〔生命研菌寄
第15833 号（ＦＥＲＭ Ｐ−15833 ）〕によるエンドシ
アリダーゼの生産が確認された。 （分析条件） カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｋ ＷＡＸ−１ 移動相：Ｈ2 Ｏ／０．０８Ｍ Ｎａ2 ＳＯ4 流速：０．７mL/min 検出：２１０nm ＵＶ吸収
質転換株エシュリヒア・コリＤＨ５α（pSD18)〔Escher
ichia coli ＤＨ５α（pSD18)〕〔生命研菌寄第15833
号（ＦＥＲＭ Ｐ−15833 ）〕を、ＬＢ培地１００mLを
含む５００mL容のフラスコで３７℃にて１晩振とう培養
した後、遠心分離にて集菌した。菌体を生理食塩水で２
〜３回洗浄後、１０mLの純水に溶解し、超音波により菌
体を破砕した。遠心分離により破砕菌体を取り除き、エ
ンドシアリダーゼ酵素液とした。この酵素液中の蛋白質
量をブラッドフォード法により定量したところ、２２．
４mg/Lであった。コロミン酸水溶液１５mg/mL に前記、
酵素液１mLを添加して５０℃で４８時間インキュベート
し、下記条件の高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に
よりシアル酸オリゴマーの分析をした結果を表１に示
す。同様に本クローニングの起源となったファージと形
質転換前のエシュリヒアでの結果も合わせて示す。この
結果、形質転換株エシュリヒア・コリＤＨ５α（pSD18)
〔Escherichia coli ＤＨ５α（pSD18)〕〔生命研菌寄
第15833 号（ＦＥＲＭ Ｐ−15833 ）〕によるエンドシ
アリダーゼの生産が確認された。 （分析条件） カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｋ ＷＡＸ−１ 移動相：Ｈ2 Ｏ／０．０８Ｍ Ｎａ2 ＳＯ4 流速：０．７mL/min 検出：２１０nm ＵＶ吸収
【００１７】
【表１】
【００１８】〔実施例３〕 (1) エンドシアリダーゼの大量調製 形質転換株エシュリヒア・コリＤＨ５α（pSD18)〔Esch
erichia coli ＤＨ５α（pSD18)〕〔生命研菌寄第1583
3 号（ＦＥＲＭ Ｐ−15833 ）〕を、ＬＢ培地１００mL
を含む５００mL容のフラスコで３７℃にて１晩振とう培
養した種培養液を、３ＬのＬＢ培地（アンピシリンＮａ
５０mg/lを含む）を含む５Ｌ醗酵槽に植え継ぎ、３７
℃で３０時間、pHが６．８から７．２になるように苛性
イソーダで調節しながら培養した。培養時の菌体濃度Ｏ
Ｄ580 の経過を図２に示す。培養終了後、遠心分離にて
集菌した。菌体を生理食塩水で２〜３回洗浄後、１００
mLの純水に溶解し、超音波により菌体を破砕した。遠心
分離により破砕菌体を取り除き、エンドシアリダーゼ酵
素液とした。この酵素液中の蛋白質量をブラッドフォー
ド法により定量したところ、７８９mg/Lであった。
erichia coli ＤＨ５α（pSD18)〕〔生命研菌寄第1583
3 号（ＦＥＲＭ Ｐ−15833 ）〕を、ＬＢ培地１００mL
を含む５００mL容のフラスコで３７℃にて１晩振とう培
養した種培養液を、３ＬのＬＢ培地（アンピシリンＮａ
５０mg/lを含む）を含む５Ｌ醗酵槽に植え継ぎ、３７
℃で３０時間、pHが６．８から７．２になるように苛性
イソーダで調節しながら培養した。培養時の菌体濃度Ｏ
Ｄ580 の経過を図２に示す。培養終了後、遠心分離にて
集菌した。菌体を生理食塩水で２〜３回洗浄後、１００
mLの純水に溶解し、超音波により菌体を破砕した。遠心
分離により破砕菌体を取り除き、エンドシアリダーゼ酵
素液とした。この酵素液中の蛋白質量をブラッドフォー
ド法により定量したところ、７８９mg/Lであった。
【００１９】(2) シアル酸トリマーの生産 実施例３の(1) で得られたエンドシアリダーゼ酵素液１
００mLを２０g/L のコロミン酸水溶液に加えて５０℃で
４８時間反応させた。高速クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）によりシアル酸オリゴマーの分析をしたところ、
７．２ｇのシアル酸トリマーが得られた。
００mLを２０g/L のコロミン酸水溶液に加えて５０℃で
４８時間反応させた。高速クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）によりシアル酸オリゴマーの分析をしたところ、
７．２ｇのシアル酸トリマーが得られた。
【００２０】
【発明の効果】以上の説明からも明らかなように、本発
明はポリシアル酸の分解酵素として作用しシアル酸トリ
マーを安定かつ効率的に収集するエンドシアリダーゼを
生産することができるものである。よって本発明は従来
の問題点を一掃したプラスミド及びその調製方法並びに
そのプラスミドを含有する微生物並びにその微生物を用
いたエンドシアリダーゼの製造方法並びにそのエンドシ
アリダーゼを用いたシアル酸トリマーの製造方法とし
て、産業の発展に寄与するところは極めて大である。
明はポリシアル酸の分解酵素として作用しシアル酸トリ
マーを安定かつ効率的に収集するエンドシアリダーゼを
生産することができるものである。よって本発明は従来
の問題点を一掃したプラスミド及びその調製方法並びに
そのプラスミドを含有する微生物並びにその微生物を用
いたエンドシアリダーゼの製造方法並びにそのエンドシ
アリダーゼを用いたシアル酸トリマーの製造方法とし
て、産業の発展に寄与するところは極めて大である。
【００２１】
配列番号 ： １ 配列の長さ： 3187 配列の型 ： 核酸 鎖の数 ： 二本鎖 配列の特徴 特徴を表す記号： ＣＤＳ 存在位置 ： 137 ．．3091 特徴を表す記号： −３５signal 存在位置 ： 30．．35 特徴を表す記号： ―１０signal 存在位置 ： 56．．61 特徴を表す記号： SD sequence 存在位置 ： 123 ．．130 配列 CCCGGGCGAC GACCGCACGG TCAAGATTAC TGGCTACAAC TATGATGAAG GTTTCTATAA 60 ATACGACGGC GTCGCGCCAT ACGGCAGCGG TTTCTCCGAC GGATTCAGCG ATGGTTTTAA 120 TTAAAGAGGA CTCTATATGT CAAGCGGATG CGGTGACGTT TTAAGCCTGG CGGATTTACA 180 GACCGCCAAG AAACACCAGA TTTTCGAAGC CGAGGTTATT ACTGGTAAAT CCGGTGGGGT 240 TGCTGGCGGC GCGGATATTG ATTACGCGAC CAACGCAGTT ACAGGGCAGA CACAGAAGAC 300 ACTGCCGGCT GTGTTGCGTG ACGCAGGTTT TAAACTGGCA GATTTTGATT TCACGTCAGG 360 CGGTACACTA TCCGCTAACG ACCGAAACAC CGCAGTTTTG TGGCCGTCGT CCTCGGGCGG 420 TGACGGGGAC TGGTACTATT GGTTGGGTGC TCTGCCAAAA ATTATCCCGG CGTCATCTTC 480 TCCGCAGTCC ACCGGTGGCG TGGCAGATGG GGCATGGCGG CCCGTCGGGT CGGTCATACT 540 GCGGCAGCAA ATATCTGATG TAAACGGTGC AATTCTGTAC CCAGATTTAC ATATGGCGCG 600 ATGGAAGGAC GAATACGACC CACGTGCATG GGGTGCCGTG GGCGACGGTG TAACTGATGA 660 TACTCAATCT ATTTTTAATG TATTAGCGGC TTCTCCCAAC AATTGGATTA TAGACGGCAG 720 GGGTTTGACT TATAAAGTTT CCCAATTACC TGACATTAGT AAATTTAAGA ATGCTGCATT 780 CGTTTACGAG CGCGTAGCCG GGCAACCGCT TACTTATGTA GCTGATGGCT TCTTTAACGG 840 CTCACTAACT AAGGTGACGG ACACCCCGTT CTACAACGCA TGGACGCAGG ATAAAACTTT 900 CGTCTACGAC CATGTTATTT ACGCCCCGTT TATGGCGGGC GAACGACATG GCGTTCAAAA 960 CTTACATGTA GCTTGGGTTC GCTCTGGTGA CGACGGTCAG ACTTGGTCAA TGCCTGAGTG 1020 GTTGACTCCA ATCCATGCTG ACTATAATGC TAGTGTTTCT GCGGACAGAG TTAACTACCA 1080 CTGCATGAGC ATGGGTACGT GCGGCAACCG ATTATATGCA GTTATAGAAA CCCGCTACTT 1140 ATCTAATATG CGGATGAAGA AGGCAGAACT TTGGTCACGC CCAATGCCGT ATTTTAGACA 1200 CCCAACCGGC GGAATAACTA TTAGTTCTGG CTCCACTACT GCTACCATTG TTATAGAAAA 1260 TCATGGCCTA AAAGCAGGAG ATGCGGTTAA CTTCTCTAAT ACAGCGGCAA CTGGCGTATC 1320 GGGTAATATG ACGGTTGCGT CTATAATTAA CCGAAATACG TTCACTGTTA CGCTCTCAAG 1380 CCCTGCGGGT TCCACCATAA ACAATGCGGG GGTTACCTGG AACTTCGCAA CGCGATTCTG 1440 GGACAGCCCA TGGGAAATTA CCGAATTGCC GGAGGTGGCA TACTCCACTA ACGCTGATTT 1500 GTGTGTCACG GAGACACATA GTTTTGCGGT TATAGATGAT GCTAACTACA CTATCGCTGT 1560 CGGCTATCAC AACGACGATG TGTCCCCTCG GCGTCTCGGT GTCTTGTATT TTAGTAACGT 1620 GTATGACAAT CCAGGCGTAT TCGTTCGTCG CACTGTCGCT CAGGCATACG CTGATAACGC 1680 TTCTGAGCCG TGTGTGAAAA GTTATGGCGG TGTGCTCTAC CTTACCACAC GCGGCACATT 1740 ACCTACTTCC CCCGGCTCTA CACTGGCGAT GAGCACCGAT TCTGGGCAAA ACTGGAGCTA 1800 CTTGCGATTC CCGAACAATG TACATCACTC CAATCTTCCG TTCGCTAAAG TAGGTGACTA 1860 TCTCTACATC TTTGGTACAG AACGTGCATT TGGTGAGTGG GAAGGTGGCG CGCCGGACAG 1920 CCGCTATGAA GGTTCGTATC CGAGGACCTT TATGTGCAAA GTCAATGTGT CGTCCTGGCC 1980 TTCATCTTTA GATGATGTTC AGTGGTTTAA TATTACCGAC CAAATATACC AGGGCCATAT 2040 CGTTAACACT GCCGTCGGCG TCGGCTCTGT CTGTGTTAAA GATGGCTGGT TGTACTATAT 2100 CTTTGGAGGG GAAGACTTCT TCTCTCCCTG GAGCATCGGG GATAACAGTG CGAAGTTATG 2160 GTACAAACAT GATGGGCACC CGGCTGACTT ATATAGCTAC CGGATAAAGA TTGAAGACCA 2220 CCCGTATGTA TCACGTGATT TCAAATACGG AGCAACTCCT AACCGTACAA TACCTGTCGC 2280 CATGGGGGTA GATGGTGTAC GCCATGTAGA AGCACCTTTA ACGTTTGACA ATGATGTAAG 2340 CGTGTACTCC CTGCATGTAA CTGGTCTGGA ATACGATGGC ACACAACAGT CTGCCGTGCG 2400 TGCACGGTTT GATGGTGATT ACGGGCTGAT TTCAAAAACA GTCCCGACTA AAACCCCATC 2460 GAGGCAAAGA CTGATAGTTA GCGGTGGTGA CGGCGCATCC AGCTCCGATG GTGCATTGCT 2520 ACAACTGTAC GGGTCGAACC ATGCAACGCC TAACAGGGCT ATTATGTATG CGTCAGGAGG 2580 CTTCTACTCA TACAACAATT TCCTTCCTTA CTTAGACTCG CAAGTGTCTT TAGGTTCGGC 2640 AAGTAACAGG TGGACTACGG TGTACGCGAC CACCGGTACG ATAAACACGT CTGATGGTAC 2700 ACTTAAGACG AACAAAGAGG AAATTGAGGA ACAACTCCTT ACCGCATGGG AAGATATACA 2760 TGTAATATCT TTTAAGTGGC TTGAAAGCCT AGCAATCAAG GGTGACACTG CAAGGATACA 2820 CTTCGGTGTG ATAGCCCAAG ATGTGCGAGA CATCTTGGTC AAACATGGGC TTATGGAGAA 2880 AGATTCTACC GATTGTAAAT ATGCTTTCTT GTGCTACGAC TCAATTGAAG CTGCGTATGA 2940 TATTGATGAA TATGGCCAGA CTGTACAAGT ATCCCCTCCC GGCGGCAGAT GGGGGGTTAG 3000 GGCGGACCAG ATGTTCTTCA TAGAGATTGC GTATCAGCGT AAGAAGATGC GCGAGTTCGA 3060 GAAGAGGCTG GCGGCACTAG AAGATAAATA AAACTAAGGC CCCTAACGGG GCCTTTTCTC 3120 TACTCTTCTG ATAACTTCTC CAGTACAAAC GCCAGTTGCG CATTAGCGGC ATCTCTTTGC 3180 TGCCGTA 3187
【図１】 形質転換株エシュリヒア・コリＤＨ５α（pS
D18)のプラスミドｐＳＤ１８の制限酵素切断地図であ
る。
D18)のプラスミドｐＳＤ１８の制限酵素切断地図であ
る。
【図２】 菌体濃度と時間との関係を示すグラフであ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 増田 美奈 愛知県名古屋市瑞穂区須田町２番56号 日 本碍子株式会社内 (54)【発明の名称】 プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する微生物並びにその微生物を用いた エンドシアリダーゼの製造方法並びにそのエンドシアリダーゼを用いたシアル酸トリマーの製造 方法
Claims (12)
- 【請求項１】 宿主にエンドシアリダーゼ生産能を与え
るプラスミドであって、その制限サイトのＳｍａＩサイ
トにバクテリオファージのエンドシアリダーゼ生産に関
与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を組み込んだプラスミ
ド。 - 【請求項２】 プラスミドのベクターがエシュリヒア(E
scherichia) 属に属する微生物内で複製機能を有するベ
クタープラスミドのＤＮＡである請求項１に記載のプラ
スミド。 - 【請求項３】 プラスミドのベクターがｐＵＣ１８プラ
スミドのＤＮＡである請求項１に記載のプラスミド。 - 【請求項４】 組み換え体プラスミドがｐＳＤ１８プラ
スミドである請求項１に記載のプラスミド。 - 【請求項５】 宿主がエシュリヒア(Escherichia) 属に
属する微生物である請求項１に記載のプラスミド。 - 【請求項６】 エンドシアリダーゼ生産能を与えるバク
テリオファージの染色体ＤＮＡ断片を制限酵素を用いて
調製すること、前記染色体ＤＮＡ断片のエンドシアリダ
ーゼ生産能に関与する遺伝情報を妨害しない制限酵素を
用いてプラスミドのベクターを制限すること、制限され
た前記プラスミドＤＮＡの制限サイトのＳｍａＩサイト
に前記染色体ＤＮＡ断片を組み換えること、及び組み換
えられたプラスミドを抽出することからなるエンドシア
リダーゼ生産に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を組
み込んだプラスミドの調製方法。 - 【請求項７】 エンドシアリダーゼの生産能に関する遺
伝子ＤＮＡをエシュリヒア(Escherichia) 属に属する微
生物内で複製機能を有するベクタープラスミドに連結し
た組み換え体プラスミドで形質転換されたエシュリヒア
(Escherichia) 属に属する微生物。 - 【請求項８】 エンドシアリダーゼの生産能を有するエ
シュリヒア・コリＤＨ５α（pSD18)〔Escherichia coli
ＤＨ５α（pSD18)〕である請求項７に記載の微生物。 - 【請求項９】 請求項７に記載の微生物を培地中に培養
して培養物中にエンドシアリダーゼを蓄積せしめ、該培
養物からエンドシアリダーゼを採取することを特徴とす
るエンドシアリダーゼの製造方法。 - 【請求項１０】 微生物がエシュリヒア・コリＤＨ５α
（pSD18)〔EscherichiacoliＤＨ５α（pSD18)〕である
請求項９に記載のエンドシアリダーゼの製造方法。 - 【請求項１１】 請求項９で得られたエンドシアリダー
ゼを用いてα−２，８シアル酸オリゴマーよりシアル酸
トリマーを生産することを特徴とするシアル酸トリマー
の製造方法。 - 【請求項１２】 微生物がエシュリヒア・コリＤＨ５α
（pSD18)〔EscherichiacoliＤＨ５α（pSD18)〕である
請求項１１に記載のシアル酸トリマーの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9186092A JPH10327873A (ja) | 1996-09-20 | 1997-07-11 | プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する微生物並びにその微生物を用いたエンドシアリダーゼの製造方法並びにそのエンドシアリダーゼを用いたシアル酸トリマーの製造方法 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25034796 | 1996-09-20 | ||
| JP8014697 | 1997-03-31 | ||
| JP8-250347 | 1997-03-31 | ||
| JP9-80146 | 1997-03-31 | ||
| JP9186092A JPH10327873A (ja) | 1996-09-20 | 1997-07-11 | プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する微生物並びにその微生物を用いたエンドシアリダーゼの製造方法並びにそのエンドシアリダーゼを用いたシアル酸トリマーの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10327873A true JPH10327873A (ja) | 1998-12-15 |
Family
ID=27303226
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9186092A Pending JPH10327873A (ja) | 1996-09-20 | 1997-07-11 | プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する微生物並びにその微生物を用いたエンドシアリダーゼの製造方法並びにそのエンドシアリダーゼを用いたシアル酸トリマーの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10327873A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013010660A1 (en) * | 2011-07-15 | 2013-01-24 | Medizinische Hochschule Hannover (Mhh) | Enzymes having alpha2,9 endosialidase activity |
| CN112795583A (zh) * | 2020-11-16 | 2021-05-14 | 上海大学 | 重组唾液酸外切酶的制备方法、表达基因、重组表达载体及构建方法 |
-
1997
- 1997-07-11 JP JP9186092A patent/JPH10327873A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013010660A1 (en) * | 2011-07-15 | 2013-01-24 | Medizinische Hochschule Hannover (Mhh) | Enzymes having alpha2,9 endosialidase activity |
| CN112795583A (zh) * | 2020-11-16 | 2021-05-14 | 上海大学 | 重组唾液酸外切酶的制备方法、表达基因、重组表达载体及构建方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20030328 |