JPH02265492A - シグナル配列及びそれを含むｄｎａ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、新規なシグナル配列及びそれを含むＤＮＡ
配列に関する。

［従来の技術］ 今日、多種の微生物を利用し、産業上有用な物質を効率
良くまた多量に生産することが可能となってきた。とり
わけ、大腸菌を用いた系は５強力なプロモーター系、正
確な制御系、さらには多くの種類の宿主系が確立され、
微生物由来の遺伝子をはじめとし、植物、動物に至る遺
伝子まで発現制御することが可能となってきている。し
かしながら、大腸菌は、細胞内膜の外側に細胞壁、さら
にその外側に莢膜と呼ばれる膜を有し、それら３重の構
造を有するため、分泌されるタンパク質も莢膜と内膜の
間にあるペリプラズム層に蓄積される。そのため、蓄積
される量も物理的に制限を受ける。また、ペリプラズム
層に蓄積されたタンパク質を取り出す場合、菌体な物理
的又は生物的方法で破砕し、抽出するという非常に複雑
な工程を必要とする。この場合、タンパク質が機械的障
害又は酵素的障害を受は活性を失うおそれがあり、必ず
しも高い回収率は達成できない。

また、動物由来のタンパク質（例えばインターフェロン
、ヒト成長ホルモン等）を大腸菌で機能するプロモータ
ーの下流に連結し、発現を行なわせた場合、多（の場合
そのタンパク質は細胞質中に不溶性顆粒として形成され
、活性を持たない不溶物として形成される。この場合も
先の場合と同様に物理的又は生物的方法により菌体を破
砕し不溶画分として、目的タンパク質を集めなければな
らない、また、大腸菌以外のタンパク質の発現であるた
め動物中では可溶性タンパク質にも関わらず大腸菌内で
は不溶性かつ不活性型として取り出される。そのため、
活性を持つ正しい三次構造のタンパク質に変性剤を用い
て再構築しなければならない、それら一連の方法は非常
に煩雑であり、実用上は不向きである。また、他の微生
物（例えば枯草菌、酵母、カビ等）を用い生産物を菌体
外に分泌させ、活性型として取り出す方法等が研究され
ているが、発現量が低いとか、宿主菌によるタンパク質
分解酵素により分解され失活するといった問題点を有し
ている。また、動物細胞による分泌発現の系も多（研究
されているが微生物に比べ増殖能が非常に低く、大量に
タンパク質を必要とする場合不向きである。

タンパク質の分泌には、いわゆるシグナルペプチドが関
与することが知られている。シグナルペプチドは、成熟
タンパク質のＮ末端側に付加されたアミノ酸配列であっ
て、通常、そのＮ末端付近は塩基性アミノ酸に富み、中
央付近は疎水性アミノ酸に冨む、約２０アミノ酸から成
るペプチドである。シグナルペプチドは、タンパク質が
膜を通って分泌される際に切断除去される。従って、高
活性のシグナルペプチドが所望の成熟タンパク質のＮ末
端に付加されていれば、所望のタンパク質を効率良（分
泌させることができ、菌体の破砕や変性剤による活性化
が不要となり、また、タンパク質の精製が容易となり有
利である。

現在の技術では、宿主の種類等により、適当なシグナル
ペプチドを選択して使用しなければならないという問題
点を有している。このことは即ち、目的物の分泌生産を
種々の宿主で実現する場合には、それら宿主内で働く種
々のシグナルペプチドをコードする配列を準備し、プラ
スミドを構築しなければならないことを意味している。

［発明が解決しようとする課題］ 従って、この発明の目的は、少なくともバチルス属細菌
及び大腸菌に、活性型の所望のタンパク質を菌体外に分
泌生産させるために利用することができるシグナルペプ
チドをコードするシグナル配列を提供することである。

［課題を解決するための手段］ 本願発明者らは、高い分泌能を持つバチルス属細菌に着
目し、とりわけ高頻度で分泌されるタンパク質を選び出
して鋭意研究した結果、少な（ともバチルス属細菌内及
び大腸菌内で産生されたタンパク質を菌体外に効率良く
分泌させるシグナルペプチド及び該シグナルペプチドを
コードするシグナル配列を見出し、さらに該シグナル配
列を有するプラスミドを構築し、これを用いて所望のタ
ンパク質を菌体外分泌させることに成功し、本発明を完
成した。

すなわち１本発明は、少なくともバチルス属細菌内及び
大腸菌内で生産されたタンパク質を菌体外へ分泌させる
シグナルペプチドをコードするシグナル配列を提供する
。

［発明の効果Ｊ 本発明により、少なくともバチルス属細菌又は大腸菌に
所望のタンパク質を分泌生産させることができるシグナ
ル配列が提供された。所望の成熟タンパク質をコードす
る構造遺伝子の上流に本発明のシグナル配列を有するＤ
ＮＡ配列を含むプラスミドを用いてタンパク質を生産す
ると、該タンパク質が菌体外に効率的に分泌されるので
、菌体を破砕する必要がなくなり、その結果、タンパク
質が障害を受けることがなくなる。また、生産された所
望のタンパク質の精製も容易である。

［発明の詳細な説明］ 上述のように、シグナルペプチドは菌体内で産生された
タンパク質を菌体外に分泌する機能を有し、従来より種
々のものが知られている０本発明のシグナルペプチドは
、少なくともバチルス属細菌及び大腸菌の両方において
機能するものである。このようなシグナル配列は、バチ
ルス属細菌の耐熱性中性プロテアーゼのシグナル配列に
見出すことができ、下記実施例においてはバチルス・ス
テアロサーモフィルスの耐熱性中性プロテアーゼ工Ｍの
シグナル配列を採用しているがこれに限定されるもので
はない、好ましいシグナルペプチドの例としてＭｅｔ−
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−１）ｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−
Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−＾
１ａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａを挙げることができ、こ
れをコードする配列としてＡＴＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡ
ＴＧＡＡＡＡＴＧＡＡＡＴＴＡＣＧＡＴＣＧＴＴＴＧＧ
ＴＧＴＴＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＴＡＧＣＧを挙げること
ができる。

シグナル配列の下流には、所望の成熟ポリペプチドをコ
ードする構造遺伝子が存在する。構造遺伝子は、いかな
る所望のタンパク質をコードするものであってもよ（、
その由来もヒトその他の動植物及び微生物等いずれのも
のであってもよい、原核生物由来の構造遺伝子は染色体
ＤＮＡから直接分離したものをそのまま用いることがで
きるが、真核生物の構造遺伝子は介在配列を有するので
、先ずｍＲＮＡを回収し、それと相補的なｃＤＮＡを調
製して用いることが好ましい、下記実施例においては、
この構造遺伝子は、バチルス・ステアロサーモフィルス
由来の耐熱性中性プロテアーゼ旺す又はヒトウロキナー
ゼであるが、これらに限定されるものでないことは言う
までもない。

上記シグナル配列と構造遺伝子とは直接つながっていて
もよいが、その間にいわゆるプロ構造をコードする配列
（以下プロ構造コード配列と言う）が存在することが好
ましい、プロ構造は、その明確な機能は明らかにはなっ
ていないが、従来よりタンパク質、特にタンパク質分解
酵素の分泌に関係することが知られており、いくつかの
タンパク質分解酵素のプロ構造が知られている０本発明
のプラスミドにおけるプロ構造は、特に限定されないが
、バチルス属細菌の耐熱性中性プロテアーゼ由来のもの
であってよく、下記実施例のプラスミドは、バチルス・
ステアロサーモフィルスの耐熱性中性プロテアーゼエｌ
ｌ由来のプロ構造コード配列を有する。プロ構造及びプ
ロ構造コード配列の一例が図１に示されている。

本発明のシグナル配列は、常法により化学合成すること
によっても調製することができるし、本発明のシグナル
配列を含む天然の染色体ＤＮＡから切り出してくること
もできる。後述の実施例においては、本発明のシグナル
配列は、バチルス・ステアロサーモフィルスＭＫ−２３
２株（微工研菌寄第９６４５号）の染色体ＤＮＡから得
られたものである。

本発明のシグナル配列は、従来と同様の態様により、所
望のポリペプチドを高効率に生産するために用いること
ができる。すなわち、本発明のシグナル配列及び必要に
よりその下流に位置するプロ構造コード配列、並びにシ
グナル配列（又はプロ構造コード配列）の下流に位置す
る所望のポリペプチドをコードする構造遺伝子、該シグ
ナル配列の上流に位置するプロモーター配列及びその下
流に位置するＳＤ配列、前記構造遺伝子の下流に位置す
るターミネータ−並びに宿主細胞内で複製するための複
製開始点、さらには好ましくは形質転換株を選択するた
めの、薬剤耐性や栄養要求性のような選択マーカーを有
するプラスミドを構築し、このプラスミドで枯草菌のよ
うなバチルス属細菌や大腸菌を常法により形質転換し、
形質転換株を培養し、培養物又は国体から所望のポリペ
プチドを回収することにより、所望のポリペプチドを生
産することができる。このようなプラスミドは、例えば
ｐＵＢｌｌＯ及びｐＴＢ５３のような市販の発現ベクタ
ーに本発明のシグナル配列及び所望のポリペプチドをコ
ードする構造遺伝子を常法により組み込むことにより得
ることができ、このような方法は例えばＴ、　１Ｊａｎ
ｉａｔｉｓら、”ＭｎｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、
　　　Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”（
１９８２１，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒや
、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　　
６８巻、１９７９に詳しく記載されている。

以下、この発明を実施例に基づきより具体的に説明する
。なお、下記実施例においては、各配列の具体的な塩基
配列やアミノ酸配列が示されているが、一般に、特定の
生理活性を有するペプチドは、そのアミノ酸配列を構成
するアミノ酸のうち少数のアミノ酸が置換され、欠失し
又は少数のアミノ酸が付加された場合であっても実質的
に同一の機能を果たす場合があることは当業者において
広（認識されているところである。従って、下記実施例
において具体的に示されるアミノ酸配列又は塩基配列と
は少数のアミノ酸又は塩基が置換され、欠失し又は付加
されている点において異なるが実質的に同一の機能を果
たすものは下記実施例において具体的に開示されたアミ
ノ酸配列又は塩基配列と実質的に同一のものであると解
釈すべきであり、このような具体的な配列が記載された
特許請求の範囲もそのような実質的に同一の配列を包含
するものと解釈する。

１皿里」 ｆｌ）　ＭＫ−２３２株染色体ＤＮＡの調製耐熱性中性
プロテアーゼ旺１（同一出願人による特願昭６２−２５
３７４９号に記載）を含むバチルス・ステアロサーモフ
ィルスＭＫ−２３２株（ＭｏｔｏｋｉＫｕｂｏ、にｅｉ
ｉｃｈｉ　Ｍｕｒａｙａｍａ、　Ｋｏｊｉ　５ｅｔｏ及
びＴａｄａｙｕｋｉ　Ｉｍａｎａｋａ、　Ｊ、　Ｆｅｒ
ｍｅｎｔ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、　　６６巻、１号、ｐｐ
、１３−１７　１９８８％”ＨｉｇｈｌｙＴｈｅｒ＋ｍ
ｏｓｔａｂｌｅ　Ｎｅｕｔｒａｌ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　
ｆｒｏｍ　Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ、微工研菌寄第９６４５号）を１００　ｍ
ｌのし培地を含む５００　ｍｌ容量フラスコ中で一夜５
５℃で培養した。遠心集菌後、２０ｍ１のＴＥ緩衝液（
１０ｍＭ）リス、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，５１
で洗浄し、次いで６ｍｌの１５％５％シボＳＯ５ｍＭ　
）リス（ｐＨ８，５１−５０ｍＭ　ＥＤＴＡ−１ｍｇ／
ｓｉ１リゾチームに懸濁し、水中で３０分間静置した。

これに６ｍｌの２％ザルコシルー５０■ｌトリス（ｐＨ
８，５１−５０ｍＭ　ＥＤＴＡを添加し、室温で約１５
分間放置して完全に溶菌させた０次いで５０ｍ１容量フ
ラスコにＣｓＣ１）１ｇを入れ、さらに前記溶菌液１２
ｍ１を加えた。その後１０　ｍｇ／＋１のエチジウムブ
ロマイド液０．６　ｍｌを加えた。この液を２本の遠心
管に分注し、ＰＲ６５Ｔローター（日立製作新製）で超
遠心場で分離した。超遠心終了後、ＤＮＡ画分を注射針
で抜き取り、ｎ−ブタノールで３回抽出を繰り返してエ
チジウムブロマイドを除去した。このＤＮＡ試料を１０
ｍＭ）リス（ｐ）Ｉ　７．５１−０．Ｉ　ｎ＋ｌＪ　Ｅ
ＤＴＡ中で透析し、４℃で保存した。

（２）制限酵素処理・リガーゼ処理 枯草菌を宿主として複製維持できるベクタープラスミド
ｐＴＢ５３　　（文献：命中ら、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１４６巻、１０９１頁、１９
８１年；命中ら、Ｊ。

Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１３０巻、１３９９
頁、１９８４年）を常法により調製した。このｐＴＢ５
３及び上記のようにして調製したバチルス・ステアロサ
ーモフィルスＭに一２３２株染色体ＤＮＡを制限酵素Ｐ
ｓｔＩでそれぞれ完全分解した０反応条件は次のとおり
であった。

Ｐｓｔ　Ｉ緩衝液（１０Ｉｌ１Ｍトリス（ｐＨ７，４１
−１０ａ＋ＭＭｇＣ１ｓ　−５０ｍｕ　ＮａＣ１−１ｉ
Ｍジチオスレイトール）の１０倍ｉ１）縮液を使用する
（１０　ｘ　ＰｓｔＩ緩衝液）。

１）Ｍに−２３２ＤＮＡ　　　　　　　　　　３０　　
μ１）０　ｘ　Ｐｓｔｌ緩衝液　　　　　　　　１０μ
ｍウシ血清アルブミン（５ｍｇ／ｓｌｌ　　　　２　　
ｕ　１蒸留水　　　　　　　　　　　　　５６　　μｌ
温Ｉ　　　　　　　　　　　　　　２　μ１ｉｉ） ｐＴＢ５３　　　　　　　　　　　　　２０　　μ１）
０　ｘ　Ｐｓｔｌ緩衝液　　　　　　　　ｔｏｕｔウシ
血清アルブミン（５ｍｇ／ｍｌｌ　　　　２　　ｕ　ｌ
蒸留水　　　　　　　　　　　　　６６ｕｌ脆Ｉ　　　
　　　　　　　　　　　２　μ１）反応３７℃で９０分
間行なった。

２種のＤＮＡを混合し、５Ｍ酢酸ナトリウムを加え、そ
の後エタノールを０．４５　ａｌｌ加えて１０〜１５分
、２０℃放置後、遠心して上演を捨てた。沈殿をエタノ
ールで洗って脱水、脱塩し、デシケータ−で乾燥した。

乾燥物に１０　ｘ　　リガーゼ緩衝液（６６０＋＋＋Ｍ
トリス（ｐＨ７，６１６６ｍＭＭｇＣｌｔ）　　５μｌ
、１）００ＩＩＩジチオスレイトール５μｌ　、　１０
　ｍＭ　ＡＴＰ　５μｍ％蒸留水３４μｌを加えて混合
した後、ＤＮＡリガーゼ１μｌを加え、４℃、１６時間
保った。これを次の形質転換に用いた。

（３）コンピテントセルの調製 バチルス・サチルスＭＴ−２株（文献：藤井ら、Ｊ、　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５４巻、８３１頁、　１９８
３年）をＬ培地で３７℃、−後培養した培養液を、ＴＦ
−１（Ｓｐｉｚｉｇｅｎ’ｓ　５ａｌｔ　ｘ　１０　（
ＮＨ４）ＳＯ４２％、Ｋ、ＨＰＯ４１４％、ＫＨ，Ｐｏ
、　６％、クエン酸ナトリウム１％）２ｍｌ、２％カザ
ミノ酸０．２　ｍｌ、　１　ｍｇ／ｍｌアミノ酸液１ｍ
酸液１留ｌ！４．８．ｎ＋１　、５％グルコース＋０．
２％Ｍｇ５Ｏ，２ａｌｌに植え、３時間４５分振盪培養
し、ＴＦ−２（１０ｘ　Ｓｐｉｚｉｇｅｎ’ｓ　５ａｌ
ｔ　３．６　ｍｌ　、　２％カザミノ酸０．１８　ｍｌ
　、７Ｊｇ留水２８．４４　ｍｌ、５％グルコース＋０
．２％ＭｇＳＯ４３，６ｍｌｌ　に植え、１時間３０分
振盪培養し、コンピテントセルを得た。

（４）耐熱性中性プロテアーゼのクローニング前記（２
）のＤＮＡ溶液４０ｕｌと１ｍｌのコンピテントセルを
混合し、３７℃、３０分激しく撹拌した。これを遠心後
、３ｍｌのＬ培地を加え、３７℃、２時間穏やかに撹拌
した。そのＯ，１ｍｌを１％カゼインと共にテトラサイ
タリン（２０μｍ７ｍ１）又はカナマイシン（５μｌ／
ｍｌ）を含むＬＡプレートにまいた。このプレートを１
６時間、３７℃に保ち、ハローを形成するコロニーを取
得した。このようにして得られた形質転換株をバチルス
・サチルスＭＴ−２／ｐＴＺ２３２と命名した。バチル
ス・サチルスＭＴ−２／ｐＴＺ２３２は昭和６１年９月
３０日付で微工研に微工研菌寄第８９８２号として寄託
されている。バチルス・サチルスＭＴ−２／９ＴＺ２３
２を培養して常法によりプラスミドＤ　Ｎ　Ａ　、　ｐ
ＴＺ２３２を得た。このプラスミドの制限酵素開裂部位
を図２に示す。

（５）耐熱性プロテアーゼ構造遺伝子及びその近傍の全
塩基配列の決定 プラスミドｐＴＺ２３２から旧ｎｄＬＩＩ　−ＰｓｔＩ
断片を切り出し、ジデオキシ法によりその全塩基配列を
決定した。結果を図１に示す。

（６）プロモーター配列の同定 プラスミドｐＴＺ２３２の転写開始点を８１マツピング
法により同定した。すなわち、プラスミドｐＴ２２３２
から旧ｎｄｍ　−ＢａｍＨＩ断片を公知の方法で分離し
、ＢａｍＨＩ　５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用い、［γ−”ＰＩＡＴＰでラベルした。この断
片と、公知の方法で分離した旺す遺伝子の−ＲＮＡを含
むＲＮＡ画分をパイプリダイズした。

これをＳｌヌクレアーゼ処理し、Ｇｉｌ＋＋＋ａｎとＣ
ｈａｎ＋ｂｅｒｌｉｎ　ｆｃｅｌｌ　３５巻、ｐＰ、　
２８５−２９３．１９８３１記載の方法に従い、転写開
始点を決定した。その結果１図１に示すＴ（−１０領域
から１）塩基対下流）から転写されることが明らかとな
った。従って、この転写開始点より上流がプロモーター
配列であり、検索を行なったところ、工Ｔ　（Ｊ　。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６３巻、ｐｐ、　８２４−８
３１．１９８５１と非常によく似たプロモーター配列を
見出すことができた０図１に示されるように、このプロ
モーターの一３５領域はＴＴＴＴＣＣｌ−１０領域はＴ
ＡＴＴＧＴであり、その間の塩基数は１８塩基でありた
。

（７）ＳＤ配列の同定 （６）で決定した転写開始点の下流で、かつＡＴＧ（Ｍ
ｅｔｌ以下のオーブンリーディングフレームの上流で、
ＳＤ配列の検索を行なったところ、ＧＡＡＡＡＧＧから
成るＳＤ配列が見出された。なお、ＳＤ配列の検索は、
常法に基づき、コンセンサス配列及び従来報告されてい
るＳＤ配列の比較により行なった。

（８）シグナルペプチドコード配列の同定図１に示す塩
基配列を基にアミノ酸配列を推定したところ、唯一のオ
ーブンリーディングフレームが見出された。その結果、
図１に示すように、　ＡＴＧ　（Ｍｅｔｌから１９アミ
ノ酸から成るシグナル配列が見出された。なお、シグナ
ルペプチドのアミノ酸配列は種によって大きく異なるが
、般的に。

Ｍｅｔ−塩基性アミノ酸−疎水性アミノ酸−Ａｌａ二Ａ
ｌａ↓ （又はＡｌａ　−Ｘ−Ａｌａ）　（↓は切断点を示す）
で表わされる約２０アミノ酸から成ることがわかってい
る。

（９）プロ構造配列の同定 バチルス・ステアロサーモフィルスの菌体外に分泌され
る耐熱性プロモ−ターｌｌを、’　Ｔ！ｌ＋Ｋｇｅｌ−
Ｇ３０００ＳＷ及びＴＳＫ　ｇｅｌ−Ｇ２０００ＳＷ　
　（東ソー株式会社製ゲルろ適用担体）によるクロマト
グラフィーにより精製した。その精製したタンパク質を
エドマン分解し、全自動シークエンサーによりそのＮ末
端部分のアミノ酸配列を同定した。その結果、　ｌｌ５
−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−３ｅｒが同定され、　Ｉｌ
ｅ以降が成熟タンパク領域であり、それ以前がシグナル
配列までプロ構造であることが同定された。

支五里ユ 耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドの小型
化 上記（４１で得られたプラスミドｐＴＺ２３２を２０ユ
ニットの制限酵素Ｂｇｌ　ＩＩで切断後１％アガロース
電気泳動にかけ分子量の大きいバンドのゲルを切り取っ
た。このゲル中のＤＮＡをＧＥＮＥ　ＣＬＥＡＮ（フナ
コシ）を用いて回収するとＢｇｉ　ｎ断片が得られた。

得られたＢｇｌ　ＩＩｎ断片上記（２）の方法によりＤ
ＮＡリガーゼを用いライゲーションを行ない、プラスミ
ドｐＴＺ２３２を小型化した（図３）。得られたプラス
ミドをプラスミドｐ７２２３２８ｇと命名した。

ｐＴＺ２３２の制限酵素地図を図４に示す。

上記（３）で示したコンピテントセル調製に従い、プラ
スミドｐＴ２２３２Ｂｇを用いてバチルス・サチルスＭ
ｔ−２を形質転換した。このプラスミドを持つＭｔ−２
株は小型化前のプラスミドと同様、耐熱性中性プロテア
ーゼの生産を効率良（行なった。

１五■ユ 大腸菌における発現 図２に示した、プロモーター配列を含む５ａｉｌ−Ｐｓ
ｔＩ断片の大きい方を実施例２で示した方法により回収
した。大腸菌中で複製可能なプラスミドｐＵｃ１９を立
Ｉ及びｐｓＴＩで切断後、上記江Ｉ−ＰｓｔＩ断片を実
施例１（２）で示した方法により連結した。該組換えプ
ラスミドを大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造
（株））に常法により形質転換した。得られた形質転換
株をＬ培地で３７℃、１６時間培養した。菌体を集菌後
、培地中のプロテアーゼ活性を測定したところ、５００
　Ｕ　／ｍｌのプロテアーゼ活性が培地中に分泌されて
いた。このように本発明のシグナル配列は枯草菌のみな
らず大腸菌中においても効率良く異種タンパク質を分泌
させた。

１立ＪＬ４ ヒトウロキナーゼの分泌生産 図２に示す、シグナル配列を含む断片である胎旧−■１
■断片及びＡａｔｌ−ＰｓｔＩ断片を抽出した。ウロキ
ナーゼ構造遺伝子はＢ５ｊ　Ｈ−Ａ、ａｔＩｆＡｇｒｉ
ｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｒ＠、、　５２巻、３２９−
３３６．　１９８８１として抽出した。これらの断片と
ベクターとしてｐＴＢ５３のＰｓｔｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ
で切断したものとを実施例１（２）に示した方法により
連結した（図５）、このようにして得られた組換えプラ
スミドを実施例１（３）で示した方法により形質転換し
た。得られた組換え菌をＬ培地で３７℃、２４時間培養
した。菌体を集菌後、培地中のウロキナーゼ活性を測定
した。その結果、培地１＋ｍｌ当たり３０００　Ｕ／ｍ
ｌの酵素活性を示した（ウロキナーゼの活性測定はＳ−
２４４４合成基質活性測定法（）（ＢｙＢｓｈｉ、　Ｓ
ら、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、　２２巻、５７３−５７
８．１９８１に従い測定した。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明のシグナル配列及びプロ構造コード配列並
びにその上流のプロモーター配列及びＳＤ配列並びにそ
の下流の耐熱性中性プロテアーゼ構造遺伝子を含む領域
の塩基配列並びにそれによってコードされるアミノ酸配
列を示す図、 図２は本発明のシグナル配列の１実施例を含むプラスミ
ドであるｐＴＺ２３２の制限酵素地図、図３はｐＴＺ２
３２を小型化しテｐＴＺ２３２Ｂｇを作製する工程を示
す図、 図４はｐＴ２２３２８ｇ）制限酵素地図、図５は、ヒト
ウロキナーゼをコードする、本発明の１実施例のシグナ
ル配列を含むプラスミドｐＭＫ４の制限酵素地図である
。 ＧｌｙＬｙｓＡｓｐＴｈｒ６１ｕＰｈｅＶａｌＶａ１丁
ｙｒＶａｌＡｓｎＧｌｙＡｓｐＧ１ｕＡｌａｓｅｒＬｅ
ｕＡｌａＴｙｒＶａｌＶａｌＡｓｎｌｅｕＡｓｎＰｈｅ
ｙＶａ ＴｙｒＡｓｎＡｒｇＬｅｕＡ　１ａＳｅｒＴｈｒＧｌ　
ｕＨｉ　ｓＶａ　１ＴｈｒＴｒｐＡｓｒｆ；ｌ　ｎＧｉ
ｎｐｈｅＧｌｎＴｈｒＰｒｏＧｌ　ｎＰｈｅＩ　１ｅＳ
ｅｒＧｌｙＡｓｐＡｒｇＬａＩＬｙｓＶａ　１ＡｓｎＧ
ｌ　ｙＴｈｒＳｅｒＰｒｏＧｌ　ｕＧ　１ｕＬｅｕＶａ
ＩＴｙｒ（ｌ＋１ｎＴｙｒＶａｌＧ１ｕＪｙＪｓｎＧ　
１ｕＡｓｎＬｙｓＰｈｅＬｙｓ１）ｅＴｈｒＧｌｙＴｈ
ｒＳｅｒＴｈｒＶａｌＧｌｙＶａｌＧｌｙＡｒｇＧｌｙ
ＶａｌＬｅｕＧｌｙＡｓｐＧｌｎ　ＬｙｓＡｓｎＩｌａ
ＡｓｎＴｈｒＴｈｒＴｙｒＳｅｒ丁ｈｒＴｙｒ“ｒｙｒ
丁ｙｒＬｅｕＧｌｎＡｓｐＡｓｎＴｈｒＡｒｇＧｌｙＡ
ｓｎＧｌｙｌｌｅＰｈｅＴｈｒＴｙｒＡｓｐＡ　ｌａＬ
ｙｓＴｙｒＡｒｇＴｈｒＴｌｕ−ＬｅｕＰｒｏＧ　１ｙ
ＳｅｒＬｅｕＴＰｈｅ）ＩｉｓＧｌｕＡｓｎＡｌａＬｙ
ｓＡｓｐＴｈｒＬｅｕＧ１ｎＬｅｕｌｙｓＧ１ＳｅｒＴ
ｙｒＡｓｐＡｌ　ａＰｒｏＡｌａＶａｌＡｓｐＡ　ｌ　
ａＨｉ　５ＴｙｒＴｙｒＡ　ｌ　ａＧｌｙＶａｌＴｈｒ
ＴｙｒＡｓｐＴｙｒＴｙｒＬｙｓＡｓｎＶａＩ　Ｈｉ　
５ＡｓｎＰｈｅＧｌｒ＋ＧＩｎＴｈｒＴｙｒＬｙｓＧｌ
ｙＴ　１ｅＰｒｏＶａｌＰｈｅＧｌｙＧｌｎＶａ１Ａｒ
ｇＬｅｕｓｅｒＴｙｒＡｓｐＧｌ　ｙＡｓｎＡｓｎＡｌ
ａＡ　ｌ　ａＴ　ｌ　ｅＡｒｇＳｅｒＳｅｒＶａｌＨｉ
　５ＴｙｒＳｅｒＧ　１　ｎＧ　１ｙＴｙｒＡｓｎＡｓ
ｎＡ　ｌ　ａＰｈｅＡ　ｌ　ａＬｅｕＳｅｒ（；　１　
ｙＴｈｒＡｒｇ　Ｉ　ＬｅＰｒｏ　Ｉ　１ｅＰｒｏＡｓ
ｎＬｅｕＡｓｐＴｈｒＬｙｓＧｌｙｓｅｒＬｅｕｌｙｓ
ｓａ（ｉ　１ｙＬｙｓＬｙｓＬｅｕｓｅｒＶａｌ　Ａ　
Ｉ　ａＨｉ　ｓＧＩ　ｕＬｅｕＴｈｒＨ１ｓＡｌａＶａ
ｌＴｈｒＡｓｐＴｙｒＴｈｒＡ　１ａＧ１　ｙＬｅｕ　
＋１　ｅＴｙｒＧ　１ｒｕｌＬｓｎＧｌｕｓｅｒＧ　Ｉ
ｙＡ　ｌａ　ｌ　ｌ　ｅＡｓｎＧ　ｌ　ｕＡ　ｌａ　Ｉ
　ｌ　ｅＳｅｒＡｓｐ　ＩＩ　ｅＰｈｅＧｌｙＴｈｒＬ
ｅｕＶａ　ＩＧ　１ｕＰｈｅＴｙｒＡ　ｌ　ａＡｓｎ　
ＬｙｓＡｓｎＰｒｏＡｓｐＴｒｐＧｌ　ｕ　＋１　ｅＧ
　ｌ　ｙＧｌｕＡｓｐＶａｌＴｙｒＴｈｒＰｒｏＧｌｙ
ｌ　１ｙｒＧｌｙＡｓｐＰｒ。 ＡｓｐＨｉ　ｓＴｙｒＳｅｒＬｙａＡｒｇＴｙｒＴｔｕ
（；　ｌ　ｙＴＩｕ（ｉ　１　ｎＡｓｐＡｓｎＧ　ｌ　
ｙＧ　１ｙＶａｌ　）Ｉ　ｉｓ　Ｉ　ｌ　ｅＡｓｎｓａ
（；　ｌｙＩ　１ｅ１）　ｅＡｓｎＬｙｓＡ　１　ａＡ
　１ａＴｙｒＬｅｕ　Ｉ　１　ｅｓｅｒＧｌ　ｎＧ１　
ｙＧ　１ｙＴｈｒＨｉ　５ＴｙｒＧＩ　ｙＶａｌ　Ｓｅ
ｒＶａｌＶａｌ　Ｇｌ　ｙ　Ｉｆ　ｅＧ　ｌｙＡｒｇＡ
ｓｐＬｙｓＬｅｕＧ　Ｌｙｓ００ 図４ Ｌｙｓ　Ｉ　ｌ　ｅＰｈｅＴｙｒＡｒｇＡｌ　ａＬｅｕ
ＴｈｒＧ　１ｎＴｙｒＬｅｕＴｈｒＰｒ。 Ｇｌ　ｎＳｅｒＡ　ｌ　ａＴｈｒＡｓｐＬｅｕＴｙｒＧ
ｌ　ｙｓｅｒＴｈｒＳｅｒＧ　ｌ　ｎＧ　１　ｕＶａ　
ＩＡ　１　ａＳｅｒＶａｌムｄ■ｎＡｌａＰｈｅＡｓｐ
ＡｌａＶａｌＧｌｙ図１ （ぞの３） 図５ ｈｂ

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくともバチルス属細菌内及び大腸菌内で生産
   されたタンパク質を菌体外へ分泌させるシグナルペプチ
   ドをコードするシグナル配列。
2. （２）バチルス属細菌の耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子
   由来のものである請求項１記載のシグナル配列。
3. （３）バチルス・ステアロサーモフィルスの耐熱性中性
   プロテアーゼ遺伝子由来のものである請求項２記載のシ
   グナル配列。
4. （４）前記シグナルペプチドが、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ａｒ
   ｇ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ
   −Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−
   Ｌｅｕ−Ａｌａで表わされる請求項１ないし３のいずれ
   か１項に記載のシグナル配列。
5. （５）前記シグナルペプチドをコードする配列がＡＴＧ
   ＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＡＡＴＴＡＣ
   ＧＡＴＣＧＴＴＴＧＧＴＧＴＴＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＴ
   ＡＧＣＧで表わされる請求項４記載のシグナル配列。
6. （６）請求項１ないし５のいずれか１項に記載のシグナ
   ル配列と、該シグナル配列の下流に位置する、プロ構造
   をコードする配列とを含むＤＮＡ配列。
7. （７）前記プロ構造コード配列がバチルス・ステアロサ
   ーモフィルスの耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子由来のも
   のである請求項６記載のＤＮＡ配列。
8. （８）前記プロ構造が、 【遺伝子配列があります】 で表わされる請求項６又は７記載のシグナル配列。
9. （９）前記プロ構造コード配列が 【遺伝子配列があります】 で表わされる請求項８記載のＤＮＡ配列。