JPH02273189A - ウシのメタロチオネイン調節領域 - Google Patents
ウシのメタロチオネイン調節領域Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は組換えＤＮＡバイオテクノロジーの分野に関す
る。１つの観点において本発明はＤＮＡの転写をＡ節す
るＤＮＡフラグメントに関する。
る。１つの観点において本発明はＤＮＡの転写をＡ節す
るＤＮＡフラグメントに関する。
他の観点Ｔ／ｃおいて本発明は上記のＤＮＡフラグメン
トを取込むベクターに関する。もう一つの他の観点ＶＣ
オいて、本発ｇＡは上記ベクターで形質転換した新規細
胞Ｋｉｌ！する。
トを取込むベクターに関する。もう一つの他の観点ＶＣ
オいて、本発ｇＡは上記ベクターで形質転換した新規細
胞Ｋｉｌ！する。
一般的に１本発明は遺伝物質の緻密な操作、特にＤＮＡ
からＲＮＡへの転写頻度の、ＪＩ節ＩＣ関する。
からＲＮＡへの転写頻度の、ＪＩ節ＩＣ関する。
特に、本発明はウシのメタロチオネイン■遺伝子の調節
領域を含むＤＮＡ、フラグメントに関する。
領域を含むＤＮＡ、フラグメントに関する。
（従来技術）
組換えＤＮＡバイオテクノロジーが近年発達してきたた
め、細胞による非常に多ａ類の有用ポリペプチドのｙ４
節生産が可能になってきた。多数の真核細胞ポリペ１チ
ド、例えはヒトの成長ホルモン、白血球インターフェロ
ン−ヒトのインクニリン８よびヒト−プロインシュリン
が種々の組換え［１１＜よって生産されている。すでに
着手されている技術を継続して応用することは、将来、
多種の他の有用ポリペプチド生産物の組換え生産を可能
くすると期待される、 組換え技術の分野で使用される基本技術は当業者に仰ら
れている。組換えＤＮＡバイオテクノロジーを実施する
にあたりて存在することが望ましい要素は、これらに限
定されるわけではないが；（１） 宿主細胞内で発現
を調節する調節遺伝子に機能しうるように連結した（機
能しうるように連結したとを工成分がその有効機能を果
たしうるように配置された配列をいう）１個以上の所望
のポリペプチドをコードする遺伝子； （り ベクター、通常ヌクレオチド配列を挿入し５るプ
ラスミド；ベクターは宿主を形質転換しうる構造を含む
任意のヌクレオチド配列である；（（至）所望のヌクレ
オチド配列を伝達しうる適切な宿主であって、宿主に伝
達されたヌクレオチド配列内にコードされた情報を発現
するための細胞器官をも有する上記の宿主： を含む。
め、細胞による非常に多ａ類の有用ポリペプチドのｙ４
節生産が可能になってきた。多数の真核細胞ポリペ１チ
ド、例えはヒトの成長ホルモン、白血球インターフェロ
ン−ヒトのインクニリン８よびヒト−プロインシュリン
が種々の組換え［１１＜よって生産されている。すでに
着手されている技術を継続して応用することは、将来、
多種の他の有用ポリペプチド生産物の組換え生産を可能
くすると期待される、 組換え技術の分野で使用される基本技術は当業者に仰ら
れている。組換えＤＮＡバイオテクノロジーを実施する
にあたりて存在することが望ましい要素は、これらに限
定されるわけではないが；（１） 宿主細胞内で発現
を調節する調節遺伝子に機能しうるように連結した（機
能しうるように連結したとを工成分がその有効機能を果
たしうるように配置された配列をいう）１個以上の所望
のポリペプチドをコードする遺伝子； （り ベクター、通常ヌクレオチド配列を挿入し５るプ
ラスミド；ベクターは宿主を形質転換しうる構造を含む
任意のヌクレオチド配列である；（（至）所望のヌクレ
オチド配列を伝達しうる適切な宿主であって、宿主に伝
達されたヌクレオチド配列内にコードされた情報を発現
するための細胞器官をも有する上記の宿主： を含む。
本発明は、ウシのメタロチオネインｌ （ｈＭＴ−１１
）調節領域、修飾したクシのメタロチオネイン！Ｉ調節
領域（ｍｂＭＴ−１）、前記調節領域からなるベクター
、およびその突然変異体について初めて開示している。
）調節領域、修飾したクシのメタロチオネイン！Ｉ調節
領域（ｍｂＭＴ−１）、前記調節領域からなるベクター
、およびその突然変異体について初めて開示している。
突然変異体は突然変異させたヌクレオチド配夕ＩＪの機
能を著るしくは損わない塩基対の変化、追加または欠落
からなると理解されている。さらには、これらのｉｉ）
ＭＴ−Ｍ調節領域を活性化する方法が開示されている。
能を著るしくは損わない塩基対の変化、追加または欠落
からなると理解されている。さらには、これらのｉｉ）
ＭＴ−Ｍ調節領域を活性化する方法が開示されている。
ｂｎＴ−１およびｖ＊ｂＭＴ−１調節領域は外因性重金
属の使用を通して篩導に対して応答する。重金属の存在
または不存といりたような容易に操作し５る外因性の環
境、ＩＩＩＩ激に対する調節応答によって、これらｇｗ
Ｊ饋城は異種換えＩ）ＨＡ技術において特別価値があり
かつ有効なものとなる。金属酸度の変化は異種蛋白質の
発現に影響するであろう。さらに、このよ５な調節領域
を裏ウシの細胞に遇合し、かつメタロチオネイン蛋白質
をコードする遺伝子から銹導された。
属の使用を通して篩導に対して応答する。重金属の存在
または不存といりたような容易に操作し５る外因性の環
境、ＩＩＩＩ激に対する調節応答によって、これらｇｗ
Ｊ饋城は異種換えＩ）ＨＡ技術において特別価値があり
かつ有効なものとなる。金属酸度の変化は異種蛋白質の
発現に影響するであろう。さらに、このよ５な調節領域
を裏ウシの細胞に遇合し、かつメタロチオネイン蛋白質
をコードする遺伝子から銹導された。
このような蛋白質は通’ＮｉＣｄ、 Ｘｓ、 Ａｇおよ
びＭｇのような重金属を多量に結合したシスティンに富
む低分子量の蛋白質である。特に、システィンに冨む蛋
白質領域はこのような金属の結合Ｋ［接係わると考えら
れている。メタロチオネインは大部分のを椎動物および
無Ｗａ動物内に存在する広く分布する低分子量蛋白質で
ある。このような蛋白質はカドミウムおよび水銀の解毒
に重要な役割を演じ、亜鉛８よび銅のホメオスタシスに
かかわる場合もある。
びＭｇのような重金属を多量に結合したシスティンに富
む低分子量の蛋白質である。特に、システィンに冨む蛋
白質領域はこのような金属の結合Ｋ［接係わると考えら
れている。メタロチオネインは大部分のを椎動物および
無Ｗａ動物内に存在する広く分布する低分子量蛋白質で
ある。このような蛋白質はカドミウムおよび水銀の解毒
に重要な役割を演じ、亜鉛８よび銅のホメオスタシスに
かかわる場合もある。
他の哺乳類のメタロテオニン遺伝子に関しては、以下の
ように数多（報告されているニスターリンゲス（５ｔａ
ｌｌｔ％異種）ら、′メタロチオネイン！および厘をコ
ードする遺伝子のチャイニーズハムスター染色体への＃
ＩＡ渡３：遺伝子の増重における染色体再配列の役割に
ついてのａｉＥｆＪ）４ （Ａａｓｉ（ｐｍａｔｓｔｏ
ｆ にａｎａａ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｍｍｔａｌｌｏｔ
ｈｉｏｎｍｉｓａ １ａｓｄ ｌ ｔｏ Ｃｈｉ
ｎａａａ Ｉｌ異種ａｔａｒ Ｃムｒｏｍｏｓｏｍ
ａ ３：Ｅｖｉｄ−％６１ ｆｏｒ ｔｈｅ
Ｒｏｌｅ ｏｆ ＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅＲａａｒｖａ
ｘｇ異種ｍｓｇ イＲＧ異種ｅ Ａｍｐｌイｆイｅ
ａｔｉｏｓ”、２９３２ ２９３６（１９８４）＊デエ
ルナム（Ｄ％デｎａＷＬ）ら、１マウスのメタロチオネ
イン−１遺伝子の単離および性質（Ｉａｏｌαｔｉｏ％
ａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ Ｍｏ５ｓｙ Ｍａｔａｌｇｏｔｋｉ−ｏｎ
ｍｉｎ−Ｉ Ｇａｎａ）”、ブ０７−ゲイングスオブア
メリカ（Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓン、７７．６５１１−６５１５
（１９８０）；カリン（Ｋａｒｉｔ＊ ）ら、′カドミ
ウムおよびグルココルチコイドホルモンによるヒトのメ
タロチオネイン−１ｌＡ遺伝子の−４にかかわるＤＮＡ
配ダ１ｊの性質（Ｃ’ｈａｒａｃｇａｒｉ露ａｔｉｏｎ
ｏｆｔ）ＩＩＡ Ｓａｑｓｇｎｃａ Ｔｈｒｏｓ
ｇｈ Ｗムｉｃｈ Ｃ”ａｄｔｙｈｉｓｍａｎｄ
Ｇ１５ｅｏｅｏｒｔｉｃｏｉｄ Ｂｏｒｍｏｎａａ
ノｎｄｓｅａ１１ｓｎｈｃ１％ ＭｍｔａｌＬｏｇｈ
ｉｏｎｍｉｎ−朧Ａ Ｇａ馴）”、工≧トニづ：！ア
１’ｒ −（Ｎａｔｓｒｅ）、 ３旦８，５１３−５１
９（１９８４）；シュミットＲよひバーマー（Ｓｃｈｍ
ｉｄｔ ａｎｄ＃ａｆ％−デ）、＠２櫨類のサル−メ
タロチオネインｅＤＮＡのりａ−ユングおよびシーフェ
ンシング分析（Ｃ”ｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓａｑｓａ
ｎｃｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆＴｗｏ Ｍｏｎｈ
ＨＩ Ｍａｔａｌｌｏｔｈｉｏｎａｉｓ ｅＤＮＡ’ａ
）”、ジーン（Ｇｕｓｓ）、２４．１３７−１４６（
１９８３）。
ように数多（報告されているニスターリンゲス（５ｔａ
ｌｌｔ％異種）ら、′メタロチオネイン！および厘をコ
ードする遺伝子のチャイニーズハムスター染色体への＃
ＩＡ渡３：遺伝子の増重における染色体再配列の役割に
ついてのａｉＥｆＪ）４ （Ａａｓｉ（ｐｍａｔｓｔｏ
ｆ にａｎａａ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｍｍｔａｌｌｏｔ
ｈｉｏｎｍｉｓａ １ａｓｄ ｌ ｔｏ Ｃｈｉ
ｎａａａ Ｉｌ異種ａｔａｒ Ｃムｒｏｍｏｓｏｍ
ａ ３：Ｅｖｉｄ−％６１ ｆｏｒ ｔｈｅ
Ｒｏｌｅ ｏｆ ＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅＲａａｒｖａ
ｘｇ異種ｍｓｇ イＲＧ異種ｅ Ａｍｐｌイｆイｅ
ａｔｉｏｓ”、２９３２ ２９３６（１９８４）＊デエ
ルナム（Ｄ％デｎａＷＬ）ら、１マウスのメタロチオネ
イン−１遺伝子の単離および性質（Ｉａｏｌαｔｉｏ％
ａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ Ｍｏ５ｓｙ Ｍａｔａｌｇｏｔｋｉ−ｏｎ
ｍｉｎ−Ｉ Ｇａｎａ）”、ブ０７−ゲイングスオブア
メリカ（Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓン、７７．６５１１−６５１５
（１９８０）；カリン（Ｋａｒｉｔ＊ ）ら、′カドミ
ウムおよびグルココルチコイドホルモンによるヒトのメ
タロチオネイン−１ｌＡ遺伝子の−４にかかわるＤＮＡ
配ダ１ｊの性質（Ｃ’ｈａｒａｃｇａｒｉ露ａｔｉｏｎ
ｏｆｔ）ＩＩＡ Ｓａｑｓｇｎｃａ Ｔｈｒｏｓ
ｇｈ Ｗムｉｃｈ Ｃ”ａｄｔｙｈｉｓｍａｎｄ
Ｇ１５ｅｏｅｏｒｔｉｃｏｉｄ Ｂｏｒｍｏｎａａ
ノｎｄｓｅａ１１ｓｎｈｃ１％ ＭｍｔａｌＬｏｇｈ
ｉｏｎｍｉｎ−朧Ａ Ｇａ馴）”、工≧トニづ：！ア
１’ｒ −（Ｎａｔｓｒｅ）、 ３旦８，５１３−５１
９（１９８４）；シュミットＲよひバーマー（Ｓｃｈｍ
ｉｄｔ ａｎｄ＃ａｆ％−デ）、＠２櫨類のサル−メ
タロチオネインｅＤＮＡのりａ−ユングおよびシーフェ
ンシング分析（Ｃ”ｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓａｑｓａ
ｎｃｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆＴｗｏ Ｍｏｎｈ
ＨＩ Ｍａｔａｌｌｏｔｈｉｏｎａｉｓ ｅＤＮＡ’ａ
）”、ジーン（Ｇｕｓｓ）、２４．１３７−１４６（
１９８３）。
この領域に関する米国特許も３件発行されている：カリ
７ （Ｋａｒｉｎ ）、第４．６０１，９７８号（１９
８６年７月２２日）、バルミテ＃ （Ｐａ１ｍ１ｔａｒ
） ラ、第４．５７９，８２１号（１９８６年４月１
日）およびホゲル（Ｆｏｇａｉｉ）ら、第４，５１１，
６５２号（１９８５年４月１６日）。しかしながら、こ
れらの文献の中にはウシのメタロチオネイン調節遺伝子
にりいて説明しているものではない。
７ （Ｋａｒｉｎ ）、第４．６０１，９７８号（１９
８６年７月２２日）、バルミテ＃ （Ｐａ１ｍ１ｔａｒ
） ラ、第４．５７９，８２１号（１９８６年４月１
日）およびホゲル（Ｆｏｇａｉｉ）ら、第４，５１１，
６５２号（１９８５年４月１６日）。しかしながら、こ
れらの文献の中にはウシのメタロチオネイン調節遺伝子
にりいて説明しているものではない。
不発明以前にクシのメタロチオネイン調節遺伝子は同定
されていなかった。しかしながら、ウシのメタロチオネ
イン…の調節遺伝子の発見に伴い、されている。
されていなかった。しかしながら、ウシのメタロチオネ
イン…の調節遺伝子の発見に伴い、されている。
（発明が解決しようとする課題］
このように、本発明の目的は新規のウシ−メタロチオネ
イン１ （ｂＭＴ−Ｎ ）の−動領域を含むベクター及
び重金属の存在に応答する前記ｂＭＴ−１―頗領域％：
提供することにある。本発明の他の目的は修飾したウシ
−メタロチオネインｎ （ｍｂＭＴ−Ｉｌｌｌｊ！領域
を含むベクター及び、重金属の存在に応答する前記修飾
されたｗｍｂＭＴ −＊調節領域Ｖ＊供することにある
。さらに、不発明の他の目的は異種のヌクレオチド配列
に機能しうるように連結されたｂＭＴ−１ｔたはｗｈｂ
ＭＴ −１からなる新規のベクターである。さらに、本
発明の他の目的は典稙のヌクレオチド配列の発現を容易
にするｂＭＴおよびｍｂＭＴ−１調節遺伝子の活性化方
法にある。本発明の他の総点、目的およびいくつかの効
果は以下の明細書、実施例および脣許艙求の範囲より明
らかになるであろう。
イン１ （ｂＭＴ−Ｎ ）の−動領域を含むベクター及
び重金属の存在に応答する前記ｂＭＴ−１―頗領域％：
提供することにある。本発明の他の目的は修飾したウシ
−メタロチオネインｎ （ｍｂＭＴ−Ｉｌｌｌｊ！領域
を含むベクター及び、重金属の存在に応答する前記修飾
されたｗｍｂＭＴ −＊調節領域Ｖ＊供することにある
。さらに、不発明の他の目的は異種のヌクレオチド配列
に機能しうるように連結されたｂＭＴ−１ｔたはｗｈｂ
ＭＴ −１からなる新規のベクターである。さらに、本
発明の他の目的は典稙のヌクレオチド配列の発現を容易
にするｂＭＴおよびｍｂＭＴ−１調節遺伝子の活性化方
法にある。本発明の他の総点、目的およびいくつかの効
果は以下の明細書、実施例および脣許艙求の範囲より明
らかになるであろう。
（１１題を解決するための手ＩＲ）
不発明に従って、宿生細胞環境内の１金属の存在に応答
する不質的にウシのメタロチオネイン調節領域ｔＪｓら
なるウシの１）ＮＡ フラグメントが同定され、単離さ
れ、その性質が調べられた。本発明で開示するｂＭＴ−
Ｉ調節領域は１）ＮＡからＲＮＡへの転写をｔｉ制御す
る能力によって、および重金属の存在によって誘導可能
であることによってＩＰ！ｆｇＬ付けられる。
する不質的にウシのメタロチオネイン調節領域ｔＪｓら
なるウシの１）ＮＡ フラグメントが同定され、単離さ
れ、その性質が調べられた。本発明で開示するｂＭＴ−
Ｉ調節領域は１）ＮＡからＲＮＡへの転写をｔｉ制御す
る能力によって、および重金属の存在によって誘導可能
であることによってＩＰ！ｆｇＬ付けられる。
本発明の池の観点において、本質的に宿主細胞環境内の
重金属の存在に応答しかつｍ２図の制限地図をもりＬ）
ＮＡフラグメントからなるｂＭＴ−１１調節遺伝子から
誘導されたウシの修飾ＤＮＡフラグメントもまた同定さ
れ、単離され、その性質が調べられた。ここに開示され
たｖｍｂＭＴ −１調節領域はＤＮＡからＲＮＡへの転
写を制御する能力、および重金属の存在下で９４１’Ｊ
能であることによって特徴付けられる。
重金属の存在に応答しかつｍ２図の制限地図をもりＬ）
ＮＡフラグメントからなるｂＭＴ−１１調節遺伝子から
誘導されたウシの修飾ＤＮＡフラグメントもまた同定さ
れ、単離され、その性質が調べられた。ここに開示され
たｖｍｂＭＴ −１調節領域はＤＮＡからＲＮＡへの転
写を制御する能力、および重金属の存在下で９４１’Ｊ
能であることによって特徴付けられる。
本発明の８らなる観点において、ｂＭＴ−１ｇたは惰ｂ
Ｍ’ｆ−１を含むベクター、Ｓよび異種遺伝子の発現を
容易にするためのｂＭＴ 調節領域の活性化方法が提供
される。
Ｍ’ｆ−１を含むベクター、Ｓよび異種遺伝子の発現を
容易にするためのｂＭＴ 調節領域の活性化方法が提供
される。
ここで図面について簡単に説明する。
第１図はウシのメタロチオネイン１１１ｍ節領域の制限
地図である。
地図である。
第２図は修飾したウシのメタロチオネイン調節領域の制
限地図である。
限地図である。
第３図はプラスミドｐＬ２６０の制限地図である。
この図中に示されたＰａｔ ｌサイトは概算位置である
。
。
第４図はプラスミドｐＬ２６６の制限地図である。
この図中のＰａｔｌ、 Ｂｇｌ鳳ＨよびＡｐａ ｌサイ
トは概算の位置である。
トは概算の位置である。
第５図ＡはｐＬ２６０の構築法を説明する７−−チヤー
トである。
トである。
ｍ５図ＢはｐＬ２２３の構築法を説明するフローチャー
トである。
トである。
Ｍ５１［（’Ｇ！ｐＬ２６４、ｐＬ ２６５ｊｄヨヒｐ
Ｌ２６６の構築法をａｌ！Ａする７０−チャートである
。
Ｌ２６６の構築法をａｌ！Ａする７０−チャートである
。
図中、連結反応により破Ｊ１！されたがヌクレオチド配
列の操作に使用したｍｌ！１３＠サイトは破壊されたサ
イトの略号を括弧で囲むことによって示した。
列の操作に使用したｍｌ！１３＠サイトは破壊されたサ
イトの略号を括弧で囲むことによって示した。
本発明に従りて、宿王環境内の重金属の存在に応答する
クシのＩＪ＠ｍ領域からなる新規ＤＮＡフラグメントが
提供される。ｂＭＴ−１調節領域の制限地図を第１図に
示す。このｉｎｎ領領域第１表に示すヌクレオチド配列
によってさらに特徴付けられる。ｂＭＴ−厘調節領域は
ほぼヌクレオチド−７４９のも」１サイトからほぼヌク
レオチド−１のｍ！サイト（第１ｉを参照されたい）に
わたる。このヌクレオチド配列は少なくとも約５ケ所の
はつ′ｆ！９とした金属応答エレメントを含んでいる。
クシのＩＪ＠ｍ領域からなる新規ＤＮＡフラグメントが
提供される。ｂＭＴ−１調節領域の制限地図を第１図に
示す。このｉｎｎ領領域第１表に示すヌクレオチド配列
によってさらに特徴付けられる。ｂＭＴ−厘調節領域は
ほぼヌクレオチド−７４９のも」１サイトからほぼヌク
レオチド−１のｍ！サイト（第１ｉを参照されたい）に
わたる。このヌクレオチド配列は少なくとも約５ケ所の
はつ′ｆ！９とした金属応答エレメントを含んでいる。
この調節領域はポリペプチドをコードする７４ｍのＤＮ
Ａ配列の５′木端に位はし、これに８！能しうるように
連結された横置にＡＮＡの転写を制御する能力なもつ。
Ａ配列の５′木端に位はし、これに８！能しうるように
連結された横置にＡＮＡの転写を制御する能力なもつ。
−金１４ 応答ニレメン） （ＭＲＥ）（センスストラ
ンド） ＝＝＝二＝金ＪｌｌＥ応答ニレメン） ＣＭＲＥ）（ア
ンチセンスストランド） 一−−−−Ｔ Ａ Ｔ Ａボックス 記ＤＮＡ配列と実質的に同一の機能活性をもつｓｋＭＴ
−Ｔｉヌクレオチド配列の突然変異体も含まれる。
ンド） ＝＝＝二＝金ＪｌｌＥ応答ニレメン） ＣＭＲＥ）（ア
ンチセンスストランド） 一−−−−Ｔ Ａ Ｔ Ａボックス 記ＤＮＡ配列と実質的に同一の機能活性をもつｓｋＭＴ
−Ｔｉヌクレオチド配列の突然変異体も含まれる。
また、本発明の範囲内には、前記のＤＮＡ配列と実質的
に同一の機能活性をもつ上記ヌクレオチド配列の突然変
異体も含まれる。
に同一の機能活性をもつ上記ヌクレオチド配列の突然変
異体も含まれる。
さらに、本発明に従って、宿主環境内の重金属の存在に
応答するウシの修飾メタロチオネイン■詞節領域（ｓ６
Ｍ７’−ｎンが提供される。愼ｈＭＴ−■調節領域の制
限地図を第２−に示す。この調節領域は第２表に示され
るヌクレオチド配列によってさらに特徴付けられる。ｍ
ｈ Ｍ Ｔ −ｎ調節領域ははソヌクレオテド−４６
４のＢａｖｍｌｌｌサイトからはｙヌクレオチド−１の
／ＶａｅＩサイト（第２表に示す）にわたる。この配列
は、第２茨に示すように少なくとも５カ所のはっきりと
した金属応答エレメントを含む。また、本発明の範囲内
には、前ウシのメタロチオネイン調節領域はＭｉｉ）Ｂ
Ｅ（ＡＴＣ（、’＃ＣＣＬ２２）のようなウシの細胞系
から以下の実施例に記載の方法に類似した方法によって
回収されるか、または第１表あるいは第２表に示すヌク
レオチド配列から合成されるかのいずれかにより得られ
る。
応答するウシの修飾メタロチオネイン■詞節領域（ｓ６
Ｍ７’−ｎンが提供される。愼ｈＭＴ−■調節領域の制
限地図を第２−に示す。この調節領域は第２表に示され
るヌクレオチド配列によってさらに特徴付けられる。ｍ
ｈ Ｍ Ｔ −ｎ調節領域ははソヌクレオテド−４６
４のＢａｖｍｌｌｌサイトからはｙヌクレオチド−１の
／ＶａｅＩサイト（第２表に示す）にわたる。この配列
は、第２茨に示すように少なくとも５カ所のはっきりと
した金属応答エレメントを含む。また、本発明の範囲内
には、前ウシのメタロチオネイン調節領域はＭｉｉ）Ｂ
Ｅ（ＡＴＣ（、’＃ＣＣＬ２２）のようなウシの細胞系
から以下の実施例に記載の方法に類似した方法によって
回収されるか、または第１表あるいは第２表に示すヌク
レオチド配列から合成されるかのいずれかにより得られ
る。
ウシの調節領域を回収するための一般的方法は、ｌ金ｋ
１１４ａ度をより高濃度に増加させた長期間の間、一種
類の重金属または東金属類の存在下でウシ細胞系を増殖
させることからなるであろう。高ａ度の重金属にさらし
た結果高レベルのメタロチオネインＲＮＡが存在するよ
うになり、このメタロチオネインＲＮＡはオリゴ−１分
子を用いてポリオ−含有分子を選択するといったような
適切な技術によって回収され得た。そうした後、ＡＮＡ
が回収され、さらにこのＲＮＡはライブラリーを形成す
るためにベクター内に連結されるーＤＮＡを合成するた
めに用いられた。さらに、これに次いでライブラリーな
哺乳類メタロチオネイン遺伝子の蝮いセグメントをプロ
ーブとしてハイブリダイゼーションを行ない、アニーリ
ングによって相同領域を検出した。ライブラリーより単
離された相同のａ Ｄ Ｎ Ａはその後例えばサザンハ
イプリダイゼーションアツセイまたはウシのゲノムライ
ブラリーでウシのゲノムのプローブとして用いて、ウシ
のメタロチオネイン遺伝子およびその調１ｉｉＩＫ域の
位置を決定した。
１１４ａ度をより高濃度に増加させた長期間の間、一種
類の重金属または東金属類の存在下でウシ細胞系を増殖
させることからなるであろう。高ａ度の重金属にさらし
た結果高レベルのメタロチオネインＲＮＡが存在するよ
うになり、このメタロチオネインＲＮＡはオリゴ−１分
子を用いてポリオ−含有分子を選択するといったような
適切な技術によって回収され得た。そうした後、ＡＮＡ
が回収され、さらにこのＲＮＡはライブラリーを形成す
るためにベクター内に連結されるーＤＮＡを合成するた
めに用いられた。さらに、これに次いでライブラリーな
哺乳類メタロチオネイン遺伝子の蝮いセグメントをプロ
ーブとしてハイブリダイゼーションを行ない、アニーリ
ングによって相同領域を検出した。ライブラリーより単
離された相同のａ Ｄ Ｎ Ａはその後例えばサザンハ
イプリダイゼーションアツセイまたはウシのゲノムライ
ブラリーでウシのゲノムのプローブとして用いて、ウシ
のメタロチオネイン遺伝子およびその調１ｉｉＩＫ域の
位置を決定した。
また、この調節領域は第１表塘たは第２衣に示すヌクレ
オチド配列を用い、そしてＦ１＃素的または化学的手段
を用いて配列を合成することによっても得ることができ
た。適切な手段には、これらに制限されるわけではない
が、ホスホｌエステル、ホスファイト、またはシ・７ノ
エチルホスホルアミダイト化学法に基づいた化学的方法
が含まれる。
オチド配列を用い、そしてＦ１＃素的または化学的手段
を用いて配列を合成することによっても得ることができ
た。適切な手段には、これらに制限されるわけではない
が、ホスホｌエステル、ホスファイト、またはシ・７ノ
エチルホスホルアミダイト化学法に基づいた化学的方法
が含まれる。
また、当業者は起こりうる遺伝浮動またはシーフェンシ
ングの間違いのため後で＊離した調節領域に最少限（ｄ
ｓ ５４ｓｊ鵡１８）のヌクレオチドの差異が含まれる
場合もあることを誌めるであろう。
ングの間違いのため後で＊離した調節領域に最少限（ｄ
ｓ ５４ｓｊ鵡１８）のヌクレオチドの差異が含まれる
場合もあることを誌めるであろう。
また、ウシ調節領域の修飾は、リンカ−ＤＮＡを追加し
て新規の１１ｉｉｊ＠サイトを追加すること、７２グメ
ント末端をプラントエンドにすることによって５′ある
いは３′末端に存在する制限サイトを除去すること、ま
たは当業者に既知の他の任意の手段によって成し遂げる
ことができた。
て新規の１１ｉｉｊ＠サイトを追加すること、７２グメ
ント末端をプラントエンドにすることによって５′ある
いは３′末端に存在する制限サイトを除去すること、ま
たは当業者に既知の他の任意の手段によって成し遂げる
ことができた。
ウシのメタロチオネイン調節領域が回収されたされるｐ
ＢＲ３２２などの原核細胞あるいは真核細胞プラスミド
−宿主システムまたはこの技術分野で既知の任意の他の
適切なシステム内で維持または複製することができる。
ＢＲ３２２などの原核細胞あるいは真核細胞プラスミド
−宿主システムまたはこの技術分野で既知の任意の他の
適切なシステム内で維持または複製することができる。
当業者は、細菌プラスミドＤＮＡ、マーカー遺伝子、バ
クテリオファージＤＩＩＡ、自己複製配列または長い末
端繰返しのよ５な数多くのさらなるＤＮＡ配列もまた本
発明を実施するにあたって用いられるベクターに取り込
ませることができ、そのうちの２〜３例を代表として実
施例に挙げであることを認めるであろう。
クテリオファージＤＩＩＡ、自己複製配列または長い末
端繰返しのよ５な数多くのさらなるＤＮＡ配列もまた本
発明を実施するにあたって用いられるベクターに取り込
ませることができ、そのうちの２〜３例を代表として実
施例に挙げであることを認めるであろう。
こ＼に開示したウシのメタロチオネイン調節領域を利用
するために、第１図および纂２図に記載されたフラグメ
ントが異撫ＤＮＡ配列に機能しうるように連結すること
ができる。本明細沓の目的において、異種のＤＮＡ配列
は自然界においては第１図および第２図に示すフラグメ
ントとは機能しうるように連結しないｌ１ＮＡ配列であ
る。ウシのメタロチオネイン調節領域と機能しうるよう
に連結されうるポリペプチドをコードする適当な異種Ｄ
ＮＡ配列は、これに限定されるわけではないがウシのＭ
、長ホルモン、ヒトの成長ホルモン、ニワトリの成長ホ
ルモ／、およびヒトの成長ホルモン放出因子をコードす
る配列がｋすれる。本発明で用いられる７４９ＤＮＡ配
列は５’Ａ”ｌ’Ｇ開始コドンおよび３′終止コドンを
含んでいなければならず、さらにはポリアデニル化を棉
く配列のようにｓ ＲＮ Ａを安定化するために機能す
るヌクレオチド配列を含む場合もある。
するために、第１図および纂２図に記載されたフラグメ
ントが異撫ＤＮＡ配列に機能しうるように連結すること
ができる。本明細沓の目的において、異種のＤＮＡ配列
は自然界においては第１図および第２図に示すフラグメ
ントとは機能しうるように連結しないｌ１ＮＡ配列であ
る。ウシのメタロチオネイン調節領域と機能しうるよう
に連結されうるポリペプチドをコードする適当な異種Ｄ
ＮＡ配列は、これに限定されるわけではないがウシのＭ
、長ホルモン、ヒトの成長ホルモン、ニワトリの成長ホ
ルモ／、およびヒトの成長ホルモン放出因子をコードす
る配列がｋすれる。本発明で用いられる７４９ＤＮＡ配
列は５’Ａ”ｌ’Ｇ開始コドンおよび３′終止コドンを
含んでいなければならず、さらにはポリアデニル化を棉
く配列のようにｓ ＲＮ Ａを安定化するために機能す
るヌクレオチド配列を含む場合もある。
異＠１）ＮＡ配列と機能しうるように連結されたクシの
メタロチオネイン詞節＠城の結合物は違択された宿主細
胞のための適切なベクター内に挿入されるであろう。多
数のベクター−宿生細胞の組み合わせが可能であり、こ
の組み曾わせは当業者に既知である。適切な修飾パポー
バウイルス、アデノウィルス、トリのレトロウィルスお
よび哺乳類のレトロウィルスに起源を有するベクターは
哺乳類宿主に良く適合する。マーカー遺伝子、または細
菌あるいは酵母内で成長を増幅しかつ増殖な早（する能
力をベクターに与える他の配列のような配列もまたさら
に存在させることができる。
メタロチオネイン詞節＠城の結合物は違択された宿主細
胞のための適切なベクター内に挿入されるであろう。多
数のベクター−宿生細胞の組み合わせが可能であり、こ
の組み曾わせは当業者に既知である。適切な修飾パポー
バウイルス、アデノウィルス、トリのレトロウィルスお
よび哺乳類のレトロウィルスに起源を有するベクターは
哺乳類宿主に良く適合する。マーカー遺伝子、または細
菌あるいは酵母内で成長を増幅しかつ増殖な早（する能
力をベクターに与える他の配列のような配列もまたさら
に存在させることができる。
本発明を実施するにあたって適切なベクターの１つは第
３図に示すｐＬ２６０ベクターである。
３図に示すｐＬ２６０ベクターである。
１４８１のＤＮＡ配列（５’ＡＴＧ開始コドン、３′終
止コドンおよびポリアデニル化を命令するヌクレオチド
配列）とこれに機能しうるように連結したウシ−メタロ
チオネイン調節領域からなる一連の配列が同一方向でこ
のベクター中に２〜３コピー存在することは、このベク
ターでの生産か高レベルになることからむしろ好ましい
。これら一連の配列は、ｂＭＴ−■調節領域またはｓ６
＃７’−ＩＩｆＪＩｉ節領域が異種ＤＮＡ配列に機能し
うるように連結され、その３′末端が異種ＤＮＡ配列と
これに機能しうるように連結されたｈ Ｍ １”−■調
節領域または惧ｂＭＴ−１［調節領域からなる少なくと
も１個の一連の配列に連結されるように位置しなければ
ならない。このようなタイプの一連の配列を同一方向で
含むベクターの代宍が第４因に示す、Ｌ２６６である。
止コドンおよびポリアデニル化を命令するヌクレオチド
配列）とこれに機能しうるように連結したウシ−メタロ
チオネイン調節領域からなる一連の配列が同一方向でこ
のベクター中に２〜３コピー存在することは、このベク
ターでの生産か高レベルになることからむしろ好ましい
。これら一連の配列は、ｂＭＴ−■調節領域またはｓ６
＃７’−ＩＩｆＪＩｉ節領域が異種ＤＮＡ配列に機能し
うるように連結され、その３′末端が異種ＤＮＡ配列と
これに機能しうるように連結されたｈ Ｍ １”−■調
節領域または惧ｂＭＴ−１［調節領域からなる少なくと
も１個の一連の配列に連結されるように位置しなければ
ならない。このようなタイプの一連の配列を同一方向で
含むベクターの代宍が第４因に示す、Ｌ２６６である。
ウシ−メタロチオネイン調節領域を利用するための適切
な宿主細胞には真核細胞、特にを椎動物細胞および好適
にはこれに限定されるわけではないがウシおよびネズミ
の細胞を含む哺乳類の細胞が含まれる。
な宿主細胞には真核細胞、特にを椎動物細胞および好適
にはこれに限定されるわけではないがウシおよびネズミ
の細胞を含む哺乳類の細胞が含まれる。
ウシ−メタロチオネイン調節領域を適合するベクターに
よって宿主細胞系へ形質転換することは、当業者に既知
の適切な形質転換技術によって成し遂げられるであろう
。
よって宿主細胞系へ形質転換することは、当業者に既知
の適切な形質転換技術によって成し遂げられるであろう
。
適切な宿主内に形質転換されたウシーメタロチオネイン
調節領域とこれに機能しうるように連結されたＪ４棟Ｄ
ＮＡ配列の発現は、宿主細胞の重金属のＭｇ２込みを容
易にするような方法で宿主細胞環境内へ重金属を導入す
ることによって肪導されるであろう。発現を６尋するの
に適切な重金属は、Ｃｄ％Ｚ％、Ｃｓ％Ａｇ、およびＨ
ｇならびにその組み合わせからなる群より選択される重
金属からなる。
調節領域とこれに機能しうるように連結されたＪ４棟Ｄ
ＮＡ配列の発現は、宿主細胞の重金属のＭｇ２込みを容
易にするような方法で宿主細胞環境内へ重金属を導入す
ることによって肪導されるであろう。発現を６尋するの
に適切な重金属は、Ｃｄ％Ｚ％、Ｃｓ％Ａｇ、およびＨ
ｇならびにその組み合わせからなる群より選択される重
金属からなる。
ＣｄおよびＺｓの組み合わせが望ましく、その最適比率
はｌ：４である。
はｌ：４である。
さらに、異なる起源の細胞が異なる様式で１金属による
発現の誘尋に応答することも認識しておかねばならない
。ヒト、ブタおよびサルの細胞はカドミウムのような重
金属に対して容易に適合するが、これに対してウシの細
胞は最初は細胞が生育しうる有意の低い重金Ｊｔ４１１
［を要求するであろ５゜また、重金属濃度を増加させな
がら長期間培養した細胞は発現を紡導するにあたってよ
り高いレベルの重金属に耐性である場合もある。このよ
うな細胞系は、＃導を改畳するために、形質転換前に高
濃度の重金属を排除し、さらに形負転換恢重金属存在下
で再誘導する場合もある。しかしながら、前もって重金
属にさらされていない細胞系を使用するのが望ましい。
発現の誘尋に応答することも認識しておかねばならない
。ヒト、ブタおよびサルの細胞はカドミウムのような重
金属に対して容易に適合するが、これに対してウシの細
胞は最初は細胞が生育しうる有意の低い重金Ｊｔ４１１
［を要求するであろ５゜また、重金属濃度を増加させな
がら長期間培養した細胞は発現を紡導するにあたってよ
り高いレベルの重金属に耐性である場合もある。このよ
うな細胞系は、＃導を改畳するために、形質転換前に高
濃度の重金属を排除し、さらに形負転換恢重金属存在下
で再誘導する場合もある。しかしながら、前もって重金
属にさらされていない細胞系を使用するのが望ましい。
これらの細胞系は、重金属にさらされた場合、ポリペプ
チドをコードする異種ＤＮＡ配列とこれに機能しうるよ
うに連結されたウシ−メタロチオネイン調節領域からな
るベクターで形′ｘ転換された後により強い発現を示す
。
チドをコードする異種ＤＮＡ配列とこれに機能しうるよ
うに連結されたウシ−メタロチオネイン調節領域からな
るベクターで形′ｘ転換された後により強い発現を示す
。
以下の実施例は、これに限定されるわけではなく、本発
明の実施を具体的に説明するためにこ＼に提示する。
明の実施を具体的に説明するためにこ＼に提示する。
ＭＤＢＫ（ウシ腎臓細胞系）ＡＴＣ（、’＃ＣＣＬ２２
ｓｚｈ３Ｔ３ｃマウス胎児性稙維芽細胞系〕ＡＴＣＣ＃
ＣＲＬ１６５Ｂ 光全セ地 デエルベ：２ （Ｄｓｌｈａｃａａ）の５００１１１１
Ｊ瓶に以下の成分二 １）５１１ｊのペニシリン−ストレプトマイシン溶液（
Ｇ）＃（’（７） ＠終濃度＝ １０ μｙ／ｍＡス
トレプトマイシン、ＩＱＬｊ／Ｉｎｔペニシリン２）５
０− ウシ胎児血清 ３）５−非必須アミノ酸、最終濃度＝ｌｓｊｆ４）５Ｒ
ｔグルタミン、最終濃度＝２鵠Ｍを加えた修飾イーグル
（Ｅａｇｌｍ）培地。
ｓｚｈ３Ｔ３ｃマウス胎児性稙維芽細胞系〕ＡＴＣＣ＃
ＣＲＬ１６５Ｂ 光全セ地 デエルベ：２ （Ｄｓｌｈａｃａａ）の５００１１１１
Ｊ瓶に以下の成分二 １）５１１ｊのペニシリン−ストレプトマイシン溶液（
Ｇ）＃（’（７） ＠終濃度＝ １０ μｙ／ｍＡス
トレプトマイシン、ＩＱＬｊ／Ｉｎｔペニシリン２）５
０− ウシ胎児血清 ３）５−非必須アミノ酸、最終濃度＝ｌｓｊｆ４）５Ｒ
ｔグルタミン、最終濃度＝２鵠Ｍを加えた修飾イーグル
（Ｅａｇｌｍ）培地。
Ｉｊｆ−）
リス（Ｔデミｓ）バッファー
ＴＥバッファー
ＳＣ
１” Ａ Ｅ
０Ｘ
５ＰＥ
ｄＮＴＰ原液
ＢＥ
ＢＳ
２１．１
？
トリス塩基／８０（９４Ｂ、０
１．０Ｓｊｆ−Ｅｉｉ）ＴＡ／ ０．０１ｊ（（ｐＥ
７．４ ）トリスバッファー ０．１ ５Ｍ ＮａＣｌ バッファー） ５ｔフィ＝ｓ−Ａｔ （Ｆｉａｏｌｌ ）５ｔポリビニ
ルピロリドン 水で認容蓋を５０ ＱＷＬｔにする。
７．４ ）トリスバッファー ０．１ ５Ｍ ＮａＣｌ バッファー） ５ｔフィ＝ｓ−Ａｔ （Ｆｉａｏｌｌ ）５ｔポリビニ
ルピロリドン 水で認容蓋を５０ ＱＷＬｔにする。
２０渦Ｍ ＥＤＴＡ
０、１ ６ Ｍ Ｎａ（）Ｅ
０．２ Ｍ Ｎａ１ｉｔＰ Ｏ＜ ・Ｂ＊０３−６ＭＮ
αＣ′ノ Ｎａ０Ｅ テ１１１７． ＯＫ ｌｉＩ整ｈＭＴ−ｎＺ
節領領域単離およびその性質ウシ腎ＰｉＡｌＩＢ胞系（
ＭＤＢλ、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２２）は、長期間細胞を非
常に低濃度のカドミウムにさらし、次にカドミウム濃度
をより高（増加させながら増殖することＫよって、６０
μにカドミウム中で増殖できるように適合させた。適合
細胞系はより多くのＢＭＴ−特異的ＩＩＬＲＮ Ａを生
成することによってカドミウム濃度の増加に反応した。
αＣ′ノ Ｎａ０Ｅ テ１１１７． ＯＫ ｌｉＩ整ｈＭＴ−ｎＺ
節領領域単離およびその性質ウシ腎ＰｉＡｌＩＢ胞系（
ＭＤＢλ、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２２）は、長期間細胞を非
常に低濃度のカドミウムにさらし、次にカドミウム濃度
をより高（増加させながら増殖することＫよって、６０
μにカドミウム中で増殖できるように適合させた。適合
細胞系はより多くのＢＭＴ−特異的ＩＩＬＲＮ Ａを生
成することによってカドミウム濃度の増加に反応した。
この細胞系はＭＤＢＫＲと名付けた。ＭＤＥＫＲ開発の
詳細を以下に記載する。
詳細を以下に記載する。
ｌバイアルのＭｉｉ）ＢＫを〜ＩＯＭの完全培地の入っ
た７５ＣＩＬ”のファルコンフラスコに入れた。
た７５ＣＩＬ”のファルコンフラスコに入れた。
ファルコンフラスコを３７℃、５〜１０％ＣＯ，Ｚ囲気
中で一晩インキエペーションした。培地は次の日、古い
培地を吸引除去し１０−の新しい培地をフラスコに添加
することによって取り替えた。
中で一晩インキエペーションした。培地は次の日、古い
培地を吸引除去し１０−の新しい培地をフラスコに添加
することによって取り替えた。
次いで細胞を３７℃、５〜１０％ＣＯ３中で集密的にな
る迄、通常３〜４日増殖させた。
る迄、通常３〜４日増殖させた。
細胞が集密的になってから、これらを分離した。
このことは培地を吸引除去しさらに２ｄ１０併トリプシ
ン・ＥＤＴＡ溶液（Ｇ−Ｊ−ＢＣＯ）を添加することに
よって成し遂げられた。この溶液は吸引除去し、さらに
２１の同浴液と取り替えた。細胞がプレート表面から離
れ始める迄、通常５〜１５分間、細胞をこの溶液と接触
させておいた。細胞が離れた後、ｌＯ−の完全培地を２
−の細胞溶液に添加し、その全量を吸引上下して細胞凝
集体を分散させた。５〜１０％の培地含有細胞をすべて
吸引してフラスコの外に取り出した。１０ａｊの培地を
フラスコ内に残っている５〜ｌＯ％細胞溶液に添加し、
フラスコな丹び３７℃、５〜ｌＯ％ＣＯ８中でインキエ
ベーションした。この操作は細胞が集密的になった場合
に、２〜３日おきに繰返した。
ン・ＥＤＴＡ溶液（Ｇ−Ｊ−ＢＣＯ）を添加することに
よって成し遂げられた。この溶液は吸引除去し、さらに
２１の同浴液と取り替えた。細胞がプレート表面から離
れ始める迄、通常５〜１５分間、細胞をこの溶液と接触
させておいた。細胞が離れた後、ｌＯ−の完全培地を２
−の細胞溶液に添加し、その全量を吸引上下して細胞凝
集体を分散させた。５〜１０％の培地含有細胞をすべて
吸引してフラスコの外に取り出した。１０ａｊの培地を
フラスコ内に残っている５〜ｌＯ％細胞溶液に添加し、
フラスコな丹び３７℃、５〜ｌＯ％ＣＯ８中でインキエ
ベーションした。この操作は細胞が集密的になった場合
に、２〜３日おきに繰返した。
カドミウム耐性のウシ腎臓細胞系ＭＤＢＫ を開発す
るために、細胞を工上記方法に従ってＯ８目に接種し、
０．２μＭ−ＣｄＣ４，を培地に添加した。細胞は１８
日目に集密的になり、２８日目に分離し、さらに３７，
４４、および４７日目に再び分離した。培地は必要に応
じて２〜３日ごとに取り替え、培地を堆り替える度ごと
（０，２μＭＣｄＣＪｌ、を追加し続けた。
るために、細胞を工上記方法に従ってＯ８目に接種し、
０．２μＭ−ＣｄＣ４，を培地に添加した。細胞は１８
日目に集密的になり、２８日目に分離し、さらに３７，
４４、および４７日目に再び分離した。培地は必要に応
じて２〜３日ごとに取り替え、培地を堆り替える度ごと
（０，２μＭＣｄＣＪｌ、を追加し続けた。
細胞を５２日目に再び分離し、一方のフラスコには２．
０μＭ（、’ｄｅｌ、を添加した。他方のフラスコには
０，２μＭ ＣｄＣ１１，を追加し続けた。両方のフラ
スコを５７日目に分離し、その時点ですべてのフラスコ
に２．ＯμＭ ＣｄＣｌ１＊を追加した。５８日目に細
胞をトリプシン処理し、ＣｄＣ４，非存在下で増殖させ
た。１日後、５９日目に、細胞に貴び２．０μＭ Ｃｄ
Ｃｌ、を追加した。
０μＭ（、’ｄｅｌ、を添加した。他方のフラスコには
０，２μＭ ＣｄＣ１１，を追加し続けた。両方のフラ
スコを５７日目に分離し、その時点ですべてのフラスコ
に２．ＯμＭ ＣｄＣｌ１＊を追加した。５８日目に細
胞をトリプシン処理し、ＣｄＣ４，非存在下で増殖させ
た。１日後、５９日目に、細胞に貴び２．０μＭ Ｃｄ
Ｃｌ、を追加した。
細胞を６１日目に分離し、新しいフラスコに０．２μＭ
−ＣｄＣ４＊を追加した。１日後、６２日目、ＣｔｔＣ
／３４度を２．０μＭＫ上昇させた。細胞を６３日目に
３通りに分けた。３通りのフラスコのＣｄＣ４゜濃度は
２μＭ、２μＭおよび０．２μＭとした。これらのフラ
スコのうちの１通りの濃度は６４日目に２μＭから５μ
Ｍに変化させた。これら３通りの培養液は６６日目に分
離し文、ｃｔｉｃｌａ度は６４日目の時と同じにした。
−ＣｄＣ４＊を追加した。１日後、６２日目、ＣｔｔＣ
／３４度を２．０μＭＫ上昇させた。細胞を６３日目に
３通りに分けた。３通りのフラスコのＣｄＣ４゜濃度は
２μＭ、２μＭおよび０．２μＭとした。これらのフラ
スコのうちの１通りの濃度は６４日目に２μＭから５μ
Ｍに変化させた。これら３通りの培養液は６６日目に分
離し文、ｃｔｉｃｌａ度は６４日目の時と同じにした。
５μＭ ＣｄＣ７１，を追加した細胞は７４日目に集密
的となった。これらを分離し、その後７５日目に再び分
離した。一つの７：）スコの細胞は７５日目から１０μ
Ｍ−Ｃｄ（、”ｌＮ中で増殖させ、他のフラスコの細詣
は５μＭ ＣｄＣ１，のま＼にしておいた。１０日後、
８５日目に１０μＭ ＣｄＣ４，中で増殖した細胞を再
び分離して、１５μＭ−Ｃ’ｄＣ１ｔ中で増殖させた。
的となった。これらを分離し、その後７５日目に再び分
離した。一つの７：）スコの細胞は７５日目から１０μ
Ｍ−Ｃｄ（、”ｌＮ中で増殖させ、他のフラスコの細詣
は５μＭ ＣｄＣ１，のま＼にしておいた。１０日後、
８５日目に１０μＭ ＣｄＣ４，中で増殖した細胞を再
び分離して、１５μＭ−Ｃ’ｄＣ１ｔ中で増殖させた。
これらの細胞を分離し、以下の記載のようＫ（、”ｄｔ
’１．１１度を上昇させた：９１９１日目 ２０μに １２１ ３０μＭ １４７ ４０μμ ｍ７７ ５０μＭ ２３７日目に細胞を分離し、６０μＭ−ＣｅｔＣ１，＋
８０μＭａ１％Ｃ１１を追加した。細胞を６０μＭ−Ｃ
ｄＣ４゜＋８０μＭ１％Ｃ６で維持した。
’１．１１度を上昇させた：９１９１日目 ２０μに １２１ ３０μＭ １４７ ４０μμ ｍ７７ ５０μＭ ２３７日目に細胞を分離し、６０μＭ−ＣｅｔＣ１，＋
８０μＭａ１％Ｃ１１を追加した。細胞を６０μＭ−Ｃ
ｄＣ４゜＋８０μＭ１％Ｃ６で維持した。
の構築
ポリＡ”ＲＮＡは以下の方法に従って５０μ〃ｔ”ｄｃ
ｌｔ存在下での増殖に適応したＭＤＢＫ細胞より単離し
た。５０μＭ ＣｄＣ１ｔ中で増殖したおよそ１０番個
の細胞をトリプシン処理し、かき集めて５０１遠心管に
収集し、２０００デｐｓで１０分間回転させた。ペレッ
トは１ｘＰＢＳで一回洗滌し、次いで５就の１ｘＰＢＳ
に再懸濁した。軽くうす巻き攪拌する間、２０ｍのプロ
テイナーゼＸバッファー（２００μｙ／ｍｌのブロテイ
ナーゼＸを含む）を添加した。混合物は室温で３０分間
インキュベーションし、次いでフェノール／クロロホル
ム：イソアミルアルコールで２回、その後クロロホルム
：イソアミルアルコール（２４：１）で１回抽出した。
ｌｔ存在下での増殖に適応したＭＤＢＫ細胞より単離し
た。５０μＭ ＣｄＣ１ｔ中で増殖したおよそ１０番個
の細胞をトリプシン処理し、かき集めて５０１遠心管に
収集し、２０００デｐｓで１０分間回転させた。ペレッ
トは１ｘＰＢＳで一回洗滌し、次いで５就の１ｘＰＢＳ
に再懸濁した。軽くうす巻き攪拌する間、２０ｍのプロ
テイナーゼＸバッファー（２００μｙ／ｍｌのブロテイ
ナーゼＸを含む）を添加した。混合物は室温で３０分間
インキュベーションし、次いでフェノール／クロロホル
ム：イソアミルアルコールで２回、その後クロロホルム
：イソアミルアルコール（２４：１）で１回抽出した。
この段階に続いて核酸のエタノール沈澱を行なった。
１．５倍容量のフェノール〔再結晶化した分子生物学用
のフェノール、ベテスダ・リサーチ・ラボラトリ−（Ｂ
ｅｔｈａａｄａ ＮｇａａａｒａルＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ ）衾、ＴＥバッファーで平衡化したもの〕および１
．５倍容量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２
４：１）をＲＮＡ／ＤＮＡ混合物に添加した。溶液を手
でおよそ１分間激しく振り、次いで３．００ Ｏｒｐｍ
で１５分間回転させた。下方の有機層を除去し捨てた。
のフェノール、ベテスダ・リサーチ・ラボラトリ−（Ｂ
ｅｔｈａａｄａ ＮｇａａａｒａルＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ ）衾、ＴＥバッファーで平衡化したもの〕および１
．５倍容量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２
４：１）をＲＮＡ／ＤＮＡ混合物に添加した。溶液を手
でおよそ１分間激しく振り、次いで３．００ Ｏｒｐｍ
で１５分間回転させた。下方の有機層を除去し捨てた。
抽出物は上記の操作をくり返した。次いで、同容量のク
ロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を添加
し、上記の操作をくり返した。上方の水層を収集し、以
下の方法に従ってエタノール沈澱を行なった。２倍容量
の９５％エタノールと共に、ＮａＣ１を最終濃度が０．
１Ｍになるように添加した。溶液を激しく攪拌し２０℃
で一晩インキユペーションシタ。次いで沈澱は３＋ＯＯ
Ｏｒｐｍで３０分間遠心分離することによって収集した
。
ロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を添加
し、上記の操作をくり返した。上方の水層を収集し、以
下の方法に従ってエタノール沈澱を行なった。２倍容量
の９５％エタノールと共に、ＮａＣ１を最終濃度が０．
１Ｍになるように添加した。溶液を激しく攪拌し２０℃
で一晩インキユペーションシタ。次いで沈澱は３＋ＯＯ
Ｏｒｐｍで３０分間遠心分離することによって収集した
。
ＲＮＡおよＵＩ＃ＡＱ）沈ｍ物＋１１０ ｙｎｌノＴ
Ｅ バッファー中ＶＣ再懸濁し、ベックマン（Ｂａｃｋ
ｎａｓ）ＳＷ４１ポリアロマ−チューブに入れた４ｄＣ
ａＣ１（最終績度１ｔ／ｘｉ）／ＴＥバッファーのクツ
ション２本の上に屑をなすよ５Ｋｉんだ。チューブはＴ
Ｅバッファーで釣合わせ、３７．０００ｒ−で２０時間
、室温で回転させた。ＲｌＷＡのペレットは上澄液を注
意深く吸引除去することによって収集した。（上澄液は
粘り気のあるＤＮＡの帝の下方迄除去した。）ＤＮＡは
別に収集し、エタノール沈設を行ない、後に使用するた
めに保存した。
Ｅ バッファー中ＶＣ再懸濁し、ベックマン（Ｂａｃｋ
ｎａｓ）ＳＷ４１ポリアロマ−チューブに入れた４ｄＣ
ａＣ１（最終績度１ｔ／ｘｉ）／ＴＥバッファーのクツ
ション２本の上に屑をなすよ５Ｋｉんだ。チューブはＴ
Ｅバッファーで釣合わせ、３７．０００ｒ−で２０時間
、室温で回転させた。ＲｌＷＡのペレットは上澄液を注
意深く吸引除去することによって収集した。（上澄液は
粘り気のあるＤＮＡの帝の下方迄除去した。）ＤＮＡは
別に収集し、エタノール沈設を行ない、後に使用するた
めに保存した。
それぞれのペレットは３ｄのＥＴＳバッファー中に再Ｉ
＆！！濁し、次いで遠心管に移した。容量をＥＴＳバッ
ファーで１５ｍ１に迄増加させ、ＲＮＡが溶液状になる
迄〜２分間、６５℃で緩やかに遠心管を加熱した。次い
でＲＮＡは３，０００ ｒｐｍで３０分間遠心分離する
ことによって収集し、ペレットを２ｘｌＡＴＳバツフア
ー中に再懸濁した。そうした後ＲＮ Ａ ＠ｆ５を２６
０％溝の吸収測定によって足墓し、１１度が〈５■ＲＮ
Ａ／ＫｌになるようにＥＴＳでｖ４！Ｉした。次いでこ
の溶液を６５℃で５分間インキュベーションし、氷で呈
温迄冷却し、さらに５ Ｍ −ＮａＣ１を最Ｐ、ａ度が
０．５ Ｍになるように添加した。ＲｆｉｌＡは２２の
オリゴＤＴセルロース〔コラボラティブリサーチ（Ｃｏ
ｌｌａｂｏｒａＨｖａＲｅｓｅａｒｃｈ ） ）を充填
したオリがＤＴカラム（ｌ−カラム）に負荷した。ＲＮ
Ａ酢加前にカラムにＥＴＳバッファーを充填し、０．５
Ｍ −Ｎａ０Ｅで洗滌し、０．５Ｍ−ＮＥＴＳ ｃＥ
ＴＳ＜ツ７１−＋ ０．５ Ｍ −ＮａＣｌ （最終濃
度）〕で平衡化した。
＆！！濁し、次いで遠心管に移した。容量をＥＴＳバッ
ファーで１５ｍ１に迄増加させ、ＲＮＡが溶液状になる
迄〜２分間、６５℃で緩やかに遠心管を加熱した。次い
でＲＮＡは３，０００ ｒｐｍで３０分間遠心分離する
ことによって収集し、ペレットを２ｘｌＡＴＳバツフア
ー中に再懸濁した。そうした後ＲＮ Ａ ＠ｆ５を２６
０％溝の吸収測定によって足墓し、１１度が〈５■ＲＮ
Ａ／ＫｌになるようにＥＴＳでｖ４！Ｉした。次いでこ
の溶液を６５℃で５分間インキュベーションし、氷で呈
温迄冷却し、さらに５ Ｍ −ＮａＣ１を最Ｐ、ａ度が
０．５ Ｍになるように添加した。ＲｆｉｌＡは２２の
オリゴＤＴセルロース〔コラボラティブリサーチ（Ｃｏ
ｌｌａｂｏｒａＨｖａＲｅｓｅａｒｃｈ ） ）を充填
したオリがＤＴカラム（ｌ−カラム）に負荷した。ＲＮ
Ａ酢加前にカラムにＥＴＳバッファーを充填し、０．５
Ｍ −Ｎａ０Ｅで洗滌し、０．５Ｍ−ＮＥＴＳ ｃＥ
ＴＳ＜ツ７１−＋ ０．５ Ｍ −ＮａＣｌ （最終濃
度）〕で平衡化した。
カラムからの流出液を集めて、再びカラムを２回通過さ
せ、その後３０ｍの０．５Ｍ−ＮＥＴＳで洗滌した。ポ
リＡ＋ ＲＮＡは４ｍｌのＥＴＳバッファーで溶出させ
、２倍容量のエタノール十ＮａＣノ（最終儂［０，２５
Ｍ）でエタノール沈澱を行ない、−２０℃に一晩保った
。ＲＮＡ沈澱物をシリコーン化シた１５ｔｎｌのコーレ
ツクス（Ｃｏデーｚ）チューブを用い、１０．０００デ
ｐｆｎで３０分間遠心分離を行なうことによって収集し
た。
せ、その後３０ｍの０．５Ｍ−ＮＥＴＳで洗滌した。ポ
リＡ＋ ＲＮＡは４ｍｌのＥＴＳバッファーで溶出させ
、２倍容量のエタノール十ＮａＣノ（最終儂［０，２５
Ｍ）でエタノール沈澱を行ない、−２０℃に一晩保った
。ＲＮＡ沈澱物をシリコーン化シた１５ｔｎｌのコーレ
ツクス（Ｃｏデーｚ）チューブを用い、１０．０００デ
ｐｆｎで３０分間遠心分離を行なうことによって収集し
た。
ペレットは１００μｌのＥＴＳバッファーに再懸濁し、
このうちの５μｌを用いてボＩ）Ａ＋ＲＮＡＡ度を定量
した。１μｔのポリＡ＋ＲＮＡは１ｘＴＢＳ（トリス−
ホウ酸−ＥＤＴＡ）を泳動用バッファーとして用い１．
５％アガロースゲルで電気泳動し、ＲＮＡが完全である
かどうかを決定した。
このうちの５μｌを用いてボＩ）Ａ＋ＲＮＡＡ度を定量
した。１μｔのポリＡ＋ＲＮＡは１ｘＴＢＳ（トリス−
ホウ酸−ＥＤＴＡ）を泳動用バッファーとして用い１．
５％アガロースゲルで電気泳動し、ＲＮＡが完全である
かどうかを決定した。
残りのポリＡ”ＲＮＡは２倍容量のエタノール＋０、２
５ Ｍ −ＮａＣ１を添加することによって沈澱させ２
０℃で一晩保った。ＲＮＡ沈澱物は３０００ ｒｐｔｎ
で３０分間遠心分離することによつて収集した。ＲＮＡ
ペレットは無菌蒸留水を加えて最終濃度が１μｔ／μノ
になるように再懸濁した。
５ Ｍ −ＮａＣ１を添加することによって沈澱させ２
０℃で一晩保った。ＲＮＡ沈澱物は３０００ ｒｐｔｎ
で３０分間遠心分離することによつて収集した。ＲＮＡ
ペレットは無菌蒸留水を加えて最終濃度が１μｔ／μノ
になるように再懸濁した。
ａ Ｄ Ｎ Ａライブラリーは以下に記載の方法に従ッ
テ構築シタ。５ Ｉｌｌ （１）ＲＮＡ溶液（５１１１
ＲＩＶＡ）を１．２μ１０１０ｍ＃水酸化メチル水銀〔
アルファバイオケミカルズ（Ａげａ Ｂｉｏｅｈｍｔｎ
ｉｏａｌｍ ） ）と混合し、混合物を室温に５分間保
った。２．０μｌの０．７Ｍ／Ｉ−メルカプトエタノー
ル、０．５μ！の１００μ屑−ＤＴＴおよび３μ！のＲ
Ｎアーゼ（２４（／／ｓｕ；プロメガ バイオチック（
Ｐｒｏｍａｇａ Ｂｉｏｔａｏ）〕を添加し、反応物を
室温に５分間保った。以下の試薬を上記混合物に添加し
、最終反応液（５０μｊ）を４２℃に６０分間保った：
２３．３μ！ 逆転写酵素用バッファー５．０μ！ ア
クチノマイシン７）（６００μｆ廓） ２．５μｌ ”Ｐ−ｄｃＴＰｃ３２００ｃ４／ｍｔｎ
ｏ１ｇ）８．３＃Ｊ 逆転写＃素（２０Ｕ ／ ｓｒ
；モｌ／キュ２− ジエネテイツクス リサーチ（Ｍｅｌｏｎ％１・デＧ−惰−ｔ−−６１１Ｒ
＃ａＯ聾デｅａ−）） 逆転写酵素を添加する前に０．５μノのサンプルな０時
間のサンプルとしてＴＣＡ沈澱を行なうために採取した
。
テ構築シタ。５ Ｉｌｌ （１）ＲＮＡ溶液（５１１１
ＲＩＶＡ）を１．２μ１０１０ｍ＃水酸化メチル水銀〔
アルファバイオケミカルズ（Ａげａ Ｂｉｏｅｈｍｔｎ
ｉｏａｌｍ ） ）と混合し、混合物を室温に５分間保
った。２．０μｌの０．７Ｍ／Ｉ−メルカプトエタノー
ル、０．５μ！の１００μ屑−ＤＴＴおよび３μ！のＲ
Ｎアーゼ（２４（／／ｓｕ；プロメガ バイオチック（
Ｐｒｏｍａｇａ Ｂｉｏｔａｏ）〕を添加し、反応物を
室温に５分間保った。以下の試薬を上記混合物に添加し
、最終反応液（５０μｊ）を４２℃に６０分間保った：
２３．３μ！ 逆転写酵素用バッファー５．０μ！ ア
クチノマイシン７）（６００μｆ廓） ２．５μｌ ”Ｐ−ｄｃＴＰｃ３２００ｃ４／ｍｔｎ
ｏ１ｇ）８．３＃Ｊ 逆転写＃素（２０Ｕ ／ ｓｒ
；モｌ／キュ２− ジエネテイツクス リサーチ（Ｍｅｌｏｎ％１・デＧ−惰−ｔ−−６１１Ｒ
＃ａＯ聾デｅａ−）） 逆転写酵素を添加する前に０．５μノのサンプルな０時
間のサンプルとしてＴＣＡ沈澱を行なうために採取した
。
６０分後に０．５μ！サンプルを２通り採取し、０．５
μｌの２０％ＳＤＳ、２μｊの０．５Ｍ−ＥＤＴＡ。
μｌの２０％ＳＤＳ、２μｊの０．５Ｍ−ＥＤＴＡ。
および２１．７μｌのＩ Ｎ −ＮａＯＨを添加するこ
とＫよって反応を停止させ、６５℃に３０分間保った。
とＫよって反応を停止させ、６５℃に３０分間保った。
次いで、１０μｌの１Ｍトリス（ｐＥ７．４）および２
１．７μノのＩＮ−ＢＣＩを添加し、上述の方法に従っ
て混合液をフェノール／クロロホルム：イソアミルアル
コールで１回抽出し、さらにクロロホルム：イソアミル
アルコールで１回抽出した。
１．７μノのＩＮ−ＢＣＩを添加し、上述の方法に従っ
て混合液をフェノール／クロロホルム：イソアミルアル
コールで１回抽出し、さらにクロロホルム：イソアミル
アルコールで１回抽出した。
ＴＣＡ沈澱は０時間および６０分後の反応液から採取し
た２通りのサンプル０．５μノについて行なった。ＴＣ
Ａ法を以下に記載する。それぞれの０．５μ！サンプル
を最終容量１００μ！の溶液〔８０μ）のＴＥバッファ
ー ２０μノキヤリアＲＮＡ（１０ｑ／ｍｕ））中装置
イタ。１０１１１を採取し、ニトロセルロースディスク
上にスポットした。残りの９０μｌは４００μｊ０２０
％ＴＣＡを添加することによって沈澱させ、その後氷上
に１０分分間−た。沈澱物はニトロセルロースディスク
でＰ遇し、その後室温和おいて５％ＴＣＡで洗滌するこ
とにより【収集した。すべてのＦ紙を熱球で乾燥させ、
それぞれを計数Ｃａｐｓ）するためにシンチレーション
流体内に置いた。高分子量ＤＮＡ内へのラベルの堆り込
み％は１０μ！および９０μｌの値を用いることによっ
て定量した。
た２通りのサンプル０．５μノについて行なった。ＴＣ
Ａ法を以下に記載する。それぞれの０．５μ！サンプル
を最終容量１００μ！の溶液〔８０μ）のＴＥバッファ
ー ２０μノキヤリアＲＮＡ（１０ｑ／ｍｕ））中装置
イタ。１０１１１を採取し、ニトロセルロースディスク
上にスポットした。残りの９０μｌは４００μｊ０２０
％ＴＣＡを添加することによって沈澱させ、その後氷上
に１０分分間−た。沈澱物はニトロセルロースディスク
でＰ遇し、その後室温和おいて５％ＴＣＡで洗滌するこ
とにより【収集した。すべてのＦ紙を熱球で乾燥させ、
それぞれを計数Ｃａｐｓ）するためにシンチレーション
流体内に置いた。高分子量ＤＮＡ内へのラベルの堆り込
み％は１０μ！および９０μｌの値を用いることによっ
て定量した。
１μｔの一本鎖ｅ ＤＮ Ａはおよそ８．５％の取り込
みに等しい。
みに等しい。
１．５％アガロースＴＨＥグルには０．５μノの反応生
成物を負荷し、泳動させた。−重鎖ａｉｉ）ＨＡの平均
サイズは〜１５００−２０００ヌクレオチドであった。
成物を負荷し、泳動させた。−重鎖ａｉｉ）ＨＡの平均
サイズは〜１５００−２０００ヌクレオチドであった。
抽出物から除去した最上部の水層なＴＥバッファーで平
衡化したｌ−のセファデックス（Ｓａｐｈａｄａｇ ）
Ｇ ５０カラムに負荷し、取り込まれなかったｍ５１
ｍを除去した。ＴＥバッファーを溶出に用い、１００μ
ノずつフラクションを採取した。標識された一本鎖ａ
Ｄ Ｎ Ａを含むフラクションをプールした。プールし
たフラクションはブタノール抽出を行ないおよそ５０μ
ノに減量し、１０μノの１０Ｍ−ＮＨ４０Ａａおよび２
倍容１（１） 工／ノールを添加した。混合物は一２０
’Ｃに一晩保った。（ブタノール抽出の際には、６容量
のブタノールを１容量の溶液ｅ’ｃｆＡ加し、激しく振
とうした。
衡化したｌ−のセファデックス（Ｓａｐｈａｄａｇ ）
Ｇ ５０カラムに負荷し、取り込まれなかったｍ５１
ｍを除去した。ＴＥバッファーを溶出に用い、１００μ
ノずつフラクションを採取した。標識された一本鎖ａ
Ｄ Ｎ Ａを含むフラクションをプールした。プールし
たフラクションはブタノール抽出を行ないおよそ５０μ
ノに減量し、１０μノの１０Ｍ−ＮＨ４０Ａａおよび２
倍容１（１） 工／ノールを添加した。混合物は一２０
’Ｃに一晩保った。（ブタノール抽出の際には、６容量
のブタノールを１容量の溶液ｅ’ｃｆＡ加し、激しく振
とうした。
最上部の水層を除去し捨てた。）
一重鎖、ＤＮＡの沈澱物は微量遠心機で１５分間遠心分
離を行なうことによって収集した。ＤＮＡペレットは７
０％エタノールでｉｌｌ洗滌した。これをスピードバキ
ューム（ａｐｅｅｄ ｖａａ）で完全に乾燥させ、（こ
の操作に伴なって起こる放射能標識の減少量を定量する
ための基準線を得るために）ペレットを計数した。第二
鎖は以下の物質と混合し、１４℃に２時間、次いで３７
℃に２０分間保つことによって合成した： 異種ＤＮＡペレット ２５μｍ ２Ｘ第二鎖用バツフアー２２μｌ
ｄＢ、０ １．０μｌ ！リーｄ（、”ＴＰ （３２００Ｃ４／１
胴１）０時間後０．５μｌのサンプルを２通り反応混合
物から採取し、上述のように’ｌ’ Ｂ Ｅゲルおよび
ＴＣＡ沈澱のために用いた。次いで２．０μ！クレノー
（Ａｊ ａｓａｗ ） （５ｊ／ ／ １１）；ＩＢＩ
）を添加し、反応を３７℃で２０分間進行させた。
離を行なうことによって収集した。ＤＮＡペレットは７
０％エタノールでｉｌｌ洗滌した。これをスピードバキ
ューム（ａｐｅｅｄ ｖａａ）で完全に乾燥させ、（こ
の操作に伴なって起こる放射能標識の減少量を定量する
ための基準線を得るために）ペレットを計数した。第二
鎖は以下の物質と混合し、１４℃に２時間、次いで３７
℃に２０分間保つことによって合成した： 異種ＤＮＡペレット ２５μｍ ２Ｘ第二鎖用バツフアー２２μｌ
ｄＢ、０ １．０μｌ ！リーｄ（、”ＴＰ （３２００Ｃ４／１
胴１）０時間後０．５μｌのサンプルを２通り反応混合
物から採取し、上述のように’ｌ’ Ｂ Ｅゲルおよび
ＴＣＡ沈澱のために用いた。次いで２．０μ！クレノー
（Ａｊ ａｓａｗ ） （５ｊ／ ／ １１）；ＩＢＩ
）を添加し、反応を３７℃で２０分間進行させた。
１６０分後２通りの０．５μノのサンプルをＴＣＡ沈澱
およびＴＢＥグル用に採取し、その後反応は２μｌ ０
）ｏ、ｓＭ−ＥＤＴＡを添加することによって停止させ
た。反応物はフェノール／クロロホルム：イソアミルア
ルコール抽出を１回、さらにクロロホルム：イソアミル
アルコール抽出を１回行なった。ｉ” ＣＡ沈澱は前述
の方法に従い０．５μノのサンプルを用いて行なった。
およびＴＢＥグル用に採取し、その後反応は２μｌ ０
）ｏ、ｓＭ−ＥＤＴＡを添加することによって停止させ
た。反応物はフェノール／クロロホルム：イソアミルア
ルコール抽出を１回、さらにクロロホルム：イソアミル
アルコール抽出を１回行なった。ｉ” ＣＡ沈澱は前述
の方法に従い０．５μノのサンプルを用いて行なった。
その後１．０％ホルムアミドグルにこのサンプルを泳動
させた。−晩泳動させた結果、二不＠ ａ Ｄ Ｎ Ａ
は適正サイズである、即ち一本鎖ｏ Ｄ Ａ’ Ａより
大きいことがわかった。
させた。−晩泳動させた結果、二不＠ ａ Ｄ Ｎ Ａ
は適正サイズである、即ち一本鎖ｏ Ｄ Ａ’ Ａより
大きいことがわかった。
次いでサンプルをセファデックスＧ−５０カラム［ｆｉ
し、最初に２００μ！ずつのフラクションを、次に１０
０μｌ−ｆつの７２クシヨンを収集した。
し、最初に２００μ！ずつのフラクションを、次に１０
０μｌ−ｆつの７２クシヨンを収集した。
溶出にはＴＥを用いた。７ラクシヨンをプールし、ブタ
ノール抽出を行なって５０μｌにした。１０μ１０１０
Ｎ −ＮＨ４０Ａ ｅを添加し、次いでサンプルに２
借容量のエタノールな加え、エタノール沈澱を一晩行な
った。
ノール抽出を行なって５０μｌにした。１０μ１０１０
Ｎ −ＮＨ４０Ａ ｅを添加し、次いでサンプルに２
借容量のエタノールな加え、エタノール沈澱を一晩行な
った。
ＮＨ４０Ａ ｅ、および２倍容公のエタノール中に杏懸
濁した。混合物をドライアイス／エタノール浴中で１０
分間インキュベーションし、次いで微量遠心分離機を用
いて１５分間遠心分離した。ペレットは７０％エタノー
ルで洗滌し、再び１５分間遠心沈澱させた。エタノール
を吸い出し、ペレットをスピードバキュームで簡単に乾
燥した。
濁した。混合物をドライアイス／エタノール浴中で１０
分間インキュベーションし、次いで微量遠心分離機を用
いて１５分間遠心分離した。ペレットは７０％エタノー
ルで洗滌し、再び１５分間遠心沈澱させた。エタノール
を吸い出し、ペレットをスピードバキュームで簡単に乾
燥した。
逆転写酵素反応を行なって第二鎖を完全なものにした。
ペレットは２６μｌのｄｌｌ、ＯＫ再懸濁し、以下の試
薬を添加し、４２℃で６０分間反応させた： ５．０μｌ ０．５Ｍトリス／ｐＨ８，３２，５μ
Ｊ ０．２ＭＭｇＣ１１ ２，０μｍ ０．７Ｍβ−メルカプトエタノール６
．５μｌ ＩＭＫＣｌ １、２５ ｆｉｔ ２０ ｓｊｆ ｄＮＴＰａ （合
計４種類；各々１．２５μｊずつ） ３．０μｌ 逆転写酵素（ｌ［／／μｌ〕反応を２μｌ
のＱ、５Ｍ−ＥＤＴＡの添加によって停止し、次いでフ
ェノール／クロロホルム：イソアミルアルコール抽出を
１回、クロロホルム：イソアミルアルコール抽出を１回
行なった。
薬を添加し、４２℃で６０分間反応させた： ５．０μｌ ０．５Ｍトリス／ｐＨ８，３２，５μ
Ｊ ０．２ＭＭｇＣ１１ ２，０μｍ ０．７Ｍβ−メルカプトエタノール６
．５μｌ ＩＭＫＣｌ １、２５ ｆｉｔ ２０ ｓｊｆ ｄＮＴＰａ （合
計４種類；各々１．２５μｊずつ） ３．０μｌ 逆転写酵素（ｌ［／／μｌ〕反応を２μｌ
のＱ、５Ｍ−ＥＤＴＡの添加によって停止し、次いでフ
ェノール／クロロホルム：イソアミルアルコール抽出を
１回、クロロホルム：イソアミルアルコール抽出を１回
行なった。
１０μノの１０ Ｍ −ＮＭ、ＯＡ ａを添加し、さら
に混合物は一２０℃で一晩エタノール沈澱を行なった。
に混合物は一２０℃で一晩エタノール沈澱を行なった。
次の日、ＤＮＡの沈澱物は微量遠心機を用いて１５分間
遠心分離することＫよって収集した。次に７０％エタノ
ールで洗滌し、ＤＮＡをスピードバキュームで乾燥した
。次いで、ペレットを４４μ１−ｄＢ、０中に桝懸濁し
、以下の試薬を混合し、３７℃で３０分間インキュベー
ションすることによってＳｌヌクレアーゼ反応を行なっ
た：５μｌ １０Ｘ５１バツフアー １μｌ Ｃ４℃に保存；シグマ（Ｓり惧ａ）；１０Ｕ
／μ！〕 Ｓ１添加前に０．５μｌの混合物を０時間のサンプルと
してＴＣＡ沈澱および１，５％アガロースゲル用に２通
り採取した。反応時間は２μ１００．５Ｍ−ＥＤＴＡを
添加することにより停止させた。反応物はフェノール／
クロロホルム：インアミルアルコール抽出を１回、クロ
ロホルム：イソアミルアルコール抽出を１回行なった。
遠心分離することＫよって収集した。次に７０％エタノ
ールで洗滌し、ＤＮＡをスピードバキュームで乾燥した
。次いで、ペレットを４４μ１−ｄＢ、０中に桝懸濁し
、以下の試薬を混合し、３７℃で３０分間インキュベー
ションすることによってＳｌヌクレアーゼ反応を行なっ
た：５μｌ １０Ｘ５１バツフアー １μｌ Ｃ４℃に保存；シグマ（Ｓり惧ａ）；１０Ｕ
／μ！〕 Ｓ１添加前に０．５μｌの混合物を０時間のサンプルと
してＴＣＡ沈澱および１，５％アガロースゲル用に２通
り採取した。反応時間は２μ１００．５Ｍ−ＥＤＴＡを
添加することにより停止させた。反応物はフェノール／
クロロホルム：インアミルアルコール抽出を１回、クロ
ロホルム：イソアミルアルコール抽出を１回行なった。
反応を停止する前に０．５μノの混合物を３０分後のサ
ンプルとしてＴＣＡ沈澱および１．５％アガロースゲル
用に２通り採取した。
ンプルとしてＴＣＡ沈澱および１．５％アガロースゲル
用に２通り採取した。
水層なＧ−５０カラムに負荷し、ＴＥバッファーで溶出
して１００μｌずつ７ラクシヨンを収ｆｉした。はｙ５
本のａ Ｄ 、Ａ’ Ａ含有フラクションをプールし、
ブタノール抽出を行なって最終容量を５０ｐｌＫ減じた
。１０ａｔ のＮＢ４ｏＡａ＋ｚｍ容童のエタノールを
添加し、二本鎖ａ ｉｉ） Ｎ Ａ沈澱物を一２０℃で
一晩インキユベーションすることによって収集した。沈
澱したＤＮＡは遠心沈澱させ、７０％エタノールで洗滌
し、次にスピードバキュ−ムで乾燥させた。ペレットを
４０μノのｄＢ、０に再Ｍ濁した。
して１００μｌずつ７ラクシヨンを収ｆｉした。はｙ５
本のａ Ｄ 、Ａ’ Ａ含有フラクションをプールし、
ブタノール抽出を行なって最終容量を５０ｐｌＫ減じた
。１０ａｔ のＮＢ４ｏＡａ＋ｚｍ容童のエタノールを
添加し、二本鎖ａ ｉｉ） Ｎ Ａ沈澱物を一２０℃で
一晩インキユベーションすることによって収集した。沈
澱したＤＮＡは遠心沈澱させ、７０％エタノールで洗滌
し、次にスピードバキュ−ムで乾燥させた。ペレットを
４０μノのｄＢ、０に再Ｍ濁した。
ａ Ｄ Ｎ Ａの半分には以下の試薬を加え、３７℃に
３０分間保つことによってＣを末端につないだ。
３０分間保つことによってＣを末端につないだ。
２０μｍ ａＤＮＡ＜１００ｓｆ／２０ｆｉｉｉ）
ｌＯμＪ ５Ｘテーリングバツフアー３μｌ １
０μＭＷ＆ｄＣＴＰ １ｐｌ”１Ｐ−ｄｃＴＰ １５μｌ ｔｉＥ、０ １μｌ ターミナルト２ンスフエラーゼＴＴアーゼ［２
１Ｕ／μｊ；ラトリ フエ バイオケミカルズ（〕（ａｔＪｓ−ｆｆａ Ｂｉ
ｏａｋｍｔｍ４ａａｌａ ） ）０．５μｌの反応物を
０分後および３０分後に採取し、ＴＣＡ反応を行なった
。ＴＣＡ反応は数個のＣが添加されただけであることを
示したので、反応物を水中に移し、さらに３μノの１０
μＭ−Ｃ’ｌ”？および１μノのＴＴアーゼを添加した
。反応は３０分間３７℃で進行させた。２回目のＴＣＡ
沈澱物は適正数のＣが添加されていることを示した。
ｌＯμＪ ５Ｘテーリングバツフアー３μｌ １
０μＭＷ＆ｄＣＴＰ １ｐｌ”１Ｐ−ｄｃＴＰ １５μｌ ｔｉＥ、０ １μｌ ターミナルト２ンスフエラーゼＴＴアーゼ［２
１Ｕ／μｊ；ラトリ フエ バイオケミカルズ（〕（ａｔＪｓ−ｆｆａ Ｂｉ
ｏａｋｍｔｍ４ａａｌａ ） ）０．５μｌの反応物を
０分後および３０分後に採取し、ＴＣＡ反応を行なった
。ＴＣＡ反応は数個のＣが添加されただけであることを
示したので、反応物を水中に移し、さらに３μノの１０
μＭ−Ｃ’ｌ”？および１μノのＴＴアーゼを添加した
。反応は３０分間３７℃で進行させた。２回目のＴＣＡ
沈澱物は適正数のＣが添加されていることを示した。
尾を付けた６ＤＮＡをセフエデツクスＧ−５０カラムに
負荷し、ＴＥバッファーで溶出してクラクションを収集
し、次いでプールした。ブタノール抽出＋１．ａＤＮＡ
は一２０℃で一晩エタノール沈澱させた。Ｃを末端につ
ないだａ Ｄ Ｎ Ａ沈澱物を微量遠心機で１５分間遠
心分離を行ない、次いで７０％エタノールで洗滌するこ
とによって収集した。ａ Ｄ Ｎ Ａは乾燥させ、２０
μノのＴＥに再懸濁した。
負荷し、ＴＥバッファーで溶出してクラクションを収集
し、次いでプールした。ブタノール抽出＋１．ａＤＮＡ
は一２０℃で一晩エタノール沈澱させた。Ｃを末端につ
ないだａ Ｄ Ｎ Ａ沈澱物を微量遠心機で１５分間遠
心分離を行ない、次いで７０％エタノールで洗滌するこ
とによって収集した。ａ Ｄ Ｎ Ａは乾燥させ、２０
μノのＴＥに再懸濁した。
Ｃを末端につないだａ ｊ） Ａ’ Ａは以下のよ５ｔ
ＣしてＧを末端につないだｐＢＲ３２２ベクターとアニ
ーリングさせた： １９μｌｌ ｅＤ＃Ａ（１００−１５０％ｔ）５μ
ｌ ５Ｘアニ一リング用バツフアー上記成分を混合
し、６５℃に３時間、次いで４２’ＣＫ２時間保った。
ＣしてＧを末端につないだｐＢＲ３２２ベクターとアニ
ーリングさせた： １９μｌｌ ｅＤ＃Ａ（１００−１５０％ｔ）５μ
ｌ ５Ｘアニ一リング用バツフアー上記成分を混合
し、６５℃に３時間、次いで４２’ＣＫ２時間保った。
反応物を室温迄冷却し、その後−２０℃で保存した。製
造業者の教えに従つ【、１００μノの受容能のあるＨＢ
ｌ ０１ （ＢＲＬ＄５Ｂ３０２）ｄ胞を１６ ｓｙ／
２ ａｔのｅ ＤＮＡベクター（上記ンで形質転換し
た。およそ１．０００個のコロニーが生じた。
造業者の教えに従つ【、１００μノの受容能のあるＨＢ
ｌ ０１ （ＢＲＬ＄５Ｂ３０２）ｄ胞を１６ ｓｙ／
２ ａｔのｅ ＤＮＡベクター（上記ンで形質転換し
た。およそ１．０００個のコロニーが生じた。
ウシのａ １） Ｎ Ａライブラリーを、サルのＭＴ−
■配列の５′末端、サルのＭＴ−Ｔｌ配列の５′末端、
およびメタロチオニン共通配列の中央部のアンチセンス
配列をそれぞれコードする３種類のオリがヌクレオチド
（８５−４７，８５−４８，８５−５３；第３表を参照
されたい）の混合物：ならびにサルのメタロチオネイン
（Ｌｌ＋２−１）をコードするクローン化７シグメント
との複製物中で選択した。
■配列の５′末端、サルのＭＴ−Ｔｌ配列の５′末端、
およびメタロチオニン共通配列の中央部のアンチセンス
配列をそれぞれコードする３種類のオリがヌクレオチド
（８５−４７，８５−４８，８５−５３；第３表を参照
されたい）の混合物：ならびにサルのメタロチオネイン
（Ｌｌ＋２−１）をコードするクローン化７シグメント
との複製物中で選択した。
ライブラリーの複製リフト（ｄ％ｐｔｔｃαＣ−にｉ／
ｉｉ）を調製し、それぞれのフィルターに５ｘＳＳＣ，
０，１％ＳＤＳおよびＩＯＸデンハルト（Ｄｍｎｈａｒ
ｄｔ ）溶液を添加し、４２℃で１．５時間プレハイブ
リダイゼーションした。３１ｔ１１類のオリゴヌクレオ
チドはキナーゼ処理し、Ｌ１４２−１挿入物はランダム
プライミング（ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｔｎｉｎｇ） （
５Ｘ １０”ｅｐｔｍ／１ｔｉｉ）によって標識した。
ｉｉ）を調製し、それぞれのフィルターに５ｘＳＳＣ，
０，１％ＳＤＳおよびＩＯＸデンハルト（Ｄｍｎｈａｒ
ｄｔ ）溶液を添加し、４２℃で１．５時間プレハイブ
リダイゼーションした。３１ｔ１１類のオリゴヌクレオ
チドはキナーゼ処理し、Ｌ１４２−１挿入物はランダム
プライミング（ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｔｎｉｎｇ） （
５Ｘ １０”ｅｐｔｍ／１ｔｉｉ）によって標識した。
プレハイブリダイゼーションしたフィルターは５ｘＳＳ
Ｃ中で簡単に洗滌し、−りのフィルターにはオリゴヌク
レオチドプローブ混合物（それぞれ２５μｌずつのオリ
ゴヌクレオチド）を儀加し、他のフィルターにはＬ１４
２−１プローブ（１０／Ｊｊ ）を市川した。５ｘｓｓ
ｃ。
Ｃ中で簡単に洗滌し、−りのフィルターにはオリゴヌク
レオチドプローブ混合物（それぞれ２５μｌずつのオリ
ゴヌクレオチド）を儀加し、他のフィルターにはＬ１４
２−１プローブ（１０／Ｊｊ ）を市川した。５ｘｓｓ
ｃ。
０．１％ ＳＤＳ、１０Ｘデｙ ハＡ／トｆｆ！Ｉｆ！
Ｌｊ＋５よび音波処理したサケの精子ＤＮＡ （最終良
度５００μＰ／Ｊｌｌｊ）ヲ添加し、ハイブリダイゼー
ションを一晩５４℃で続行した。
Ｌｊ＋５よび音波処理したサケの精子ＤＮＡ （最終良
度５００μＰ／Ｊｌｌｊ）ヲ添加し、ハイブリダイゼー
ションを一晩５４℃で続行した。
フィルターは」５０Ｊの０４ｘＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ
溶液中、６５℃で４回、１回に何１５分間ｅｌＣ，Ｍし
た。次いでフィルターなＸ＠フィルムにさらし、それぞ
れについてオートラジオグラフィーを行なった。両方の
プローブとハイブリダイゼーションした６個の陽画、Ａ
−Ｆ、が同定され、これらについてはさらに以下に記載
の方法に従ってその性質を調べた。
溶液中、６５℃で４回、１回に何１５分間ｅｌＣ，Ｍし
た。次いでフィルターなＸ＠フィルムにさらし、それぞ
れについてオートラジオグラフィーを行なった。両方の
プローブとハイブリダイゼーションした６個の陽画、Ａ
−Ｆ、が同定され、これらについてはさらに以下に記載
の方法に従ってその性質を調べた。
小規模調製を陽画Ａ〜Ｆについて行なった。
Ｐｓｇｌ制限消化を製造業者の教えに従って行ない、１
％アガロースゲルで分析した。６個の陽画のうち、クロ
ーンＭＤＢに−Ｃ′を選択した。小規模調製したＬ）Ｎ
Ａは上述のオリゴヌクレオチド混合物で厳ｆｆ１Ｋ調べ
た。プレハイブリダイゼーションは５４℃で３時間（５
ｘｓｓｃ、ｏ、１％ＳＤＳ、 １０Ｘデンハルト＃！
ｇ）行なった。プローブとのハイブリダイゼーションを
同一条件で一晩続行した。
％アガロースゲルで分析した。６個の陽画のうち、クロ
ーンＭＤＢに−Ｃ′を選択した。小規模調製したＬ）Ｎ
Ａは上述のオリゴヌクレオチド混合物で厳ｆｆ１Ｋ調べ
た。プレハイブリダイゼーションは５４℃で３時間（５
ｘｓｓｃ、ｏ、１％ＳＤＳ、 １０Ｘデンハルト＃！
ｇ）行なった。プローブとのハイブリダイゼーションを
同一条件で一晩続行した。
クローンＭＤＢＫ−ＣＩは再びプローブとハイブリダイ
ゼーションし、これをＬ２１９−１と名付けた。
ゼーションし、これをＬ２１９−１と名付けた。
クローンＬ２１９−１の挿入物について制限地図を作成
した。Ｌ２１９−１のおよそ４５０塩基対Ｐ８ ｔ ［
／ Ｂａ鶴Ｂ！フラグメントが５′−および３′−特異
的オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイゼーショ
ンした。Ｌ２１９−１の挿入物をｐＬｌｃ１９内にサブ
クローン化し、クローンＬ２２０−１を得た。
した。Ｌ２１９−１のおよそ４５０塩基対Ｐ８ ｔ ［
／ Ｂａ鶴Ｂ！フラグメントが５′−および３′−特異
的オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイゼーショ
ンした。Ｌ２１９−１の挿入物をｐＬｌｃ１９内にサブ
クローン化し、クローンＬ２２０−１を得た。
実 施 例 ４、 Ｌ２２０−１挿入物の配列Ｌ２２
０−１の挿入物はジデオキシ法〔サンガアメリカ（ＰＮ
ＡＳ）、７４．５４６３（１９７７）］によってその配
列を決足した。ＤＮＡ配列はその配列から推論されるア
ミノ酸配列に翻訳され、このＬ）ＮＡ配列は文献に記載
されたｂＭＴ−国のアミノミＲ配列と１個のアミノ酸が
置換されていることを除いて同一の蛋白負をコードして
いることが分かった。Ｌ２２０−１円のアミノ酸＃１８
のコドンはプロリンをコードしているのに対し【、文献
に記載されたｂＭＴ−１の配夕１ｊはアミノ酸＃１８の
位置にセリンを有している〔ムンゲン（＃５ｓｙｓｓ）
ト リ − （／ Ｂ（：’）、２６０． １００３２
−１００３８（１９８５））。
０−１の挿入物はジデオキシ法〔サンガアメリカ（ＰＮ
ＡＳ）、７４．５４６３（１９７７）］によってその配
列を決足した。ＤＮＡ配列はその配列から推論されるア
ミノ酸配列に翻訳され、このＬ）ＮＡ配列は文献に記載
されたｂＭＴ−国のアミノミＲ配列と１個のアミノ酸が
置換されていることを除いて同一の蛋白負をコードして
いることが分かった。Ｌ２２０−１円のアミノ酸＃１８
のコドンはプロリンをコードしているのに対し【、文献
に記載されたｂＭＴ−１の配夕１ｊはアミノ酸＃１８の
位置にセリンを有している〔ムンゲン（＃５ｓｙｓｓ）
ト リ − （／ Ｂ（：’）、２６０． １００３２
−１００３８（１９８５））。
のｍ築
ＤＮＡは実施例２記載の方法に従ってＭＤＢＫおよびＭ
Ｌ）ＢＫ Ｒから抽出した。ＤＮＡはＴＥバッファー
中に再懸濁し、１５μノのＤＮＡなＬ１丘で消化し、Ｔ
ＨＥバッファーを用いて１．０％アガロースゲル上を電
気泳動させ、ゼータプローブナイロン膜に移し、キナー
ゼ処理した３６マーオリゴヌクレオチドプローブとＬ２
２０−１内のｂＭＴ挿入物のＡＴＧとの結びつきをＩＮ
！Ｌ′８！に祠べた。
Ｌ）ＢＫ Ｒから抽出した。ＤＮＡはＴＥバッファー
中に再懸濁し、１５μノのＤＮＡなＬ１丘で消化し、Ｔ
ＨＥバッファーを用いて１．０％アガロースゲル上を電
気泳動させ、ゼータプローブナイロン膜に移し、キナー
ゼ処理した３６マーオリゴヌクレオチドプローブとＬ２
２０−１内のｂＭＴ挿入物のＡＴＧとの結びつきをＩＮ
！Ｌ′８！に祠べた。
オリゴヌクレオチドの配りＩＪは以下の通りである：５
’−ＣＧＣ−にＧＴ−ＧＣＡ−ＧＧＡ−ＧＣＡ−ＧＴＴ
−ＧＧに−ＡＴＣ−ＣＡＴ−ＧＧ（、”−ＧＡＧ−ＣＴ
に−３’ハイブリダイゼーションの条汗を工以下の通り
である： フィルターを乾燥させ、フィルム下に８６時時間−た。
’−ＣＧＣ−にＧＴ−ＧＣＡ−ＧＧＡ−ＧＣＡ−ＧＴＴ
−ＧＧに−ＡＴＣ−ＣＡＴ−ＧＧ（、”−ＧＡＧ−ＣＴ
に−３’ハイブリダイゼーションの条汗を工以下の通り
である： フィルターを乾燥させ、フィルム下に８６時時間−た。
現像したフィルム＆ＸＭＤＢＫ細胞と比較すれはＭｉｉ
）ＢＫ” 細胞内で増幅された４、７ｈｂの大きさのＬ
↓厘フラグメントを明確に示しており、このフラグメン
トはｂＡＩＴ 遺伝子脛を含んでいると思われる。ゲノ
ムＤＮＡの大１ｍ ｆ！ｌｔフラグメントの１ＪＩ４製
を行ない４．７ｈｂのｐｕｓ…フ２クメントを単離した
。このＦＩＪ’ＡはＰｅｗ ｌで消化し、０．８チアガ
ロースゲルを用いサイズで選択した。ラムダサイズのマ
ーカーを千行く泳動させた。ゲルは尤箱上に置き、サイ
ズ３．５−６に＆のフラグメントを含むゲル部分をレー
ザー刃で削り出し、透析チューブ内に入れた。ＤＮＡ７
−）グメントを透析デユープ内のゲルスライスから電気
的に浴出し、ざらＫＤＮＡをチューブ内の溶成から収集
した。得られた１）！’ＩＡフラグメントは製造業者の
教えに従って、シエレイケル・シェル エルチップ カ
ラム（Ｓａｈｌｍｉａｈｅｒ ａｎｄ ５ｃｈｓにｔ
ｍｔｓ＝ｐ Ｃｏｓ＊ｍｓ）にかけることによって精製
した。
）ＢＫ” 細胞内で増幅された４、７ｈｂの大きさのＬ
↓厘フラグメントを明確に示しており、このフラグメン
トはｂＡＩＴ 遺伝子脛を含んでいると思われる。ゲノ
ムＤＮＡの大１ｍ ｆ！ｌｔフラグメントの１ＪＩ４製
を行ない４．７ｈｂのｐｕｓ…フ２クメントを単離した
。このＦＩＪ’ＡはＰｅｗ ｌで消化し、０．８チアガ
ロースゲルを用いサイズで選択した。ラムダサイズのマ
ーカーを千行く泳動させた。ゲルは尤箱上に置き、サイ
ズ３．５−６に＆のフラグメントを含むゲル部分をレー
ザー刃で削り出し、透析チューブ内に入れた。ＤＮＡ７
−）グメントを透析デユープ内のゲルスライスから電気
的に浴出し、ざらＫＤＮＡをチューブ内の溶成から収集
した。得られた１）！’ＩＡフラグメントは製造業者の
教えに従って、シエレイケル・シェル エルチップ カ
ラム（Ｓａｈｌｍｉａｈｅｒ ａｎｄ ５ｃｈｓにｔ
ｍｔｓ＝ｐ Ｃｏｓ＊ｍｓ）にかけることによって精製
した。
λ１１１０およびλｇｔｌｌクローニングベクターへの
挿入物を調製するにあたって、ＥｅｏＲｌ リンカ−を
サイズで選択したフラグメントの末端に添加した。
挿入物を調製するにあたって、ＥｅｏＲｌ リンカ−を
サイズで選択したフラグメントの末端に添加した。
以下のりンカーを使用した：
１８マー ５’ Ｃ’ＣＴＴＧＡＣＣＧＴＡＡＧＡＣＡ
ＴＧ−３’２２ ｖ −３’ ＧＧＡＡＣＴＧＧＣｉｒ
ＴＣＴＧＴＡＣＴＴＡＡ−５’１８マーは以下の試薬を
混合し、３７℃に１５分間イン牛エベーションすること
によってリン酸化した。
ＴＧ−３’２２ ｖ −３’ ＧＧＡＡＣＴＧＧＣｉｒ
ＴＣＴＧＴＡＣＴＴＡＡ−５’１８マーは以下の試薬を
混合し、３７℃に１５分間イン牛エベーションすること
によってリン酸化した。
２２５ ｐｖｈ０１ｅ８１８マー
水
ｌＯＸ キナーゼバッファー
”Ｐ−ＩＡＴＰ（’１０００ Ｃ４７ｍｍｏｌｅ）キナ
ーゼ２（Ｕ／μｉｉ） ＋ ６．８μｍ １．２μ！ １．０μ！ １．０μｌ ｌＯμｊ 以下の２ａｌ類の試薬を上記混合物に添加し。
ーゼ２（Ｕ／μｉｉ） ＋ ６．８μｍ １．２μ！ １．０μ！ １．０μｌ ｌＯμｊ 以下の２ａｌ類の試薬を上記混合物に添加し。
３７℃で３０分間インキエベーションした。
１０ｗｎ ＡＴＰ １ ｆｉｇキナー
ゼ（２Ｕ／μｉｉ） １μｌその後、＃ｌ
虞は１０分間煮沸することによって不活性化した。２２
マーは２２５ｐ惰＠１−の２２７’−（水を加えて容重
を１５μｌとする〕を添加することによりニリン酸化し
た１８マーとハイブリダイゼーションさせ、６５℃で５
分間インキエペーシミンした。その後反応物はゆっくり
と室温迄冷却した。
ゼ（２Ｕ／μｉｉ） １μｌその後、＃ｌ
虞は１０分間煮沸することによって不活性化した。２２
マーは２２５ｐ惰＠１−の２２７’−（水を加えて容重
を１５μｌとする〕を添加することによりニリン酸化し
た１８マーとハイブリダイゼーションさせ、６５℃で５
分間インキエペーシミンした。その後反応物はゆっくり
と室温迄冷却した。
アダプターの濃度は１５惰憔◎１／μｊとなり、ゲノム
ａＤＮＡ−ベクターの連結反応用に準備された。
ａＤＮＡ−ベクターの連結反応用に準備された。
以下の試薬を混合したニ
ゲノムＤＮＡ
ハイブリダイゼーションしたアダプター（１５１ｍｏｌ
／μｉｉ） 水 ｌＯＸ リガーゼバッファー リガーゼ（１０Ｕ／μＥ） ＋ ゲノム１）ＮＡの ５０倍モル過剰敢 １６μｊ ２μ！ ２μ！ ２０μｊ リンカ−を結合させたゲノムＤＮＡは以下に記載する技
術を用いてリン酸化した。リガーゼは混合物な７２℃に
１５分間加熱することＫよって不活性化した。次いで以
下の試薬を連結反応物に添加し、３７℃に３０分間加熱
した。
／μｉｉ） 水 ｌＯＸ リガーゼバッファー リガーゼ（１０Ｕ／μＥ） ＋ ゲノム１）ＮＡの ５０倍モル過剰敢 １６μｊ ２μ！ ２μ！ ２０μｊ リンカ−を結合させたゲノムＤＮＡは以下に記載する技
術を用いてリン酸化した。リガーゼは混合物な７２℃に
１５分間加熱することＫよって不活性化した。次いで以
下の試薬を連結反応物に添加し、３７℃に３０分間加熱
した。
連結反応物 ２０μｊ水
２４μｊ１０Ｘ キナーゼバッフ
ァー ３μ！ｌＯ鴨ＭＡＴＰ
１７ｔｊ中ナーゼ（２Ｕ／μｉｉ）
２μ！５０μｊ 反応は２μｊの０．５Ｍ−ＥＤＴＡを添加することによ
って停止させ、次いでフェノール／クロロホルム抽出を
１回、クロロホルム抽出を１回行なった。
２４μｊ１０Ｘ キナーゼバッフ
ァー ３μ！ｌＯ鴨ＭＡＴＰ
１７ｔｊ中ナーゼ（２Ｕ／μｉｉ）
２μ！５０μｊ 反応は２μｊの０．５Ｍ−ＥＤＴＡを添加することによ
って停止させ、次いでフェノール／クロロホルム抽出を
１回、クロロホルム抽出を１回行なった。
上記ＤＮＡは以下に記載の技術を用いて精製し、サイズ
で選択した。ＤＮＡはスピードバキュームで〜２０μｌ
に乾燥させた。２．５μＩのゲル積載用染料を添加し、
サンプルはＴＥバッファーで洗滌したバイオゲル（Ｂｌ
ＯＧＥＬ）Ａ−５０カラムに負荷・溶出した。５分間フ
ラクションを収集（〜３０μｇ） シ１１ シンチレー
ションカウンターで針数した。収集した７ラクシヨン（
０，５μｅ）のい（りかは１．５５１７ガロースゲル上
を泳動させた。
で選択した。ＤＮＡはスピードバキュームで〜２０μｌ
に乾燥させた。２．５μＩのゲル積載用染料を添加し、
サンプルはＴＥバッファーで洗滌したバイオゲル（Ｂｌ
ＯＧＥＬ）Ａ−５０カラムに負荷・溶出した。５分間フ
ラクションを収集（〜３０μｇ） シ１１ シンチレー
ションカウンターで針数した。収集した７ラクシヨン（
０，５μｅ）のい（りかは１．５５１７ガロースゲル上
を泳動させた。
ゲルを撮影し、乾燥させ、フィルム下に置いた。
Ｅ、ｏＲＫを木端にもつフラグメントは以下に記載の方
法を用いて１ｇε１１円に連結させた。ＤＮＡを含むフ
ラクションをプールし、ブタノール抽出して２０〜３０
μｊに量を減らし、５μｊ０１０Ｍ−ＮＨ，ＯＡｃ＋
２倍答量のエタノールを添加してＤＮＡを沈澱させた。
法を用いて１ｇε１１円に連結させた。ＤＮＡを含むフ
ラクションをプールし、ブタノール抽出して２０〜３０
μｊに量を減らし、５μｊ０１０Ｍ−ＮＨ，ＯＡｃ＋
２倍答量のエタノールを添加してＤＮＡを沈澱させた。
サンプルは微量遠心機を用いて１５分関連心沈澱させ、
次いで９５％エタノールで洗滌し乾燥させた。ＤＮＡ＋
ヱＴＥバッファー（〜０．１Ｏｐ渦ｏｊ／μ／）中に再
懸濁した。
次いで９５％エタノールで洗滌し乾燥させた。ＤＮＡ＋
ヱＴＥバッファー（〜０．１Ｏｐ渦ｏｊ／μ／）中に再
懸濁した。
連結反応は以下の試薬を含み、１４〜１６℃に一晩イン
キュベーションした。
キュベーションした。
（１μｍのλｇ霧１１ベクターー０．０３５３）惰６Ｊ
ベクター）１ｇε１１（１μＰ／μｉｉ） １μ！
く３μ！ ｌμ１ １μ！ ５μｊ λｇｔ １０およびλｇｓｌｌは製造菓者の教えに従っ
て、ジガパツク・インビトロ・パッケージング・キット
（Ｇｉｇａｐａｃｋ ｉｎ ｆｉｃｒｏ ｐａｃｋαｇ
＝ｎｇ ｈ＝ｔ）〔ストラタゲン（Ｓけα寥αｇａｎｇ
）製〕を用いてパッケージした。その後１９客１１７
アージは人＃Ｍ宿主１’１０８Ｂと共に５枚のプレート
に濃度が〜２０．０００プラーク／プレートになるよう
に平嶺ｊ＠餐した。
ベクター）１ｇε１１（１μＰ／μｉｉ） １μ！
く３μ！ ｌμ１ １μ！ ５μｊ λｇｔ １０およびλｇｓｌｌは製造菓者の教えに従っ
て、ジガパツク・インビトロ・パッケージング・キット
（Ｇｉｇａｐａｃｋ ｉｎ ｆｉｃｒｏ ｐａｃｋαｇ
＝ｎｇ ｈ＝ｔ）〔ストラタゲン（Ｓけα寥αｇａｎｇ
）製〕を用いてパッケージした。その後１９客１１７
アージは人＃Ｍ宿主１’１０８Ｂと共に５枚のプレート
に濃度が〜２０．０００プラーク／プレートになるよう
に平嶺ｊ＠餐した。
夾 施 例 ６． ゲノムライブラリーリスクリーニ
ング ｂＭＴ−２請願領域配列についてのＭＤＢ＆”ゲノムラ
イブラリーを選択するために、２槍類のプロ水 ５Ｘ リガーゼバッファー リガーゼ（１０Ｕ／μＥ） 一ブを作製した。５！施例５で使用した３６マーオリゴ
プローブをキナーゼ処理し、その比活性は５Ｘ １０”
Ｃｐｔｎ／μノであった。大規模プラスミド調製物は
災り例３に記載のｐＬ２２０−１より作製した。プラス
ミドをニックトランスレーションを行ない、七の比活性
は３Ｘ１０’ｃｐ％／μｍであった。複製り７ ） （
ｄ＊ｐｔｉｃａｔｇ １ｉｆｔｓ ） ’Ｉｒ：それぞ
れのプレートから作製した。
ング ｂＭＴ−２請願領域配列についてのＭＤＢ＆”ゲノムラ
イブラリーを選択するために、２槍類のプロ水 ５Ｘ リガーゼバッファー リガーゼ（１０Ｕ／μＥ） 一ブを作製した。５！施例５で使用した３６マーオリゴ
プローブをキナーゼ処理し、その比活性は５Ｘ １０”
Ｃｐｔｎ／μノであった。大規模プラスミド調製物は
災り例３に記載のｐＬ２２０−１より作製した。プラス
ミドをニックトランスレーションを行ない、七の比活性
は３Ｘ１０’ｃｐ％／μｍであった。複製り７ ） （
ｄ＊ｐｔｉｃａｔｇ １ｉｆｔｓ ） ’Ｉｒ：それぞ
れのプレートから作製した。
一組のリフト（１ｉｆｔ）を６ＸＳＳＰＥ、５Ｘデンハ
、／ｌ／ト（１）ａｎｈａｒｄｔ ）溶液、２５％ホル
ムアミド、０．１％ＳＤＳ、 おｊヒ２００＃／ｊｌ
ｊ ノｌ［ＪｌｆｒＬ４．−＝シン精子ＤＮＡおよび〜
ｌ Ｘ １０’ ｃｐｔｍ／就のプローブの混合物中、
１７時間、４２℃でオリゴプローブとハイブリダイゼー
ションさせた。次いでフィルターを０．２ＸＳＳＰＥお
よび０．１％５Ｌ）Ｓ混合駁中、５５℃で、数回洗滌（
それぞれ１５分間ずつｅｌｃｍ）Ｌ、、た。フィルター
はスクリーン何フィルム下に一装置いた。
、／ｌ／ト（１）ａｎｈａｒｄｔ ）溶液、２５％ホル
ムアミド、０．１％ＳＤＳ、 おｊヒ２００＃／ｊｌ
ｊ ノｌ［ＪｌｆｒＬ４．−＝シン精子ＤＮＡおよび〜
ｌ Ｘ １０’ ｃｐｔｍ／就のプローブの混合物中、
１７時間、４２℃でオリゴプローブとハイブリダイゼー
ションさせた。次いでフィルターを０．２ＸＳＳＰＥお
よび０．１％５Ｌ）Ｓ混合駁中、５５℃で、数回洗滌（
それぞれ１５分間ずつｅｌｃｍ）Ｌ、、た。フィルター
はスクリーン何フィルム下に一装置いた。
もう−組のフィルターの複表物を、５ＸＳＳＰＥおよび
５０％ホルムアミドｆ６ｘｓｓＰＥおよび２５％ホルム
アミドの代わりに使用するＩ＃ヲ除いてはオリゴプロー
ブの場合と同−条件でプラスミドプローブとハイブリダ
イゼーションさせた。フィルターを０．ｌＸ５ＳＰＥお
よび０．１％ｓＤｓ中、６５℃で数回洗滌し、スクリー
ン付フィルム下に一装置いた。
５０％ホルムアミドｆ６ｘｓｓＰＥおよび２５％ホルム
アミドの代わりに使用するＩ＃ヲ除いてはオリゴプロー
ブの場合と同−条件でプラスミドプローブとハイブリダ
イゼーションさせた。フィルターを０．ｌＸ５ＳＰＥお
よび０．１％ｓＤｓ中、６５℃で数回洗滌し、スクリー
ン付フィルム下に一装置いた。
複製り７ ） （ｄｓｐｌｉａａｓａ Ｉｓ／＠ｇ ）
のフィルムを現像し、オリゴおよびプラスミドプローブ
と相同の挿入配列からなるλクローンを表わしているハ
イブリダイゼーションのスポットを比較した。
のフィルムを現像し、オリゴおよびプラスミドプローブ
と相同の挿入配列からなるλクローンを表わしているハ
イブリダイゼーションのスポットを比較した。
ＡＩ’Ｇ捕獲用プローブとハイブリダイゼーションした
１２個の陽性の可能性のあるクローンが同定された。プ
ラスミドｐＬ２２０−１とのハイブリダイゼーションを
エバツクグラウンドが高くなったためにこのプローブと
ハイブリダイゼーションしたｂＭＴ プロモーターエ
レメント配列を含むクローンを同定することは不可能で
あった。バックグラクンドはプローブ内の配列とλｇｉ
ｌｌベクター内配り１１および大１１ｋＹｌｉＹ １０
ｓ ａ宿主内配タリとの間の相同性によるものである
。
１２個の陽性の可能性のあるクローンが同定された。プ
ラスミドｐＬ２２０−１とのハイブリダイゼーションを
エバツクグラウンドが高くなったためにこのプローブと
ハイブリダイゼーションしたｂＭＴ プロモーターエ
レメント配列を含むクローンを同定することは不可能で
あった。バックグラクンドはプローブ内の配列とλｇｉ
ｌｌベクター内配り１１および大１１ｋＹｌｉＹ １０
ｓ ａ宿主内配タリとの間の相同性によるものである
。
２個のクローン、λＢＭ＃Ｔ９およびλＢＭＴ１２を選
び、その性質を調べた。これらのクローンはプラーク＆
製を行ない、ベンソン（Ｂ−％５ｏｎ）ｒ：）％バイオ
テクニックス（Ｂｉｏｔｍｃｋｎｉｑｓａｓ）、１９８
４年５月７６月、１２６頁に記載の方法に促りて小規模
ｖ４製を行なりた。クローンλＢＭＴ９ およびλＢＭ
Ｔ１２クローンへの挿入サイズは、小規模調製物をＥｃ
ｏ Ｒｌで消化し【挿入物を切り出し、０．８％アガロ
ースゲル上に消化生成物を泳動させることによって決定
した。φＸ１７４色υ川−消化用）ＮＡおよびλＢｉｎ
ｄｌｌ−消化ＤＮＡのサイズマーカーを平行応動させた
。美化エテジ９ム染色の結果、内挿入物のサイズは４．
７＆６であった。最初Ｋ（Ｐｉ化した小規模網製ＤＮＡ
の他方のアリコートｔｏ、８％の帛二のアガロースゲル
上に泳動させ、両方のアガロースゲルを完全に乾燥させ
た。核酸を変性・中相後、ゲルは前記方法に従ってＡ７
”Ｇ−捕獲用オリゴまたはｐＬ２２０−１のと’ｂｂか
のプローブとハイブリダイゼーションさせた。内挿入物
は両方のプローブとハイブリダイゼーションした。
び、その性質を調べた。これらのクローンはプラーク＆
製を行ない、ベンソン（Ｂ−％５ｏｎ）ｒ：）％バイオ
テクニックス（Ｂｉｏｔｍｃｋｎｉｑｓａｓ）、１９８
４年５月７６月、１２６頁に記載の方法に促りて小規模
ｖ４製を行なりた。クローンλＢＭＴ９ およびλＢＭ
Ｔ１２クローンへの挿入サイズは、小規模調製物をＥｃ
ｏ Ｒｌで消化し【挿入物を切り出し、０．８％アガロ
ースゲル上に消化生成物を泳動させることによって決定
した。φＸ１７４色υ川−消化用）ＮＡおよびλＢｉｎ
ｄｌｌ−消化ＤＮＡのサイズマーカーを平行応動させた
。美化エテジ９ム染色の結果、内挿入物のサイズは４．
７＆６であった。最初Ｋ（Ｐｉ化した小規模網製ＤＮＡ
の他方のアリコートｔｏ、８％の帛二のアガロースゲル
上に泳動させ、両方のアガロースゲルを完全に乾燥させ
た。核酸を変性・中相後、ゲルは前記方法に従ってＡ７
”Ｇ−捕獲用オリゴまたはｐＬ２２０−１のと’ｂｂか
のプローブとハイブリダイゼーションさせた。内挿入物
は両方のプローブとハイブリダイゼーションした。
さらに第二の小規模調製をλＢＭＴ９ について行な
った。制限地図は、小規模１１１製ＤＮＡのアリコート
な製造業者の教えに従クズ以下の酵素：Ｂ６．Ｈ１・
加電・ ４エニ！匡・墾ｌ・！上！！・！二！−３、！
、佐ｚｃｌ、Δ嵯」：で消化することによって作製した
。λＢＭＴ９０制御ａ池図を第１図に示す。
った。制限地図は、小規模１１１製ＤＮＡのアリコート
な製造業者の教えに従クズ以下の酵素：Ｂ６．Ｈ１・
加電・ ４エニ！匡・墾ｌ・！上！！・！二！−３、！
、佐ｚｃｌ、Δ嵯」：で消化することによって作製した
。λＢＭＴ９０制御ａ池図を第１図に示す。
λＢＭＴ９を大規模調製し、挿入１）ＮＡをＥｇＯＲ１
消化により切り出した。挿入物ＶＯ，Ｓラアガロースゲ
ルの電気泳動によって精製した。４．７ｋｂフラグメン
トをゲルから切り出し、フラグメントを透析チューブ内
に電気溶出した。次いでフラグメントをエルチップカラ
ムで精製した。挿入物のさまさヱなサブクローンなＭ１
３内に構築し、次いでサンガー（Ｓａｎｇｅｒ ）のジ
デオキシ配列決定決しサンガー（Ｓａｐｇａｒ、 Ｆ、
）およびコクルソクン（Ａ、Ｒ，Ｃｏ５１ ａｏｓｓ
）、′″ＤＮＡＤＮＡポリメラゼ合成によるＤＮＡ配列
決定迅速法（Ａ ＲａｐｉｄＭｅｔｈｏｄ ｆｏｒ
１）ｍｔａｒｔ＊ｉｎｉｎｇ Ｓａｑｓｍｓ異種
ｉｎ ＤＮＡｂｙ Ｐｒｉｖｈｍｄ ５ｙｎｔ
ｈａｓｔｓ ５ｍ１ｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｍ
ｒＢａａ；トの配タリを決定した。
消化により切り出した。挿入物ＶＯ，Ｓラアガロースゲ
ルの電気泳動によって精製した。４．７ｋｂフラグメン
トをゲルから切り出し、フラグメントを透析チューブ内
に電気溶出した。次いでフラグメントをエルチップカラ
ムで精製した。挿入物のさまさヱなサブクローンなＭ１
３内に構築し、次いでサンガー（Ｓａｎｇｅｒ ）のジ
デオキシ配列決定決しサンガー（Ｓａｐｇａｒ、 Ｆ、
）およびコクルソクン（Ａ、Ｒ，Ｃｏ５１ ａｏｓｓ
）、′″ＤＮＡＤＮＡポリメラゼ合成によるＤＮＡ配列
決定迅速法（Ａ ＲａｐｉｄＭｅｔｈｏｄ ｆｏｒ
１）ｍｔａｒｔ＊ｉｎｉｎｇ Ｓａｑｓｍｓ異種
ｉｎ ＤＮＡｂｙ Ｐｒｉｖｈｍｄ ５ｙｎｔ
ｈａｓｔｓ ５ｍ１ｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｍ
ｒＢａａ；トの配タリを決定した。
λＢＭＴ９挿入物の配列（第１表）を他極のメタロチオ
ネインプロモーターエレメントの既知配列と比較した。
ネインプロモーターエレメントの既知配列と比較した。
（Ｉ数の金属ｐ４節領域、” ＴＡＴＡ”ボックスおよ
びイニシエーターＡＴＧを同定することにより、λＢＭ
Ｔ９挿入物はＭＴプロモーターエレメントを含んでいる
と同定された。λＢＭＴ９の構造遺伝子の配夕１１とす
でに報告され【いる６、ｖｒ−ｉ歳日買のアミノミｌ配
列の比較より、λＢＭＴ９挿入物を工１）ＭＴ−＠プロ
モーターエレメントおよび構造遺伝子の一部ｔコードし
ていることが同定された。
びイニシエーターＡＴＧを同定することにより、λＢＭ
Ｔ９挿入物はＭＴプロモーターエレメントを含んでいる
と同定された。λＢＭＴ９の構造遺伝子の配夕１１とす
でに報告され【いる６、ｖｒ−ｉ歳日買のアミノミｌ配
列の比較より、λＢＭＴ９挿入物を工１）ＭＴ−＠プロ
モーターエレメントおよび構造遺伝子の一部ｔコードし
ていることが同定された。
実厖例８． ｐＬ２６０のＳ築
プラスミドｐＬ１７−１はｐＢＲ３２２を基礎にして作
製した１ラスミドであり、５′ および３′ＭＳＶ
ＬＴＲ５の両方を含む。５’ＬＴＲ−含有フラグメント
は、ｔｊＬｖＪに大規模ブラスト、ｉＩ４製を行ない〔
マニアテス（Ｍａｎｉａｔｉａ）も〕、次に製造業者の
教えに従りてＥｅｏＲＩＭよびＰａｔＫで消化すること
により”ＣｐＬ１７−１から切り出した。適正なサイズ
の７２グメントを１％アガロースゲル上で同定し、単離
した。およそ１６８０ ｈｐ ｆ）ＬＴＲ−含有フラグ
メントな、あらかじめムリ！およびＥｃＯＲｌで切断し
ておいたｐＬｌｃｌｆ３プラスミドＤＮＡに結合させた
。結合条件は久の通りである：それぞれのフラグメント
〜ｌ ００ ｎｙを結合反応混合物中に添加し、Ｔ４リ
ガーゼを加えて１４℃に一装置いた。結合生Ｉｉｔ物は
細菌＃Ｂ１０１細胞円に形質転換した。形ＪＪ＆転換株
はΔ−、１４によって選択した。
製した１ラスミドであり、５′ および３′ＭＳＶ
ＬＴＲ５の両方を含む。５’ＬＴＲ−含有フラグメント
は、ｔｊＬｖＪに大規模ブラスト、ｉＩ４製を行ない〔
マニアテス（Ｍａｎｉａｔｉａ）も〕、次に製造業者の
教えに従りてＥｅｏＲＩＭよびＰａｔＫで消化すること
により”ＣｐＬ１７−１から切り出した。適正なサイズ
の７２グメントを１％アガロースゲル上で同定し、単離
した。およそ１６８０ ｈｐ ｆ）ＬＴＲ−含有フラグ
メントな、あらかじめムリ！およびＥｃＯＲｌで切断し
ておいたｐＬｌｃｌｆ３プラスミドＤＮＡに結合させた
。結合条件は久の通りである：それぞれのフラグメント
〜ｌ ００ ｎｙを結合反応混合物中に添加し、Ｔ４リ
ガーゼを加えて１４℃に一装置いた。結合生Ｉｉｔ物は
細菌＃Ｂ１０１細胞円に形質転換した。形ＪＪ＆転換株
はΔ−、１４によって選択した。
Ｌ）ＩＶＡの小ｆｉ４．＠Ｗ４良を形質転換株について
行ない、診断用＃巣でＩｌｌ ｍ ｒ白化を行なうこと
によって１クスミドが過正にＳ巣され【いることを確認
した。
行ない、診断用＃巣でＩｌｌ ｍ ｒ白化を行なうこと
によって１クスミドが過正にＳ巣され【いることを確認
した。
得られたプラスミドをｐＬ１５３と命名した。
プラスミドｐＬ３Ｂはニワトリ成長ホルモン（ｃＧＨ）
を発現させるために設酊した組俟レトロウィルスベクタ
ーである。５’ＬＴＲはＭＳＶ Ｋ由来し５．ＧＩｌ遺
伝子の発現を促進するために用いられる。ｊｌＩｌ鴫の
ネオマイシン遺伝子（ｎｅｏ ）は真核細胞の選択マー
カーとしてプラスミドに用いられている。その発現はマ
ウスのメタロチオネインプロモーター（ｂＭＴ−１）に
よって１１１４節されてい６゜３’ＬＴＲｘｖｉ：ｙＨ
裏ＡｆＬＪ’ Ｋ由来Ｌ、５’ＬＴＲと共に、ベクター
内に３’Ｌ１’Ｒが存在すると真核細胞ゲノム内ヘブラ
スミドを任意に単コピーで組込むことが可能になる。ｐ
Ｌ３８の大観ｗ調製を行なった。ＤＮＡを互ｔｎｄ ｌ
［および色轡Ｂｌで消化し、およそ３２２０ ｈｐの小
さい方のフラグメントを単離した。このフラグメントに
ｔ工ｇＬＭ’ｒ −舊−Ｏ発現ユニットが含まれる。Ｈ
ｃＬ、 Ｂ ｌおよびＥｅｏＲｌを用いて第二の消化を
行なうと細菌の複製開始点（ｏｒｉ ）、細菌のアンピ
シリン耐性遺伝子（ａｖｍｐ ） ′Ｐ６よひＭＬＶ
ＬＴＲｆ含む〜４２６０ｈｐのフラグメントが得られ
た。
を発現させるために設酊した組俟レトロウィルスベクタ
ーである。５’ＬＴＲはＭＳＶ Ｋ由来し５．ＧＩｌ遺
伝子の発現を促進するために用いられる。ｊｌＩｌ鴫の
ネオマイシン遺伝子（ｎｅｏ ）は真核細胞の選択マー
カーとしてプラスミドに用いられている。その発現はマ
ウスのメタロチオネインプロモーター（ｂＭＴ−１）に
よって１１１４節されてい６゜３’ＬＴＲｘｖｉ：ｙＨ
裏ＡｆＬＪ’ Ｋ由来Ｌ、５’ＬＴＲと共に、ベクター
内に３’Ｌ１’Ｒが存在すると真核細胞ゲノム内ヘブラ
スミドを任意に単コピーで組込むことが可能になる。ｐ
Ｌ３８の大観ｗ調製を行なった。ＤＮＡを互ｔｎｄ ｌ
［および色轡Ｂｌで消化し、およそ３２２０ ｈｐの小
さい方のフラグメントを単離した。このフラグメントに
ｔ工ｇＬＭ’ｒ −舊−Ｏ発現ユニットが含まれる。Ｈ
ｃＬ、 Ｂ ｌおよびＥｅｏＲｌを用いて第二の消化を
行なうと細菌の複製開始点（ｏｒｉ ）、細菌のアンピ
シリン耐性遺伝子（ａｖｍｐ ） ′Ｐ６よひＭＬＶ
ＬＴＲｆ含む〜４２６０ｈｐのフラグメントが得られ
た。
ｐＬ１５３の大規模プラスミド調製を行ない、ＭＳＶ
ＬＴＮ−含有フラグメント？：Ｈｃｏ ＲＥ ｊｄよ
ひｌ１ｉｎｄ ｌ［消化により切り出した。適正サイズ
の７２グメント（およそ１２００ ｈｐ）’ｌアガロー
スゲルより同定し単離した。
ＬＴＮ−含有フラグメント？：Ｈｃｏ ＲＥ ｊｄよ
ひｌ１ｉｎｄ ｌ［消化により切り出した。適正サイズ
の７２グメント（およそ１２００ ｈｐ）’ｌアガロー
スゲルより同定し単離した。
単離した３棟類のフラグメントは標準的な結合条件を用
いて結合させた。細菌細胞を連結反応混合物で形質転換
し、その後アンピシリン含有培地内で増殖させた。形質
転換株は株のアンピシリン中での増殖能によって同定し
た。プラスミドを形質転換株から回収し、さらに分析用
＃素で消化してプラスミドの組立てが適正であることを
確認した。 Ｈｉｎｄｆｌ／Ｈ異種Ｈ！消化により５４
９９および３２１５ ｈｐの２８類のバンドが得られた
；＃ｊｍ１１１ ／ ＢａｖｎＢ ｌ １Ｅｃｏ ＲＩ
Ｍ化により４３１Ｏ１３１８４，１１８９、および３１
（目でを工４Ｍ認できない）のバンドが得られた。得ら
れたプラスミドをｐＬ１５６と命名した。
いて結合させた。細菌細胞を連結反応混合物で形質転換
し、その後アンピシリン含有培地内で増殖させた。形質
転換株は株のアンピシリン中での増殖能によって同定し
た。プラスミドを形質転換株から回収し、さらに分析用
＃素で消化してプラスミドの組立てが適正であることを
確認した。 Ｈｉｎｄｆｌ／Ｈ異種Ｈ！消化により５４
９９および３２１５ ｈｐの２８類のバンドが得られた
；＃ｊｍ１１１ ／ ＢａｖｎＢ ｌ １Ｅｃｏ ＲＩ
Ｍ化により４３１Ｏ１３１８４，１１８９、および３１
（目でを工４Ｍ認できない）のバンドが得られた。得ら
れたプラスミドをｐＬ１５６と命名した。
プラスミドｐＬ１５６は右回り方向に以下の遺伝子：
ＭＳ Ｖ Ｌ Ｔ Ｒ１５Ａｆ Ｔ −ｎｅｏ、 Ｍ
ＬＶ ＬＴ Ｒ。
ＭＳ Ｖ Ｌ Ｔ Ｒ１５Ａｆ Ｔ −ｎｅｏ、 Ｍ
ＬＶ ＬＴ Ｒ。
細菌のａ裂開始点、および細菌α溝ｐ：を含んでいた。
ｐＬ１５６の大規模プラスミドｇ１４＆！物について角
化を２回別々に行ない、それぞれ％ＭＴ−ｎｅ。
化を２回別々に行ない、それぞれ％ＭＴ−ｎｅ。
発現ユニットおよびプラスミド配列＋ＬＴＲを単離した
。最ｖＪＫ Ｈｉｎｄ ［［／ Ａｓｓ ｆｉの二重消
化を行なった。この消化により二種類のフラグメントが
得られた。そのうちの一種類のフラグメントはおよそ５
６６０ ｈｐであり、５’ＭＳＶ ＬＴＲおよび３′
ＭＬＶ ＬＴＲが含１れていた。このフラグメントを
アガロースゲルから単離した。さらにｐＬ１５６をＥｃ
ｏＲＩ／’５譬１で二重消化を行ない、３種類のフラグ
メントを得た。中間サイズのフラグメント（およそ３．
ｏｏＯｂｐ）は惰ＭＴ−ｎｅｏ発現ユニットを含んでい
た。このフラグメントをアガロースゲル上で同定し単離
した。
。最ｖＪＫ Ｈｉｎｄ ［［／ Ａｓｓ ｆｉの二重消
化を行なった。この消化により二種類のフラグメントが
得られた。そのうちの一種類のフラグメントはおよそ５
６６０ ｈｐであり、５’ＭＳＶ ＬＴＲおよび３′
ＭＬＶ ＬＴＲが含１れていた。このフラグメントを
アガロースゲルから単離した。さらにｐＬ１５６をＥｃ
ｏＲＩ／’５譬１で二重消化を行ない、３種類のフラグ
メントを得た。中間サイズのフラグメント（およそ３．
ｏｏＯｂｐ）は惰ＭＴ−ｎｅｏ発現ユニットを含んでい
た。このフラグメントをアガロースゲル上で同定し単離
した。
プラスミドｐＬ２２３はウシー成長ホルモンＣｂＧＩＩ
）ｃＤＮＡ 配列を含むｐ Ｕ Ｃ９を基本としたプラ
スミドである。ｐＬ２２３の大規模プラスミド１Ｌｌｆ
Ｉ製を行ない、ｂＧＩＩ ｅＤＮＡをＥｃｏＲＥ／Ｂ
ｉｎｄ ｉｉの二に消化によりｐＬ２２３から切り出し
た。二種類の７２グメ７トがこの消化の結果得られた。
）ｃＤＮＡ 配列を含むｐ Ｕ Ｃ９を基本としたプラ
スミドである。ｐＬ２２３の大規模プラスミド１Ｌｌｆ
Ｉ製を行ない、ｂＧＩＩ ｅＤＮＡをＥｃｏＲＥ／Ｂ
ｉｎｄ ｉｉの二に消化によりｐＬ２２３から切り出し
た。二種類の７２グメ７トがこの消化の結果得られた。
小さい方のおよそ９００ｂｐフラグメントはｂＧＢ配列
を含んでいた。このフラグメントをアガロースゲル上で
同定し、単離した。
を含んでいた。このフラグメントをアガロースゲル上で
同定し、単離した。
互り！！／舊セリ瓜フラグメント、白ｔｏＲｌ ／Ａき
ＵフラグメントおよびＡａｓｌ／Ｈ４ｔη」フラグメン
トを用いた三通りの連結反応を標準的な連結反応条件下
で行なった。［１を得られたプラスミドｐＬ２３９で形
質転換し、アンピシリン耐性形質転換株を選択した。ｐ
Ｌ２３９は唯一可能な連結反応生成物であり、このこと
は小規模ｇ４製したＤＮＡの分析用消化により同定した
。プラスミドｐＬ２３９は右回り方向に以下の遺伝子：
５’ＭｙＬＴＲ％ｈＧＨ６ＤＮＡ、ｍＭＴ−ｓａｏ発
現ユニット、３’ＭＬｉ／ ＬＴＲ，および細菌の複
製開始点ｏｒｉおよび異種ｐ遺伝子を含んでいる。
ＵフラグメントおよびＡａｓｌ／Ｈ４ｔη」フラグメン
トを用いた三通りの連結反応を標準的な連結反応条件下
で行なった。［１を得られたプラスミドｐＬ２３９で形
質転換し、アンピシリン耐性形質転換株を選択した。ｐ
Ｌ２３９は唯一可能な連結反応生成物であり、このこと
は小規模ｇ４製したＤＮＡの分析用消化により同定した
。プラスミドｐＬ２３９は右回り方向に以下の遺伝子：
５’ＭｙＬＴＲ％ｈＧＨ６ＤＮＡ、ｍＭＴ−ｓａｏ発
現ユニット、３’ＭＬｉ／ ＬＴＲ，および細菌の複
製開始点ｏｒｉおよび異種ｐ遺伝子を含んでいる。
ベクターｐＬ２６０は、以下の方法に従り【ｐＬ２３９
からｂＧＩＩ遺伝子およびｇ％ＭＴプロモーターを切り
出すことによって構築した。ｐＬ２３９の大規模プラス
ミド調製を行ない、ＢｙｌＢで消化して二ａ類のフラグ
メントを得た。大きい方のベクターフラグメント（およ
そ６７５ Ｑ ｈｐ）を７ガロースゲル上で同定し・単
離した。直線状ベクターはＤＮＡ Ｔ４リガーゼを用
いて環化した。
からｂＧＩＩ遺伝子およびｇ％ＭＴプロモーターを切り
出すことによって構築した。ｐＬ２３９の大規模プラス
ミド調製を行ない、ＢｙｌＢで消化して二ａ類のフラグ
メントを得た。大きい方のベクターフラグメント（およ
そ６７５ Ｑ ｈｐ）を７ガロースゲル上で同定し・単
離した。直線状ベクターはＤＮＡ Ｔ４リガーゼを用
いて環化した。
得られたプラスミドｐＬ２６０！’Ｌプラスミドで形質
転換した異種ｐ”１ｌＬｊ−細胞から小規模調製したＤ
ＮＡによってＮ認した。このプラスミドは細菌の異種ｐ
遺伝子および複製開始点と共に５１Ｍ５ＶＬＴＲ１ｌａ
ｋｌｅＤｎｙｉＲ伝子Ｍ！Ｕ３’ ＭＬＶ ＬＴＲから
なる。プラスミドｐ１２６０（第３図）はおよそ６７０
０ ｈｐである。このプラスミドの構築法を説明するフ
ローチャートを第５図Ａに提供する。
転換した異種ｐ”１ｌＬｊ−細胞から小規模調製したＤ
ＮＡによってＮ認した。このプラスミドは細菌の異種ｐ
遺伝子および複製開始点と共に５１Ｍ５ＶＬＴＲ１ｌａ
ｋｌｅＤｎｙｉＲ伝子Ｍ！Ｕ３’ ＭＬＶ ＬＴＲから
なる。プラスミドｐ１２６０（第３図）はおよそ６７０
０ ｈｐである。このプラスミドの構築法を説明するフ
ローチャートを第５図Ａに提供する。
以下の操作を行ない、ｂＭＴ−ｂＧＭｆ夾施例８で作製
した組換え戯発現ベクターｐＬ２６０ 内に挿入した
。
した組換え戯発現ベクターｐＬ２６０ 内に挿入した
。
プラスミドｐＢＧＨ１０ＡはｂＧＭ ａＤＮＡからな
るｐＢＲ３２２を基本としたプラスミドである。
るｐＢＲ３２２を基本としたプラスミドである。
ｐ Ｂ ＧＪＩ １０ Ａ ノ大ｍ模フラスミ）’ＩＪ
Ｑ装物１ｋＰｓｔＩで部分ｍ化して数ａ鎮め具なるフラ
グメントを得た。このうち１つのフラグメントはおよそ
９１０ｈｐであり、５′コ一ド配列が９ｂｐ欠落したｂ
ＧＢ配列であった。このフラグメントをアガロースゲル
上で同定し単離した。プラスミドｐｕｃｇはＰａｔｌ消
化によりて直線状にし、その後ゲルから単離した。Ｐａ
ｔｌ−消化のｐｕｃｇと加！を床端にもりｂＧＥフラグ
メントの連結反応を標準的方法で行なった。細菌を連結
反応混合物で形質転換し、ａ講ｐ ：ｔａ＝−を選択
した。小規模調製したＤＮＡを分析用酵素消化すること
によつ【連結反応が適正に構築されていることを確認し
、このプラスミドなｐＬ１８７と命令した。Ａｐ（Ｌ
１ ／ Ｐｇ ｔＩ消化によりベクターフラグメン）＋
３２０参ｈｐのバンドが得られた。ｌ１ｉｎｄｌｌ −
ＥａｏＲｌｉ化によりベクター＋ ９００ ｂＰのバン
ドが得られた。
Ｑ装物１ｋＰｓｔＩで部分ｍ化して数ａ鎮め具なるフラ
グメントを得た。このうち１つのフラグメントはおよそ
９１０ｈｐであり、５′コ一ド配列が９ｂｐ欠落したｂ
ＧＢ配列であった。このフラグメントをアガロースゲル
上で同定し単離した。プラスミドｐｕｃｇはＰａｔｌ消
化によりて直線状にし、その後ゲルから単離した。Ｐａ
ｔｌ−消化のｐｕｃｇと加！を床端にもりｂＧＥフラグ
メントの連結反応を標準的方法で行なった。細菌を連結
反応混合物で形質転換し、ａ講ｐ ：ｔａ＝−を選択
した。小規模調製したＤＮＡを分析用酵素消化すること
によつ【連結反応が適正に構築されていることを確認し
、このプラスミドなｐＬ１８７と命令した。Ａｐ（Ｌ
１ ／ Ｐｇ ｔＩ消化によりベクターフラグメン）＋
３２０参ｈｐのバンドが得られた。ｌ１ｉｎｄｌｌ −
ＥａｏＲｌｉ化によりベクター＋ ９００ ｂＰのバン
ドが得られた。
プラスミドｐＬ１８’ｌはｐＵＣ９プラスミド配タリか
らなり、細菌のａｓｐ遺伝子およびｏｒ＜、ならびにｂ
ＧＩｉのほぼ完全なコード配列を含む。ｐＬ１８７内で
のｂＧＨフラグメントの方向はｐＢＧＨ１０Ｊ内のそれ
とは反対である。
らなり、細菌のａｓｐ遺伝子およびｏｒ＜、ならびにｂ
ＧＩｉのほぼ完全なコード配列を含む。ｐＬ１８７内で
のｂＧＨフラグメントの方向はｐＢＧＨ１０Ｊ内のそれ
とは反対である。
欠失した５’−１００Ｍ配列は以下に記載した３通りの
フラグメントの連結反応に従って再設置した。
フラグメントの連結反応に従って再設置した。
ｐＬ１８７のｂＧＩＩ遺伝子の５′床端はＰｓｔｌ／Ａ
ｐａ Ｉ酵素によって大規模プラスミドｖｆ４製物を消
化することにより、およそ３１５ ｈｐのＰａｇｌ／Ａ
’ｌＪＧ Ｉ フラグメントとして単離した。適正サイ
ズのフラグメントｔゲル上に表われた数機類のｐａｔｌ
／ Ａｐａ １フラグメントから同定し、単離した。
ｐａ Ｉ酵素によって大規模プラスミドｖｆ４製物を消
化することにより、およそ３１５ ｈｐのＰａｇｌ／Ａ
’ｌＪＧ Ｉ フラグメントとして単離した。適正サイ
ズのフラグメントｔゲル上に表われた数機類のｐａｔｌ
／ Ａｐａ １フラグメントから同定し、単離した。
調製したｐＬ１８７についてＭｉｎｄＷｉ／ ＡｐａＩ
消化を行ない、大きなおよそ３１８０ ｈｐのフラグメ
ントを同定、単離した。このフラグメントはｐＬ１８７
プラスミド配列の大部分を含んでいる。
消化を行ない、大きなおよそ３１８０ ｈｐのフラグメ
ントを同定、単離した。このフラグメントはｐＬ１８７
プラスミド配列の大部分を含んでいる。
ω１／Ａｐａｌおよびシ費ｌ／懸剪但フラグメントは二
本鎖の合成オリゴヌクレオチドと共に３通りのフラグメ
ントリ連結反応に用いた。この二本鎖の合成オリゴヌク
レオチドｉｔ／Ｘ！した５’−ｂＧＩｉ配列を元通り添
加し、さらにｂＧＨ遺伝子の５′宋趨に従来存在するＢ
ｔ％ｄＩＩＩおよびＰａ＃ｌサイトに加えてさらに２つ
のクローニングサイト（Ｂｙｌ ＭおよびＮｅｏ ｌ
）を形成するために供給した。連結反応の条件は標準的
である。合成オリゴヌクレオチド対の配列は以下の通り
である： ！ＬｉｊｉｌＩｌ 垣１５’ ＡＧ
ＣＴＴＡＧＡＴ（、”ｉ’ＣＣＩＡＴＧｊＧＣ１’ＧＣ
’Ａ ３’、ｆｆこ了ＡＧＡにＧ ＴＡ（、’ （
Ｘ：細菌（ＡｆＣ１０６１）を連結反応混合物で形質転
換し、ａｔ’ｎｐ”コロニーを選択した。得られたプラ
スミドをｐＬ２２３と命名し、小規模肖製したＤＮＡの
分析用ｆＦＩ化により同定した。（真５ｄｌｌｌ、〜」
ＩまたはＢｙｌｒｉで消化して正しいベクターを直線状
にした。）プラスミドｐＬ２２３はｂＧＩｉの完全なコ
ード配夕１］を含んでいた。
本鎖の合成オリゴヌクレオチドと共に３通りのフラグメ
ントリ連結反応に用いた。この二本鎖の合成オリゴヌク
レオチドｉｔ／Ｘ！した５’−ｂＧＩｉ配列を元通り添
加し、さらにｂＧＨ遺伝子の５′宋趨に従来存在するＢ
ｔ％ｄＩＩＩおよびＰａ＃ｌサイトに加えてさらに２つ
のクローニングサイト（Ｂｙｌ ＭおよびＮｅｏ ｌ
）を形成するために供給した。連結反応の条件は標準的
である。合成オリゴヌクレオチド対の配列は以下の通り
である： ！ＬｉｊｉｌＩｌ 垣１５’ ＡＧ
ＣＴＴＡＧＡＴ（、”ｉ’ＣＣＩＡＴＧｊＧＣ１’ＧＣ
’Ａ ３’、ｆｆこ了ＡＧＡにＧ ＴＡ（、’ （
Ｘ：細菌（ＡｆＣ１０６１）を連結反応混合物で形質転
換し、ａｔ’ｎｐ”コロニーを選択した。得られたプラ
スミドをｐＬ２２３と命名し、小規模肖製したＤＮＡの
分析用ｆＦＩ化により同定した。（真５ｄｌｌｌ、〜」
ＩまたはＢｙｌｒｉで消化して正しいベクターを直線状
にした。）プラスミドｐＬ２２３はｂＧＩｉの完全なコ
ード配夕１］を含んでいた。
ｂＭＴｐｗＪ領域はλｇｔ１０を基本としたプラスミド
λＢＭＴ９に含まれている。ｂＭＴフラグメントはλＥ
ＭＴ９の大規模プラスミド調製物を■すｌで消化するこ
とによってλＢＭＴ９より切り出した。
λＢＭＴ９に含まれている。ｂＭＴフラグメントはλＥ
ＭＴ９の大規模プラスミド調製物を■すｌで消化するこ
とによってλＢＭＴ９より切り出した。
およそ６８０ ｈｐのフラグメントが７ガロースゲル上
で同定・単離された。
で同定・単離された。
ｐＬ２２３の大規模プラスミド調製物を釣ヒ！でｔ白化
し、これにまりｂＧＥ遺伝子の５′禾端でプラスミドが
開裂した。直線状になったプラスミドをアガロースゲル
から単離した。連結反応は二種類のＮ６ｏｌを末端にも
つフラグメントな用いて行ない、ｂＭＴプロモーターな
りＧＩｉ遺伝子の５′末端に挿入した。細菌細胞＃（’
１０６１を連結反応生成物で形質転換し、■リ コロニ
ーを選択した。
し、これにまりｂＧＥ遺伝子の５′禾端でプラスミドが
開裂した。直線状になったプラスミドをアガロースゲル
から単離した。連結反応は二種類のＮ６ｏｌを末端にも
つフラグメントな用いて行ない、ｂＭＴプロモーターな
りＧＩｉ遺伝子の５′末端に挿入した。細菌細胞＃（’
１０６１を連結反応生成物で形質転換し、■リ コロニ
ーを選択した。
プラスミドＤＮＡを小規模ｖ４製によって形質転換細胞
から単離し、ｂＭＴの挿入方向を数個のクローンの小規
模詞製サンプルの制限消化により確認した。適正方向で
組み立てられた１つのプラスミドがｐＬ２５４であった
。
から単離し、ｂＭＴの挿入方向を数個のクローンの小規
模詞製サンプルの制限消化により確認した。適正方向で
組み立てられた１つのプラスミドがｐＬ２５４であった
。
プラスミドｐＬ２５４はｂｂｉｒ−ｈ異種発現発現力ド
ツトなる。Ｂａ５ＨＩ消化により、完全なりＧＩＩ遺伝
子配列を発現するよ５に機能的に方向付けられた５′−
床端の欠落したｂＭＴプロモーターなｔむフラグメント
が遊離した。このような消化は大規模プラスミドｙ４製
物について行なわれ、適正サイズのフラグメント（およ
そ１２５０ ｈｐ）がゲル上で同定され単離された。久
いでＢａ％ＩＩ ｌを末端にもつフラグメントは、大規
模プラスミドＣｐＬ２６０）ｖ４製物をＢａ講Ｅ ｌで
消化することにより１す遺伝子の３′末端で開環したプ
ラスミドｐＬ２６０内に結合させた。連結反応生成物を
細菌４７Ｃ１０６１へ形質転換し、α愼ｐ コロニーを
選択した。
ツトなる。Ｂａ５ＨＩ消化により、完全なりＧＩＩ遺伝
子配列を発現するよ５に機能的に方向付けられた５′−
床端の欠落したｂＭＴプロモーターなｔむフラグメント
が遊離した。このような消化は大規模プラスミドｙ４製
物について行なわれ、適正サイズのフラグメント（およ
そ１２５０ ｈｐ）がゲル上で同定され単離された。久
いでＢａ％ＩＩ ｌを末端にもつフラグメントは、大規
模プラスミドＣｐＬ２６０）ｖ４製物をＢａ講Ｅ ｌで
消化することにより１す遺伝子の３′末端で開環したプ
ラスミドｐＬ２６０内に結合させた。連結反応生成物を
細菌４７Ｃ１０６１へ形質転換し、α愼ｐ コロニーを
選択した。
３８類のプラ、Ｘ、ミ）”： ｐＬ２６４、ｐＬ２６５
、およびｐＬ２６６＜ｗｃ４図）を単離した。プラスミ
ドｐＬ２６４は３１Ｇ遺伝子と同一の方向でｂＭＴ−ｂ
ＧＩ１発現ユニットを有し’、ｐＬ２６５ではこの発現
ユニットの方向が反対である。プラスミドｐＬ２６６に
は２コピーのｂＭＴ−ｂＧＩｉ発現ユ発現ユニットに並
んで含まれており、七〇方向はｔｓａｏ遺伝子とは反対
である。これらの構築法を説明するフローチャートを第
５図ＢおよびＣＫ提供する。
、およびｐＬ２６６＜ｗｃ４図）を単離した。プラスミ
ドｐＬ２６４は３１Ｇ遺伝子と同一の方向でｂＭＴ−ｂ
ＧＩ１発現ユニットを有し’、ｐＬ２６５ではこの発現
ユニットの方向が反対である。プラスミドｐＬ２６６に
は２コピーのｂＭＴ−ｂＧＩｉ発現ユ発現ユニットに並
んで含まれており、七〇方向はｔｓａｏ遺伝子とは反対
である。これらの構築法を説明するフローチャートを第
５図ＢおよびＣＫ提供する。
化条件
Ａ、細胞の培養
３種類の細胞系を用いた：
１）ＭＤＢＫ細胞−ウシ腎臓細胞系、Ａ Ｔ ＣＣ”＃
（、’ＣＬ２２． ２）ＭＤＢＫＢ細胞一実施例１１に記載、３）ＮＩＨ３
７３ｍＡ胞−マウス胎児性繊維芽細胞系、ＡＴｃｃ＠Ｃ
ＲＬ１６５Ｂ。
（、’ＣＬ２２． ２）ＭＤＢＫＢ細胞一実施例１１に記載、３）ＮＩＨ３
７３ｍＡ胞−マウス胎児性繊維芽細胞系、ＡＴｃｃ＠Ｃ
ＲＬ１６５Ｂ。
３株類の細胞系はすべて以下の方法で増殖させた。１バ
イアルの細胞を〜１０ａｌｊの完全培地を含む７５ｃＩ
Ｒ１のファルコンフラスコ内に入れた。フラスコを３７
℃で一晩５〜ＩＱ％ｃＯ，中でインキエベーションした
。培地は次の日に取り替え、細胞が集密的になる迄、お
よそ３〜４日間、３７℃、５〜ＩＱ％ＣＯ，中で増殖さ
せた。
イアルの細胞を〜１０ａｌｊの完全培地を含む７５ｃＩ
Ｒ１のファルコンフラスコ内に入れた。フラスコを３７
℃で一晩５〜ＩＱ％ｃＯ，中でインキエベーションした
。培地は次の日に取り替え、細胞が集密的になる迄、お
よそ３〜４日間、３７℃、５〜ＩＱ％ＣＯ，中で増殖さ
せた。
次いで細胞が集密的になってから細胞を分離した。これ
は、培地を吸引除去し２ＩＬｔのｌ×トリプシン・ＥＤ
ＴＡ（Ｇ）ＢＣＯ）４５液を添加することによって成し
遂げられる。これを吸引除去し、２νの同溶液を再添加
した。細胞がプレート表面から離れ始める迄、通常５〜
１５分間、この溶液と接触させてＳいた。細胞が離れた
後、１０５１ｊの完全培地１に２ＩＬｔの細胞溶層に添
加し、全容重を吸引上下させて細胞凝集体を分散させた
。５〜１０％の細胞含有培地のすべてをフラスコに吸引
除去した。１０釘の培地を添加し、フラスコを３７℃、
５〜１０％ｃｏ、中でインをユペーションした。細胞が
′！Ｉｋ密的になる数日間おきにこれをくり返した。
は、培地を吸引除去し２ＩＬｔのｌ×トリプシン・ＥＤ
ＴＡ（Ｇ）ＢＣＯ）４５液を添加することによって成し
遂げられる。これを吸引除去し、２νの同溶液を再添加
した。細胞がプレート表面から離れ始める迄、通常５〜
１５分間、この溶液と接触させてＳいた。細胞が離れた
後、１０５１ｊの完全培地１に２ＩＬｔの細胞溶層に添
加し、全容重を吸引上下させて細胞凝集体を分散させた
。５〜１０％の細胞含有培地のすべてをフラスコに吸引
除去した。１０釘の培地を添加し、フラスコを３７℃、
５〜１０％ｃｏ、中でインをユペーションした。細胞が
′！Ｉｋ密的になる数日間おきにこれをくり返した。
Ｂ、培養液内での細胞のトランスフェクションａｌｌ織
培餐細胞を、６０ｆｌの皿に、１皿に何〜５ｘ １ ｏ
１細胞の濃度で、トランスフェクションを行なう２４時
間前に分配した。３紅の完全培地を添加し、細胞を一晩
３７℃でインキエベーションした。トランスフェクショ
ンを行な５２〜３時間前に古い培地を吸引除去し３ｖの
新鮮培地を添加することによって培地を取り替えた。
培餐細胞を、６０ｆｌの皿に、１皿に何〜５ｘ １ ｏ
１細胞の濃度で、トランスフェクションを行なう２４時
間前に分配した。３紅の完全培地を添加し、細胞を一晩
３７℃でインキエベーションした。トランスフェクショ
ンを行な５２〜３時間前に古い培地を吸引除去し３ｖの
新鮮培地を添加することによって培地を取り替えた。
次いで以下の方法に従ってリン酸カルシウム沈澱物をそ
れぞれのプラスミドについ【銅製した。
れぞれのプラスミドについ【銅製した。
１０μｍの精製したプラスミドＤＮＡおよび認容食４０
０ ｔｉｌ （１）ｔＪ：、ＩｆｉＪシｒ：ＤＮＡ溶液
を６０鰭の皿ごとに添加した。
０ ｔｉｌ （１）ｔＪ：、ＩｆｉＪシｒ：ＤＮＡ溶液
を６０鰭の皿ごとに添加した。
トランスフェクション混合物
サケ精子
１）ＮＡ（１〜へり ｌＯμＥ
２．５Ｍ ＣａＣ１，２０μｌ
それぞれのチューブ〔通常１５１Ｌｔのファルコン（Ｆ
ａＩｃｏｎ ）チューブ〕は、層流７−ド中で別々に調
製した。ＤＮＡ−ＣａＣｌ２を含むチューブ内に空気を
ゆっくりと通気しながら、ｌ１ＢＳ浴叡を滴下した。そ
の後、得られたＣαｓ（”＊）＊溶液を室温で１５〜３
０分間インキエベーションした。次いで４００ｆｉｌｅ
１）沈澱したＤＮＡ 浴ｇを、３ｇの培地を含んだヱま
の６０％ｆｉの皿に添加した。ｆ＃液が平等に分配され
る迄わずかく渦巻撹拌した後、皿を３７℃で６時間イン
キエベークヨンした。６時間後、培地を交換し、新鮮な
完全培地と取り替えた。４８時間後細胞を１０００の皿
に分配し、Ｇ４１８、ネオマイシン類似体を以下の績度
で添加した： ３Ｔ３？ｆａ胞−４００μｐ／１１４ ＭＤＢＫＭｉ胞−８００−１，０００１４７ＩＬＬこの
時点で細胞のイを１枚の１００ｍの皿に置き、残り２の
細胞を別の１枚の１００１１ＩＩの皿に置いた。
ａＩｃｏｎ ）チューブ〕は、層流７−ド中で別々に調
製した。ＤＮＡ−ＣａＣｌ２を含むチューブ内に空気を
ゆっくりと通気しながら、ｌ１ＢＳ浴叡を滴下した。そ
の後、得られたＣαｓ（”＊）＊溶液を室温で１５〜３
０分間インキエベーションした。次いで４００ｆｉｌｅ
１）沈澱したＤＮＡ 浴ｇを、３ｇの培地を含んだヱま
の６０％ｆｉの皿に添加した。ｆ＃液が平等に分配され
る迄わずかく渦巻撹拌した後、皿を３７℃で６時間イン
キエベークヨンした。６時間後、培地を交換し、新鮮な
完全培地と取り替えた。４８時間後細胞を１０００の皿
に分配し、Ｇ４１８、ネオマイシン類似体を以下の績度
で添加した： ３Ｔ３？ｆａ胞−４００μｐ／１１４ ＭＤＢＫＭｉ胞−８００−１，０００１４７ＩＬＬこの
時点で細胞のイを１枚の１００ｍの皿に置き、残り２の
細胞を別の１枚の１００１１ＩＩの皿に置いた。
対照プレートも同時に設置した。対照プレートのトラン
スフェクションは同波のＤＮＡを含むが選択可能なマー
カー遺伝子を含まない。サケ精子ＤＮＡ ′％ニブラス
ミドの代わりに用いた。得られたトランスフェクション
細胞は選択工程で残らないであろう。
スフェクションは同波のＤＮＡを含むが選択可能なマー
カー遺伝子を含まない。サケ精子ＤＮＡ ′％ニブラス
ミドの代わりに用いた。得られたトランスフェクション
細胞は選択工程で残らないであろう。
３〜４日後、トランスフェクションを行なった細胞を工
新鮮な培地を洗滌し、死滅細菌の破片を除去した。抗生
物質を含む培地を皿に添加し戻した。
新鮮な培地を洗滌し、死滅細菌の破片を除去した。抗生
物質を含む培地を皿に添加し戻した。
１０〜１２日で単離された細胞のクローンか目で検出で
きるようになった。
きるようになった。
６４１８１クローンは以下の方法に従り【単離した。１
００μｊのトリプシン−ＥＤＴＡをリンプロ（Ｌｔｎｂ
デＯ）の６ク工ルプラーク用皿のそれぞれのウェルに添
加した。培地は目視可能な細胞を含む皿から吸引し、そ
れぞれのクローンには消えないマーカーで皿の底に印を
付げた。１対のピンセットを炎で焼き、冷却し、無国の
円形フィルター〔ワットマン（ＩＰ’ｈａｔｖｎａｎ）
直径１〜２削の円形、前もって無菌にしたもの〕を捕む
たわに用いた。
００μｊのトリプシン−ＥＤＴＡをリンプロ（Ｌｔｎｂ
デＯ）の６ク工ルプラーク用皿のそれぞれのウェルに添
加した。培地は目視可能な細胞を含む皿から吸引し、そ
れぞれのクローンには消えないマーカーで皿の底に印を
付げた。１対のピンセットを炎で焼き、冷却し、無国の
円形フィルター〔ワットマン（ＩＰ’ｈａｔｖｎａｎ）
直径１〜２削の円形、前もって無菌にしたもの〕を捕む
たわに用いた。
無−フィルターは一滴の培地で湿らせ、久いで単一りａ
−ンの最上部に置いた。フィルターは細胞な移丁ために
それぞれのクローンの上でわずかにこすって細胞を捕獲
した。次いでそれぞれのフィルターはトリフシンを含む
ウェルに別々に置き、１０〜１５分間そのヱまにしてお
いた。次いで２紅の完全培地なそれぞれのウェルに添加
した。クローンを含む最初のブＶ−トは完全培地で再び
満たした。クローンを６ウエルの皿の中でＣ１１ｆｔｌ
ｆＬ。
−ンの最上部に置いた。フィルターは細胞な移丁ために
それぞれのクローンの上でわずかにこすって細胞を捕獲
した。次いでそれぞれのフィルターはトリフシンを含む
ウェルに別々に置き、１０〜１５分間そのヱまにしてお
いた。次いで２紅の完全培地なそれぞれのウェルに添加
した。クローンを含む最初のブＶ−トは完全培地で再び
満たした。クローンを６ウエルの皿の中でＣ１１ｆｔｌ
ｆＬ。
城によって３〜５日）増殖させ、次いでアッセイ、およ
び／またはより大きい皿に分配した。
び／またはより大きい皿に分配した。
Ｃ−」羨１Ω３１！
プラスミドｐＬ２６４、ｐＬ２６５および／またはｐＬ
２６６でのＮノＨ３Ｔ３、ＭＤＢＫおよび／工た４１
Ａｆ Ｌ） Ｂ Ａ ” 細胞系のトランスフェクショ
ンは上述の方法に従って行ない、ネオマイシン耐性＃Ｉ
胞を選択した。ｂＧＥ蛋白質の合成および遊離は、さま
ざまなトランスフェクション細胞系の培地からＲＩＡに
より測定した。はとんどの場合、単一の１００ｍｍの皿
からのクローンをプールした。
２６６でのＮノＨ３Ｔ３、ＭＤＢＫおよび／工た４１
Ａｆ Ｌ） Ｂ Ａ ” 細胞系のトランスフェクショ
ンは上述の方法に従って行ない、ネオマイシン耐性＃Ｉ
胞を選択した。ｂＧＥ蛋白質の合成および遊離は、さま
ざまなトランスフェクション細胞系の培地からＲＩＡに
より測定した。はとんどの場合、単一の１００ｍｍの皿
からのクローンをプールした。
クローンのプールを含む１００龍の皿を用いてｂＧＨ濃
度を測定した。
度を測定した。
第４表に、これらのプラスミドでトランスフェクション
して得られた細胞系からのＲＩＡデータを集めた。これ
らのデータから、培地への金属供給を行なわなかった場
合、ｂＭＴ−ｂＧＩｉ発現ベクターでトランスフェクシ
ョンしたこれらの細胞中で合成されるｂＧＩＩ蛋白質の
レベルは低いことがわかった。
して得られた細胞系からのＲＩＡデータを集めた。これ
らのデータから、培地への金属供給を行なわなかった場
合、ｂＭＴ−ｂＧＩｉ発現ベクターでトランスフェクシ
ョンしたこれらの細胞中で合成されるｂＧＩＩ蛋白質の
レベルは低いことがわかった。
このデータから、Ｎ１Ｍ３Ｔ３／ｐＬ２６０クローン＃
１１がｂＧＨ蛋白質を最も高レベルで発現するクローン
として同定された。
１１がｂＧＨ蛋白質を最も高レベルで発現するクローン
として同定された。
第５表罠金楓で篩導したｂＧＭ蛋白質の発現データをま
とめた。金属は対照細胞の増殖中の培地には添加しなか
った。ここで、１対照Ｓ″値とは金属に応答し【増加す
るｂＧＢ蛋白質の発現を表わす。（１００％の値は対照
と等しいｂＧＥｌｉ白質レベル、即ち訪導されていない
こと、を表わ−）１アッセイ時間は培地サンプルを採取
した時間と一致し、金属の初期添加（＜−０）に相関す
る。
とめた。金属は対照細胞の増殖中の培地には添加しなか
った。ここで、１対照Ｓ″値とは金属に応答し【増加す
るｂＧＢ蛋白質の発現を表わす。（１００％の値は対照
と等しいｂＧＥｌｉ白質レベル、即ち訪導されていない
こと、を表わ−）１アッセイ時間は培地サンプルを採取
した時間と一致し、金属の初期添加（＜−０）に相関す
る。
２この値は二重のサンプルまたはクローンサンプルの平
均から計算され、最も近い整数に四捨五入した。
均から計算され、最も近い整数に四捨五入した。
亜鉛：カドミクム比を４：ｌにすると最良の遺伝子発現
が誘導された。（注：金属イオンの絶対濃度は、金属イ
オン耐性細胞、即ちＭＤＢＫｖ′細胞中でより高くする
ことができ、金属存在下では正常に増殖しない細胞中で
はより低くなければならない。ン ４、図面簡単な説明〕 ｗ、１図をエウシのメタロチオネインＩ調節領域の制限
地図である。
が誘導された。（注：金属イオンの絶対濃度は、金属イ
オン耐性細胞、即ちＭＤＢＫｖ′細胞中でより高くする
ことができ、金属存在下では正常に増殖しない細胞中で
はより低くなければならない。ン ４、図面簡単な説明〕 ｗ、１図をエウシのメタロチオネインＩ調節領域の制限
地図である。
第２図は修飾したクシのメタロチオネイン■調Ｗ１４＠
域の制限地図である。
域の制限地図である。
第３図はプラスミドｐＬ ２６０の制限地図である。
第４図はプラスミドｐＬ２６６の制限地図である。
第５図ＡはｐＬ２６０の構築法を説明する工程図である
。
。
第５図ＢはｐＬ２２３の構築法を説明する工程図である
。
。
第５図ＣはｐＬ２６４、ｐＬ２６５およびｐＬ２６６の
構築法を説明する工程図である。
構築法を説明する工程図である。
代 埋
人
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、調節領域が宿主細胞環境内の重金属の存在に応答す
る、本質的にウシのメタロチオネインの調節領域からな
るＤＮＡフラグメント。 ２、前記ＤＮＡフラグメントが第１図の制限地図をもつ
、請求項１記載のＤＮＡフラグメント。 ３、前記ＤＮＡフラグメントが第１表のヌクレオチド配
列をもつ、請求項２記載のＤＮＡフラグメント。 ４、前記ＤＮＡフラグメントがポリペプチドをコードす
る異種ＤＮＡ配列に機能しうるように連結される、請求
項１記載のＤＮＡフラグメント。 ５、前記ＤＮＡフラグメントがウシの成長ホルモン、ヒ
トの成長ホルモン、ニワトリの成長ホルモン、およびヒ
トの成長ホルモン放出因子からなる群より選択されたポ
リペプチドをコードする異種ＤＮＡ配列に機能しうるよ
うに連結される、請求項４記載のＤＮＡフラグメント。 ６、前記ＤＮＡフラグメントがポリペプチドをコードす
る異種ＤＮＡ配列に機能しうるように連結された請求項
３記載のＤＮＡフラグメントで形質転換した真核細胞。 ７、前記ＤＮＡフラグメントが宿生細胞環境内の重金属
の存在に応答しかつ第２図の制限地図をもつ、本質的に
ウシのメタロチオネインの調節領域からなるＤＮＡフラ
グメント。 ８、前記ＤＮＡフラグメントが第２表のヌクレオチド配
列をもつ、請求項７記載のＤＮＡフラグメント。 ９、前記ＤＮＡフラグメントがポリペプチドをコードす
る異種ＤＮＡ配列に機能しうるように連結される、請求
項７記載のＤＮＡフラグメント。 １０、前記ＤＮＡフラグメントがウシの成長ホルモン、
ヒトの成長ホルモン、ニワトリの成長ホルモン、および
ヒトの成長ホルモン放出因子からなる群より選択される
ポリペプチドをコードする異種のＤＮＡ配列に機能しう
るように連結された、請求項９記載のＤＮＡフラグメン
ト。 １１、前記ＤＮＡフラグメントがポリペプチドをコード
する異種のＤＮＡ配列に機能しうるように連結された請
求項７記載のＤＮＡフラグメントで形質転換した真核細
胞。 １２、前記調節領域が宿主細胞環境内の重金属の存在に
応答し、ポリペプチドをコードする異種ＤＮＡ配列に機
能しうるように連結されるウシのメタロチオネイン調節
領域からなる真核細胞および原核細胞からなる群より選
択される細胞内でまたは両方の細胞内で複製する能力を
もつベクター。 １３、前記ベクターが： ｉ）少なくとも１個のマーカー遺伝子； ｉｉ）少なくとも１個の長い末端繰返し；およびｉｉｉ
）少なくとも１個の細胞の複製開始点；を含む、請求項
１２記載のベクター。 １４、前記ベクターが以下の成分； ｉ）ポリペプチドをコードする異種のＤＮＡ配列に機能
しうるように連結したウシのメタロチオネイン調節領域
と同一方向で存在する少なくとも２個の連結した連続的
な配列； ｉｉ）ネオマイシン耐性マーカー遺伝子； ｉｉｉ）アンピシリン耐性マーカー遺伝子；を含む、請
求項１３記載のベクター。 １５、請求項１２記載のベクターで形質転換した真核細
胞。 １６、請求項１３記載のベクターで形質転換した真核細
胞。 １７、請求項１４記載のベクターで形質転換した真核細
胞。 １８、請求項１２記載のベクターで形質転換したウシ細
胞。 １９、請求項１３記載のベクターで形質転換したウシ細
胞。 ２０、請求項１４記載のベクターで形質転換したウシ細
胞。 ２１、請求項１２記載のベクターで形質転換したＮＩＨ
３Ｔ３細胞。 ２２、請求項１２記載のベクターで形質転換したＭＤＢ
Ｋ細胞。 ２３、プラスミドｐＬ２６６。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US27424188A | 1988-11-18 | 1988-11-18 | |
| US274241 | 1988-11-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02273189A true JPH02273189A (ja) | 1990-11-07 |
Family
ID=23047397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1294774A Pending JPH02273189A (ja) | 1988-11-18 | 1989-11-13 | ウシのメタロチオネイン調節領域 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0369458A2 (ja) |
| JP (1) | JPH02273189A (ja) |
| KR (1) | KR900008042A (ja) |
| CA (1) | CA2003296A1 (ja) |
| DK (1) | DK579189A (ja) |
| NO (2) | NO894143D0 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4833991B2 (ja) * | 2004-11-02 | 2011-12-07 | アレス トレーディング ソシエテ アノニム | 哺乳動物細胞のための無血清細胞培養培地 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5618796A (en) * | 1991-09-12 | 1997-04-08 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Metal binding oligonucleotide and methods and compositions for their use to treat metal toxicity |
| US8273553B2 (en) | 2004-11-02 | 2012-09-25 | Ares Trading S.A. | Production of growth hormone in serum-free cell culture medium for mammalian cells |
| BRPI0517942B8 (pt) * | 2004-11-02 | 2021-05-25 | Ares Trading Sa | processo para a produção do hormônio de crescimento humano recombinante (rhgh) e usos de um meio de cultura de células isento de soro |
-
1989
- 1989-10-17 NO NO894143A patent/NO894143D0/no unknown
- 1989-11-13 KR KR1019890016519A patent/KR900008042A/ko not_active Withdrawn
- 1989-11-13 JP JP1294774A patent/JPH02273189A/ja active Pending
- 1989-11-17 DK DK579189A patent/DK579189A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-11-17 CA CA002003296A patent/CA2003296A1/en not_active Abandoned
- 1989-11-17 NO NO89894598A patent/NO894598L/no unknown
- 1989-11-17 EP EP89121295A patent/EP0369458A2/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4833991B2 (ja) * | 2004-11-02 | 2011-12-07 | アレス トレーディング ソシエテ アノニム | 哺乳動物細胞のための無血清細胞培養培地 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0369458A2 (en) | 1990-05-23 |
| DK579189D0 (da) | 1989-11-17 |
| NO894598D0 (no) | 1989-11-17 |
| DK579189A (da) | 1990-05-19 |
| NO894598L (no) | 1990-05-21 |
| KR900008042A (ko) | 1990-06-02 |
| CA2003296A1 (en) | 1990-05-18 |
| NO894143D0 (no) | 1989-10-17 |
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