JPH02273192A - イソマルチユロースの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はイソマルチユロース（別名パラチノース）の製
造法に関する。更に詳細には、本発明は蔗糖からイソマ
ルチユロースを効率よく、大量に生産しうる方法に関す
る。

［従来技術及び発明が解決しようとする課題］これまで
、糖転換能を有する微生物、なかでも蔗糖から有用な二
糖を生成する微生物としては、蔗糖を、イソマルチユロ
ースに主に転換する能力ヲモつロイコノストック・メセ
ンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔ
ｅｒｏｉｄｅｓ）、プロタミノバクタ−・ルブラム（Ｐ
ｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ　ｒｕｂｒｕｍ）、セラ
チアーマルレツセンス（ＳｅｒｒａＬｉａ　ｍａｒｃｅ
ｓｃｅｎｓ）、セラチア・プリムチ力（Ｓｅｒｒａｔｉ
ａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）、エルビニア・カロトボラ
（Ｅｒｖｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルビニ
ア・カロトボラ・アトロセプチカ（Ｅｒｖｉｎｉａ　ｃ
ａｒｏｔｏｖｏｒａ　ｖａｒ、　ａｔｒｏｓｓｐＬｉｃ
ａ）、エルビニア・デソルベシス（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｄ
ｉｓｓｏｌｖｅｎｓ）、エルビニア・ラホンテイシ（Ｅ
ｒｗｉｎｉａ　ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ）等が知られてい
る。しかしながら、これらのイソマルチユロース生産性
菌はイソマルチユロースの生成時にグルコースとフルク
トースの副生を伴う。そのため、これら単糖を除く必要
が生じる。さらに、このことは蔗糖からイソマルチユロ
ースの収率にも影響する。

そこで、本発明者らはさらにすぐれた糖転換能を有し、
単糖類の副生の無い新規な微生物を探索すべく多くの菌
株を土壌より分離し、その糖転換能について検討を加え
るとともに、菌株保存機関からの分譲菌株に対しても同
様の検討を加えた。

［課題を解決するための手段Ｊ その結果、クレブシェラ属に属する成る種の菌株、例え
ば、クレブシェラ・テリゲナＱ１６ｂｓｉｅｌｌａ　ｔ
ｅｒｒｉｇｅｎａ）　Ｊ　ＣＭ　１６８７　（理化学研
究所微生物系統保存施設）及びクレブシェラ・エスピー
（に１ｅｂｓｉｅｌｌａ　ｓｐ、）　ｋ　８８が優れた
グルコシルトランスフェラーゼ生産能を有しており、蔗
糖をイソマルチ二ロースに転換するのに有用であり、殊
に、後者のクレブシェラ・エスピー翫８８菌株は優れた
糖転換能を示し、単糖類の副生がなく極めて有用な菌株
であることを見い出し、本発明を完成するに至った。

かくして、本発明によれば、クレブシェラ属に属スるグ
ルコシルトランスフェラーゼ生産性微生物の菌体又はそ
の処理物の存在下に蔗糖をイソマルチ二ロースに転換す
ることを特徴とするイソマルチ二ロースの製造方法が提
供される。

また、本発明によれば、クレブシェラ属に属するグルコ
シルトランスフェラーゼ生産性微生物を蔗糖を含有する
培地で培養し、培地からイソマルチ二ロースを回収する
ことを特徴とするイソマルチ二ロースの製造方法が提供
される。

本発明は、クレブシェラ属に属する微生物が生産するグ
ルコシルトランスフェラーゼを利用し、蔗糖を酵素反応
により又は発酵法により、イソマルチ二ロースに転換す
るものである。

本発明の方法に使用しうるクレブシェラ属に属するグル
コシルトランスフェラーゼ生産性微生物の具体例には、 クレブシェラ舎テリゲナＪＣＭ１６８７（埼玉県和光市
の理化学研究所微生物系統保存施設） クレブシェラ・エスピーに８８（ＦＥＲＭ　　Ｐ等が挙
げられるが、本発明は何らこれらに限られるものではな
く、通常のスクリーニング法を用いることにより、例え
ば、蔗糖を含む寒天平板培地に土壌懸濁液を塗布し、３
０℃で２４〜４８時間培養後、寒天平板培地上で生育し
た蔗糖資化性菌を分離し、上記分離菌を次に蔗糖を含む
液体培地で３０℃で７２時間振盪培養後、イソマルチ二
ロースの生成の有無をペーパークロマトグラフィーで確
認することにより、当業者であれば本発明の方法に使用
しうるクレブシェラ属に属するグルコシルトランスフェ
ラーゼ生産性微生物を容易に取得しうる。

本発明で使用しうる上記のクレブシェラ・エスピーＮａ
、８８は、従来の文献に未載の新規な菌株であり、その
菌学的性質を示せば次のとおりである。

上記菌株の同定実験は、主としてＭａｎｕａｌ　ｏｆ　
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ　　（米国微生物学全編、１９８１）お
よび［微生物の分類と同定」（長谷用武治編　東大出版
会、１９８５）に準拠して行った。

■　細胞形態 肉汁寒天、３７℃培養二通常１．０−１．５Ｘ２゜０〜
４．０μｍの桿菌。単独または直鎖状の二対をなし、稀
に連鎖した細胞も観察される。

多形性なし。運動性なし。無胞子。非抗酸性。ダラム陰
性。さらに莢膜の存在が認められる。

■　培養的性質 （１）肉汁寒天平板培養、３７℃ 形状；円形　大きさは２４時間で２１１１１１゜周縁；
金縁 隆起；扁平状ないしやや半レンズ状 光沢；あり 表面：平滑 色調；不透明、内容は均質なバター質、白色（２）肉汁
寒天斜面培養、３７℃ 生育度；良好 形状−糸状 （３）肉汁液体培養、３７℃ 生育度；良好　全体に生育し混濁 沈渣：少量 着色、脱色：なし （４）肉汁ゼラチン穿刺培養 １５℃で穿刺線に沿って生育。ゼラチンを液化しない。

３７℃でゼラチンを液化しない。

（５）リドマス・ミルク、３７℃ リドマス退色。凝固、液化なし。酸性化。

■　生理学的性質 （１）硝酸塩の還元性；陽性 （２）脱窒反応；陽性 （３）ＭＲテスト；陰性 （４）ＶＰテスト；陽性 （５）インドールの生成；陰性 （６）硫化水素の生成；陰性 （７）デンプンの加水分解：陰性 （８）クエン酸の利用；コーザー培地およびクリステン
セン培地およびシモンズ培地において陽性 （９）無機窒素源の利用；アンモニウム塩および硝酸塩
ともに利用できる。

（ｌＯ）色素の生成；なし く１２）ウレアーゼ；陽性 （１３）カタラーゼ；陽性 （１４）生育の範囲；　ｐＨ６〜１０　。

温度　ｌＯ〜４４．５℃ （１５）酸素に対する態度；通気嫌気性（１６）Ｏ−Ｆ
テスト（ヒューレイフラン法）；Ｄ−グルコース発酵性
あり （１７）炭素源からの酸およびガスの生成の有無（ヒュ
ーレイフラン法による。）； 酸　　ガス Ｌ−アラビノース　　　　　＋　　＋ Ｄ−キシロース　　　　　　＋　　十 〇−グルコース　　　　　　　＋　　＋Ｄ−マンノース
　　　　　　＋　　＋ Ｄ−フラクトース　　　　　＋　　＋ Ｄ−ガラクトース　　　　　＋　　＋ 麦芽糖　　　　　　　　　　＋　　＋ ショ糖　　　　　　　　　＋　　＋ 乳糖　　　　　　　　　　　＋　　＋ トレハロース　　　　　　　　＋　　＋Ｄ−ソルビット
　　　　　　　＋　　十り−マンニット　　　　　　＋
　　＋ イノジット　　　　　　　　＋　　＋ グリセリン　　　　　　　　＋　　十 デンプン　　　　　　　　　　＋　　十アドニット ズルシトール エスクリン　　　　　　　　＋　　＋ サリシン　　　　　　　　　＋　　＋ イヌリン Ｄ−メレチトース Ｌ−ソルボース　　　　　　＋　　＋ Ｌ−ラムノース　　　　　　＋　　＋ ラフィノース　　　　　　　＋　　＋ ｄ−酒石酸　　　　　　　　＋　　＋ （１８）グルコン酸の酸化 （コースらのグルコン酸クエン酸鉄培地による）；陰性 （１９）マロン酸の利用；陽性 （２０）有機酸の利用 （カウフマンーペテルソン培地による）：クエン酸塩（
ナトリウム）：陽性 ｄ−酒石酸塩　　　　　　：陽性 粘液酸　　　　　　　　　、陽性 （２１）炭素化合物の利用： ケンチシン酸　　　　　　：陰性 ｍ−ヒドロキシ安息香酸　：陰性 （２２）有機酸窒素源の利用： Ｌ−グルタミン酸ナトリウム：陽性 Ｌ−ヒドロキシプロリン　　：陽性 （２３）アルギニンの分解（ミューチー法による）：陰
性 （２４）リジンの脱炭酸反応（ミューチー法による）：
陽性 （２５）オルニチンの脱炭酸反応（ミューチー法による
）：陰性 （２６）グルタミン酸の脱炭酸反応（ミューチー法によ
る）：陰性 （２７）フェニルアラニンの脱アモノ反応：陰性（２８
）ペクチン酸の液化（スターの方法による）；陰性 （２９）フエーカル・コリフォーム噛テスト（４４，５
℃でのラクトースからのガスの生成）：陰性 （３０）β−ガラクトシダーゼテスト：陽性　■ＤＮＡ
のＧ−Ｃ比（Ｔｍ法による）：５８．０％上述の菌学的
性質をもとにして、ＢｅｒｇｅｙのＭａｎｕａｌ　ｏｆ
　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ第８版（１９７４）およびＭａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓ
ｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉ。

１ｏｇｙ第９版（１９８４）等を参考にして検索し、公
知の菌株とさその異同を検討した。以上の結果、本菌が
クレブシェラ・プランティコーラに最も近い性質を示し
た。しかし、本菌はクレブシェラ・プランティコーラの
基準株であるＪＣＭ７２５１（ＡＴＣＣ３３５３１）と
比較して、メチルレッドテスト、及びアトニット、デン
プン、ｄ−酒石酸等の発酵性及び利用性の点で相違が認
められること、並びにクレブシェラ属に属する菌株で、
インヤルチュロースを生産する菌株は今迄の文献では認
められないことから、本菌はイソマルチユロースを生産
するという特徴を有する新規な菌株であると考えられる
。

これにより、本発明者らは上記菌株をクレブシェラ・エ
スピー翫８８と命名し、茨城県筑波郡谷田部町東１丁目
、１番３号の微生物工業技術研究所、特許微生物寄託セ
ンターに微工研菌寄第１０６４０号（ＦＥＲＭ　、Ｐ−
１０６４０）として寄託した。

本発明には上記菌株のほか同一菌属に属し、糖転換能を
有する菌株やこれらの変異株なども使用することができ
る。

本発明の方法に用いる微生物の培養はそれ自体既知の方
法により、蔗糖を主たる炭素源として含有する培地で好
適に行うことができる。培地は合成培地又は天然培地の
いずれであってもよく、含有せしめうる窒素源としては
、例えば硝酸塩、アンモニウム塩などの無機窒素化合物
又は尿素、Ｃ６Ｓ、Ｌ、、カゼイン加水分解物、ペプト
ン、酵母エキス、肉エキス、アミノ酸液などの有機窒素
含有物が用いられ、また、無機塩類としては、例えばカ
リウム塩、ナトリウム塩等を少量添加することができる
。

培地中の蔗糖濃度は２〜４０％の範囲内とすることがで
きるが、菌の生育及び増殖の面からは、２〜２０％の範
囲であることが望ましい。

培養は通常、温度３０〜３７℃、ｐＨ５，０〜７゜０の
範囲で通性嫌気的又は好気的条件下に行うことができる
。培養方式は回分培養又は半回分培養のいず６でも良い
。

培養時間は、培地中の蔗糖濃度によって異なるが、大体
１６〜４８時間程度が適当である。

培養後、菌体を培養液から分離する。分離はそれ自体既
知の方法、例えば遠心分離法、濾過法により行なうこと
ができる。遠心法で菌体を分離する場合は、培養液に各
種の凝集剤を添加して、菌体を凝集させることにより分
離を容易かつ能率的にすることができる。

菌体を除去した培養上溝液は、加熱・−過・イオン交換
樹脂処理を行い、次いで、例えば７０〜８０重量％の固
形分まで蒸発濃縮後、ゆっくり撹拌しながら徐々に例え
ば約２０℃まで冷却するとイソマルチユロースの結晶が
析出する。得られた結晶は、例えばバスケット型遠心分
離機にかけることにより母液から分離することができる
。モラセス（廃蜜）は、必要により再結晶化工程に送り
、再利用することができる。

一方、培養液から分離した菌体はグルコシルトランスフ
ェラーゼを含有しており、蔗糖をイソマルチユロースに
転換するための酵素反応に利用することができる。その
場合、菌体はそのまま又は菌体を固定化担体で包括し、
さらに架橋剤を用いて架橋処理を行った後に使用するこ
とができ、特にこれら菌体又はその処理物は固定化して
用いるのが望ましい。その固定化はそれ自体既知の方法
で行なうことができ、例えば、菌体又はその処理物をア
クリルアミド系単量体に包括し重合を行なう方法；菌体
又はその処理物を担体で包括し、架橋剤等で処理する方
法、たとえば、キトサン・グルタルアルデヒド法、カラ
ギーナン・グルタルアルデヒド法・アルギン酸・グルタ
ルアルデヒド法などを利用することができる。

以上に述べた適宜固定化されていてもよい菌体又はその
処理物を用いる蔗糖の転換反応は通常、蔗糖を基質とし
て１０〜７５重量％、好ましくは３０〜５０重量％の濃
度で含有する水性媒体中に、上記菌体又はその処理物を
加え、約３０〜約３７℃の範囲内の温度で約２０〜約４
０時間程度インキュベートすることにより行なうことが
できる。

生成するイソマルチユロースはそれ自体既知の方法、例
えば脱塩、脱色、濃縮、結晶化、分蜜等の手段により反
応液から分離し及び／又は精製することができる。

次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

実施例　１ 砂糖２０，９／ｄｉ、酵母エキス０．１６．？　／ｄｉ
。

Ｋ！ＨＰ０．０．４３２　／ｄｌ の組成を有し、ｐＨ６，０に調整した培地１ｏａｄヲ含
む２０〇−要領三角フラスコにクレブシェラ・ニス５ビ
ーＮａ、８８（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１０６４０）を接種し
、３０℃２４時間静置培養する。次にこの培養物全量を
同組成の培地ＩＱに接種し、同温度で２４時間靜装培養
する。

培養終了液は菌体を遠心分離機で除去し、上清を回収す
る。上清中の糖組成比は、ＨＰＬＣで測定シタ結果、イ
ソマルチユロース８５％、トレハルロース１５％で、そ
の他の糖は検出されなかった。

この上溝液はイオン交換樹脂のＩＲ１２０ＢとＩＲＡ−
４１１のモペットに通液脱塩後、活性炭で脱色して、糖
濃度７５重量％に濃縮すると、イソマルチユロースが晶
析する。

結晶の回収率は蔗糖当たり７０％であった。

実施例　２ 実施例１に記述した培地５０ｄを含む、５０〇−容量肩
付フラスコに、クレブシェラ・テリゲナＪＣＭ１６８７
を接種し、３７℃２４時間振盪培養する。次にこの培養
物の５ＩＩＩ１１を同組成の培地５０−に植菌し同温度
で４８時間振盪培養する。培養終了液は菌体を遠心分離
機で除去し、上清を回収する。上清液の糖組成をＴ、Ｌ
、Ｃ，で調べたところ、イソマルチユロース約１０％と
未反応の蔗糖が確認された。

実施例　３ 砂糖２０ｐ　／ａｔ、　Ｃ，Ｓ−Ｌ、０．４８ｙ　／ａ
ｔ。

Ｋ　Ｈ！Ｐ　Ｏａ　０　、２２　／　ｄｉの組成を有し
、ｐＨ６，０に調整した培地１００−を含む２０〇−容
量三角フラスコにクレブシェラ・エスピーＮｃｉ、８８
を接種し３０℃２４時間静置培養する。次に、この培養
物に蔗糖３０２を加え、３０℃でさらに２４時間培養を
継続する。

続いて実施例１に記述した工程を行った。

その結果、結晶イソマルチユロースは蔗糖当たり７５％
の回収であった。

実施例　４ クレブシェラ・エスピーＮｏ、８８を実施例１の培地の
中で、３０°０２４時間培養し菌体スラリーを１００＋
ｎ１２得ｔ；。

この菌体スラリーと、４％に一力うギーナンを同量混合
したものを３％ＫＣＩ溶液に、滴下することにより菌体
を包括する。

包括菌体は、更にポリエチレンイミン、グルタルアルデ
ヒド溶液で架橋し、菌体を固定化した。この固定化菌体
２００−を、３０〇−容量のカラムに充填し、４０％蔗
糖液をＳ、Ｖ、−０，２〜０．３．３０〜３７℃で通液
したところ蔗糖液は、イソマルチユロース８５％、トレ
ハルロース１５％の比率で転換した。

手続補正書（自船 平成１年ＩＯ月１６日 特許庁長官　　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 平成１年特許願第９１９７２号 ２、発明の名称 イソマルチユロースの製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 名称　名糖産業株式会社 ４、代理人　〒１０７ ５、補正命令の日付　　　なし ６、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ７、補正の内容 （１）明細書第８頁第１行にｒ（１２）」とあるをｒ（
１１）」と訂正する。

（２）同第８頁第１行と第２行の間にｒ（１２）オキシ
ダーゼ；陰性」を加入する。

（３）同第１１頁第５行にｒｌＶＪとあるを削除する。

（４）同第１１頁第６行にｒＤＮＡＪとあるをｒｌＶ　
　ＤＮＡＪ　、！：訂正する。

（５）同第１１頁第１２行に「ブランティコーラ」とあ
る後にｒ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｌａｎＬｉｃｏｌ
ａ）Ｊを加入する。

（６）同第１４頁第８行に「しており、」とある後に「
菌体そのもの又は菌体処理物、例えば菌体破砕物（いわ
ゆる粗酵素）もしくはそれから得られた精製酵素は、」
を加入する。

（７）同第１４頁第１θ行に「菌体」とあるをｒ菌体又
はその処理物ｊと訂正する。

（８）同第１４頁第１１行に「さらに」とあるをｒさら
に必要に応じて」と訂正する。

（９）同第１５頁下から第２行に「要領」とあるをｒ容
量」と訂正する。　　　　　　　　　以上手続補正書（
自発） 平成２年４月　７日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 平成１年特許願第９１９７２号 ２、発明の名称 イソマルチユロースの製造方法 ３゜補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 名称　名糖産業株式会社 ４、代理人　〒１０７ （１）　　明細書第１２頁第７〜８行に「寄託した。」
とある後に以下の文を加入する。

「そして、本菌株は平成２年３月３０日付で、特許手続
上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタベスト条約
に基づく国際寄託に移管され、微工研条寄第２８３８号
（Ｆ　ＥＭＲＢＰ−２８３８）なる受託番号が付された
。」（２）同第１５頁末行にｒＰ−１０６４０Ｊ　、！
：ｊ’＋６をｒＢＰ−２８３８４と訂正する。

以上 ６、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ７、補正の内容 別紙のとおり

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、クレブシエラ属に属するグルコシルトランスフエラ
   ーゼ生産性微生物の菌体又はその処理物の存在下に蔗糖
   をイソマルチユロースに転換することを特徴とするイソ
   マルチユロースの製造方法。 ２、クレブシエラ属に属するグルコシルトランスフエラ
   ーゼ生産性微生物を蔗糖を含有する培地で培養し、培地
   からイソマルチユロースを回収することを特徴とするイ
   ソマルチユロースの製造方法。 ３、クレブシエラ・エスピーＮｏ．８８株。