JPH02273199A - 化学発光測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の技術分野） 本発明は、化学発光測定法に関する。

更に詳しくは、酵素として酸又はアルカリホスファター
ゼ及び基質として 一般式 （式中、Ａｄはアダマンチル基、Ｒは低級アルキル基で
あり、Ａｒは芳香族基である。）で表されるジオキセタ
ン誘導体を用い、ｐＨ４〜ｐＨ１０，５において酵素反
応させた後、更に強アルカリにおいて発光反応を行うこ
とからなる化学発光測定法に関する。

（従来の技術） 発光測定法には化学発光および生物発光反応にもとづく
ものとがあり、高感度な超微量分析法として利用されて
いる。例えば化学発光測定法には、■アルカリ存在下、
ルミノール／フェリシアン化カリウムによるＨｚ’：ｈ
の測定（Ｂｏｓｔｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｎａｌ、。

ＣｈｅＩＩ＋、、　　４７．４４７−４５２（１９７５
）　）■ルミノールーグルコー久オキシダーゼによるグ
ルコースの測定及び（Ｂｏｓｔｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、
　Ａｎａｌ、、Ｃｈｅｍ、、４７．４４７−４５２（１
９７５）　）■アルカリ存在下、ルミノール／Ｈ！０□
によるヘモグロビンの測定（Ｅｗｅｔｚ、Ｌ、ｅｔ　ａ
ｌ、、Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　７１−、５６４−５７０（１９７
６）　）等が知られている。一方、生物発光測定法には
、（イ）ホタルの発光酵素ルシフェリン−ルシフェラー
ゼによるＡＴＰの測定（Ａｄｄａｎｋｉ　ｅｔ　ａｌ、
、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋ＩＣＺ６１−２６４
（１９９６）　）、（ロ）アクニオリンによる細胞内遊
離カルシウムイオンの測定（Ｂｌｉｎｋｓ　ｅｔ　ａｌ
、＋Ｐｈａｒ＋ｗａｃｏ１．Ｒｅｖ、、　２８．　ｌ−
９３（１９７６））及び（ハ）バクチリアルルシフェラ
ーゼによるＮ＾口（１の測定（Ｈａｓｔｉｎｇ＋　Ｊ、
Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、＋Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、。

、１１．５４９（１９７７）　）等が知られている。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、前記した化学発光法■の方法は、発光に
使用する酸化剤で試料が分解したり、酸化剤自体が分解
するため正確な測定ができない、■の方法は、発光に使
用する試薬の水溶性が低く、水系での測定は困難である
、■の方法は、発光反応が間けつ的であるため測定のタ
イミングをとるために熟練さを要求される、などの欠点
を有している。又、前記した生物発光法は（イ）（ロ）
及び（ハ）の方法は化学発光に比べると使用する酵素が
極めて高価であったり、免疫測定法に利用すると酵素が
失活するなどの欠点を有している。

（問題点を解決するための手段） 本発明者等は、高感度、高精度、簡便な化学発光測定法
を見出すべ（検討した結果、本発明を見出すに至ったも
のである。

本発明は、酵素として酸又はアルカリホスファターゼ及
び基質として前記一般式（１）で表されるジオキセタン
誘導体を用い、ｐＨ４〜ｐＨ１０，５において酵素反応
させた後、更に強アルカリ条件において発光反応を行な
う化学発光測定法である。

本発明の化学発光測定法は、酵素として酸又はアルカリ
ホスファターゼを用いるものである。これらのホスファ
ターゼは動物あるいは植物から分離精製し得ることがで
きるが、市販品であっても何ら差支えない。

本発明に用いる基質は、前記一般式（１）で表されるジ
オキセタン誘導体である。ジオキセタン誘導体は、例え
ばヨーロッパ特許公開２５４０５１、ＰＣＴ公開Ｗ０８
８００６９５号、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、
、２８１１５５−１１５８（１９Ｂ？）に記載の方法と
同様にして製造することができる。前記−触式中のＲと
しては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等
の低級アルキル基を、Ａｒとしては、フェニレン基、ナ
フチル基、アントラニル基等の芳香族基を例示すること
ができる。

尚、前記一般式（１）で表されるジオキセタン誘導体の
陽イオンとしてはナトリウム、カリウム等のアルカリ金
属、アンモニウム、ＮＣＲ”）４”　　Ｃ式中、Ｒ１は
、メチル、エチル等のアルキル基、ベンジル等のアラル
キル基を表わす、）で表される四級アンモニウムを例示
することができる。

本発明における酵素反応は、ｐＨ４〜ｐｌ＋　１０．５
において行うことを必須の要件とするものであるが酸ホ
スファターゼの場合は、ｐＨ４〜ｐＨ１で酵素反応する
ことが好ましく、アルカリホスファターゼの場合は、ｐ
Ｈ７〜ｐＨ１０，５で酵素反応することが好ましい。即
ち、前記したホスファターゼの至適ｐＨ内において酵素
反応を行うものである。

本発明は、酵素反応後、更に強アルカリ条件下において
発光反応を行い化学発光を誘導するものである。酵素反
応の終了は、基質の反応した程度により判断するもので
あるが酵素の存在量と基質の量との関係などを考慮し、
適宜決定することができる。

又、この反応の終了は、停止剤を添加し、強制的に行う
こともできる。ここで停止剤として使用できるものとし
て、酵素阻害剤、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＩＩのキレ
ート化剤、フェニルリン酸エステル、ナフチルリン酸エ
ステル等の有機リン酸エステルあるいはオルト正リン酸
等の無機リン酸を挙げることができる。停止剤の使用量
は、酵素阻害剤のＫｉを考慮し、その１０倍以上が好ま
しく例えばＥＤ−ＴＡの場合は１ｓ＋Ｍ以上であり、又
、フェニルリン酸エステルの場合は３０ｍＭ以上である
。

尚、酵素としてアルカリホスファターゼを使用している
場合は、酸性条件に設定することにより酵素反応を停止
することができる。この場合には、再び前記した如くの
アルカリホスファターゼの至適ｐＨ内に条件を設定する
ことにより酵素反応を再開させることもできる。

次いで本発明は、強アルカリ条件下において発光反応を
行い、得られる化学発光を測定するものである。本発明
における強アルカリ条件とはおよそｐ）１１１以上での
条件を指すものである。強アルカリ条件の設定は、Ｎａ
ＯＨ１ＫＯＨ、Ｍｇ（Ｏ）Ｉ）ｘなどのアルカリ金属あ
るいはアルカリ土類金属の水酸化物、水酸化アンモニウ
ム、エタノールアミン等の水酸化物イオンを有する化合
物を系中に添加することにより行うことができる。

強アルカリ条件設定と同時に発光反応が開始されるが、
発光量の測定は、市販されているルミノメータ−を用い
て容易に測定することができる。

尚、この発光反応は、前記に示した如く設定した反応条
件を解除することにより反応が停止され、再びもとの反
応条件にもどすことにより発光反応が再開される。即ち
、本発光反応は条件設定することによりＯＮ　−ＯＦＦ
状態で反応を行なわせることができる。

又、この発光反応を行う際に、哺乳類由来血清アルブミ
ン、ポリアルキル４級アミン、蛍光剤、ジメチルスルホ
キシド等をエンハンサ−として用いることができる。タ
ンパクとしては、例えば、ＢＳＡ、　ＩＳＡ、ヒト免疫
グロブリン、卵白アルブミン等を使用することができる
。又、ポリアルキル４級アミンとしては、例えば、ポリ
ジアリールジメチルアンモニウムクロライド（以下ＰＤ
ＤＡＣと記ス）、ポリ〔ビニルベンジル（ベンジルジメ
チルアンモニウムクロライド）〕（以下ＢＤＭＱと記す
）等を使用することができる。更に、蛍光剤としては、
例えば、フルオレッセイン、シス−ジクロロローフ−二
トロペンゾフラザン（以下ＮＢＤ−Ｆと記ス）、≠７−
フルオロー４−ニトロベンゾキサンアゾール（以下ＮＢ
Ｄ−Ｃと記す）とアミン、アミノ酸、ペプチド若しくは
蛋白質との結合物又は誘導体等を使用することができる
。エンハンサ−の使用量は、発光反応系の０．０００１
ｗｔ％〜１０−ｔ％である。

本発明は酵素免疫測定法として採用することができる。

その際測定できる抗原としては、血清あるいは尿などに
含まれる薬物、ホルモンあるいは各種疾患に由来する微
量成分などである。又、使用する抗体は、公知の方法に
従い取得したものを使用することができる。例えば、兎
、山羊、馬、モルモット、ニワトリなどの温血動物に、
リガンド又は酵素を体重１ｋｇ当り０．３〜２ｍｇ程度
１〜数回背中皮下、フットパッド、大腿筋等にアジュバ
ントとともに注射して当該動物の体内に抗体を形成させ
ることができる。得られた抗体はペプシン等の蛋白質分
解酵素でＦ　（ａｂ’　）ｚ＋　Ｆａｂ’　、　Ｆａｂ
などに分解して用いることもできる。

一方、モノクローナル抗体として取得することもできる
。その場合には、マウスに前記のりガンドあるいは酵素
をアジュバントとともに数回腹腔等に注射し、肺臓細胞
を取り出してポリエチレングリコール等を用いてマウス
ミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細胞の
なかから当該抗体を産生ずるものをクローニングによっ
てモノクローン細胞として増殖させ、得られたモノクロ
ーン細胞をマウス腹腔中で増殖させることによって得た
モノクローナル抗体を使用することができる。

免疫測定のための方法としては、「酵素免疫測定法」医
学書院（１９８７年版）に記載の各方法、例えば固定化
抗体上に抗原を反応させその抗原に酵素標識した抗体を
反応させ測定する方法等を採用することができる。

又、　本発明は、ポリヌクレオチド測定法として採用す
ることができる。その方法としては、ｒＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　ＰｒｏｂｅＪＶｏｌ
　　１　１７７〜１９８７年に記載の各方法、例えばニ
トロセルロースフィルターに固定させた検体のＤＮＡに
ハブテン標識相補プローブＤＮＡを反応させ、さらに抗
ハブテンアルカリホスファターゼ結合体を作用させる。

このアルカリホスフプターゼ活性をジオキセクン誘導体
を基質として用い測定することができる。

（作　用） 本発明は、酵素反応により得られた生成物を更に強アル
カリ条件下、発光反応に付すことにより、得られる化学
発光を利用している。

実施例１ （ＴＳＨの測定） １５μｊ！のＴＳＨを含むサンプル（０，２ｕＩＪ／ｍ
ｌ　）に抗ＴＳＨＦａｂ’を結合させたアルカリホスフ
ァターゼコンジュゲート１３５μ！（コンジュゲート濃
度０．５Ｍｇ／ｍｊ！０．ＩＭＦリス塩酸、２％ＢＳ＾
。

１ｓＭ　　Ｍｇｃｌｚ　、　０．１　ｍＭ　ＺｎＣ１ｚ
　、　ｐＨ７，５）を混合しこれに抗ＴＳＩ（マウスＩ
ｇＧをコートしたポリスチレンビーズ１個（直径１／８
インチ）を加え、室温下２時間放置した。このビーズを
蒸留水で３回洗浄した後３−　（２’−スピロアダマン
クン）−４−メトキシ−４−（３“−ホスホリルオキシ
）フェニル−１，２−ジオキセタン・２ナトリウム塩・
（以下ＡＭＰＰＤと記す。） １００μｇ／１１．を含む基質液（０，１Ｍ　　トリス
塩酸。

ＬｍＭ　ＮｇＣｊ！ｚ　、　０．１ｍＭ　ＺｎＣｊ！ｔ
　ｐＨ９，８）　２００　ｕ　１を加え、室温で２００
分間反応せた。この基質反応液にアルカリ溶液を添加し
直ちにルミノメータ−（ベルトールド社製）でその発光
量をカウントし１０秒間の積算値を求めた。

その結果を第１図に示す。

実施例２ １５μｊ！のＴＳＨを含むサンプ７Ｌｚ（Ｑ、　４０ｐ
Ｕ　／ｍｌりに抗ＴＳＨＦｅｂ’を結合したアルカリホ
スファターゼコンジュゲート１３５μｉ＜コンジュゲー
ト濃度０．５μｇ／　ｓＬ　０．ＩＭ　トリス塩酸、２
％ＢＳＡ　。

１ｍＭ　ＭｇＣＬｚ　、　０．１ｍＭ　ＺｎＣｊ！ｔ　
ｐＨ７、５）を混合し、これに抗ＴＳＨマウスＩｇＧを
コートしたポリスチレンビーズ１個（直径１７８インチ
）を加え、室温下２時間放置した。このビーズを蒸留水
で３回洗浄した後＾ＭＰＰＤ　１００　ｔ１ｇ／　ｍｊ
！を含む基質液（０，１Ｍトリス塩酸、　　ｌ　１ｗＭ
　ＭｇＣ１ｇ、０．１　ｍＭ　ＺｎＣｌ！、ｚ　ｐＨ９
，８）２００μｌを加え室温で反応させた。

１５分間反応を行なった後ルミノメータ−（ベルトール
ド社製）で測定した。途中、０．１Ｍ）リス塩酸、　０
．２ＭＮａｇＨＰＯｎ　、　　１０ＩＩＭ　ＥＤＴＡ　
ｐＨ９，８を１００μｌ加えて酵素反応を停止させ、停
止後８分経過した時点でＩ　Ｎ　Ｎａ０ＩＩを２０ｕｌ
加えて反応液のｐＨを１１．２まで上昇させた。ルミノ
メータ−で発光量をカウントし、１０秒間の積算値を求
めた。この測定結果を第２図に示す。

実施例３ １５ｕｌのＴＳＩ（を含むサンプＪｌｚ（０，４０μＵ
／　ｍｆｆ１）に抗ＴＳＨＦａｂ’を結合したアルカリ
ホスファターゼコンジュゲート１３５μｌ（コンジュゲ
ート濃度０．５μｇ／　ｗ＋Ｌ　　Ｏ，ＩＭ　　）リス
塩酸、２％ＢＳＡ　。

１ａ＋Ｍ　ＭｇＣｊ！＊　、　０．１ａ＋Ｍ　ＺｎＣｊ
！ｘ　ｐＨ７，５）を混合し、これに抗ＴＳ）ｌマウス
ＩｇＧをコートしたポリスチレンビーズ１個（直径１７
８インチ）を加え、室温下２時間放置した。このビーズ
を蒸留水で３回洗浄した後ＡＭＰＰＤ　１００μｇ７ｍ
ｌを含む基質液（０，ＩＭ　　）リス塩酸、　　１ｍＭ
　ＭｇＣｊ２ｚ　、　　０．１ｍＭ　ＺｎＣｊ２２ｐ１
（９，８）２００μ２を加え室温で反応させた。

４０分間反応を行なった後ルミノメータ−（ベルトール
ド社製）で測定した。途中０．１Ｍリン酸クエン酸溶液
ｐＨ３，０を２００　μ！加えて反応液のｐＨを４．６
まで落とし３分経過した時点でＩＮ　ＮａＯＨを５０μ
！加えて反応液のｐｉを１２．０まで上昇させた。ルミ
ノメータ−で発光量をカウントし、１０秒間の積算値を
求めた。その測定結果を第３図に示す。

実施例４ （ＤＭＳＯ添加ＴＳＩ＋の測定） １５μｆのＴＳＩＩを含むサンプル（０，２μＵ／　ｍ
ｊ２）に抗ＴＳ）］　Ｆａｂ’を結合させたアルカリホ
スファターゼコンジュゲート１３５μｆｌ（コンジュゲ
ート濃度０．５μｇ／　ｍｌ、　０．１Ｍ　　）リス塩
酸、２％ＢＳＡ　。

１　ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ　、　０．１ｍＭ　ＺｎＣ１ｚ　
ｐＨ７，５）を混合し、これに抗ＴＳＨマウスＩｇＧを
コートしたポリスチレンビーズ１個（直径１７８インチ
）を加え、室温下２時間放置した。このビーズを蒸留水
で３回洗浄した後ＡＭＰＰＤ　１００　ｕｇ／　ｍｌを
含む基質液（０，１Ｍトリス塩酸、　　１ｍＭ　ＭｇＣ
ｊ！ｚ　、　　０．１ｍＭ　Ｚｎ（ｆ！ｚ　ｐＨ９、８
”）　２００μ！を加え室温でこの基質反応液に２Ｎ　
ＮａＯＨ，もしくは２Ｎ　ＮａＯＨ−ＤＭＳＯ混合液（
２Ｎ　ＮａＯＨ：ＤＭＳｏ、　　２＝１，１：１．１：
２）２００μｌを加え、直ちにルミノメータ−（ベルト
ールド社製）で発光量をカウントし、１０秒間の積算値
を求めた。

その結果を表１に示す。

実施例５ （４級アミン添加ＡＦＰの測定） ｌＯｕｌのＡＦＰを含むサンプル（０，ｔｏ、　５０ｎ
ｇ／ｍ　Ｉ！、）に抗ＡＦＰ　Ｆａｂ’を結合させたア
ルカリホスファターゼコンジュゲート１５０μＩｃコン
ジエゲート濃度０．５　ｐｇ／　ｎ／２．　０．１Ｍ　
　トリス塩酸、２％ＢＳＡ　。

１ｍＭ　ＭｇＣｌ！、□、　　０．１ｍＭ　ＺｎＣ１ｚ
　ｐＨ７，５）を混合し、これに抗ＡＦＰマウスＩｇＧ
をコートしたポリスチレンビーズ１個（直径１７８イン
チ）を加え、室温で３０分間放置した。このビーズを蒸
留水で３回洗浄した後、ＡＭＰＰＤ　１００μｇ７ｍｌ
を含む基質液（０，１Ｍ　　トリス塩酸、　　１ｍＭ　
ＭｇＣ１ｚ　、　　０．１ｍＭＺｎＣＲ，ｚ　ｐＨ９，
８）もしくは、それにさらにＰＤＤＡＣを０．０５％添
加した基質液を２００μ！加えて室温で２０分間反応さ
せた後、１００ｕｆの４Ｎ−ＮａＯＨを添加し、ルミノ
メータ−（ベルトールド社製）でその発光量をカウント
し、１０秒間の積算値を求めた。

その結果を表２に示す。

表２ 実施例６ （酸性フォスファターゼの活性測定） ０、１　ｍｇ／　ｍｌの４ＭＰＰ［ｌを含む０．１　Ｍ
酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）　２００μ２に酸性フォスフ
ァターゼを含む酸素液ｌＯμ！加え０〜１２０分間室温
で反応させ、これに４Ｎ　ＮａＯＨＩ　Ｑ　Ｏｐ　１ｆ
Ｊｕえて反応を停止させ、その１０秒間の発光量を計測
した。第４図は各濃度の酸性フォスファターゼ（０，１
５７，０，３１３，０，６２５，１，２５，２，５Ｘ　
１０−６Ｍ）での酸素反応のタイムコースを示している
。

実施例７ （蛍光剤での増感発光及びエネルギートランスファーに
よる長波長発光計測） ＡＭＰＰＤ（５０μｇ／ｍｌ、０．１　Ｍ　）リス−Ｆ
ＩＣｆ。

ＢＤＭＱ　Ｏ，０１％、蛍光剤０〜１００ｔｔｇ／　ｍ
ｌ、ｐＨ９．８）溶液２　ｍｌｌにアルカリフォスファ
ターゼ１０μ！加え、直ちにその発光を波長３６０ｎｍ
〜６００ｎｍまで計測し、その発光量の積分値を求めた
。表３は各蛍光剤での増幅率を示し、又第５−１〜５−
３図は波長シフトのパターンを示している。

表３ ＊ｌ：Ｒ（ｉは波長４８０〜６００ｎｍの発光積算値を
３８０〜４８０ｎ−の発光積算値で割った値のトランス
ファー率を示す。

＊２：添加時の発光積算値を未添加の発光積算値で割っ
た値を示す。

実施例８ （ヒト肝炎Ｂ型ウィルス表面抗原（ｌ（ＢＶｓ）　ＤＮ
Ａの検出） ＨＢＶｓ　ＤＮＡ　（１００，１０，１，Ｏ，ｌｐｇ／
　ｍｌ）を等量の０．６　Ｎ　ＮａＯＨを添加すること
により変性させ、弱く吸引することによりナイロンメン
ブラン（Ｉｌｙｂｏｎｄ−Ｎ、アマジャム社製にプロッ
トした。このメンプランを２Ｍアンモニアおよび５Ｘｓ
ｃｃで洗浄後、このＤＮＡをＵｖ照射によりメンプラン
に固定した。固定化したメンプランをプレハイブリダイ
ゼーション緩衝液（５Ｘｓｃｃ、５ｘデンハート溶液、
０．１％５ＤＳ）で１５分間、５０’Ｃでインキエベー
トした。この溶液２　ｍｌに１ＯＩＩｆｆｉのプローブ
ＤＮＡ　（アルカリ性ホスファターゼ標識オリゴヌクレ
オチドＤＮＡ、　Ｄｕｐｏｎｔ社製）を加え、５０°Ｃ
で３０分間ハイブリダイゼーションした。その後、この
メンプランをｌＸ５ｓｃ、１％ＳＤＳを含む溶液で１回
につき室温で５４間浸して２回洗浄し、更に１Ｘｓｓｃ
、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含む溶液で１回につ
き５０″Ｃで５分間浸して２回洗浄した。

最後にこのメンプランを撹拌しなから１Ｘｓｓｃを含む
溶液で１回につき室温で５分間浸して２回洗浄した。ア
ルカリ性ホスファターゼの活性測定は＾ＭＰＰＤ　（１
００ａ　ｇ／　ｍｆｆ１）およびＢ［１ＭＱ　（０，０
２％）を含む基質液を用い室温で５分間浸すことにより
行い、５分後にこのメンプランを０．０１Ｍリン酸１　
ｍ　ＭＥＤＴ＾ｐＨ６゜０に浸して洗浄し、更にこのメ
ンプランをｌ　Ｎ　ＮａＯＨ溶液に浸した。その後、直
ちにＸ線フィルムにこのメンプランを３分間感光させた
。対照として０．１　Ｍ　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ５，２）
に浸し、フィルムに感光させた。表４はそのときの各濃
度に対する感光スポットを示している。

表４ ＨＢＶ　ｃｏｎｅ、　　１０ｐｇ　１００ｐｇ　１００
０ｐｇＮａ０１１（−）　　　　　　　＋ Ｎａ０Ｈ（＋）　　　　　＋　　　　　　＋　　　　　
借（−）目で判定できない。

（＋）目で感光スポットをよみとれる。

（昔）目でスポットが黒くよみとれる。

（柑）スポットが広く外部に及んでいる。

（発明の効果） 本発明は、酵素反応と更に強アルカリ条件における発光
反応を組合せた化学発光測定法である。

極めて多量の光量を得ることができるため高感度、高精
度の測定ができる。又、発光を任意の時間に行なわせる
こともできるため極めて有用な測定法である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、アルカリ条件による発光量の変化を示した図
であり、第２図は、酵素阻害剤で反応を停止させてから
アルカリ条件で発光をさせた時の発光量を示す図である
り、第３図は酸を添加し反応を停止させた後再びアルカ
リ条件で発光をさせた時の発光量を示す図であり、第４
図はアシッドホスファターゼ活性の測定を行なった時の
発光を示す図であり、第５−１〜５−３図は各蛍光剤添
加時の発光スペクトルの変化を示す図である。 特許出願人　冨士レビオ株式会社 カウント数 カウント数 第１ 図 第 図 カウント数 （ｘｌｏ−’／１０杓 カウント数 （ｘｌｏ−’７１０秒） 時間（分） 第 図 第 図 時間（分） 時間（分） 第５−１図フルオレッセインによるトランスファ０μｇ
／ｍノ

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵素として酸又はアルカリホスファターゼ及び基
   質として 一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表されるジオキセタン誘導体を用い、ｐＨ４〜ｐＨ１
   ０．５において酵素反応させた後、更に強アルカリ条件
   において発光反応を行うことからなる、化学発光測定法
   （式中、Ａｄはアダマンチル基、Ｒは低級アルキル基で
   あり、Ａｒは芳香族基である。）。
2. （２）化学発光測定法を酵素免疫測定法に用いた、特許
   請求の範囲第（１）項に記載の方法。
3. （３）化学発光測定法をポリヌクレオチド測定法に用い
   た、特許請求の範囲第（１）項に記載の方法。
4. （４）酵素反応を停止剤を添加し、反応を停止させた後
   に強アルカリにおいて発光反応を行う、特許請求の範囲
   第（１）、（２）又は（３）項に記載の方法。
5. （５）停止剤が酵素阻害剤又は酸である、特許請求の範
   囲第（４）項に記載の方法。
6. （６）強アルカリで反応を行う際にエンハンサーを共存
   させる、特許請求の範囲第（１）、（２）又は（３）項
   に記載の方法。
7. （７）エンハンサーがタンパク、ポリアルキル４級アミ
   ン又は蛍光剤である、特許請求の範囲第（６）項に記載
   の方法。
8. （８）タンパクがＢＳＡ、ＨＳＡ、ヒト免疫グロブリン
   又は卵白アルブミンである特許請求の範囲第（７）項に
   記載の方法。
9. （９）蛍光剤がフルオレッセイン、シス−ジクロロビス
   （２，２′−ビピリジン）ルテニウム（II）ハイドレー
   ト又は４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザン、７−
   フルオロ−４−ニトロベンゾキサンアゾールとアミン、
   アミノ酸、ペプチド若しくは蛋白質との結合物又はその
   誘導体である、特許請求の範囲第（７）項に記載の方法
   。