JPH02274244A - 人工血管およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「発明の目的」 本発明は人工血管およびその製造法に係り、抗血栓性の
優れた人工血管およびその製造法を提供しようとするも
のである。

（産業上の利用分野） 人工血管とその製造技術。

（従来の技術） 人工血管は従来から知られており、即ち一般法としてポ
リエチレンフタレートを素材とし、これを紡糸して得ら
れるポリエステル繊維を編織してチューブ状とし、これ
に襞をつけてキング現象（屈曲によって折れる現象）を
防止したものや、ポリテトラフルオロエチレンをチュー
ブ状に成形し延伸加工して結節と小繊維よりなる多孔質
組織としたものが用いられている。即ちこれらのものを
人工血管として用いると管壁の構造が有孔化されている
ため、その隙間に細胞が侵入生育し生体化する利点があ
り、前記したような人工血管が生体に移植されると、先
ず血液と接触する内表面に凝血層が生じ、この上に細胞
が増殖して抗血栓性の内膜形成をなすものである。

ところで血管についてはその内面が１層の内皮細胞で覆
われており、この内皮細胞には抗血栓性機能の存在する
ことが証明されている。従って斯うしだ内皮細胞の抗血
栓性を利用する考えは古くから存在したが、内皮細胞の
採取培養技術が伴わないことから実現が困難であった。

然し１９７８年にヘリング（Ｈｅｒｒｉｎｇ）等により
自家内皮細胞を、いわゆる播種法により人工血管に接着
させることで抗血栓性を向上することが報告され（Ｊｅ
ｅｒｒｉｎｇＭ、Ｂ、ｅｔ　ａｌ、：　Ａ　Ｓｉｎｇｌ
ｅ−ｓｔａｇｅｄ　ｔｅｃｈｎｊｑｕｅ　ｆｏｒｓｅｅ
ｄｉｎｇ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｇｒａｆｔｓ　ｗｉｔｈ
　ａｕｔｏｇｅｎｏｕｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ、　Ｓ
ｕｒｇｅｒｙ　８４：　４９８．１９７８．）、以後そ
の有用性が各種文献において確められている（Ｓｔａｎ
ｌｅｙ、　Ｊ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、：　Ｅｎｈａｎｃｅｄ
　ｐａｔｅｎｃｙ　ｏｆｓｍａｌｌ−ｄｉａｍｅｔｅｒ
、　ｅｘｔｅｒｎａｌｌｙ　５ｕｐｐｏｒｔｅｄ　Ｄａ
ｃｒｏｎｉｌｉｏ−ｆｅｍｏｒａｌ　ｇｒａｆｔｓ　　
５ｅｅｄｅｃｌ　ｗｔｔｈ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃ
ｅｌｌｓ、　Ｓｕｒｇｅｒｙ　９２：　９９４＋　１９
８２．）＋　（Ｓｈｅｐａｒｄ、　Ａ、Ｄ。

ａｔ　ａｌ、：　Ｅｎｄｏｔｂｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　
ｓｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｓｍａｌｌ−ｃａｌｉｂｅｒ　
５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　　ｇｒａｆｔｓ　　ｉｎ　　ｔｈ
ｅ　ｂａｂｏｏｎ、Ｓｕｒｇｅｒｙ９９　　：　　３１
８．　１９８６．）、　　（Ｓｃｈｍｉｄｔ、　　Ｓ、
Ｐ、　　ｅむ　ａｌ、：　　Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆ　　ａ
ｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ　ａｇｅｎｔｓ　　ｉｎ　ｃｏ
ｍｂｉｎａｔｉｏｎ　　ｗｉｔｈｅｎｄｏｔｈｅｌｉａ
ｌ　　ｃｅｌｌ　　ｓｅｅｄｉｎｇ　　ｏｎ　　ｓｍａ
ｌｌ−ｄｉａｍｅｔｅｒＤａｃｒｏｎ　　ｖａｓｃｕｌ
ａｒ　　ｇｒａｆｔ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　　ｉｎ
　　ｔｈｅ　　ｃａｎｉｎｅｃａｒｏｔｉｄ　ａｒｔｅ
ｒｙ　ｍｏｄｅｌ、　　Ｊ、　　Ｖａｓｃ、　　Ｓｕｒ
ｇ、　　２：　　８９８＋１９８５、）。また近年、臨
床応用の報告が散見されるようになってきた（Ｈｅｒｒ
ｉｎｇ、　Ｍ、Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、：　Ｓｅｅｄｉｎｇ
ｈｕｍａｎ　ａｒｔｅｒｉａｌ　ｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ
　１ｖｉｔｈ　ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｌｙｄｅｒｉｖｅ
ｄ　　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ、　　Ｔｈｅ　　ｄｅｔ
ｒｉｍｅｎｔａｌ　　ｅｆｆｅｃむ　０ｆｓｎ＋ｏｋｉ
ｎｇ、　Ｊ、　Ｖａｓｃ、　Ｓｕｒｇ、　１：　２７９
＋　１９８４）＋　（Ｉｌｅｒｒｉｎｇ。

Ｍ、Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、：　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　
ｓｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒ
ｏｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｐｏｐｌｉｔｅａｌ　ｂｙｐａｓ
ｓｅｓ、　Ａ　ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｒｅｐｏｒｔ、
　Ｊ、　Ｖａｓｃ、　Ｓｕｒｇ、　６：　１１４．１９
８７）。

（発明が解決しようとする課題） 上記した従来一般法の場合、最初に生成する凝血層の厚
さは１．０〜１．５　ｎｒにも達し、しかも内膜形成も
充分でないので血栓の誘発を生じ易い。従って四肢末梢
の小口径動脈または静脈の血行再建の際、満足できる人
工血管は未だ得られていない。

比較的太い大腿動脈閉塞に対してすら自家静脈が最も適
した代用血管と考えられており、動脈硬化性疾患の増加
しつつある今日、抗血栓性の優れた人工血管開発は血管
外科医にとって重要な課題である。

斯うした問題を解消すべく播種法により自家内皮細胞を
人工血管に接着させる前記の従来法は、採取した内皮細
胞をプリクロッティングの血液に混入させる方法であっ
て、この技術には幾つかの避は得ない問題点がある。即
ち以下の如くである。

■　採取される使用可能な細胞数が少＜、播種できる細
胞数も一定でない。

■　播種した細胞が必ずしも全て接着するとは限らず、
充分接着するまでにどの程度の時間を必要とするのか不
明で、細胞採取時の障害から回復させるにはどうしたら
よいか不明である。

■　植込まれた細胞が剥離し易い。

即ちトリプシンやコラゲナーゼ等による細胞の障害は、
洗浄によって直ちに取除かれるものでなく、その後数時
間も影響を持続するとされており、内皮細胞は障害を受
けたような状態では抗血栓どころか、逆に血栓形成性に
働く可能性も指摘されている。播種を行っている施設で
は播種した細胞を１度培養系に移したり　（Ｓｈｅｐａ
ｒｄ、　Ａ、Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、二Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉ
ａｌ　ｃｅｌｌ　ｓｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｓｍａｌｌ−
ｃａｌｉｂｅｒｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｇｒａｆｔｓ　ｉ
ｎ　ｔｈｅ　　ｂａｂｏｏｎ、　Ｓｕｒｇｅｒｙ　９９
：３１Ｌ　１９８６．）＋　（Ｇｒａｈａｍ、　Ｌ、Ｍ
、、　ｅｔ　ａｌ、：　Ｅｘｐａｎｄｅｄｐｏｌｙｔｅ
ｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｖａｓｃｕｌａ
ｒ　ｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓｓｅｅｄｅｄ　ｗｉｔｈ　ｅ
ｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ａｎｄ　
ｃｕｌｔｕｒｅｄｃａｎｉｎｅ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａ
ｌ　ｃｅｌｌｓ、　Ｓｕｒｇｅｒｙ　９１：　５５（Ｌ
１９８２）　、脂肪組織から大量に内皮細胞を取ったり
することが報告され（Ｊａｒｒｅｌｌ、　Ｂ、Ｅ、　ｅ
ｔ　ａｌ、：　Ｕｓｅｏｆ　ｆｒｅｓｈｌｙ　１ｓｏｌ
ａｔｅｄ　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａ
ｌ　ｃｅｌｌｓｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　
ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｍｏｎｏｌａ
ｙｅｒｏｎ　ａ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｇｒａｆｔ　ａｔ
　ｓｕｒｇｅｒｙ、　　Ｓｕｒｇｅｒｙ　１００　：３
９２、１９８６）、いろいろと方法を改良し解決を図っ
ているが完全となし難い。

又、大量の細胞を播種し、数時間で融合させ、移植時人
工血管の内面を完全に内皮細胞で被覆してしまう方法も
検討されているが（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ。

ＲＡ、Ｄｕｒａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｃｏｎｆｌｕｅｎ
ｔ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｖｉｌ　　ｃｅｌｌｍｏｎｏｌａ
ｙｅｒｓ　　ｏｎ　　ｓｍａｌｌ−ｃａｌｉｂｅｒ　　
ｖｕｓｃｕｌａｒ　ｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓｉｎ　ｖｉｔ
ｒｏ　Ｓｕｒｇｅｒｙ；　１０３：　４５６−４６２．
１９８８）　、生体内での検討では、１週間での細胞被
覆率は７５．８％と、まだ十分ではない（Ｔｏｎｎｅｎ
ｂａｕｍ　Ｇ＋　Ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ　ｓｅｅｄ
ｉｎｇ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉ
ａｌ　ｃｅｌｌｓ　１ｅａｄｓ　ｔｏ　ｒａｐｉｄ　ｃ
ｏｖｅｒａｇｅ　ｏｆ　Ｐｏｔｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒ
。

ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｒａｆｔｓ、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　
Ｓｕｒｇｅｒｙ；　３１８−３２１＋１９８７）。

「発明の構成」 （課題を解決するための手段） 本発明者等は上記したような従来技術の問題を解決する
ことについて検討を重ね、予め人工血管に内皮細胞を接
着増殖させ、完全状態に内皮細胞で覆われた、所謂自家
内皮細胞被覆人工血管の開発研究を重ね、本発明を完成
した。即ち本発明によるものは以下の如くである。

１、生体移植用の人工血管であって、該人工血管基材に
おける血液接触側の面に移植対象である生体の血管にお
ける自家内皮細胞が緻密に被覆された状態となっている
ことを特徴とした人工血管。

２、人工血管用基材の血液接触側の面に移植対象である
生体の血管より採取した内皮細胞を播種し、これを生体
外の培養系において培養し、前記した血液接触側の面が
上記内皮細胞によって緻密に被覆された状態となるよう
に該内皮細胞を増殖することを特徴とする人工血管の製
造法。

３６予め人工血管用基材の播種面にコラーゲンを被覆し
、血管内皮細胞の培養、増殖をＲＩＴＣ８０−７に牛脂
児血清および成長因子を加えた培地を用いて行う前記２
項に記載の人工血管の製造法。

なお上記したような本発明人工血管用基材としては従来
から人工血管として用いられているものは何れも採用で
き、ポリエステル繊維を編織したもの、ポリテトラフル
オロエチレンを延伸加工し結節と小繊維より成る多孔質
構造としたもの等が人工血管としての実績が豊富である
ことから好ましいものであることは言うまでもない。

又血管内皮細胞の体外培養により緻密な被覆が行われる
まで増殖させるためには培地として線維芽細胞の無血清
培養用の培地であるＲＩＴＣ８０−７に牛脂児血清およ
び成長因子を加えたものを使用することが好ましい。

このような牛脂児血清を添加しない場合には血管内皮細
胞は殆ど増殖しないが、牛脂児血清を添加しその濃度を
高めるに従って増殖が刺戟され、第１図に示すように高
い血清の要求性が示される。

なお成長因子としては特に牛脳抽出液および酸性線維肺
細胞成長因子が有効である。

又血管内皮細胞の体外培養で目標とする緻密な被覆が得
られるまでの増殖を行うためには血管内皮細胞の人工血
管用基材への播種に先だって播種面にコラーゲンを被覆
することが必須であり、これは初期の接着に有効である
。更に播種用内皮細胞の生体血管からの採取に際しては
トリプシン、コラゲナー°ゼ等の適当な酵素を用いて行
うことが好適である。

なお、第１図は培地としてＲＩＴＣ８０−７＋酸性線維
芽細胞成長因子２０　ｎｇ／ｍｌ＋ベバリン２５μｇ／
ｍｌに各濃度の牛脂児血清を加えたもので、細胞数計数
を４日間に行い、コラーゲン被覆は濃度２５μｇ／−で
行ったものである。なお、図中矢印は播種細胞数を示す
ものである。

（作用） 本発明による人工血管を生体移植に用いると、人工血管
内面に内皮細胞が接着増殖されて緻密被覆状態となって
いることから細胞数の問題が解決されると共に接着も充
分となり、細胞採取の際の障害からも回復した状態で内
皮細胞を利用せしめ、内皮細胞の抗血栓性機能を充分に
得しめる。

即ち内皮細胞の抗血栓機能であるプロスタサイクリンの
産出能も本発明で使用した細胞で確認された。

（実施例） 本発明によるものの具体的な実施例について説明すると
、以下の如くである。

実施例１ これは培養皿上でのコラーゲン被覆の効果についてのも
のである。

大内皮細胞を酵素法で採取し初代培養を行った。

即ち気管内挿管全府下で雑種成人の外頚静脈を露出し、
全身ヘパリン化の後、約１９ｃｍ摘出し、静脈の両切断
端よりチューブを挿入し、ヘパリン加ＣＭ　Ｆ　−Ｐ　
Ｂ　Ｓ　　（Ｃａ”、　Ｍｇ”のない燐酸緩衝ン夜）に
て赤血球を除去した後、内腔に！ｌｌＴｃ　８０−７培
地を充たし培養室へ直ちに搬送した。ＣＭＦ−ＰＢＳで
洗浄後、内腔に０．１％コラゲナーゼ液（ｔｙｐｅ　ｒ
Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　Ｍｏ　ＵＳＡ
）を注入し室温で１０分間静置した。

次いでこれを採取し、１２０Ｏｒｐｍ、５分間の遠心処
理をなし沈渣の細胞をＲｒＴＣ８０−７＋　１０％牛脂
児血清（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂ、、　Ｎｏｒｔｈ　Ｒｙｄｅ
　Ａｕ５ｔｒａｌｉａ）　＋成長因子（３％牛脳抽出液
または酸性線維芽細胞成長囚子２０ｎｇ／ｎ＋ｊ！＋ヘ
パリン２５μｇ／ｍ　（１）で再浮遊させ、３５鶴プラ
スチック培養皿（ＬｕｘＭｉｌｅｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ、　ＩＬ　ＵＳ＾）で培養した。

この操作を５回５０分まで行い、計５個の皿で初代培養
を行った。継代は２５ｃａｌの組織培養フラスコ（Ｆａ
ｌｃｏｎ　　Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｌａ
ｂｗａｒｅ　ＮＪ　ＬＩＳＡ製）を用いて行った。５個
の皿の中、平滑筋細胞、線繊芽細胞混入のみられない皿
の内皮細胞を同培地で培養し、緻密被覆の状態で０．０
０５％トリプシン（ｔｙｐｅ　ｍ　Ｓｉｇｍａ）を用い
て三分割して継代した。なお培養は７％０□、５％ＣＯ
２，８８％Ｎ２の低酸素条件で行い、検討には継代数４
の内皮細胞を用いた。

細胞の分散、計数はＣＭＦ−ＰＢＳで２度軽く洗浄した
後、０．０７５％プロナーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ）　−Ｂ
＋　０．０２％ＥＤＴＡ　（エチレンジアミンテトラ酢
酸でＣａ−，Ｍｇ”−等２価の金属イオンのキレート剤
）＋ＣＭＦ−ＰＢＳを用いて分散し、セルカウンター（
Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ　Ｉｎｃ、　
ＦＬ　ＵＳＡ製）により細胞数を数えた。

コラーゲン被覆は、０．２５％タイプ■コラーゲン（呉
羽化学社製）をＣＭＦ　　ＰＢＳで適当な濃度とし、こ
れに１時浸すことにより被覆せしめ、被覆後ＣＭＦ−Ｐ
ＢＳで軽く洗浄した。

走査電顕標本は、燐酸塩緩衝１．６％グルタルアルデヒ
ドで約１２時間、４°Ｃで固定し、アセトン系列で脱水
し、酢酸イソアミルで置換後、臨界点乾燥、金蒸着して
作製し、Ｓ−４５０型走査電子顕微鏡（日立社製）で観
察した。

上記したような大内皮細胞の増殖を検討した結果は第２
図の如くであって、コラーゲン被覆のない場合は倍加時
間が４５時間であり、特に播種細胞数が少いと成長因子
を加えても第３図に顕微鏡写真を示すように極めて拡が
りにくい形態を示し緻密被覆になり難いものであったが
２５μｇ７ｍｌ濃度のコラーゲン被覆を行った場合には
倍加時間２０時間とその増殖が刺戟され、第４図のよう
に小石状の外観を示す形態をとった。

第２図は培地としてＲｒＴｃ８０−７＋１０％牛脂児血
清＋牛脳抽出液を使用し、穴当り１０，０００の播種細
胞数で培地交換を２日に１回行ったもので、測定値は繰
り返し実験３回の平均である。また、Ｏはコラーゲン被
覆を２５μｇ／１１１１で行った場合を示し、・はコラ
ーゲン被覆を行わない場合を示す。

更にコラーゲン濃度を変えて第２図に準する条件で内皮
細胞増殖への影啓を検討した結果は第５図に示す如くで
あり、コラーゲン濃度７．５μｇ／ｒｄまで細胞の増殖
は刺戟されたが、それ以上の濃度となっても実質的に変
化のないものであった。

なお、第５図の細胞数計数は４日目に行い、測定値は繰
り返し実験６回の平均である。

実施例２ これはコラーゲン被覆の効果についてのもので、基材が
延伸多孔質ポリテトラフルオロエチレンの場合のもので
ある。

実施例１において述べたところと同様に採取し培養した
大内皮細胞を用い、結節とそれら結節をつなぐ微小繊維
より成る延伸多孔質ポリテトラフルオロエチレン（結節
間平均距離：１０μｍ）上でのコラーゲン被覆の細胞増
殖に及ぼす影響を検討した結果は第６図に示す如くであ
り、細胞の分散、計数、コラーゲン被覆の方法について
は実施例１に記載したところと同様に行ったが、細胞が
完全に分散されたかどうかは分散した後に基材の先頭標
本を作成し、細胞の残存しないことを確認した。

またＣＭＦ−ＰＢＳで洗浄の際に人工血管上に受動的に
載っている細胞のみが洗い落され、充分接着した細胞が
洗浄操作で剥落しないことを見るため、洗浄に用いたＣ
ＭＦ　　ＰＢＳを倒立顕微鏡で観察し球形の単一細胞だ
けが浮遊していることを確認した。

第６図は培地としてＲＩＴＣ８０−７÷１０χ牛脂児血
清＋酸性線維芽細胞成長因子で２０　ｎｇ／　ｍＡ’＋
ベパリン２５μｇ／ｄを用い、細胞数計数は自社につい
ては１日口、黒柱については６日目に行ったものである
。ここでの増殖率は６日目の細胞数の１日口の細胞数に
対する比であり、測定値は繰り返し実験２回の平均であ
る。また、破線は播種細胞数を示す。

即ち第６図から明かなようにコラーゲン被覆を行わない
場合には細胞の接着率は４．５％で、細胞は殆んど接着
、増殖を示していないが、コラーゲン濃度を大とすると
細胞の接着率は急激に増加し、コラーゲン濃度７．５〜
７５μｇ／ｍ　！！で４５％前後と最大状態を示すが、
更に濃度を高めると接着率は逆に低下する。又１日口の
接着細胞数に対する６日目の細胞数の比は延伸多孔質ポ
リテトラフルオロエチレン上における真の細胞増殖を示
すと考えられるが、これをコラーゲンの濃度別でみると
、コラーゲン濃度２５μｇ／ｍ　（ｌで７．９と最大で
、コラーゲン濃度がこれより高くても低くてもその増殖
比は低下するものであった。

このような結果の仔細は必ずしも明かでないが、コラー
ゲンが存在しないと、本素材の疎水性などにより、細胞
は接着増殖できず、又コラーゲンが厚くコーティングさ
れると、逆に細胞の移動が妨げられて、増殖に不利なの
ではないかと考えられ、コラーゲンの最適濃度と認めら
れる２５μｇ／ｍ　１の被覆では走査電子顕微鏡でもコ
ラーゲンの繊維は観察されない程度であって、細胞は僅
かに延伸多孔質ポリテトラフルオロエチレン上に付いた
このコラーゲンを足場として接着した後、自ら産生した
マトリックスを足場として増殖するものと推定される。

また、このマトリックス被覆が余り厚いと接着した細胞
と共にマトリックスごと剥離される可能性も考えられる
。

実施例３ これは基材がポリエステル繊維編織布の場合のものであ
る。

実施例１と同しに採取、培養した大内皮細胞を用い、オ
ートクレーブで滅菌したポリエステル繊維１１”！布（
Ｋｎｉｔｔｅｄ　Ｄａｃｒｏｎ　：　Ｍｅａｄｏｘ　Ｍ
ｅｄｔｃａｌｓ。

Ｉｎｃ、　ＮＪ　ＵＳＡ製造）上での培養、増殖を行っ
た。

コラーゲン被覆の濃度は２５μｇ／ｍｆｆと２．５　ｍ
ｇ／ｍ　１の２水準となし、上記編織布上での内皮細胞
接着の走査電子顕微鏡写真は前記実施例１と同様の方法
で得た結果は第７図に示す如くである。

コラーゲン被覆の濃度を前記実施例２の延伸多孔質ポリ
テトラフルオロエチレンの場合と同じく２５μｇ／ｎｙ
　１とすると、上記編織布上ではその表面の凹凸が大き
いため細胞は第７図（ａ）のようにポリエステル繊維織
布上にへばりつくのみであり、同図（ｂ）のようにコラ
ーゲンを厚く被覆し、繊維間を埋めるようにしないと人
工血管全面を内皮細胞で完全に覆うことは難しいことが
知られた。

実施例４ これは成長因子の効果についてのものである。

実施例１において述べたところと同様に採取、培養した
大内皮細胞を用い、その成長因子に対する反応性を検討
した。

即ち、上皮成長因子を抜いたｔＴｃ８０−７に１０％牛
脂児血清を加えて培地とし、これに上皮成長因子（ＥＧ
Ｆ）１０ｎｇ／ｍ６、酸性線維芽細胞成長因子（Ｆ　Ｇ
　Ｆ）　　２０ｎｇ／ｍｆｆを加えてその増殖を検討し
た結果は第８図の如くであった。第８図において破線は
播種細胞数を示し、自社はコラーゲン被覆を２５μｇ／
−で行った場合を示し、黒柱はコラーゲン被覆なしの場
合を示し、又細胞数の計数は７日目であって、測定値は
繰返し実験３回の平均値を示すものであるが、この第８
図に明かなように上皮成長因子、酸性線維芽細胞成長因
子を加えない場合はコラーゲン被覆された皿上で僅かに
増殖がみられるのみであった。これに対し上皮成長因子
Ｌｏｎｇ／ｍｆｆを添加すると、添加しない場合に比し
約２倍の増殖刺戟が認められたが、酸性線維芽細胞成長
因子２０ｎｇ／ｍｌ！、ヘパリン２５μｇ／ｍ　ｊ＋の
添加ではコラーゲン被覆のみの場合、約１６倍に相当し
た増殖促進が得られた。

又上皮成長因子、酸性線維芽細胞成長因子を共に加える
と軽度であるが更に増殖が刺戟された。

実施例５ 実施例１と同様に採取、培養した大内皮細胞を用い、抗
血栓性機能の存否を確認すべくプロスタサイクリンの産
生能を検討した。

プロスタサイクリンの測定は１２穴培養皿で緻密被覆に
近い状態まで培養した継代数４の大内皮細胞を用い、プ
ロスタサイクリンの産生能を、６ｋｅ　ｔｏ−プロスタ
グランジンＦ１αを測定することによって求めた。即ち
基礎培地ＭＥＭに緩衝液の）ＩＥＰＥ５３．３　ｍｇ／
ｍｌ　、　ＮａＨＣＯ３１，４ｍｇ／ｍｌｌ　、　Ｉ　
ＮＮａＯＨ７，５／ＩＩ！／ｍｌを加え、ｐ）１７．４
とし、これによって２度洗浄し、更に３０分子備培養し
た後、刺戟物質を添加した。即ちブロスタサイタリン産
生刺戟物質としてはアラキドン酸（５μｇ／ｍ　ｌ　Ｓ
ｉｇｍａ）Ａｚ＊＋１．ｔ　（２Ｘ　１０−６Ｍ　Ｓｉ
ｇｍａ）ブラデイキニン（ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ：　５
Ｘ１０−’Ｍ％　　５　Ｘｌ０−６Ｍ、　Ｐｒｏｔｅｉ
ｎＲｅｓ　Ｉｎ５ｔ、　０ｓａｋａ）を各々の濃度にＭ
ＥＭで溶解したものを用い、刺戟物質添加後３０分でこ
れを築め、ＭＥＭ中の６　　ｋｅｔｏ−プロスタグラン
ジンＦ１αを直接検出する方法のＲＩＡ（ラジオイミン
ノアクセイ）で測定した。なおアラキドン酸刺戟時の６
−ｋｅｔｏ−プロスタグランジンＦ１α産生量は、６−
ｋｅｔｏ−プロスタグランジンＦ１αとアラキドン酸の
交差活性を考慮し補正した。またシクロオキシゲナーゼ
（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）の阻害物質であるイ
ンドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ：　３．３　
Ｘ　１０−ｂＭ、薫育製薬）を刺戟物質添加前１０分に
加えてプロスタサイクリンの産生抑制についても検討を
加えた。実験中は３７℃に保ち、５−ｋｅｔｏ−プロタ
グランジンＦ１αの産生量は細胞数１０’当りで表した
結果は第９図の如くである。第９図で黒柱はインドメタ
シンなしの場合を示し、０柱はインドメタシン３．３Ｘ
１０−ｈＭの場合を示し、検定はｔ−検定によるもので
ある。即ち、バザール（Ｂａｓａｌ）の１６０±６９μ
ｇ／細胞数１０’に比し、アラキドン酸、Ａ２３１１１
７の刺戟では夫々１７２０＝！＝３３０．１６８０±７
３０　ｐｇ／細胞数１０’と約１０倍の６　　ｋｅｔｏ
−プロスタグランジンＦ１α産生量を示し、又インドメ
タシン３．３ＸｌＯ−ｈＭの投与によりその産生が抑え
られた。

また生理活性物質であるプラディキニンによる刺戟では
バザール２５０±４０ｐｇ／細胞数１０’に対し、ブラ
ディキニン５Ｘ１０−’Ｍで３４０±８０μｇ／細胞数
１ＯＳ、同じ＜　５　Ｘ　１０−’Ｍノ刺戟テ４１０　
＋４０μｇ／１ｔＰｌ胞数１０’と濃度に依存して６　
　ｋｅｔｏ−プロスタグランジンＦｌαの産生が刺戟さ
れる傾向が認められた。

実施例６ 実施例２と同じ培養条件で、細胞の接着率を検討した。

これは培養人工血管作成のための基礎的培養条件を決定
するだめのものである。

即ち、第１表にその結果を示すように延伸多孔質ポリテ
トラフルオロエチレンではコラーゲン被覆によっても３
０〜５０％しか接着せず、これは通常の培養皿の場合に
比し２ないし１／３である。本素材は疎水性であり、表
面に凹凸がみられ、これが細胞の接着を妨げている可能
性があると考えられた。走査電顕での観察では細胞は１
時間以内に接着してくるが本素材の結節とのみ接着し、
この表面形状が細胞の接着を妨げている可能性が示唆さ
れた。

併し時間をかけて培養すると細胞は増殖し略に全面を被
覆した。（第２１図） 第　　　１　　　表 実施例７ これは血管内皮細胞の緻密な被覆を完成させるだめの条
件についてのものである。

実施例１におけると同じに採取、培養した大内皮細胞を
用い、結節と微小繊維よりなる延伸多孔質ポリテトラフ
ルオロエチレン（平均結節間距渭は１０μｍ）上での播
種細胞数を変えて増殖試験を行い、実際の円筒状人工血
管に細胞を植え込む際に問題となる、どれだけの細胞を
播種したときに、どれだけの期間培養すれば人工血管の
内面全域を覆う状態を形成し得るかを検討した結果は第
１０図の如くであった。なおこの場合の細胞の分散、計
数、コラーゲン被覆の方法は何れも実施例１と同じであ
る。

第１０図で培地はＲＩＴＣ８０−７＋　１０χ生胎児血
清＋酸性線維芽細胞成長因子２０　ｎｇ／艷十ベバリン
２５μｇ７ｍｌを用い、コラーゲン被覆は２５μｇ／ｍ
ｌで行い、測定値は繰り返し実験２回の平均である。

また、○は播種細胞数２６／　龍２を、△は同１８０／
ｓｍ２を、×は同３６０／ｍＷ”を、・は皿上での比較
対照基準で播種細胞数２６／　ｍ１２を示す。

第１０図の播種細胞数別増殖曲線から目標の細胞数を８
００／ｍｍ”とすると、１８０／ｎ”の播種で５日、３
６０／ｕａ”では４日培養することが必要である。この
ように、僅かなコラーゲンを足場として、細胞を接着さ
せた後は、細胞自らマトリックスを産生させ、これを足
場に増殖させることで、細胞の接着は強固となり、また
生体に最も近い内膜状態となると考えられる。

さらに時間をかけて、増殖させることで細胞分散時の障
害から回復させ得るものである。また細胞骨格の研究か
らは培養内皮細胞が視覚的に充分緻密な被覆となってか
ら更に数日おかないと生体と同様な被覆状態とならない
という報告もあり、充分な時間をかけて人工血管基材上
で培養することが必要と考えられ、前記培養日数に更に
数日を加えた培養をなすことが好ましい。

実施例８ これは本発明の人工血管の製造についてのものである。

雑種成人をチオベンクールナトリウム２５ｍｇ／ｋｇの
静脈内投与で麻酔導入した後気管内挿管全麻下（酸素、
ハロセンにて維持）に全身ヘペリン化（１０００／ｋｇ
）を行い、外頚静脈を約１０ｃｍにわたり摘出した。摘
出した静脈の両断端よりチューブを挿入しヘベリン加Ｃ
ａ”、　Ｍｇ”無添加燐酸緩衝液のＣＭＦ−ＰＢＳで赤
血球を除去した後線維芽細胞の無血清培養用１’；！　
Ｉ　Ｔ　Ｃ８０−７培地を内腔に充たして内皮細胞の有
効性維持を計り培養室に搬送した。

内腔を再びＣＭＦ　　ＰＢＳで洗浄しＯ８１％コラゲナ
ーゼ溶液を充たし内皮細胞を採取した。１０分毎５０分
間これを繰り返し、５つの培養皿で初代培養を行った。

平滑筋細胞、線維芽綱胞の混入の見られない皿を培養瓶
に移し、三分割して継代培養した。培地はＲＩ　Ｔ　Ｃ
８０−７＋１０％牛脂児血清＋酸性線維芽細胞成長囚子
２０ｎｇ／　ｍｌ、＋ヘパリン２５μｇ／ｄを用い、タ
イプ■コラーゲン（呉羽化学社製）を被覆した培養皿で
Ｏｆ　７％、ＣＯ□５％、Ｎ２８８％と低酸素の条件で
培養した。

人外頚静脈由来内皮細胞は初代培養後１ケ月以内に継代
数２〜３に達し実験にはこれを用いた。

人工血管は内径４ｍｇ＋、７ｃｍ長の延伸多孔質ポリテ
トラフルオロエチレン人工血管（結節間平均距離：３０
ｔｓ、ジャパンボアテックス社製）ヲ用い、又鉛を埋め
込んだポリスチレン性の蓋を作製しこれを人工血管の両
断端に装着した。更に第１１図に示すように錘として人
工血管に細胞毒性の無いステンレス線を巻きガラス性の
培養皿に入れオートクレーブで滅菌した。ＣＭＦ−ＰＢ
Ｓで５μｇ／１Ｉｌｌの濃度としたタイプＩコラーゲン
溶液を人工血管内腔に満たし、３０分間静置した後これ
を吸引し人工血管を１２０°回転し再度コラーゲン溶液
を満たした。これを３回繰り返し内腔面全域にコラーゲ
ン被覆した。次いで培地で３００〜４５０／ｍｍ”の播
種密度となるよう調節した大内皮細胞浮遊液を作製し、
これを人工血管内腔に注入し１時間静置した。

人工血管を１２０°回転した後内腔の細胞浮遊液を吸引
後新たな綱胞浮′Ｍ液を注入しコラーゲン被覆と同様に
やはり３回これを繰り返して人工血管内腔面全体に細胞
を接着させた尚、回転角度は、人工血管を全く回転させ
ない場合に細胞は人工血管の１７３周にのみ接着ずつこ
とから１２０６とした。人工血管内の乾燥を防ぐ為、細
胞播種時より培養皿内に１００−の培地を満たし、細胞
播種の操作は全てこの中で行った。４日に１回培地を交
換し約１週間培養した。培養条件はシート状素材での検
討結果に基づいたが、接着％が３０〜５０％と幅のある
結果であったことより安全％を見込んで設定した。内皮
被覆人工血管は同時に同じ物を３本作製し、植込直前に
１本の内腔面をヘマトキシリン染色し人工血管内面が略
々全域にわたって内皮細胞で被覆されていることを確認
した（第１２図）。

実施例９ これは本発明の人工血管の生体移植実験についてのもの
である。

即ち実施例７で製造した内皮細胞で被覆した延伸多孔質
ポリテトラフルオロエチレン人工血管を犬に自家移植し
た。細胞採取時と同様に気管内挿管全府下に、両側頚動
脈、大腿動脈を露出した。

全身ヘパリン化の後動脈にプルドッグ鉗子をかけ血流を
遮断し動脈を約２ｃｒａ切除した。ここに両断端を各々
ｆｅｌｌ切除し５Ｇ長とした実施例８の人工血管を移植
し対側に同径同長の無処理の延伸多孔質ポリテトラフル
オロエチレン人工血管を比較例として移植した。６−０
ナイロン連続にて端端吻合したが合計頚動脈に４対、大
腿動脈に３対計４頭の犬に移植した。抗凝固剤、抗血小
板薬は術中使用したヘパリン以外術前、術中、術後を通
じて一切使用しなかった。又、術中、ベントシリン０．
５ｇ点滴静注し、５００　ｒｎｉの補液を原則とした。

移植後７日目に気管内挿管全府下で移植人工血管を摘出
した。先ず全身ヘパリン化を行い吻合部も含めて人工血
管を摘出しヘパリン加生理食塩水にて内腔を洗浄した。

その後人工血管を長軸方向に割断し内面を写真盪影した
。１．６％ゲルタールアルデヒドで６時間固定し、人工
血管の近位側、中央部、遠位側６龍角を走査電顕の標本
とした。

残りをホルマリン固定し、ヘマトキシリン−エオシン染
色し先頭標本を作製した。前記走査電子顕微鏡標本はゲ
ルタールアルデヒド固定後、アセトン、イソアミルアセ
テートで脱水し臨界点乾燥、金蒸着しＳ−４５０走査型
電子顕微鏡（日立社製）で観察した。又、開存した人工
血管中央部の内腔面を１０箇所走査電顕下、ｘ　２００
　（面積０．１７５−０．１８５龍２）で写真揚影しコ
スモゾーンＩｓオートアナライザーシステムにコン社製
）にて内皮細胞被覆面積を計測し、内皮細胞被覆率を算
出した。

肉眼的観察の結果は第２表に示す通りであって比較例で
は移植した７氷中３本のみの開存に対し実施例８の人工
血管では、７本生６本が開存していた。閉塞例では何れ
も人工血管全長にわたる血栓の充満をみた。比較例の１
例に吻合部の狭窄を見、組織学的検索でも手技上の失敗
と考えられたが、他の例では吻合部の狭窄を認めなかっ
た。開存例では実施例８の人工血管の場合、内腔面は光
沢のある平坦、平滑な一様の面であったが、全体に斑な
赤色部分が認められた。比較例群でも同様に赤色部分と
白色部分の混在が認められたが、全体として光沢の無い
不規則な隆起を伴った面状として観察さ゛れた（第１３
図）。

第 表 組織学的検索において走査電顕像では実施例７の人工血
管の中央部では平坦な一層の細胞が連続的に表面を覆っ
ていた（第１４図）。細胞は血流方向に延び、個々の細
胞にはマイクロヴイライが見られ典型的な内皮細胞の形
態を呈していた（第１５図）。細胞間の接合部は硬く接
合した成熟な部分とやや離開した未成熟な部分が見られ
た。血小板、多核白血球は内皮細胞の表面への接着は極
めて少なく、この未成熟な細胞間結合部に多く接着して
いる傾向がみられた（第１５図）。第１４図に示すよう
に細胞の下層は延伸多孔質ポリテトラフルオロエチレン
人工血管の結節が透見出来るほど薄く、角度をつけて観
察すると細胞層は、第１６図に示すように延伸多孔質ポ
リテトラフルオロエチレン表面の凹凸により波打つよう
に存在する。また細胞間離間部から観察すると第１７図
のように内皮細胞と延伸多孔質ポリテトラフルオロエチ
レン人工血管との間にはほとんど結合織や血栓の存在し
ない部分が多く観察された。しかし、一部に延伸多孔質
ポリテトラフルオロエチレンの透見出来ないところも見
られこれらは流血下に置かれた時、延伸多孔質ポリテト
ラフルオロエチレン上の内皮細胞が剥離してその後周囲
の細胞が増殖し覆ったものと考えられた。比較例では血
小板、白血球、赤血球を含む血栓でほぼ全域が覆われて
おり内皮細胞は見られなかった。血栓の厚さは一様でな
く薄い所では延伸多孔質ポリテトラフルオロエチレンの
表面の露出している所も見られた。−人工血管の中央部
での内皮細胞については第１表に示すように比較例では
内皮細胞が全く観察されず、実施例８の人工血管では９
８．５％と極めて高い被覆率を示した。人工血管吻合部
付近は人工血管と動脈との間に人工による解離があった
為十分な観察はできなかったが、中央部とほぼ同様の所
見であった。特に比較例ではパヌス生成に伴う内皮細胞
の被覆は十分ではなかった。

第１８図に示すように、電顕像では実施例８の人工血管
は略々全長に渡ってその内面を一層の内皮細胞が覆って
いた。細胞と延伸多孔質ポリテトラフルオロエチレンと
の間は大部分が細胞成分、マトリックスが存在せず、内
部被膜はほぼ細胞−層の厚さであった。

延伸多孔質ポリテトラフルオロエチレン人工血管の間隙
には血液成分が充満し、一部血栓となっていたが、器質
化は見られなかった。人工血管間隙の内腔側には多核白
血球、マクロファージが多く見られたが、これは比較例
も同様であった。実施例８の人工血管の閉塞した一例で
は人工血管内面には内皮細胞は全く見られながったが、
微小膿瘍の所見がみられた。比較例ではほぼ全面に厚さ
不均一な血栓の付着がみられ（第１９図）、吻合部は一
部に軽度のパヌス生成が見られた。

「発明の効果」 以上説明した。ような本発明によるときは、従来の内皮
細胞利用人工血管における問題点、即ち採取できる内皮
細胞の数、採取時の障害、人工血管への接着上の問題、
植込み細胞の剥離等を有効に解決し、プロスタサイクリ
ン産生能を有し、抗血栓性にイ１れているだけでな（、
生体適合性賦与においても好ましく、それらの特性を長
期に亘って保持せしめ得る人工血管を提供し得るもので
あり、更にはそうした自家内皮細胞被覆人工血管を効率
的且つ容易に製造し得るなどの効果を有しており、医学
的ないし工業的にその効果の大きい発明である。

なお本発明のように採取した血管内皮細胞を培養系に移
すことにより平滑筋細胞、線維芽細胞の混入が抑制され
、それらの混入による内皮細胞の接着障害、傷内膜の過
形成などを防止し得ることは明かである。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の技術的内容を示すものであって、第１図
は大内皮細胞の増殖に対する血清の影響を要約した図表
、第２図はコラーゲン被覆の有無が大内皮細胞の増殖曲
線に及ぼす影響を示した図表、第３図はコラーゲン被膜
がない場合の増殖犬内皮細胞に関する拡がり、第４図は
コラーゲン被覆のある場合の同様な拡がり状態を示した
各位相差顕微鏡写真、第５図は大内皮細胞の増殖に及ぼ
すコラーゲン被覆の影響を示した図表、第６図は延伸多
孔質ポリテトラフルオロエチレンに対する大内皮細胞の
接着、増殖に及ぼすコラーゲン被覆の影響を示した図表
、第７図は編織ポリエステルに対する大内皮細胞の走査
電子顕微鏡写真、第８図は大内皮細胞の成長因子に対す
る影響を示したグラフ、第９図は増殖入内皮細胞に関す
るプロスタサイクリンの産生能を示したグラフ、第１０
図は播種細胞数側に延伸多孔質ポリテトラフルオロエチ
レン上での大内皮細胞増殖曲線を示した図表、第１１−
ａ図は円筒状培養人工血管の作製方法を示す概要図、第
１１−ｂ図は該人工血管の作製の過程を示す写真、第１
２図は移植前の培養人工血管の写真、第１３図は移植後
１週間の摘出人工血管の内面を示す写真、第１４〜１７
図は培養人工血管の走査電顕写真、第１８図は培養人工
血管の光顕写真、第１９図は無処理のＥＰＴＦＥ人工血
管（比較例）の光顕写真、第２０図は培養の初期及び後
期における人工血管の走査電顕写真、第２１図はＥＰＴ
ＦＥ人工血管上での接着増殖過程を播種細胞数１２０／
ｍｍ”で１，４及び７日目において撮影した光顕写真で
ある。 第２図 培 蒼 日 数 第１図 ＣＯムｇ＠ｎ濃度（μ９／−） 特開平？−２７４２４４（１１） ｄｕｐｌｉｃａｔｅＸ　６ ｗ１ｌｃｏｘｏイｓ　ｔｅｓｔ 土芒蚤 養 日 数 手続主甫正書（方式） 平成元年８月２２日

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. １．生体移植用の人工血管であって、該人工血管基材に
   おける血液接触側の面に移植対象である生体の血管にお
   ける自家内皮細胞が緻密に被覆された状態となっている
   ことを特徴とした人工血管。
2. ２．人工血管用基材の血液接触側の面に移植対象である
   生体の血管より採取した内皮細胞を播種し、これを生体
   外の培養系において培養し、前記した血液接触側の面が
   上記内皮細胞によって緻密に被覆された状態となるよう
   に該内皮細胞を増殖することを特徴とする人工血管の製
   造法。
3. ３．予め人工血管用基材の播種面にコラーゲンを被覆し
   、血管内皮細胞の培養、増殖をＲＩＴＣ８０−７に牛胎
   児血清および成長因子を加えた培地を用いて行う請求項
   ２に記載の人工血管の製造法。