JPH02275360A - 酵素触媒作用の抑制による磁気イムノアッセイにおける信号の増強 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、分析対象物の磁気イムノア・ノセイ及びそれ
に用いる物質に関するものであり、更に詳しくは、本発
明は、検出可能な信号の増強を、指示薬反応の酵素触媒
作用の抑制によって行うイムノアッセイのための方法及
び材料に関するものである。

発明の背景 流体中の物質の濃度を測定するために、迅速でかつ感度
の高い試験系が開発されている。イムノアッセイは、特
異抗体に対する抗原又はハブテンの結合に基づくもので
あり、高いレベルの特異性及び感度を与えるので特に有
用である。これらの試験は、一般に、標識化形態の上記
の試薬の一方を用いており、この標識化試薬は、トレー
サーと称されることが多い。イムノアッセイ法は、溶液
内又は固体支持体上で行うことができ、不均一に行うこ
とも（この場合には結合トレーサーを遊離（非結合）ト
レーサーから分離する必要がある）また均一に行うこと
もできる（この場合には分離工程は必要でない）。

遊離トレーサーから結合トレーサーを分離するために種
々の方法が用いられている。一つの工程においては、そ
れに結合している抗体を有する磁気粒子を固体相として
用い、分離工程を、結合反応の後に、粒子を試験容器の
壁に吸引する磁気によって行い、非結合トレーサーをデ
カント除去出来るようにしている。磁気粒子を用いるイ
ムノアッセイ法の例は、Ｌｕｏｔｏｌａらに与えられｔ
；米国特許環４，７７７．１４５号及びＨｏ１ｉａｎら
に与えられた米国特許環４，７４５，０７７号において
開示されているものである。

イムノアッセイの標識は、通常、ラジオアイソトープ、
フルオロクロム（ｆｌｕｏｒｏｅｈｒｏｍｅｓ）又は酵
素である。従来の酵素イムノアッセイ（Ｅ　Ｉ　Ａ）に
おいては、酵素を、特異結合抗原−抗体対の一方の成分
と共有結合させ、得られた酵素結合体を基質と反応させ
て検出及び測定される信号を生成させる。信号が色変化
である場合には、平均的な人間によっては発色団の存在
を約ｉｏ−’又は１０Ｍまでしか検出することが出来な
いので、裸眼による検出が制限される。

ＥＩＡの感度は、分光光度法によって上昇させることが
できることが多いが、これらの方法は高価な装置を必要
とする。他のアプローチにおいては、種々の増幅法によ
って感度を上昇させることができる。簡単な酵素増幅法
によれば、１０−’〜１０”’°Ｍの濃度で存在するリ
ガントが検出されると開示されている。しかしながら、
これらの方法は、１０−”Ｍ以下のリガント濃度におい
ては一般に満足できないものである。カスケード増幅法
においては、検出しうる（一般に着色された）分子の数
は、２種以上の酵素又は酵素誘導体を用いることによっ
て増加する。■ｘｒｒｉｓに与えられた米国特許環４．
４６３．０９０号においては、酵素又はリガントに結合
した酵素前駆体のような大分子活性化剤によって第２の
酵素を活性化して、これを基質と反応させて検出可能な
信号を生成するか、または続いて第３の酵素を活性化さ
せるカスケード増幅イムノアッセイが開示されている。

Ｓｅ目に与えられた米国特許環４，４４６，２３１号に
おいては、第１及び第２酵素系並びに第２の酵素系の為
のモジュレータ−を含む循環増幅酵素イムノアッセイが
開示されている。第１の系は、リガントに結合している
第１の酵素を含む。Ｓｅｌ＋の発明の第１の態様におい
ては、第１の酵素系がモジュレータ−前駆物質に作用し
てモジュレータ−を遊離させる。モジュレータ−は第２
の酵素の補因子であり、第２の酵素系を活性化して検出
可能な生成物への基質の反応に触媒作用を与える。

反応中に、モジュレータ−は不活性な形態に転化し、モ
ジュレータ−を再活性化する第３の酵素によって循環が
行われる。第２の態様においては、モジュレータ−は第
２の系の抑制剤であり、第１の酵素系によって除去され
、それによって第２の系を活性化して基質に作用して検
出可能な生成物を生成する。

ＢｏｇｕｓＩｓｓｋｉらの米国特許環４，４９２，７５
１号においては、酵素基質又は補酵素が特異結合対の一
方と結合している循環系が教示されている。

種々の分子が、対象とする酵素の特異的な不活性化を行
うことが示されている。メカニズムペースの抑制剤（ｍ
ｅｃｈａｎｉｓｍ−ｂｘｓｅｄ　１ｏｈｉｂｉＬｏｒ）
と称される抑制剤の下位概念は、酵素と反応して共有結
合を形成する酵素用の基質である。メカニズムベースの
抑制剤はＷａｌｓｈによって報告されている（Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎ　３Ｂ、　８月、１９０）。抑制剤の他
の下位概念としては、安定な遷移状態相似体として作用
する分子が挙げられる。Ｇｅ１ｂらのＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ２４、　ｌＮ３．１９Ｎ）において、加水分解
酵素の遷移状態抑制剤としてのあるフルオロケトン類が
開示されている。

発明の概要 本発明の一態様は、液体試料（以下、未知試料と称する
）中のリガントを検出するための方法である。リガント
を含むと考えられる未知試料を、磁気粒子に結合した特
異坑リガント（ｉｎ日！ｉｇｘｎｄ）及びリガント用の
トレーサーと合わせる。トレーサーは、リガント又は第
２の坑リガントのいずれかに結合した、同様にリガント
に対して特異的な第１のヒドロラーゼを含む。リガント
、坑リガント及びトレーサーの間の結合を得る条件が与
えられ、粒子上に結合相が与えられる。磁石によって粒
子を試験容器の壁に吸引し、液体を吸引又はデカンテー
ションすることによって、その上に結合相を有する粒子
を流体から分離した後に、液体中において結合相をブロ
ックト抑制剤（ｂｌｏｃｋｅｄ１ｏｈｉｂｉｔｏｒ）及
び第２のヒドロラーゼと接触させる。

第１のヒドロラーゼによってブロッキング基が除去され
、第２のヒドロラーゼのための抑制剤が与えられる。次
に、第２のヒドロラーゼのための基質を加える。基質を
第２のヒドロラーゼによって転化させて、検出可能な信
号を与える生成物を得るが、第２のヒドロラーゼによる
生成物への基質の転化を抑制剤によって抑制する。

リガントは抗原、ハプテン又は抗体であってよい。好ま
しいリガントは抗原、最も好ましくはウィルス性抗原で
ある。該方法は、競合イムノアッセイ法によって行うこ
とができ、この場合には、トレーサーは第１のヒドロラ
ーゼと結合したリガントである。好ましくは、サンドイ
ッチイムノアッセイ法を用いることができるが、この場
合には、トレーサーは第１のヒドロラーゼと結合した第
２の坑リガントである。

本発明の好ましいブロックト抑制剤は、トレーサーの第
１のヒドロラーゼ成分によって抑制剤に転化せしめられ
るブロックト抑制剤である。好ましい基質は、第２のヒ
ドロラーゼによって異なる色の生成物に転化させること
のできる発色団である。最も好ましくは、発色団は無色
であり、第２のヒドロラーゼによって着色生成物に転化
せしめられるが、この生成物への発色団の転化が抑制剤
によって抑制される。

最も好ましいアッセイ法においては、抗体を磁気粒子と
結合させて、結合条件下で、ウィルス性抗原、及び、抗
原に対して特異的であり、アルカリホスファターゼによ
って標識されている第２の抗体と接触させられる。結合
及び分離の後、それに付着されている抗体：抗原：アル
カリホス７アターゼ標識抗体サンドイッチを有する粒子
を、液体中においてブロックト抑制剤及びエステラーゼ
と接触させる。抗原が液体中に存在していると、粒子上
に捕捉されているアルカリホスファターゼによってブロ
ッキング基が除去され、抑制剤が与えられる。無色の発
色団を加える。液体内で生成した抑制剤によって、エス
テラーゼが発色団を着色生成物に転化させるのが抑制さ
れる。このように、色が生じることによって試料中に抗
原が存在していないことが示され、色の発生が起こらな
いことによって試料中に抗原が存在していることが示さ
れる。

本発明の他の態様は、実質的に上記したような本発明方
法を行うための材料キットを含むものである。

酵素抑制剤のブロック解除（ｕａｂｌｏｃｋｉａｇ）を
含む全てのＥＩＡ系においては、試験が最大の感度を示
さなければならない場合は、抑制剤及びブロックト抑制
剤の両方について大きな制約が課される。

本発明によれば、ブロックト抑制剤は第１の（ブロッキ
ング解除）ヒドロラーゼに対する優れた基質であるが、
第２の（色形成）ヒドロラーゼに対しては実質的に非反
応性である。同様に、アンブロックト（ｏｎｂｌ＋ｃｋ
ｅｌ）抑制剤は、第２のヒドロラーゼの潜在的な抑制剤
であるが、第１のヒドロラーゼに対して実質的に何の効
果も有していない。

ブロックト抑制剤及び抑制剤と、それぞれ第１及び第２
のヒドロラーゼとの反応は極めて選択的であるので、交
差した反応性を原因とする従来の循環ＥＩＡ系の「短絡
」特性が実質的に排除される。

このように、本発明は、流体中に極めて低い濃度で存在
するリガントに関して試験するための多目的の方法と、
磁力による簡単で有効な分離法とを組み合わせたもので
ある。本方法によって、リガントが１０””Ｍ程度の低
い濃度で存在している場合においても試験信号の裸眼検
出及び測定が可能になり、高価であるかまたは繁雑な装
置を用いることなく検出又は測定するこきのできるリガ
ントの濃度範囲が大きく拡張される。更に、試験感度、
即ちリガントの存在又は不存在を検出するのに必要な時
間を、従来のＥＩＡに比較して１００倍減少させること
ができる。これによって費用及びスペースが大きく節約
され、本発明による試験を、小さな臨床検査室又は医院
においても行うことができるようになる。

好ましい態様の詳細な説明 本発明は多くの異なる形態の態様によって満足されるが
、ここでは本発明の好ましい態様を詳細に説明する。こ
こで、以下の開示は本発明の原理の例示として考えるべ
きであって、本発明を記載されている態様に限定するも
のではないと理解すべきである。本発明の範囲は、添付
の特許請求の範囲及びその均等物によって決定される。

本発明方法によれば、未知試料中に存在する基質（以下
、リガントと称する）を、極めて低い濃度で存在する場
合においても、視覚的に、即ち、裸眼による観察によっ
て検出することができる。

本方法は、少なくとも二つの増幅段階を包含する。

第１の増幅段階は、酵素抑制剤の酵素ブロッキング解除
である。第２の増幅段階は、指示薬反応の酵素触媒作用
である。これらの増幅段階は、連続して起こり、１０６
＠又はそれ以上の信号増幅を与え、それによって１０−
”Ｍ又はそれ以下のレベルで試料中に存在するリガント
を裸眼で検出することができる。更なる増幅が所望の場
合には、多数の酵素を包含する連続反応のカスケード（
これらの反応の任意の一つ又は全てによって更なる信号
増幅を与えることができる）を開始する第１の酵素を与
えることができる。

本発明方法において、未知試料中のリガントを検出する
ために免疫反応が用いられる。ここで用いる「免疫反応
」という用語は、抗原と抗体、ハブテンと抗体、又は同
様に特異的に結合する抗原、抗体若しくはハプテンの適
当な類縁体の特異結合反応を意味するものである。

免疫反応は、任意の好適な液体中で行うことができる。

例えば、液体は、血清、尿、脳を髄液、肋膜液などのよ
うなリガントを含有すると考えられる体液であってよい
。また、液体は、水、食塩水又は他の好適なバッファー
、あるいは、体液と、リガントを含有すると考えられる
試料が加えられｔ；他の液体との混合物であってもよい
。

本発明のサンドイッチアッセイのための好ましい方法を
、まず、以下のアッセイ７０−シートを参照して説明し
て各アッセイ成分に関する概略的な理解を与え、次に各
成分について詳細に説明する。

Ｂ−鵠 上記の７０−シートにおいては、以下の定義が与えられ
、コロンは免疫結合を示し、ノ＼イフンは、化学結合又
は吸葉のような物理的付着を示し、実線の矢印は化学的
転化を示し、破線の矢印は反応又はアッセイ成分のモジ
ュレーションを示している。

ＡＬ　　−抗リガント Ｌ　　−リガント Ｔ　　−トレーサー Ｅ、　　−第１の酵素 Ｅ、　−第２の酵素 Ｂ−Ｍ　　−ブロックトモジュレータ−Ｍ　　−酵素用
のモジュレータ− Ｂ　　−モジュレータ−用のブロッキング基５ｕｂ−基
質 Ｐ　　−生成物 フローシートから、リガントが抗リガント及びトレーサ
ーと結合する条件が与えられ、次に、分離工程及び適当
°Ｃ洗浄工程が与えられることが明らかである。第２の
酵素、及び、モジュレータ−（活性化剤又は抑制剤）及
びブロッキング基からなるブロックトモジュレータ−を
加え、トレーサーの第１の酵素成分によってブロッキン
グ基を除去する。第２の酵素用の基質を加え、＠２の酵
素による検出可能な生成物への基質の転化を、第１の酵
素によってブロックトモジュレータ−から遊離したモジ
ュレータ−によって調節する。生成物の濃度は、モジュ
レータ−が活性化剤であるか抑制剤であるかによって、
モジュレータ−の濃度、したがってリガントの濃度に正
比例又は反比例する。測定される実際の信号は、指示薬
反応に関連する色や、例えば、生成物の色、その生成速
度、あるいは基質の色又はその消失速度であってよい。

本発明の分離工程は、１以上のアッセイ成分を磁石粒子
の表面に付着させることができる磁力によって行われる
。磁性粒子又は起磁性粒子と様々に称される種々の粒子
は当該技術において周知であり、種々のイムノアッセイ
法において用いられている。多くは市販されており、本
発明は、抗リガントがそれに付着することができ、そと
から施す磁石によって試験容器の壁に磁力で吸引するこ
とのできる任意の粒子を用いることを考慮している。

磁性粒子の製造者の例は、Ａｄｖｘｎｃｅｄ　ＭＢｏｅ
Ｌｉｃｓ。

Ｃｚｍｂｒｉｄ＠ｅ、ＭＪｓｓｉｃｂｎｓｓｅｔｔｓ；
　ＤｎＰｏｎｔ、　ＷｉｌｍｉＢｔｏｎ。

Ｄｅｌｓｖｉｒｅ；　　Ｍｏ１ｅｃｎｌｉｒ　Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅ＋ｍｓ　Ｉｎｃ、、　５ｘｎＤｉ＊ｇｏ、　Ｃ
ａ１ｉｆｏｒｎｉａ；及び、ｌｍｍｎｎ１ｃｏａ、　Ｒ
ｅｎｎ１ｎ（ｄｏｎＶａｌｌｅｙ、　Ｐｅｎ＋＋５ｙｌ
ｖ＊ａｉｓである。

磁性粒子に対する抗リガントの結合は、当該技術におい
て周知で十分に説明されている手順によっておこなうこ
とができる。一般に、これらの方法は、製造者によって
供給された粒子上の官能基を、抗リガント上のヒドロキ
シル、メルカプト、アミノ又はカルボキシル基のような
官能基に結合させることを包含している。カルボジイミ
ド、トシレ１ト及びグルタルアルデヒドのような結合試
薬がこの目的のためにしばしば用いられる。代表的な手
順が、ＰｏａｒｆｓｒｘｓｎｅｂらのＭｅｔｈｏｄｓ　
ｏｆ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＡ＋＋＊１ｙｓｉｓ、　
２８．２６７、１９０；　Ｌｉｇａｎｄ　ＱｕｉｒＬｅ
ｒｌｙ　５゜４＋　（ａ９Ｎ）に記載されている。

アッセイ成分の詳細な説明に戻る。リガントは任意の製
造源から得ることができ、抗原、抗体又はハブテンであ
ってよい。例えば、リガントは、体液中に存在する抗原
であってよく、あるいは、体液から単離され、次にバッ
ファーのような異なる液体中に導入されたものであって
もよい。他の場合においては、リガントは、体液以外か
らのもの、例えば、微生物の培養菌又はそのｍ胞抽出物
であってもよい。好ましいリガントは抗原であり、最も
好ましくは、単純ヘルペスウィルス（Ｈ３Ｖ）、アデノ
ウィルス、インフルエンザＡウィルス、パラインフルエ
ンザ３ウイルス及びＲ８Ｖのような体液中に存在するウ
ィルス性抗原である。

粒子の表面上の抗リガントは、抗原であっても抗体であ
ってもよく、モノクローナルであってもポリクローナル
であってもよく、あるいは、リガントと特異的に反応す
るその任意の適当な類縁体であってもよい。更に、抗リ
ガントは、多数の結合抗体、例えば第１の抗体に特異的
に結合する第２の抗体からなる抗体コンプレックスであ
ってもよい。また、リガントは、幾つかの異なる抗リガ
ント、例えばポリクローナル抗体の組み合わせ、又は、
リガントの異なる表面領域に同時に結合する幾つかのモ
ノクローナル抗体分子の混合物と結合してもよい。一般
に、第２の抗体は異なる種の第１の抗体よりも活性化さ
れている。コンプレックスにおける多数の結合抗体は、
約２〜１０又はそれ以上の抗体を含んでいてもよい。

本発明のサンドイッチアッセイにおいては、実質的に全
てのリガントと結合するのに十分な結合部位を有する過
剰の抗リガントを用いることが好ましい。

トレーサーは二つの成分を含んでおり、第１の酵素はリ
ガントと結合しているか（以下に説明する競合アッセイ
）、あるいは好ましいサンドイッチアッセイにおいては
第２の抗リガントに結合している。酵素は、任意の好適
な方法でリガント又は第２の抗リガントに結合すること
ができ、好ましくは免疫反応の前に共有結合によって結
合する。

リガント又は抗リガントに対する酵素の共有結合は、通
常のものであり、当業者に周知なものである。

ブロックトモジュレータ−からブロッキング基を除去す
ることのできる任意の酵素を第１の酵素として用いるこ
とができる。好適な第１の酵素は、一般に、ホスファタ
ーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ、グリコシダーゼな
どのようなヒドロラーゼである。好適な第１の酵素の例
としては、トリプシン、トロンビン、は乳類肝臓エステ
ラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ又は最も好ましくはアルカリホスファターゼが挙
げられるが、これらに限定されるものではない。

必要ならば、粒子、リガント及びトレーサーを含む液体
をインキュベートして結合を誘発させることができる。

インキュベーションは、任意の温度で、結合を起こすの
に好適な任意の時間、好ましくは約２０〜４０’Ｏで約
１〜４時間行うことができる。粒子及び結合しｊ；リガ
ント及びトレーサーを、以下、結合フラクションと称し
、結合していないリガント及びトレーサーを、以下、遊
離７ラクシヨンと称する。アッセイは、結合フラクショ
ンと遊離７ラクシヨンとの間に平衡が達成されるように
行うことができるが、このようにする必要はない。

結合の後、外部から施す磁石によって粒子を試験容器の
壁に吸引することによって、アッセイ混合物の液体相中
の遊離７ラクシヨンから結合７ラクシヨンを分離するこ
とができる。液体をデカント除去又は吸引除去し、粒子
を洗浄して妨害物質を除去し、同様の方法で洗浄液から
分離し、水、食塩水又はバッファーのような第２のアッ
セイ液体相中に懸濁することができる。次に、ブロック
トモジュレータ−を加え、ｐＨを、以下に記載するよう
なブロッキング基の非酵素性除去を起こさない任意のレ
ベル、好ましくは６〜８に調節することができる。

ブロックトモジュレータ−は、第１の酵素によって第２
の酵素のモジュレータ−に転化することのできるいかな
る物質であってもよい。好ましいブロックトモジュレー
タ−は、二つの成分、即ちモジュレータ−及びブロッキ
ング基を有する。最も好ましいブロックトモジュレータ
−は、そのブロッキング基が第１の酵素によって除去さ
れ、抑制剤がアッセイ媒体中に解離するまでは第２の酵
素に対して非反応性であるブロックト抑制剤である。

このように、ブロックト抑制剤の成分の選択は、用いる
第１及び第２の酵素に依存する。ブロッキング基は、第
１の酵素によって実質的に選択的に開裂させることので
きる結合によって抑制剤に共有結合することのできるも
のでなければならず、抑制剤成分は、第１の酵素には実
質的に何の効果も有さないが第２の酵素の活性を抑制す
るものでなければならない。したがって、第２の酵素の
性質及びその基質に関して、ブロックト抑制剤及び抑制
剤に関する更なる説明に先立って説明する。

本発明のアッセイにおいては、第２の酵素は、一般に、
基質を生成物に転化するヒドロラーゼである。好適なヒ
ドロラーゼは、例えば、ホスファターゼ、トリプシン、
チモトリプシン及びペプシンのようなペプチダーゼ、又
は好ましくはアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）
及びプチルコリンエ３テラーゼのようなエステラーゼで
ある。

最も好ましい第２の酵素は、ウサギ肝臓エステラーゼ（
ＲＬ　Ｅ）のようなカルボキシエステラーゼである。第
２の酵素がエステラーゼである場合には、アッセイは、
抗リガントに加えてエステラーゼを磁気粒子に結合させ
ることによって行うことができる。

基質は、第２の酵素によって開裂し、色に関連した信号
によって検出することのできる生成物を与えることので
きる基を有するいかなる物質であってもよい。このよう
に、本発明の一態様においては、検出される信号は、色
の発生又は消失、あるいはある色から他の色への変化で
ある。本発明の他の態様においては、信号は、基質が生
成物に転化する速度における変化でありでよく、例えば
、基質の色が、特定の時間未変化で保持されることを観
察することができる。このように、信号の測定は、動的
条件又は熱力学的条件下のいずれかで行うことができる
。動的測定は、一定時間に起こる変化の程度を測定する
ものであり、一般に、アッセイ試薬を結合させた後の種
々の時間において一連の測定を行うことによって行われ
る。熱力学的測定は、基質と指示薬反応の生成物との間
に平衡が達成された際に起こっている変化の程度を測定
するものである。

測定は、装置を用いて行うことも、あるいは、好ましく
は裸眼で行うこともできる。

基質は、第２の酵素によって開裂して有色生成物を与え
るまでは無色であることが好ましい。好適な基質は、〇
−及びｐ−ニトロフェニルアセテート又はブチレートの
ようなニトロフェノール類のニス゛チルである。これら
の基質は、カルボキシエステラーゼによるアセチル又は
ブチリル基の解離が起こって有色のニトロフェノール類
を与えるまでは無色である。好ましい基質は、インドフ
ェニルブチレート、インドフェニルアセテート及び最も
好ましくは４−［（３，５−ジクロロ−４−ブチリルオ
キシフェニル）イミノ］−２，５−シクロへキサジエン
−１−オン、（以下、ＤＣＩ　ＰＢと称する３′５″−
ジクロロインドフェニルブチレート）のヨウなインドキ
シルのエステルである。

本発明方法は、また、蛍光イムノアッセイにおいて用い
ることもできることが明らかである。本発明のこの態様
においては、第２の酵素によって、非蛍光性（＋＋ｏｎ
ｆｌｎｏｒＢｅｎｉｃ）基質を、蛍光性（ｆｌａｏｒｏ
（ｅｎｉｃ）生成物に転化させることができ、この場合
、測定される信号は蛍光のモジュレーションである。本
発明のこの態様のためには、モジュレータ−が抑制剤で
あり、第２の酵素がエステラーゼであることが好ましい
。

上述したように、トレーサーの第１の酵素成分によって
、ブロックト抑制剤からプロ・ツキング基が解離して第
２の酵素の抑制剤を与える。本発明に好適な抑制剤及び
ブロックト抑制剤は、同じ譲受人に譲渡された共に審査
中の米国特許出願環９３２．９５１号において十分に記
載されており、二重酵素ＥＩＡにおけるブロックト抑制
剤及び抑制剤の製造及び使用が開示されているこの出願
の部分を参照としてここに記載する。

本発明の最も好ましい態様においては、トレーサーは、
それに共有結合しているアルカリホスファターゼを有す
る第２の抗リガントである。粒子を分離し、洗浄し、好
適なアッセイ液中に再懸濁させた後、ＲＬＥ又はＡＣｈ
Ｅ（第２の酵素）及びブロックトフルオロケトン抑制剤
を加える。抗原が未知液体中に存在している場合には、
抗原及びトレーサーが粒子上に捕捉され、アルカリホス
ファターゼによってブロッキング基が解離して有利フル
オロケトン抑制剤が与えられる。アッセイはＤＣＩＰＢ
を加えることによって完了する。

未知液体中の抗原の存在によって抑制剤が生成すると、
エステラーゼの活性が抑制され、無色のＤＣｒＰＢは有
色のジクロロインドフェノールに転化しない。未知液体
中に抗原が存在していない場合には、アルカリホスファ
ターゼは粒子上に捕捉されず、抑制剤が生成されず、し
たがってエステラーゼが抑制されないので有色生成物が
生成する。

第１の酵素及び第２の酵素として、それぞれ、１　ｘ　
１０−”Ｍのアルカリホスファターゼ、及び、３ＸＩＯ
−”ＭのＲＬＥを用いる本発明の最も好ましい態様にお
いては、ｌ×１０−１！Ｍまでのレベルの未知液体中の
抗原の存在又は非存在を約７分間で検出することができ
る。未知液体中に抗原が存在していると、裸眼によって
検出しうる色はこの時間内には生成しない（生成物■約
ｌＸｌ０−’Ｍ）。抗原が存在していると色が発生する
。これに対して、第１の酵素（アルカリホスファターゼ
）のみを用いる通常のイムノアッセイによっては、酵素
によって十分なホスホリル化基質を解離して検出可能な
色を与えるのに約１０４分を必要とする。このように、
本発明は、これらのレベルでこれらの試薬を用いるアッ
セイ感度が１５倍向上したことが示される。

上述したように、本発明の他の態様は、トレーサーが、
第１の酵素に結合した所定量のリガントである競合アッ
セイである。競合アッセイにおいては、粒子に結合した
坑リガントの量は、アッセイ液中に存在するリガント及
びトレーサーの全てと結合するには不十分であるので、
リーガンドとトレーサーとが、限定された数の坑リガン
ト結合部位に対して競合する。したがって、競合アッセ
イにおいては、坑リガント（結合フラクション）に結合
するリガント及びトレーサーの量が、アッセイ液中のそ
れらの濃度に反比例する。

更なる信号増幅が所望の場合には、アッセイ媒体中の多
数の試薬を連続して反応させ、最終的にモジュレータ−
のブロッキング解除（ｎｎｂｌｏｃｋｉＢ）を行う多段
カスケード増幅アッセイを行うことができる。本発明の
この態様を説明するには、上記記載の第１の酵素を、ア
ッセイ媒体中の試薬を、上記第２の酵素に関するモジュ
レータ−をプロツキング解除する第２の酵素に酵素的に
転化させる第１の酵素と考えると好都合である。更に、
第２の酵素又は任意の引き続く酵素を、更なる試薬と反
応させて、モジュレータ−がブロッキンク解除されるま
で酵素反応のカスケードを継続することのできる更なる
酵素を与えることができる。アッセイ媒体に加える試薬
を適当に選択することによって、任意の所望の数の増幅
段階を行うことができる。

第１の酵素又は引き続き生成する任意の酵素、及び第２
の酵素を実際に触媒として作用させ、単一の酵素分子を
、消費することなく、それぞれ実質的に制限されない数
のブロックトモジュレータ−又は基質分子に対して作用
させることができるので、増幅は上述の本発明の態様の
いずれにおいても起こる。しｔ；がって、理論的には、
本発明方法を行うにはそれぞれの酵素が一分子あれば十
分である。実際には、加える酵素の量及び用いる増幅段
階の数の決定は、所望の増幅の度合いに依存し、これは
当業者の常識の範囲内である。

本発明の範ちゅうに属する殆ど制限されない数の競合及
びサンドイッチアッセイ法が考えられることが明らかで
ある。更に、本発明は、リガントの検出又はリガント濃
度の測定を行うのに好適なアッセイ法を与える。リガン
トの濃度は、未知試料によって生成した信号の強度と、
実質的に同等の条件下で一定範囲の既知量の試験される
リガントのアッセイによって測定された信号の強度とを
比較することによって測定することができる。リガント
濃度を測定するために本発明方法を用いる場合には、分
光光度計、例えばＢｓｃｋ＋ａａｎ　Ｄ■７分光光度計
（Ｂｅｃｋ＋ｗｓａ　Ｉｎ５ｔｒａａ＋ｅｎｔｓ、　Ｉ
ｎｃ、、　Ｉｒｖｉｎｅ。

Ｃａ１ｉｆｏｒ＋＋ｉａ）のような適当な装置によって
信号強度を読み取ることが有利である。

本発明の他の態様においては、第２の酵素を、結合坑リ
ガントにごく近接している粒子に結合させることができ
る。免疫反応によってリガント及びトレーサーを粒子上
に捕捉した後、粒子を液相から分離し、洗浄し、ブロッ
クトモジュレータ−を加える。トレーサーの第１の酵素
部分が、粒子上の第２の酵素に対するそシュレータ−と
反応してこれを解離させる。次に、上述したように、第
２の酵素に対する基質を加えてアッセイを完了させるこ
とができる。

本発明の他の態様は、本発明方法にしたがってリガント
に関するアッセイを行うための材料の試薬キット又は包
装物である。キットは、その第１のものが磁気粒子に結
合する１以上の坑リガント、第２の坑リガント又はリガ
ントに結合することのできる第１の酵素、第２の酵素、
及び第２の酵素に関するブロックトモジュレータ−を包
含することができる。キットは、また、リガントに対す
る標準物、例えば既知濃度の１以上のリガント試料を含
んでいてもよく、また、他の試薬、酵素基質、又は他の
標識若しくは未標識特異リガント、坑すガンド若しくは
アッセイを行うのに有用なそのコンプレックスを含んで
いてもよい。また、食塩水又はバッファーのような溶液
を含んでいてもよい。

キットの成分は、例えば、ガラス瓶のような別々の容器
内に供給することもでき、あるいは、２種以上の成分を
単一の容器内で合わせることもできる。

本発明を更に説明するために以下の実施例を与えるが、
これは、本発明を制限するものと考えるべきではない。

実施例１ 磁気粒子の調製：抗体結合体 懸垂第１アミ７基を有する磁気粒子（Ａｄｖｘｎｅｅｄ
ｌＪａｇｎｅｔｉｃｓ、　　Ｃｓｍｂｒｉｄｇｅ、　　
Ｍｉｓｓａｃｂ＋＋ｓｓ＊ｔｓ）を、　ｐＨ８，０〜８
．３の０．１Ｍ重炭酸ナトリウムで５回洗浄した。サマ
リウムコバルト磁石を用いて、各洗浄後に粒子を溶液か
ら分離した。上澄み液をデカントし、重炭酸塩バッファ
ー３ｍｎ中のへテロニ官能性架橋剤スルホＳ　Ｍ　ＣＣ
（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ。

＋１１ｉｎｏｉｓ、　５０Ｂ、　　１２０　ｐモル）を
加えた。

この試薬を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを
介して第１級アミンと反応させて、柔軟なスペーサー鎖
及びチオール含有蛋白質と結合するためのマレイミドを
生成させた。混合物を３時間穏やかに混合し、蛋白質結
合バッファー（５０ｍＭｔｒｉｓ、　５０　ｍＭ酢酸ナ
トリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ　　ＥＤＴ
ＡＳ　ｐＨ８，０）で粒子を洗浄した。還元バッファー
（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム
（二塩基性）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ　　
ＥＤＴＡ。

ｐＨ６，５）中のジチオトレイットで抗体を還元し、蛋
白質結合バッファーで溶出した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−
２５上で精製した。次に、約９ｍｇの還元された抗体を
粒子に加え、懸濁液を一晩穏やかに混合した。上澄み液
の蛋白質アッセイ（ＢＣＡ、　Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃ
ｋｌｏｒｄ。

１１１ｉｎｏｉｓ）を用いて結合効率を測定すると、約
９０％であった。粒子をウィルス抽出試薬（２５０ｍＭ
　ｔｒｉｓ、　　１５０ｍＭ　ＮａＣＬ　　１０ｍＭ　
　ＥＤＴＡ、０．７５％ナトリウムグリコデオキシコレ
ート、ｐＨ８，５）で洗浄し、吸着した抗体を除去し、
ナトリウムアジド０．２％を含有する同様のバッファー
中、４℃で保存した。これらの条件下では、粒子は少な
くとも一ケ月安定であった。

実施例２ ＡＰの調製：抗体結合体（トレーサー）アルカリホスフ
ァターゼ（Ｂｏｅｒｉｎ（ｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を
、リン酸カリウムバッファー　（ＫＰ　ｉ８５０ｍＭ、
　ｐ　Ｈ７，５）中で一晩透析した。次に、最終濃度３
２５μＭでＤＭＦ　（２０ｍＭ）中に溶解しｆ：４−Ｃ
ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭ　Ｐ　Ｈ、
５ｉｎａ）によって酵素（３ｍｇ／ｍ１）を誘導体化し
た。雰囲気温度で３０分後、溶出用に５０ｍＭのＫＰｉ
を用いて５ｅｐｂａｄｓｘ　Ｇ−２５カラム（Ｐｈｉｒ
ｍｓｃｉａ）上で分離することによって反応を停止した
。ＳＭＰＢの溢出が起こらないように注意した。誘導体
化された酵素を限外濾過セル（Ａｍｉｃｏｎ。

ＹＭ−３０メンブレン）によってＩＱｍｇ／ｍｌｉに濃
縮した。酵素１モルあたり１〜２モルのＳＭＰＨが導入
された。モノクローナル坑Ｒ５Ｖ−４８抗体（約ｉｏｍ
ｇ／ｍｅ）を、抗体還元バッフ７−（５０ｍＭ酢酸ナト
リウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナ
トリウム、５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸、ｐＨ６
，５）中で１時間、ジチオトレイット（２０ｍＭ）で還
元し、上記記載のように、５０ｍＭのＫＰｉで溶出して
５ｅｐｈｓｄｅｘＧ−２５上で精製した。還元された抗
体を速やかにＳＭＰＢ−アルカリホスファターゼと混合
して、それぞれ１．６及び３．２ｍｇ／ｍＱの最終濃度
を与えた。溶液を雰囲気温度に２時間放置し、４℃で一
晩放置した。次に、２−メルカプトエタノール（０，５
ｍＭ）で反応を停止させ（ｑｕｓ＋＋ｅｈ）、５０ｍＭ
ｔｒｉｓ、　ｌ　ＯＯｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＭｇ
Ｃｆｔ！、ｐＨ７，５で予め平衡にした５ｅｐｈｘｅｒ
ｙｌ　Ｓ−３００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉり上で精製
した。次に、結合体を約０．５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、ナ
トリウムアジド（０，１％）の存在下、−２０’Ｏで保
存した。

１１の丸底フラスコに、アセトニトリル７５０ｍσ及び
２．６−ジクロロインドフェノール（ナトリウム塩、水
和物）３０．０ｇ　（０，１０３モル）を入しタ。無水
酪酸（２５ｍ１１０．１５３モル）を、添加漏斗内でピ
リジン１０＋ｍ１ｌ（０，１２４モル）及びアセトニト
リル１０ｍＭと合わせた。この混合物を、十分に撹拌し
た反応混合物に１時間かけて滴加した。雰囲気温度で撹
拌を更に１６時間継続し、減圧下のロータリーエバポレ
ーションによって反応混合物を濃縮した。得られたシロ
ップ状物を酢酸エチル５００１１ＩＱで希釈し、ＩＮ−
塩酸２５０　ｍｌ。

飽和重炭酸ナトリウム２００ｍＡで洗浄し、無水硫酸マ
グネシウム上で乾燥した。ロータリーエバポレーション
によって粗生成物をシロップ状に濃縮した。無水酪酸と
の反応が二つの反応性フェノラート中心で起こりうるの
で、粗生成物中には二つの異性体が存在していた。酢酸
エチル／ヘキサン（ａ５／８５）中、シリカ上で７ラツ
シユクロマトグラフイーにかけることによってこれらの
異性体を分離した。酢酸エチル／ヘキサン（２０／８０
）中でＴＬＣによって７ラクシジンの純度を評価した。

所望の化合物は０．３２のＲｆを有していたが、他の異
性体は０．３８であった。望ましくない異性体を不純物
として含有する７ラクシヨンを再びクロマトグラフィー
にかけた。プールした生放物が６４％の収率で得られた
（２２．２　ｇ）。

Ｎ　Ｍ　Ｒ（ＣＤ　ＣＱｓ）　：　１．０９（ｔ、３１
１）、　１．８６（ｍ、２［１）。

２．６７（ｊ、２Ｈ）、　６．６６（ｍ、２Ｈ）、　６
．９０（ｓ、２Ｈ）。

７．０７（ｄ、ＩＩＩ）、　７．２５（ｄ、ｌ１１）。

実施例４ Ｒ５Ｖに関するアッセイ 全ての操作を雰囲気温度において行った。磁気分離ラッ
クは、Ｃｉｂａ−Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｄｉｇｇ＋＋ｏｓｔ
ｉｃｓ、　Ｍｅｄｆｉｅｌｄ、　Ｌｓｓｘｃｈｕｓｓｅ
Ｌｔｓから入手した。実施例１で得られた抗体結合粒子
の懸濁液を、ガラス試験管にピペットで入れ、粒子を分
離し、上澄み液を吸引した。ウィルス抽出試薬中の分析
対象物溶液（ａ００μＱ）を加え、混合し、１分間静置
した。これに、アッセイバッファー（ａ００ｍＭ　ｔｒ
ｉｓ。

１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％ナトリウムアジ
ド、０．１％カゼイン（Ｇ＊１Ｉｓｒｄ−５ｃｈｌｓｓ
ｉｎ（ｅｒ。

Ｃｘｒｌｅ　Ｐｌａｃｅ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、］＼メル
ステン（ｈｓｍｍｅｒｓｔｅｎ）グレード）　、ｐＨ７
，５）１ｍｌｌ中の実施例２のモノクローナル抗体−Ａ
Ｐ結合体を加えた。混合物を混合し、５分間静置した。

磁石で粒子を管の側部に吸引し、上澄み液を吸引した。

アッセイバッファー（ａｍＭ）を加え、吸引した。次に
、アッセイバッファー２ｍ（ｌで２回洗浄しく各洗浄の
際に混合した）、最終的な洗浄液を吸引した。ＤＥＯＡ
バッファー（５０ｍＭジェタノールアミン、５０μＭ　
　ＭｇＣｔ、、Ｉ）　Ｈ９，０，５００μＣ）中のウサ
ギ肝臓エステラーゼ（０，８μｇ／ｍ１ｌ）及びブロッ
クトフルオロケトン抑制剤（０，１５ｍＭ）の溶液を、
全ての試験管及び対照試験管に加えた。

管を混合し、２０分間静置した。基質バッファー（５０
ｍＭ　ｔｒｉｓ　　ＨＣＱ、　　２０％メタノール、ｐ
Ｈ７，５，２５０μＱ）中のＤＣＩＰＢ（実施例３）０
．３５ｍＭを加え、色を発生させた。５分後、停止バフ
７７−　（５０ｍＭ　ＬｒｌＳ％　１ｍＭ　　２，２．
２−トリフルオロアセトフェノン、０．１％メタノール
、ｐＨ７，５，５０μｌｌ）を加えて、エステラーゼ反
応を停止させた。全工程に約４０分間を要した。６２０
ｎｍで吸光度を測定すると、少なくとも１時間安定であ
った。

実施例５ 本発明の二重酵素アッセイと市販のアッセイとの杢（ Ｒ５Ｖに対して陽性であることが分かつている５０個の
臨床試料をプールし、プールした検体を、本発明方法、
及び、市販の酵素結合イムノソーペントアッセイ（Ｒ５
Ｖ−ＥＬＩＳＡ、　０ｒｔｈｏ　ＤｉａｇｎｏｓＬｉｃ
Ｃｏｒｐ、、　Ｒａｒｉｔａｎ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅ
ｙ）によって試験した。

実施例５に従った本発明のアッセイによると、プールし
た検体は、プールをウィルス抽出試薬でｌ：１５００に
希釈した後も陽性であった。対照的に、プールした検体
は、１：２５０にしか希釈しないで０ｒｔｈｏ　Ｒ５Ｖ
−ＥＬＩＳＡに関する製造者の説明書に従って試験する
と陰性であった。したがって、本発明のアッセイは、市
販のアッセイと比較して少なくとも６倍感度が高いこと
が示された。

実施例６ 坑Ｒ３Ｖ９７抗体及びＲＬＥの共複合（ｃｏ−ｃｏｎｊ
ｕｇａｔｉｏｎ） 抗体の還元に関して実施例１に記載のものと同様の手順
を用いて、ジチオトレイットでＲＬＥを還元した。この
方法においては、その活性を殆ど保持しながらＲＬＥを
磁気粒子に結合させた。モノクローナル坑Ｒ５Ｖ９７及
びＲＬＥの両方を別々に還元し、次にこれらを種々の割
合で合わせ、これらを、マレイミドを有する磁気粒子（
スルホ−５ＭＣＣ）に加えることによってこの方法の効
率を試験した。これによって、ＲＬＥと坑Ｒ５Ｖ９７の
両方が付着した粒子が得られた。この方法で調製された
粒子を上記記載のように用いて、Ｒ５Ｖ抗！及びモノク
ローナル坑Ｒ８Ｖ４８−アルカリホスファターゼ複合体
のサンドイッチを形成させた。粒子を分離し、洗浄し、
５０ｍＭジェタノールアミン（ｐＨ９，０）中でブＶツ
クト抑制剤のみを加えた（ＲＬＥは加えず）。続いてＤ
ＣＩＰＢ（ＲＬＥ基質）を加えた。色の生成は、加えた
Ｒ５Ｖ抗原の量に反比例した。このアッセイを、坑Ｒ３
Ｖ９７のみを有する粒子を用いる本発明のアッセイと比
較すると、大きな違いは示されなかった。この系の有利
性は、試薬を粒子上に配置することによって試薬の添加
（ＲＬ　Ｅ）が排除されるということである。

したがって、本発明は、磁気分離法と、ある酵素によっ
て第２の酵素のブロックト抑制剤を酵素的にブロッキン
グ解除することを包含する二重酵素アッセイ法とを組み
合わせたものである。この方法によって、１０’倍又は
それ以上の信号増幅が得られ、通常のＥＩＡよりも１０
０倍少ない時間で信号を裸眼で検出することが可能にな
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、以下の工程： （ａ）試験容器内において、リガントを含むと考えられ
   る第１の液体を、磁気粒子に結合した坑リガント（ａｎ
   ｔｉｌｉｇａｎｄ）及び第１のヒドロラーゼを含むトレ
   ーサーと合わせ、それによって該坑リガントを該リガン
   トに結合させかつ該トレーサーを該坑リガント及び該リ
   ガントの一方に結合させて、該粒子上に結合相を与え、 （ｂ）該粒子を該第１の液体から分離し、 （ｃ）該粒子を、第２のヒドロラーゼ及びブロックトフ
   ルオロケトンを含む第２の液体と接触させ、それによっ
   て、該第１のヒドロラーゼによって該ブロックトフルオ
   ロケトンをフルオロケトンに転化させかつ該フルオロケ
   トンを該第２の液体中に解離させ、 （ｄ）該第２の液体に、該第２のヒドロラーゼに関する
   基質を加え、それによって該第２のヒドロラーゼによる
   生成物への該基質の転化を該フルオロケトンによって抑
   制し、 （ｅ）該転化に関連する信号によって該リガントを検出
   する 工程を含む液体中のリガントの検出方法。 ２、該トレーサーが、該坑リガントに結合し、更にそれ
   に結合している該第１のヒドロラーゼを有する該リガン
   トを含む請求項１記載の方法。 ３、該トレーサーが、該リガントに結合し、更にそれに
   結合している該第１のヒドロラーゼを有する第２の坑リ
   ガントを含む請求項１記載の方法。 ４、信号によって検出する工程が、該生成物に関連する
   色を検出することを含む請求項１記載の方法。 ５、以下の工程： （ａ）試験容器内において、リガントを含むと考えられ
   る第１の液体を、磁気粒子に結合した坑リガント及び第
   １のヒドロラーゼを含むトレーサーと合わせ、それによ
   って、該坑リガントを該リガントと結合させかつ該トレ
   ーサーを該リガント及び該坑リガントの一方と結合させ
   て該粒子上に結合相を与え、 （ｂ）該粒子を該第１の液体から分離し、 （ｃ）第２の液体内において該粒子を第２のヒドロラー
   ゼ及びブロックト抑制剤と接触させ、それによって、該
   第１のヒドロラーゼによって該ブロックト抑制剤を抑制
   剤に転化させることにより該抑制剤を該第２の液体中に
   解離させ、 （ｄ）該第２の液体に、該第２のヒドロラーゼに関する
   基質を加え、それによって、該第２のヒドロラーゼによ
   る生成物への該基質の転化を該抑制剤によって抑制し、 （ｅ）該生成物に関連する信号によって該リガントを検
   出する 工程を含む液体中のリガントを検出する方法。 ６、以下の工程： （ａ）試験容器内において、抗原を含むと考えられる第
   １の液体を、磁気粒子に結合している第１の抗体及びそ
   れに結合しているアルカリホスファターゼを有する第２
   の抗体と合わせ、それによって、該抗原を該第１及び第
   ２の抗体と結合させて該粒子上に結合相を与え、 （ｂ）その上に結合相を有する該粒子を該第１の液体か
   ら分離し、 （ｃ）分離された粒子を、エステラーゼ及びブロックト
   フルオロケトン抑制剤を含む第２の液体と接触させ、そ
   れによって、該アルカリホスファターゼによって該ブロ
   ックトフルオロケトン抑制剤を該エステラーゼのフルオ
   ロケトン抑制剤に転化させ、該フルオロケトンを該第２
   の液体中に解離させ、 （ｄ）該第２の液体に色原体を加えて、該エステラーゼ
   による着色生成物へのその転化を該フルオロケトンによ
   って抑制し、 （ｅ）該第２の液体中における色生成の抑制を検出する
   ことによって該抗原を検出する 工程を含む液体中の抗原を検出する方法。 ７、該エステラーゼが該磁気粒子に結合している請求項
   ６記載の方法。 ８、磁気粒子に結合している坑リガント、リガント及び
   第２の坑リガントの一方に結合している第１のヒドロラ
   ーゼ、及び第２のヒドロラーゼに関するブロックト抑制
   剤を含む、リガントに関して試験を行うための材料キッ
   ト。 ９、更に該第２のヒドロラーゼを含む請求項８記載のキ
   ット。 １０、酵素基質、抗原、抗体及び抗体コンプレックス、
   バッファー及び食塩水からなる群より選択される少なく
   とも１種の他の試薬を更に含む請求項８記載のキット。