JPH0641950B2 - リガンドの検出方法および検出用キット - Google Patents

リガンドの検出方法および検出用キット

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JPH0641950B2 JP62293038A JP29303887A JPH0641950B2 JP H0641950 B2 JPH0641950 B2 JP H0641950B2 JP 62293038 A JP62293038 A JP 62293038A JP 29303887 A JP29303887 A JP 29303887A JP H0641950 B2 JPH0641950 B2 JP H0641950B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は被分析体のイムノアッセイならびにそのアッセ
イで使用する物質に関し、より詳細には、指示反応の酵
素触媒作用の調節により検出可能な信号が増強されるイ
ムノアッセイ法およびそのための物質に関する。
（従来の技術） 迅速でしかも感度の高いアッセイ系は液体中のある種の
物質の濃度を測定するために開発された。イムノアッセ
イは特異的抗体への抗原またはハプテンの結合に基づい
ており、それらは高レベルの特異性および感度を与える
ので特に有用であった。これらのアッセイは一般に上記
試薬のうちの一方の標識体を使用し、その標識試薬はし
ばしばトレーサーと呼ばれている。イムノアッセイ法は
溶液中または担体上で実施され、そして遊離（非結合）
トレーサーからの結合トレーサーの分離を必要とするヘ
テロジーニアス・イムノアッセイ (heterogeneous immunoassay)、または分離工程を必要
としないホモジーニアス・イムノアッセイ(homogeneous
immunoassay)のいずれかでありうる。
ラジオイムノアッセイ(RIA)法は標識として放射性同位
元素を使用し、高レベルの感度と再現性を与え、しかも
多数の試料を迅速に処理するために自動化しやすい。し
かしながら、放射性同位体は高価であり、比較的短い半
減期を有し、高価で複雑な設備を要し、そして取扱いお
よび廃棄処分に対して十分な安全対策が講じられねばな
らない。
螢光イムノアッセイ(FIA)は標識として螢光色素を使用
し、そして標識を直接検出するものである。しかしなが
ら、有機螢光色素（例えばフルオレセインまたはローダ
ミン誘導体）を使用する既知のホモジーニアスFIA法
は、主に検定媒体中に懸濁する不純物による光散乱およ
び検定媒体中に存在する他の螢光物質からのバックグラ
ウンド螢光放出のために、RIAに匹敵する高感度を達成
しなかった。
酵素もまたイムノアッセイにおいて標識として使用され
た。通常のエンザイムイムノアッセイ(EIA)では、酵素
が抗原−抗体の特異的結合対の一方の成分と共有結合
し、その結果生じた酵素複合体が基質と反応して検出・
測定可能な信号を発する。その信号が色の変化である場
合、平均的なヒトは約10-5または10-6Ｍまでしか発色体
の存在を検出できないので、肉眼での観察には限りがあ
る。
EIAの感度はしばしばスペクトル光度測定技術により増
大しうるが、これらの技法は高価な設備を必要とする。
別の方法では、種々の増幅法により感度が高められる。
単一酵素増幅法が開示され、この場合には10-6〜10-10
Ｍの濃度で存在するリガンドが検出された。しかしなが
ら、これらの方法は一般に10-11Ｍ以上のリガンド濃度
において満足のゆくものでなかった。カスケード的増幅
法では、検出可能な（一般には着色された）分子の数が
２種以上の酵素または酵素誘導体の使用により増加され
る。ハリス(Harris)の米国特許第4463090号明細書は、
大きい分子活性化物質（例えばリガンドに結合した酵素
またはプロ酵素）が第２酵素を活性化し、その第２酵素
が基質と反応して検出可能な信号を発するか、又は順に
第３酵素を活性化することから成るカスケード的増幅イ
ムノアッセイを開示している。
セルフ(Self)の米国特許第4446231号明細書は、第１お
よび第２酵素系および第２酵素系のためのモジュレータ
ーを含む循環増幅エンザイムイムノアッセイを開示して
いる。第１酵素系はリガンドに結合した第１酵素を含
む。セルフの発明の第１の態様では、第１酵素系がモジ
ュレーター前駆体に作用してモジュレーターを遊離させ
る。そのモジュレーターは第２酵素のコファクターであ
って、第２酵素系を活性化して検出可能な生成物への基
質の反応を触媒する。その反応の間に、モジュレーター
は不活性形体に変換され、そしてモジュレーターを再活
性化する第３酵素によって循環が達成される。第２の態
様では、モジュレーターが第２酵素系の阻害剤であり、
それが第１酵素系により除去され、それによって第２酵
素系が活性化されて基質に作用し、そして検出可能な生
成物を生ずる。
ボグスラスキー(Boguslaski)らの米国特許第4492751号
明細書は、酵素基質または補酵素が特異的結合対の一方
の成分に結合された循環系を教示している。
標的酵素を特異的に不活性化する多種多様の分子が明ら
かになった。反応機構阻害剤(mechanismbasedinhibito
r)と呼ばれる１つのサブセットの阻害剤は、酵素と反応
して共有結合を形成する酵素基質である。反応機構阻害
剤はウオルシュ(Walsh)，Tetrahedron38,871(1982)によ
り論議されている。別のサブセットの阻害剤には安定し
た遷移状態類似体として作用する分子が含まれる。ゲル
ブ(Gelb)らはBiochemistry24,1813(1985)において加水
分解酵素の遷移状態阻害剤として若干のフルオロケトン
類の開示している。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明の１つの面は、液体試料（以後未知試料と呼ぶ）
中のリガンドの検出方法に関する。リガンドを含む疑い
のある未知試料は、特異的抗リガンドおよびそのリガン
ドのためのトレーサーと混合される。トレーサーはリガ
ンドまたはそのリガンドに特異的な第２抗リガンドに結
合された第１酵素を含む。リガンド、抗リガンドおよび
トレーサー間の結合へ導く条件を与えて結合相を形成さ
せる。結合相を液体から分離した後、結合相は液体中で
遮断モジュレーターおよび第２酵素と接触させる。第１
酵素がその遮断基を取り除いて第２酵素のためのモジュ
レーターを生成させる。その後第２酵素の基質を添加す
る。基質は第２酵素により検出可能な信号を発する生成
物に変わり、その第２酵素による基質の生成物への転化
反応がモジュレーターによって調節される。
リガンドは抗原、ハプテンまたは抗体でありうる。好適
なリガンドは抗原であり、最も好ましくはウイルス抗原
である。この方法は競合的イムノアッセイ法により実施
することができ、その場合トレーサーは第１酵素に結合
したリガンドである。好ましくはサンドイッチイムノア
ッセイ法が使用され、その場合にはトレーサーは第１酵
素に結合した第２抗リガンドである。
本発明の好適な遮断モジュレーターは、トレーサーの第
１酵素成分によって阻害剤に転化される遮断阻害剤であ
る。好適な基質は第２酵素により異なる色の生成物へ転
化される色原体である。最も好ましくは、その色原体は
無色であって、第２酵素により着色生成物に変わるもの
であり、色原体の生成物への転化反応が阻害剤により阻
害される。
最適なアッセイ系では、抗体が担体に固定され、そして
結合条件下でウイルス抗原とアルカリ性ホスファターゼ
（第１酵素）で標識された第２抗体（ウイルス抗原に特
異的）とに接触される。結合および分離の後、抗体：抗
原：アルカリ性ホスファターゼ標識抗体サンドイッチを
有する担体は、液体中で遮断阻害剤および第２酵素と接
触させる。抗原が液体中に存在する場合は、担体上に捕
捉されたアルカリ性ホスファターゼが遮断基を取り除い
て阻害剤を生成させる。無色の色原体が添加される。液
体中に生成された阻害剤は、第２酵素が色原体を着色生
成物へ転化するのを妨げる。従って、発色は試料中に抗
原が存在しないことを示し、発色の欠如は試料中に抗原
が存在することを示している。
本発明の別の面では、新しい種類の酵素モジュレーター
および遮断モジュレーターが提供される。好適なモジュ
レーターは酵素阻害剤であり、最も好ましくは第１酵素
により除去しうる遮断基を化学的に結合させた官能基を
もつフルオロケトンである。
本発明の別の面は、先に述べたような本発明方法を実施
するための物質から成るキットを包含する。
酵素阻害剤の遮断基除去を伴うEIA系では、検定を最高
感度で実施しようとする場合、阻害剤と遮断阻害剤の両
方に厳しい制限がかけられる。本発明によれば、遮断阻
害剤は（遮断基除去用）第１酵素のためのすぐれた基質
であるが、（発色用）第２酵素とは本質的に反応しな
い。同様に、遮断基を除去された阻害剤は第２酵素の強
力な阻害剤であるが、第１酵素には本質的に影響を及ぼ
さない。遮断阻害剤および阻害剤と第１および第２酵素
との反応はそれぞれ高度に選択的であるので、交差反応
性による従来技術の循環EIA系に特徴的な“短い循環
路”が実質的に排除される。
従って、本発明は液体中に極めて低い濃度で存在するリ
ガンドの多目的検定法を提供する。本発明方法は、10
-12Ｍ程度に低い濃度でリガンドが存在するとしても、
検定信号の肉眼での検出・測定を可能にし、そして高価
な又は複雑な装置なしで検出または測定しうるリガンド
の範囲を大いに広げるものである。さらに、検定感度す
なわちリガンドの有無を検出するのに要する時間が、通
常のEIAと比較して100倍まで短縮される。それによっ
て、コストやスペースの面での有意な節約が達成され、
本発明アッセイを小さな臨床実験室で又は医師の診療室
でさえ行うことが可能となる。
（問題点を解決するための手段） 本発明は多くの異なる形の実施態様を包含するものであ
るが、ここでは本発明の好適な実施態様を詳細に説明す
る。以下の記載は本発明の原理の例示として解釈される
べきであり、ここに記載の実施態様に本発明を制限する
ものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は特
許請求の範囲およびそれらの均等物により決定されるで
あろう。
本発明方法によれば、未知試料中に存在する物質（以後
リガンドと呼ぶ）は、非常に低濃度で存在するときでさ
えも、視覚的にすなわち肉眼での観察により検出され
る。この方法は少なくとも２つの増幅段階を含む。第１
の増幅段階はモジュレーターの遮断基の酵素的除去であ
る。第２の増幅段階は指示反応の酵素触媒作用である。
これらの増幅段階が順次行われて106倍またはそれ以上
の信号増幅を与え、それにより10-12Ｍまたはそれ以下
の濃度で試料中に存在するリガンドが肉眼で検出されう
る。それ以上の増幅を望む場合には、複数の酵素を必要
とする段階的反応（これらの反応のいずれか１つまたは
全部が更なる信号増幅を与える）を開始される第１酵素
が用意される。
未知試料中に存在するリガンドを検出するための本発明
方法においては、免疫反応が使用される。本明細書で用
いる“免疫反応”なる用語は抗原と抗体、ハプテンと抗
体、または特異的に結合する抗原、抗体もしくはハプテ
ンの適当な類似体の特異的結合反応を意味する。
免疫反応は適当な液体中で実施される。例えば、その液
体は血清、尿、脳脊髄液、脳水のようなリガンドを含む
疑いのある体液であり得る。また、その液体はリガンド
を含む疑いのある試料が添加された水、食塩水または適
当な緩衝液、もしくは体液と他の液体との混合物であっ
てもよい。
本発明の好適なサンドイッチアッセイ法は、初めにアッ
セイ成分およびそれらの相互作用の理解を与えるため
に、以下のアッセイフローシートに関して説明され、そ
の後各成分が詳しく説明されるであろう。
上記フローシートにおいて、以下の定義が使用され、そ
の際コロンは免疫結合を示し、ハイフンは化学的結合ま
たは物理的付着（例えば吸着）を示し、実線の矢印は化
学的転化を示し、そして点線の矢印は反応またはアッセ
イ成分の調節を示す。
AL−抗リガンド Ｌ−リガンド Ｔ−トレーサー E1−第１酵素 E2−第２酵素 Ｂ−Ｍ−遮断モジュレーター Ｍ−酵素のモジュレーター Ｂ−モジュレーターの遮断基 Sub−基質 Ｐ−生成物 抗リガンドおよびトレーサーへのリガンドの結合へ導く
条件が与えられ、その後分離工程および適当な洗浄工程
が行われることは上記フローシートから明らかである。
第２酵素およびモジュレーター（活性化剤または阻害
剤）と遮断基から成る遮断モジュレーターが添加され、
その遮断基はトレーサーの第１酵素成分により除去され
る。第２酵素の基質が添加され、第２酵素による基質の
検出可能な生成物への転化反応は、第１酵素により遮断
モジュレーターから遊離されたモジュレーターによって
調節される。生成物のレベルは、モジュレーターが活性
化剤であるか又は阻害剤であるかに応じて、モジュレー
ターのレベルに正比例または反比例し、それゆえにリガ
ンドのレベルに正比例または反比例する。測定される実
際の信号は指示反応に関連した色、例えば生成物の色ま
たはその発色速度、もしくは基質の色またはその消失速
度でありうる。
本発明の好適な実施態様では、１種またはそれ以上のア
ッセイ成分が担体表面に結合される。当分野で知られて
いるように、担体はアッセイを実質的に妨害しないなら
ばどんな担体でもよい。使用しうる担体の例はガラスお
よびポリマー材料（例えばポリエチレン、ポリ弗化ビニ
リデン、ポリスチレンなど）である。この種の担体はシ
ート、チューブ、ウエルのような適当な形状に作られ、
好ましくはマイクロタイタープレートのようなプレート
でありうる。例えば、アッセイ成分はチューブ（好まし
くは一端が閉じたプラスチック製チューブ）の内壁また
は底部に結合され、最も好ましくはマイクロタイタープ
レートのウエルに結合される。好適には、所望量の抗リ
ガンドを担体に結合させた後、担体上の残りの結合部位
を不活性タンパク質で飽和される。不活性タンパク質
は、担体に結合することができ且つ以下で述べるような
リガンド、抗リガンドおよびトレーサー間の特異的結合
反応をいかなる場合にも妨害しないどんなタンパク質
（例えば卵アルブミン）であってもよい。
好ましくは、担体に結合した抗リガンドをリガンドおよ
びトレーサーと一緒にインキュベーションして、両者を
担体に結合させる。妨害物質を除くための洗浄工程の後
に、残りのアッセイ成分を加え、以下で述べるようにし
てアッセイを完結させる。
今や、アッセイ成分について詳細に説明すると、リガン
ドはいかなる供給源からのものであってもよく、抗原、
抗体またはハプテンでありうる。例えば、リガンドは体
液中に存在する抗原であり得、またそれは体液から分離
されてその後緩衝液のような異なる液体中に導入されて
もよい。他の場合には、リガンドは体液以外の供給源か
らのものであってもよく、例えば微生物の培養物または
細胞抽出物であり得る。好適なリガンドは抗原であり、
最も好ましくは単純性疱疹ウイルス(HSV)、アデノウイ
ルス、インフルエンザＡ型ウイルス、パラインフルエン
ザ３型ウイルスおよびRSウイルス(Respiratory syncyti
al virus)のような体液中に存在するウイルス抗原であ
る。
抗リガンドは液体中のリガンドと接触して免疫反応を誘
発する。抗リガンドは抗原または抗体（モノクローナル
抗体またはポリクローナル抗体）であり得、またそれは
リガンドと特異的に反応する適当なその類似体であって
もよい。さらに抗リガンドは複数の結合抗体から成る抗
体複合体、例えば第１抗体に特異的に結合した第２抗体
であり得る。さらにまた、リガンドは数種の異なる抗リ
ガンドと結合させてもよく、例えばポリクローナル抗体
の集合体またはリガンドの異なる表面域に同時に結合す
る数種のモノクローナル抗体分子の混合物と結合させて
もよい。一般に、第２抗体は異なる動物種において第１
抗体に対して産生される。複合体中の複数の結合抗体は
約２〜10種またはそれ以上の抗体を含みうる。
本発明のサンドイッチアッセイにおいては、本質的にす
べてのリガンドを結合するのに十分な結合部位を有する
過剰の抗リガンドを使用することが好適である。
トレーサーは２つの成分、すなわちリガンドに結合した
第１酵素（以下で述べる競合的アッセイ）または第２抗
リガンドに結合した第１酵素（好適なサンドイッチアッ
セイ）から成る。酵素は免疫反応に先立ってリガンドま
たは抗リガンドに適当な方法で（好ましくは共有結合
で）結合される。酵素とリガンドまたは抗リガンドとの
共有結合は慣例的であり、当分野で習熟した者によく知
られている。
遮断モジュレーターから遮断基を除去しうる酵素はどれ
も第１酵素として使用することができる。適当な第１酵
素は一般にヒドロラーゼ（加水分解酵素）、例えばホス
ファターゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ、グリコシダ
ーゼなどである。好適な第１酵素の例はトリプシン、ト
ロンビン、哺乳類肝臓エステラーゼ、アセチルコリンエ
ステラーゼ、β−ガラクトシダーゼまたは最も好ましく
はアルカリ性ホスファターゼであるが、これらに限定さ
れない。
リガンド、抗リガンドおよびトレーサーを含む液体は結
合を誘発すべく必要に応じてインキュベーションされ
る。インキュベーションは結合を促進するのに適した温
度で十分な時間行われ、好ましくは約20゜〜40℃で約１
分〜４時間実施される。結合する抗リガンド、リガンド
およびトレーサーは以後結合分画と呼び、そして結合し
ない抗リガンド、リガンドおよびトレーサーは以後遊離
分画と呼ぶことにする。アッセイは結合分画と遊離分画
の間に平衡が確立されるような方法で実施しうるが、必
ずしも平衡である必要はない。
結合分画は過、デカンテーション、遠心、吸引などの
慣用方法でアッセイ混合物の液相中の遊離分画から分離
される。免疫反応が担体上で行われたときには、通常液
相をデカンテーションし、担体を洗浄して遊離分画およ
びアッセイを妨害する恐れのある他の物質を除去し、そ
の後水、食塩水または緩衝液のような適当な液体中に再
懸濁する。続いて遮断モジュレーターを添加し、そして
以下で述べるように遮断基の非酵素的除去を生起させな
いpHレベル（好ましくは６〜８）にpHを調節する。
遮断モジュレーターは第１酵素によって第２酵素のモジ
ュレーターに転化されうるいかなる物質であってもよ
い。好適な遮断モジュレーターは２つの成分、すなわち
モジュレーターと遮断基から成る。最適な遮断モジュレ
ーターはその遮断基が第１酵素によって除去されて阻害
剤がアッセイ媒体中に放出されるまで第２酵素に対して
非反応性の遮断阻害剤である。従って、遮断阻害剤の各
成分の選択は使用する第１および第２酵素に依存してい
る。遮断基は第１酵素によって実質上選択的に切断され
る結合を介して阻害剤に共有結合しうるものであり、そ
して阻害剤成分は第１酵素に対して実質的に影響を及ぼ
さないが第２酵素の活性を阻害するものであるべきであ
る。従って、第２酵素の性質およびその基質は遮断阻害
剤および阻害剤の詳しい説明に先立って論じられるであ
ろう。
本発明アッセイにおいて、第２酵素は一般に基質を生成
物に転化するヒドロラーゼである。適当なヒドロラーゼ
は例えばホスファターゼ；トリプシン、キモトリプシン
およびペプシンのようなペプチターゼ；または好ましく
はアセチルコリンエステラーゼ(AChE)およびブチルコリ
ンエステラーゼのようなエステラーゼである。最適な第
２酵素はウサギ肝臓エステラーゼ(RLE)のようなカルボ
キシエステラーゼである。
基質は第２酵素によって切断されて色と関連した信号に
より検出可能な生成物を与える基を含むいかなる基質で
あってもよい。従って、本発明の１つの実施態様におい
て、検出される信号は色の発生または消失、もしくはあ
る色から他の色への変化である。本発明の別の実施態様
では、信号は基質が生成物に転化される速度の変化であ
り得、例えば基質の色は特定時間の間未変化のままであ
ることが観察される。こうして、信号の測定は反応速度
論的または熱力学的条件下で行われる。反応速度論的測
定は一定時間にわたって生じる変化率を測定するもので
あり、一般にアッセイ試薬類を混合した後いろいろな時
間に一連の測定を行うことにより実施される。熱力学的
測定は基質と指示反応の生成物との間に平衡が達成され
たときに生じた変化の度合を測定するものである。測定
は器械を用いて、または好ましくは肉眼で行われる。
基質は第２酵素によって切断されて着色生成物を与える
まで無色であるのが好ましい。適当な基質はインドキシ
ルエステルおよび好ましくはニトロフェノールのエステ
ル（例えば酢酸または酪酸のｏ−およびｐ−ニトロフェ
ニルエステル）である。これらの基質はカルボキシエス
テラーゼによるアセチル基またはブチリル基の切断が起
こってニトロフェノール着色物質を与えるまで無色であ
る。従って、モジュレーターが阻害剤であって、基質が
ニトロフェノールのエステルである場合、測定される信
号は発色の抑制である。
本発明方法はまた螢光イムノアッセイにも使用しうるこ
とが明らかである。本発明のこの実施態様においては、
第２酵素が非螢光性基質を螢光生成物に転化し、その際
測定される信号は螢光の変化である。本発明のこの実施
態様の場合は、モジュレーターが阻害剤であり、第２酵
素がエステラーゼであることが好ましい。
先に述べたように、トレーサーの第１酵素成分は遮断阻
害剤から遮断基を切断して第２酵素阻害剤をもたらし、
そして本発明の別の面は下記の一般式Ｉ〜IVで表される
新しい種類の酵素阻害剤および遮断酵素阻害剤に関する
（以下に記載の基Ｂの性質はその化合物が阻害剤である
か又は遮断阻害剤であるかにより決定される）： 式Ｉ〜IVにおいて、Ｒ1はＨ、炭素原子数１〜６の直鎖
または分枝鎖低級アルキル、または であり；Ｒ2は炭素原子数１〜６の低級アルキルであ
り；Ｒ3はＨ、ニトロ、アルコキシ、ハロゲンなどであ
り；Ｒ4は炭素原子数１〜10のアルキル基、炭素原子数
２〜10のアルケニルまたはアルキニル基であり、これら
の基は場合によりアリール基または（ニトロ、ヒドロキ
シ、メルカプト、アルキルオキシ、ハロアルキル、ヒド
ロキシアルキルまたはメルカプトアルキル基で置換され
た）アリール基で置換されていてもよく；ＹおよびＺは
独立にＨまたはＦであり、その際ＹおよびＺの少なくと
も一方はであり、ＸはＯ、ＳまたはNR5（ここでＲ5は
ＨまたはＲ2である）であり；ｎは１〜６であり；ｍは
２〜６であり；ＡはＦまたはCF3であり；そしてＢは
Ｈ，リン酸またはその塩、グリコシル基、アミノ酸残基
（例えばアミノ酸のカルボキシル基を介してＸに共有結
合されたリシンまたはアルギニン残基）、炭素原子数２
〜４のアシル基（例えばアセチルまたはブチリル基）、
または次式のペプチド： であり、ここでＲ6は(CH2)4NH2、(CH2)3NH− またはベンジルであり、Ｒ7はＨまたは炭素原子数１〜
６の直鎖または分枝鎖低級アルキルであり、Ｒ8はＨ、
炭素原子数１〜４の直鎖または分枝鎖低級アルキルまた
はヒドロキシ低級アルキル、CH2COOHもしくは(CH2)2COO
Hであり、Ｒ9は炭素原子数１〜４の直鎖または分枝鎖低
級アルキルもしくは低級アルコキシ、フェニルまたはベ
ンジルオキシであり、そしてｑは０〜10である。
ＢがＨである場合、式Ｉ〜IVは酵素阻害剤を表す。Ｂが
Ｈ以外の基である場合、式Ｉ〜IVは遮断された酵素阻害
剤を表す。Ｂがリン酸またはその塩である場合、Ｂは次
式： （式中ＰはＸに結合され、ｎは上記定義通りである）で
表されるものである。
式Ｉ〜IVの阻害剤および遮断阻害剤は、当分野で習熟し
た者が考えうる通常の化学反応工程により合成すること
ができる。適当でしかも便利な合成方法は以下の実施例
において示す。有効な酵素阻害剤の下記表は例示目的で
提示される。
本発明の最適な実施態様において、トレーサーはアルカ
リ性ホスファターゼに共有結合された第２抗リガンドで
ある。担体の分離および洗浄、ならびに適当なアッセイ
液体中への担体の再懸濁の後に、RLEまたはAChE（第２
酵素）および式Ｖの遮断阻害剤を添加する。抗原が未知
試料中に存在する場合、抗原およびトレーサーは担体上
に捕捉され、そしてアルカリ性ホスファターゼがＶのリ
ン酸エステル結合を切断して式VIの阻害剤を与える。ア
ッセイは式VIIの酪酸ｏ−ニトロフェニルまたは酢酸ｏ
−ニトロフェニルの添加により完結される。
阻害剤VIが未知試料中の抗原の存在ゆえに形成される
と、エステラーゼの活性が阻害されて、無色の基質VII
が着色生成物VIIIに転化されない。未知試料中に抗原が
存在しないと、アルカリ性ホスファターゼが担体上に捕
捉されず、阻害剤VIが形成されず、それ故にエステラー
ゼが阻害されないので着色生成物VIIIが形成される。
１×10-12Ｍのアルカリ性ホスファターゼおよび３×10
-9ＭのRLEをそれぞれ第１および第２酵素として使用す
る本発明のこの最適な実施態様では、１×10-12Ｍのレ
ベルまでの未知試料中の抗原の有無が約７分で検出可能
である。抗原が未知試料中に存在する場合は、肉眼で検
出しうる色（約１×15-5Ｍの生成物VIII）がこの時間内
に現れない。抗原が存在しない場合には色が現れる。こ
れとは対照的に、第１酵素（アルカリ性ホスファター
ゼ）のみを使用する通常のイムノアッセイでは、酵素が
十分な量のリン酸化ニトロフェノールを分解して検出可
能な色を与えるのに約104分を要する。従って、本発明
は上記レベルのこれらの試薬類を使用する場合に１５倍
の検定感度の増加を示す。
先に述べたように、本発明の別の実施態様は、第１酵素
に結合した予め定められた量のリガンドから成るトレー
サーを使用する競合的イムノアッセイである。競合的イ
ムノアッセイでは、抗リガンドの使用量がアッセイ液体
中に存在するリガンドおよびトレーサーの全部を結合す
るのに不十分であり、それによりリガンドとトレーサー
は限られた数の抗リガンド結合部位を競い合うことにな
る。こうして、競合的イムノアッセイでは、抗リガンド
に結合するリガンドおよびトレーサー（結合分画）の量
がアッセイ液体中のそれらの濃度に反比例する。
更なる信号増幅が望まれる場合には、アッセイ媒体中の
複数の試薬が段階的に反応して最終的にモジュレーター
の遮断基除去へ導く多段カスケード的増幅アッセイが実
施される。本発明のこの実施態様を説明する際には、ア
ッセイ媒体中の試薬を２次酵素（上記第２酵素のモジュ
レーターの遮断基を除去する）へ酵素的に転化する１次
酵素として上記の第１酵素を考慮に入れることが有利で
ある。さらに、その２次酵素または後続の酵素を別の試
薬と反応させて、モジュレーターの遮断基が除去される
までカスケード的酵素反応を続行しうる追加の酵素を形
成させることもできる。アッセイ媒体に添加する試薬を
適切に選ぶことにより、所望の数の増幅段階を行うこと
が可能である。
第１酵素または続いて形成される酵素、および第２酵素
は真の触媒として作用する（１分子の酵素が消費される
ことなく本質的に無限の遮断モジュレーターまたは基質
分子に対して作用する）ので、先に記載した本発明のど
の実施態様においても増幅が起こる。従って、理論的に
は、本発明を実施するのにそれぞれの酵素１分子があれ
ば足りるであろう。実際には、添加する酵素の量および
使用する増幅段階の数は希望する増幅レベルに応じて決
定され、その決定は当分野で通常の知識を有する者の理
解の範囲内である。
本発明の範囲に含まれる競合的アッセイおよびサンドイ
ッチアッセイの構成はほとんど無限に考案しうることが
明らかである。さらに、本発明はリガンドの検出または
リガンド濃度の測定に適した構成のアッセイを提供す
る。リガンド濃度は未知試料の信号強度を、本質的に同
一条件下で検出した既知量範囲のリガンドの信号強度と
比較することにより測定される。本発明方法がリガンド
濃度の測定のために使用される場合には、適当な器械例
えばカルフォルニア州アービン、ベックマ・インスツル
メント社のベックマンDU7スペクトロフォトメータのよ
うな分光光度計を用いて信号強度を読み取ることが有利
である。
本発明の別の実施態様では、第２酵素が抗リガンドに接
近して固相に固定される。リガンドとトレーサーが担体
上に捕捉される免疫反応の後に、その担体を液相から分
離・洗浄し、そして遮断モジュレーターを添加する。ト
レーサーの第１酵素部分は遮断モジュレーターと反応し
て、担体上の第２酵素のためのモジュレーターを遊離さ
せる。その後第２酵素の基質を加えて、先に述べたよう
にアッセイを完結させることができる。
本発明の他の面は、本発明方法に従ってリガンドの検定
を行うための物質の試薬キットまたは包装品である。そ
のキットは１種またはそれ以上の抗リガンド、抗リガン
ドの１種またはリガンドに結合しうる第１酵素、第２酵
素、および第２酵素の遮断モジュレーターを含み、その
際抗リガンドの１種は場合により担体に結合される。キ
ットはまたリガンド標品、例えば１つ以上の既知濃度の
リガンド試料を含むことができ、またそれはアッセイを
行うのに有用な他の試薬、酵素基質、もしくは他の標識
または非標識特異的リガンド、抗リガンドまたはそれら
の複合体を含んでいてもよい。それは食塩水や緩衝液の
ような溶液を含みうる。キットの諸成分は別々の容器
（例えばバイアル）に供給されても、また２種以上の成
分が１つの容器に収容されていてもよい。
実験 日常的分析技術−フラッシュシリカゲルクロマトグラフ
ィーは32〜63メッシュのICNシリカゲルを用いて３〜７p
siで実施した。分析用TLCはEMサイエンティフィックか
らの0.25mmの５×20cmシリカゲル−アルミニウムプレー
トで行った。分離用TLCはEMサイエンティフィックから
の2.0mmの20×20cmシリカゲル−ガラスプレートで行っ
た。融点はトーマス・フーバー(Thomas Hoover)毛管融
点測定装置を用いて測定し、未補正であった。NMRスペ
クトルはIBM WP-200SYスペクトルフォトメーターで記録
し、化学シフトはトリメチルシランに対するppmで表し
た。HPLCはブラウンリーAX−300７×250mmカラムで２種
類の溶剤系のうちの一方を用いて、UV検出を伴うウオー
ターズ510二ポンプ装置により実施した；Ａ溶剤系は30m
M NH4OAc(pH6.5)での５分間初期保持、続いて30分間に
わたる2.0Ｍ NH4OAcへの線状勾配、その後の1.0Ｍ NH
4OAcでの５分間保持を使用した。Ｂ溶剤系は30mM NH4OA
c(pH6.5)のイソクラチック緩衝系（一定組成の溶剤によ
る溶出）を４０分間使用した。流速は1.0ｍ／分であ
った。ガスクロマトグラフィーはＪ＆Ｗサイエンティフ
ィック社から購入した30ＭDB−１メガボアカラムを使用
して、FIDおよび自動インジェクターを備えたH.P.5840A
ガスクロマトグラフで行った。GC条件は次の通りであっ
た：すなわち100℃での３分間保持、続いて250℃への10
℃／分の勾配、その後250℃での３分間保持（ただし流
速＝16.0ｍ／分）。
阻害定数は５０mMトリス（pH8.0）中で測定した。酵素
と阻害剤は周囲温度で２０分間インキュベーションし
た。その後酵素基質を加えて、加水分解速度を分光光度
計で追跡した。PLEおよびRLEのための基質は酪酸ｏ−ニ
トロフエニルであり、AChEの基質はアセチルチオコリン
およびエルマン試薬（Ellman′s reagent）であった。
実施例Ｉ ジアンモニウム〔４−（３−オキソ−4,4,4−トリフル
オロブチル）フエニル〕ホスフェート Ａ．３−（４−メトキシフエニル）−２−（１−オキソ
−2,2,2−トリフルオロエチル）プロピオン酸エチル 還流冷却器、滴下漏斗、アルゴン流入口および電磁攪拌
機を備えた１の４つの口丸底フラスコに水素化ナトリ
ウムの５０％油分散体7.17ｇ（0.149Ｍ）および乾燥エ
チルエーテル300ｍを装填した。その攪拌溶液に無水
エタノール９ｍを徐々に加えた。水素の発生がやんだ
後、4,4,4−トリフルオロメチルアセト酢酸エチル25ｇ
（0.136Ｍ）と塩化４−メトキシベンジル21.3ｇ（0.136
Ｍ）の混合物を１時間にわたって添加した。その後この
混合物を一晩還流下に加熱した。次いで反応混合物を冷
却し、水および１ＮHClで洗浄し、無水MgSO4で乾燥し、
そして減圧下に溶媒を除去した。粗反応混合物33.5ｇは
60×300mmシリカゲルカラムでクロマトグラフにかけ、
酢酸エチル／ヘキサンの１：３混合溶媒で溶出した。類
似の分画を合わせて油状の目的生成物9.0ｇ（２７％）
を得た。nmr(CDCl3)− 2.67(m,2H),3.85(m,3H),3.90(s,3H),7.24(q,4H)。
Ｂ．1,1,1−トリフルオロ−４−（４−ヒドロキシフエ
ニル）−２−ブタノン 還流冷却器、電磁攪拌機およびアルゴン流入口を備えた
100ｍの丸底フラスコに３−（４−メトキシフエニ
ル）−２−（１−オキソ−2,2,2−トリフルオロエチ
ル）プロピオン酸エチル2.05ｇ（6.7mM）、AcOH中の31
％HBr 20ｍおよび水10ｍを装填した。この混合物を
120℃で一晩加熱し、減圧下に濃縮し、ジクロルメタン
と水とに分配した。有機層を重亜硫酸塩水溶液および飽
和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水MgSO4で乾
燥し、そして減圧下に溶媒を除去した。粗反応混合物は
50×300mmシリカゲルカラムでクロマトグラフにかけ、
酢酸エチル／ヘキサンの１：１混合溶媒で溶出した。類
似の分画を合わせ、溶媒を減圧下に除去して澄明な油と
して目的生成物600mg（41％）を得た。nmr(CDCl3) 4.90（巾広，1H),6.93(dd,4H)J＝4,60Hz。
Ｃ．ジエチル〔４−（３−オキソ−4,4,4−トリフルオ
ロブチル）フエニル〕ホスフェート アルゴン流入口および電磁攪拌機を備えた10ｍの１つ
口丸底フラスコを氷浴に入れ、1,1,1−トリフルオロ−
４−（４−ヒドロキシフエニル）−２−ブタノン400mg
(1.8mM)、クロルリン酸ジエチル400mg(2.4mM)、乾燥ピ
リジン0.15ｍおよびジクロルメタン５ｍを５℃で装
填した。この混合物を周囲温度で一晩攪拌し、過して
ピリジンHClを除き、0.2NHClおよび水で洗浄し、そして
無水MgSO4で乾燥した。減圧下で溶媒を除去して褐色油
状の粗生成物600mgを得た。酢酸エチル／ヘキサンの
１：１混合展開溶媒を使用する分離用TLCにより澄明な
油状物600mg（92％）を得た。nmr(CDCl3)− 3.0(m,4H),4.20(m,4H),7.15(s,4H)。
Ｄ．ジアンモニウム〔４−（３−オキソ−4,4,4−トリ
フルオロブチル）フエニル〕ホスフェート アルゴン流入口および電磁攪拌機を備えた25ｍの１つ
口丸底フラスコにジクロルメタン5.0ｍ、ジエチル
〔４−（３−オキソ−4,4,4トリフルオロブチル）フエ
ニル〕ホスフエート140mg（0.4mM）およびブロモトリメ
チルシラン2.0ｍを装填した。この混合物を周囲温度
で３時間攪拌した後、メタノール10ｍを添加して揮発
性物質を減圧下に除去した。残留物を水に溶解し、1.0
ＮNaOHでpH7.3に調整した。その水溶液をエチルエーテ
ルで抽出し、凍結乾燥して白色固体190mgを得た。この
物質を３０mM NH4OAc緩衝液10ｍに溶解し、Ａ溶剤系
を使用するHPLCで精製した。凍結乾燥後の生成物の収量
は50mg（37％）であった。融点235〜240℃。nmr(D2O)− 2.56(m,2H),4.65(s,DOH),6.88(dd、4H)J＝6,82Hz。
実施例II １−ヒドロキシ−5,5−ジフルオロ−8,8−ジメチル−４
−ノナノン Ａ．2,2−ジフルオロ−5,5−ジメチルヘキサン酸エチル 滴下漏斗、アルゴン流入口、氷浴および電磁攪拌機を備
えた100ｍ３つの口丸底フラスコにジクロルメタン8.0
ｍおよび２−オキソ−5,5−ジメチルヘキサン酸エチ
ル2.21ｇ（20mM）を装填した。この反応混合物にジクロ
ルメタン５ｍ中の三フッ化ジエチルアミノ硫黄2.11ｇ
（13mM）を１５分間にわたって加え、この混合物を周囲
温度で一晩攪拌した。反応混合物は水とジクロルメタン
に分配し、有機層を無水MgSO4で乾燥し、そして溶媒を
減圧下に除去した。油状残留物を83〜88℃，20mmHgで蒸
留して目的生成物1.0ｇ（25％）を得た。nmr(CDCl3)− 1.40(m,4H),2.10(m,2H),4.35(q,2H) Ｂ．2,3,4,5−テトラヒドロ−２−オキソ−３−〔（5,5
−ジメチル−2,2−ジフルオロ−１−オキソ）ヘキシ
ル〕フラン 乾燥チューブ、滴下漏斗、加熱マントルおよび電磁攪拌
機を備えた25ｍ３つ口丸底フラスコに50％油分散体中
の水素化ナトリウム0.24ｇ（5.0mM）を入れた。水素化
ナトリウムを乾燥ヘキサン（２×10ｍ）で洗い、エチ
ルエーテル5.0ｍをフラスコに加えた。無水エタノー
ル５滴およびエーテル５ｍの混合物を水素化ナトリウ
ム懸濁液に徐々に加えた。水素の発生がやんだ後に、エ
チルエーテル5.0ｍ中の2,2−ジフルオロ−5,5−ジメ
チルヘキサン酸エチル1.0ｇ（5.0mM）およびγ−ブチロ
ラクトン0.43ｇ（5.0mM）の混合物を20分間にわたって
加えた。この溶液を３時間還流し、その後周囲温度で一
晩攪拌した。反応混合物は１ＮHClを用いて分配し、有
機層を水（２×50ｍ）で洗い、無水MgSO4で乾燥し、
そして減圧下に溶媒を除去した。油状残留物0.88ｇをヘ
キサン／酢酸エチル混合溶媒から結晶化させて0.66ｇ
（53％）を得た。nmr(CDCl3)− 1.35(m,2H),2.00(m,3H),2.50(m,2H),3.00(m,1H),4.25
(m,1H),4.5(m,1H)。 C.1−ヒドロキシ−5,5−ジフルオロ−8,8−ジメチル−
４−ノナノン アルゴン流入口、電磁攪拌機および還流冷却器を備えた
10ｍ１つ口丸底フラスコに氷酢酸1.0ｍ、濃HCl４滴
および2,3,4,5−テトラヒドロ−２−オキソ−３−（5,5
−ジメチル−2,2−ジフルオロ−１−オキソヘキシル）
フラン200mg(0.81mM)を装填した。この混合物をアルゴ
ン雰囲気下に110℃で一晩加熱した。反応混合物はエチ
ルエーテルで抽出し、そのエーテル層を水で洗浄し、無
水MgSO4で乾燥し、そして減圧下に溶媒を除去した。残
留物を10×60mmシリカゲルカラムクロマトグラフにか
け、ヘキサン／酢酸エチルの９：１混合溶媒で溶出して
澄明な油状物を得た。nmr(CDCl3)− 1.45(t,2H),2.00(m,6H),3.12(巾広,1H),4.15(m,1H)。
実施例III N,N−ジメチル−Ｎ−〔２−（ヒドロキシ）エチル〕−
5,5,5−トリフルオロ−４−オキソペンタンアミニウ
ム，ヒドロキシド塩 Ａ．2,3,4,5−テトラヒドロ−２−オキソ−３−〔（2,
2,2−トリフルオロ−1,1−ジヒドロキシ）エチル〕フラ
ン 還流冷却器、滴下漏斗、アルゴン流入口、電磁攪拌機お
よび加熱マントルを備えた３３つ口丸底フラスコに水
素化ナトリウムの50％油分散体36ｇ（0.75M）を入れ
た。水素化ナトリウムを乾燥ヘキサン（２×200ｍ）
で洗浄し、その後エチルエーテル800ｍおよび無水エ
タノール２ｍ中に懸濁した。この懸濁液にエーテル75
0ｍ中のγ−ブチロラクトン60.2ｇ（0.7M）およびト
リフルオロ酢酸エチル99.4ｇ（0.7M）の混合物を、穏や
かに還流しながら加えた。この混合物をさらに２時間還
流し、その後周囲温度で一晩攪拌した。反応混合物を氷
浴で冷却して、1N HCl250ｍを加えた。有機層を分離
し、水（２×200ｍ）で洗い、無水MgSO4で乾燥し、減
圧下に溶媒を除去した。残留物をヘキサン／酢酸エチル
から結晶化させて目的生成物64.0ｇ（45.4％）を得た。
融点87〜90℃。nmr(DMSO-d6)− 3.09(t,1H)J＝7Hz,4.20(m,2H),7.00(s,1H),7.52(s,1
H)。
Ｂ．1,1,1−トリフルオロ−５−ヒドロキシ−２−ペン
タノン 還流冷却器、加熱マントルおよび電磁攪拌機を備えた５
００ｍ３つ口丸底フラスコに2,3,4,5−テトラヒドロ
−２−オキソ−３−（2,2,2−トリフルオロ−1,1−ジヒ
ドロキシエチル）フラン61.5ｇ（0.31M）、濃HCl6.4ｍ
、水10ｍおよび酢酸80ｍを装填した。この反応混
合物を125℃で一晩加熱した。濃HCl3.0ｍおよび水5.0
ｍを追加してさらに１０時間加熱した。反応混合物は
水とエチルエーテルとに分配し、同時に水層を固体の炭
酸水素ナトリウム100ｇで中和した。エーテル溶液を水
（２×20ｍ）で洗い、無水MgSO4で乾燥し、減圧下に
溶媒を除去して淡黄色油状物60ｇ（45％）を得た。nmr
(CDCl3)− 4.03(m,1H),4.20(m,1H)。
Ｃ．1,1,1−トリフルオロ−５−ブロモ−２−ペンタノ
ン 滴下漏斗、電磁攪拌機、氷−塩浴、およびアルゴン流入
口を備えた500ｍ３つ口丸底フラスコに乾燥ジメチル
ホルムアミド125ｍ、トリブチルホスフィン29ｇ（35.
7mM）および1,1,1−トリフルオロ−５−ヒドロキシ−２
−ペンタノン11.2ｇ（54.9mM）を装填した。この混合物
を−５℃に冷却し、臭素11.5ｇ（71.6mM）を２時間にわ
たって滴下した。周囲温度で一晩攪拌後、反応混合物を
2.0mmHgの圧力で30cmビグリュー塔（vigreaux column）
を通して蒸留した。２つの分画：すなわち27〜35℃から
の第１分画および35〜70℃からの第２分画を集めた。第
２分画は水とエチルエーテルとに分配し、有機層を水
（３×100ｍ）で洗い、無水MgSO4で乾燥し、そして周
囲温度で減圧下に蒸発させてジメチルホルムアミド、エ
ーテルおよび目的生成物の無色油状混合物３０ｇを得、
これはさらに精製することなく次の反応に使用した。
Ｄ．N,N−ジメチル−5,5,5−トリフルオロ−４−オキソ
ペンタンアミン 滴下漏斗、アルゴン流入口、電磁攪拌機および氷−塩浴
を備えた500ｍ３つ口丸底フラスコに−８℃で無水ジ
メチルアミン21.5ｇ（0.45M）を入れた。この混合物に
−10℃でジメチルホルムアミドおよびエチルエーテル中
の1,1,1−トリフルオロ−５−ブロモ−２−ペンタノン1
9.4ｇ（88.5mM）を滴下した。この懸濁液を−10℃で2.5
時間攪拌した。その後沈殿物から溶媒をデカンテーショ
ンした。この沈殿物をエチルエーテル（３×200ｍ）
で洗い、有機層を合わせ、水（２×30ｍ）で洗い、無
水MgSO4で乾燥し、減圧下に蒸発させて淡黄色油状物15.
0ｇ（92％）を得た。HCl塩のnmr(CDCl3)-1.89(s,4H),2.
90(s,6H),3.21(t,2H)。
Ｅ．N,N−ジメチル−Ｎ−〔２−（メトキシ）エチル〕
−5,5,5−トリフルオロ−４−オキソペンタンアミニウ
ム、ヒドロキシド塩 25ｍ１つ口丸底フラスコに２−ブロモエチルメチルエ
ーテル2.95ｇ（21.2mM）、N,N−ジメチル−（5,5,5−ト
リフルオロ−４−オキソペンタンアミン）0.33ｇ（1.77
mM）、およびジメチルホルムアミド2.5ｍを装填し、
この混合物を周囲温度で３日間攪拌した。溶媒を減圧下
に除去し、琥珀色油状物はOH形のダウエックス−１（15
×200mm）カラムでクロマトグラフにかけ、水200ｍで
溶出した。カラムからの溶出液を凍結乾燥して琥珀色油
状のヒドロキシド塩としての生成物0.28ｇ（60％）を得
た。nmr(D2O)-1.94(m,2H),3.13(s,6H),3.39(s,3H),3.41
(m,2H),3.60(m,2H),3.88（巾広，2H）。この物質はこれ
以上精製することなく次の反応に使用した。
Ｆ．N,N−ジメチル−Ｎ−〔２−（ヒドロキシ）エチ
ル〕−5,5,5−トリフルオロ−４−オキソペンタンアミ
ニウム、ヒドロキシド塩 アルゴン流入口および還流冷却器を備えた10ｍ丸底フ
ラスコにN,N−ジメチル−Ｎ−〔２−（メトキシ）エチ
ル〕−5,5,5−トリフルオロ−４−オキソペンタンアミ
ニウム、ヒドロキシド塩0.275ｇ（1.1mM）、水4.0ｍ
および酢酸中30％HBr8.0ｍを装填した。この混合物を
120℃で５時間加熱し、冷却し、そして減圧下に溶媒を
除去した。残留物は３×20ｍの水と共に同時蒸留し、
得られた油状物をＯＨ形のダウエックス−１（15×200m
m）カラムでクロマトグラフにかけた。溶出液は減圧下
に蒸発させてヒドロキシド塩としての生成物0.17ｇ（63
％）を得た。nmr(D2O)-1.90(m,4H),3.13(s,6H),3.30(s,
2H),3.48(m,2H),4.01（巾広，2H）。
実施例IV N,N−ジメチル−Ｎ−〔２−（ホスホノオキシ）エチ
ル〕−5,5,5−トリフルオロ−４−オキソペンタンアミ
ニウム、アンモニウム塩 滴下漏斗、アルゴン流入口、電磁攪拌機、および氷−塩
浴を備えた10ｍ３つ口丸底フラスコにオキシ塩化リン
0.093ｍ（1.0mM）およびリン酸トリメチル0.5ｍを
装填した。この混合物に−10℃でN,N−ジメチル−Ｎ−
〔２−（ヒドロキシ）エチル〕−5,5,5−トリフルオロ
−４−オキソペンタンアミニウム、ヒドロキシド塩70.0
mg（0.2mM）を滴下した。この混合物を３０分間攪拌
し、その後冷凍庫内に一晩置いた。この混合物をエチル
エーテル、次に石油エーテル（４×50ｍ）で細かくす
りつぶし、樹脂状の沈殿物を得た。この沈殿物を氷で覆
い、1N NaOHでpH6.0に中和し、そして減圧下に蒸発乾固
させた。得られた固体107mgを30mM NH4OAc緩衝液（pH7.
0）に溶解し、Ｂ溶剤系を用いてHPLCで精製した。12分
で溶出した生成物は緩衝液の凍結乾燥により単離して無
色の樹脂9.0mg（11％）を得た。nmr(D2O)− ３．１４（ｓ，６Ｈ），３．４２（ｍ，２Ｈ），３．６
０（ｍ，２Ｈ），４．１９（巾広，2H）。
実施例Ｖ アデノウイルスからのヘキソン抗原の半サンドイッチア
ッセイ 一般方法： 精製したアデノウイルスヘキソンタンパク質の２倍連続
希釈物は、pH9.5の炭酸塩緩衝液（10mM）中で１〜18時
間かけてポリ塩化ビニル製マイクロタイターウエルに被
覆した。このプレートはリン酸緩衝溶液中の0.05％ポリ
オキシエチレンソルビタン モノラウレートから成る溶
液で数回すすいだ。免疫反応は10％培地（ウシ胎児血清
含有）中適当な濃度に希釈したアルカリ性ホスファター
ゼ結合抗体（マウス抗ヘキソンIgG）を用いて行った。
１時間インキュベーションしてすすいだ後、遮断モジュ
レーター（10-3〜10-4Ｍ）およびRLE(10-8〜10-9Ｍ）の
混合物を加え、プレートを10〜60分間プレインキュベー
ションした。この混合物に色原体基質（すなわちインド
キシルブチレートまたは酪酸ｏ−ニトロフエニル）を加
えた。発色は一般に１５分以内におこり、過剰の遊離モ
ジュレーターの添加により発色はさらに長時間安定化さ
れるであろう。１ng／ｍのヘキソンタンパク質を含む
希釈物を被覆したウエルはこの系で陽性の応答を与え
た。
実施例VI アデノウイルスのサンドイッチアッセイ ポリ塩化ビニル製マイクロタイタープレートは、10mM炭
酸塩−20mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）緩衝液中の
抗体の4.5mg／ｍ原液の１：900希釈物中で37℃におい
て１時間そのプレートをインキュベーションすることに
より、抗アデノウイルス抗体で被覆した。このプレート
を10mMトリス−154mM NaCl(pH7.6)中の0.5％カゼインか
ら成る洗浄緩衝溶液で３回洗った。0.05％ポリオキシエ
チレンソルビタンモノラウレート、0.1mg／ｍゲンタ
マイシン、0.5％フェノールレッド、0.1％ウシ血清アル
ブミン、10mM EDTAおよび100mMエチレンビス（オキシエ
チレンニトリロ）四酢酸を含有するリン酸緩衝溶液（pH
7.4）中約１×105プラーク形成単位（PFU）／ｍに希
釈したアデノウイルス感染ヒーラ細胞（HeLa cell）は
プレートの一端から他端まで２倍の希釈率で連続希釈し
た。プレートを上記のようにインキュベーションして細
胞を抗体に結合させ、洗浄緩衝液で洗い、そして0.5％
ゼレチンおよび10％不活化ウシ胎児血清を含有する洗浄
緩衝液中のアルカリ性ホスファターゼ結合抗アデノウイ
ルスの0.005mg／ｍトレーサー溶液とインキュベーシ
ョンした。過剰のトレーサー溶液をデカンテーション
し、プレートをトリス緩衝液（カゼイン不含）で３回洗
浄した。50mMトリス緩衝液（pH8.5）中の実施例Ｉから
の遮断阻害剤の１×10-4Ｍ溶液および５×10-9ＭRLEの
混合物を加え、そのプレートを室温で10分間インキュベ
ーションした。その後プレートの各ウェルに酪酸ｏ−ニ
トロフエニル（１mM）を添加した。
抗原を含まない対照ウェルは一般に約１５分で肉眼によ
り検出可能な色を示し、そして遊離阻害剤（実施例Ｉか
らの生成物Ｂ）を対照ウェルに添加すると１５分より長
い間発色が阻害された。抗原希釈物を含む試験ウェルは
１５分以上の間無色のままであった。
図面は色原体添加の２０後にベックマンDU7スペクトロ
フォトメーターで測定したときの抗原濃度に対する発色
の関係を示すものである。対照ウェル中の溶液の光学密
度(OD)は実質的に約0.24で一定であるが、試験ウェル中
の溶液のODは抗原濃度に反比例し、極めて低い抗原濃度
では対照値に近づくことが分かる。
要約すると、本発明は非常に低い濃度で液体試料中に存
在するリガンドの検出または測定方法を提供する。リガ
ンド、抗リガンドおよびトレーサーを結合させた後、そ
の結合相を分離して第２酵素および遮断モジュレーター
と接触させ、それによりトレーサーの第１酵素成分で遮
断基を除去して第２酵素のモジュレーターを形成させ
る。そのモジュレーターは検出可能な信号へ導く第２酵
素による基質の生成物への転化反応に影響を及ぼす。信
号の検出は試料中のリガンドの有無を証明する。信号の
強度を測定することにより、リガンドの濃度を決定し得
る。モジュレーターおよび第２酵素は２つの増幅段階を
与え、それにより信号は106倍またはそれ以上まで増幅
され、そして肉眼による信号の検出が通常のEIAよりも1
00倍まで短縮された時間で可能となる。
【図面の簡単な説明】
図面は本発明の方法および物質を使用する代表的アッセ
イの結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/44 6807−4Ｂ 1/46 6807−4Ｂ (56)参考文献 特表 昭56−501463（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、24、 （1985）、Ｐ．1813〜1817

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】(a)リガンドを含む疑いのある第１液体
    を、第１抗リガンドおよび下記遮断フルオロケトンの遮
    断を解離し、かつ、第２抗リガンドに結合している第１
    酵素を含有するトレーサーと接触させ、それにより、サ
    ンドイッチアッセイの様式で第１抗リガンドおよびトレ
    ーサーをリガンドと結合させて結合相を形成し； (b)該結合相を第１液体から分離し； (c)該結合相を、第２酵素および遮断フルオロケトンを
    含む第２液体と接触させ、該遮断フルオロケトンを第１
    酵素によりフルオロケトンに転化して第２液体中に該フ
    ルオロケトンを放出させ； (d)該第２液体に第２酵素用の基質を加え、第２酵素に
    よる該基質の生成物への転化反応を上記フルオロケトン
    で阻害し；そして (e)上記転化反応に関連した信号により上記リガンドを
    検出する； 工程からなる液体中のリガンドの検出方法。
  2. 【請求項２】工程(a)において、第１抗リガンドが担体
    に固定され、かつ上記結合相が担体上に形成されること
    を特徴とする、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】第１酵素または第２酵素のいずれか一方が
    ヒドロラーゼである、特許請求の範囲第１項または第２
    項記載の方法。
  4. 【請求項４】ヒドロラーゼがアルカリ性ホスファターゼ
    である、特許請求の範囲第３項記載の方法。
  5. 【請求項５】ヒドロラーゼがアセチルコリンエステラー
    ゼ、ブチルコリンエステラーゼ、カルボキシエステラー
    ゼ、トリプシン、キモトリプシンおよびペプシンからな
    る群から選択される、特許請求の範囲第３項記載の方
    法。
  6. 【請求項６】工程(a)の「リガンド」が「抗原」であ
    り、「第１抗リガンド」が「第１抗体」であり、「第２
    抗リガンド」が「第２抗体」であり、第１酵素がアルカ
    リ性ホスファターゼであり、第２酵素がエステラーゼで
    あり、第２酵素の基質が色原体であり、そして「転化反
    応に関連した信号」が「発色の形成」であることを特徴
    とする、特許請求の範囲第１項または第２項記載の方
    法。
  7. 【請求項７】(a)リガンドを含む疑いのある第１液体
    を、第１抗リガンドおよび下記遮断フルオロケトンの遮
    断を解離し、かつ、第２抗リガンドに結合している第１
    酵素を含有するトレーサーと接触させ、それにより、サ
    ンドイッチアッセイの様式で第１抗リガンドおよびトレ
    ーサーをリガンドと結合させて結合相を形成し； (b)該結合相を第１液体から分離し； (c)該結合相を、第２酵素および遮断フルオロケトンを
    含む第２液体と接触させ、該遮断フルオロケトンを第１
    酵素によりフルオロケトンに転化して第２液体中に該フ
    ルオロケトンを放出させ； (d)該第２液体に第２酵素用の基質を加え、該第２酵素
    による該基質の生成物への転化反応を上記フルオロケト
    ンで阻害し； (e)上記転化反応に関連した信号により上記リガンドを
    検出し；そして (f)上記工程(a)〜(e)で得られた信号強度を、既知量の
    リガンドを含む液体試料を用いて上記工程(a)〜(e)を繰
    り返したときの生成物の信号強度と比較する； 工程からなる、上記第１液体中のリガンドの濃度を測定
    する方法。
  8. 【請求項８】(a)リガンドを含む疑いのある第１液体
    を、抗リガンドおよび下記遮断フルオロケトンの遮断を
    解離し、かつ、検出すべきリガンドと同じリガンドに結
    合している第１酵素を含有するトレーサーと接触させ、
    それにより、競合的アッセイの様式でリガンドまたはト
    レーサーを上記抗リガンドと結合させて結合相を形成
    し； (b)該結合相を第１液体から分離し； (c)該結合相を、第２酵素および遮断フルオロケトンを
    含む第２液体と接触させ、該遮断フルオロケトンを第１
    酵素によりフルオロケトンに転化して第２液体中に該フ
    ルオロケトンを放出させ； (d)該第２液体に第２酵素用の基質を加え、第２酵素に
    よる該基質の生成物への転化反応を上記フルオロケトン
    で阻害し；そして (e)上記転化反応に関連した信号により上記リガンドを
    検出する； 工程からなる液体中のリガンドの検出方法。
  9. 【請求項９】工程(a)において、抗リガンドが担体に固
    定され、かつ上記結合相が担体上に形成されることを特
    徴とする、特許請求の範囲第８項記載の方法。
  10. 【請求項１０】「リガンド」が「抗原」であり、「抗リ
    ガンド」が「抗体」であり、第１酵素がアルカリ性ホス
    ファターゼであり、第２酵素がエステラーゼであり、第
    ２酵素の基質が色原体であり、そして「転化反応に関連
    した信号」が「発色の形成」であることを特徴とする、
    特許請求の範囲第８項または第９項記載の方法。
  11. 【請求項１１】(a)リガンドを含む疑いのある第１液体
    を、抗リガンドおよび下記遮断フルオロケトンの遮断を
    解離し、かつ、検出すべきリガンドと同じリガンドに結
    合している第１酵素を含有するトレーサーと接触させ、
    それにより、競合的アッセイの様式でリガンドまたはト
    レーサーを上記抗リガンドと結合させて結合相を形成
    し； (b)該結合相を第１液体から分離し； (c)該結合相を、第２酵素および遮断フルオロケトンを
    含む第２液体と接触させ、該遮断フルオロケトンを第１
    酵素によりフルオロケトンに転化して第２液体中に該フ
    ルオロケトンを放出させ； (d)該第２液体に第２酵素用の基質を加え、該第２酵素
    による該基質の生成物への転化反応を上記フルオロケト
    ンで阻害し； (e)上記転化反応に関連した信号により上記リガンドを
    検出し；そして (f)上記工程(a)〜(e)で得られた信号強度を、既知量の
    リガンドを含む液体試料を用いて上記工程(a)〜(e)を繰
    り返したときの生成物の信号強度と比較する； 工程からなる、上記第１液体中のリガンドの濃度を測定
    する方法。
  12. 【請求項１２】一般式Ｉ，IIおよびIII： ［式中Ｒ1はＨ、炭素原子数１〜６の直鎖または分枝鎖
    低級アルキル、または であり； Ｒ2は炭素原子数１〜６の低級アルキルであり；Ｒ3は
    Ｈ，ニトロ、アルコキシまたはハロゲンであり；Ｙおよ
    びＺは独立にＨまたはＦであるが、その際ＹおよびＺの
    少なくとも一方はＦであり；ＸはＯ，ＳまたはＮＲ
    5（ここでＲ5はＨまたはＲ2である）であり；ｎは１〜
    ６であり；ｍは２〜６であり；ＡはＦまたはＣＦ3であ
    り；そしてＢはリン酸またはその塩、グリコシル基、ア
    ミノ酸のカルボキシル基を介してＸに共有結合されたア
    ミノ酸残基、炭素原子数２〜４のアシル基、または次式
    のペプチド： であり、ここでＲ6は（ＣＨ2）4ＮＨ2、（ＣＨ2）3− またはベンジルであり：Ｒ7はＨまたは炭素原子数１〜
    ６の直鎖または分枝鎖低級アルキルであり：Ｒ8はＨ、
    炭素原子数１〜４の直鎖または分枝鎖低級アルキルまた
    はヒドロキシ低級アルキル、ＣＨ2ＣＯＯＨまたは（Ｃ
    Ｈ2）2ＣＯＯＨであり：Ｒ9は炭素原子数１〜４の直鎖
    または分枝鎖低級アルキルまたは低級アルコキシ、フェ
    ニルまたはベンジルオキシであり；ｑは０〜10であり：
    そして前記のリン酸またはその塩は次式： （式中ＰはＸに結合され、ｎは前に定義したとおりであ
    る）で表される］よりなる群から選ばれる、遮断された
    酵素阻害剤。
  13. 【請求項１３】特許請求の範囲第12項記載の一般式Ｉ，
    IIおよびIIIの式中、Ｒ1はｔ−ブチルまたは であり；Ｒ2は炭素原子数１〜６の低級アルキルであ
    り；Ｒ3はＨであり；ＸはＯであり；ＹおよびＺは独立
    にＨまたはＦであるが、その際ＹおよびＺの少なくとも
    一方はＦであり；ｍは２〜３であり；ｎは１〜３であ
    り；ＡはＦであり；そしてＢはグリコシル基または次
    式： のリン酸またはその塩である、特許請求の範囲第12項記
    載の、遮断された酵素阻害剤。
  14. 【請求項１４】検出すべきリガンドに対する第１抗リガ
    ンド； 下記遮断フルオロケトンの遮断基を除去する第１酵素、
    および該第１酵素に結合している、検出すべきリガンド
    に対する第２抗リガンドからなるトレーサー； 遮断基が除去されることにより酵素阻害剤として機能す
    るが、上記第１酵素には本質的影響を及ぼさない遮断フ
    ルオロケトン； フルオロケトンにより活性が阻害される第２酵素；およ
    び 上記第２酵素の基質； からなるリガンド検出用キット。
  15. 【請求項１５】第１抗リガンドが担体に固定されてい
    る、特許請求の範囲第14項記載のキット。
  16. 【請求項１６】抗原、抗体および抗体複合体、緩衝液お
    よび食塩水からなる試薬群から選ばれる少なくとも１種
    の他の試薬をさらに含む、特許請求の範囲第14項または
    第15項記載のキット。
  17. 【請求項１７】検出すべきリガンドに対する抗リガン
    ド； 下記遮断フルオロケトンの遮断基を除去する第１酵素、
    および該第１酵素に結合している、検出すべきリガンド
    と同じリガンドからなるトレーサー； 遮断基が除去されることにより酵素阻害剤として機能す
    るが、上記第１酵素には本質的影響を及ぼさない遮断フ
    ルオロケトン； フルオロケトンにより活性が阻害される第２酵素；およ
    び 上記第２酵素の基質； からなるリガンド検出用キット。
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