JPH02279698A

JPH02279698A - 血管内皮細胞成長因子及びその製造方法

Info

Publication number: JPH02279698A
Application number: JP1098931A
Authority: JP
Inventors: Kyoko Furukawa; 古川　教子
Original assignee: M K MEDICAL KK
Current assignee: M K MEDICAL KK
Priority date: 1989-04-20
Filing date: 1989-04-20
Publication date: 1990-11-15

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は新規な血管内皮細胞成長因子及びその製造方法
に関する。

〔従来の技術〕

現在までに血管内皮細胞成長因子として数多くのものが
報告されている。しかし、その構造が明らかにされ、か
つ確実に血管内皮細胞に対して増殖作用を有するものは
塩基性線維芽細胞成長因子（Ｂａｓｉｃ　Ｆｉｂｒｏｂ
ｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　；塩基性ＦＧ
Ｆ　）及び酸性ＩＩ維芽細胞成長因子（＾ｃｉｄｉｃ　
ＦｉｂｒｏｂｔａｓＬＧｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　；
酸性ＦＧＦ　）の２種類のみである。

塩基性ＦＧＦは最初は牛の脳下垂体より分離され、その
機種々の組織や細胞、例えば脳や脳下垂体等の神経組織
、網膜、副腎、黄体、腎臓、マクロファージなどにふい
ても産生されていることがわかり、脳組織からも分離さ
れるようになった。当初はその名が示す如く線維芽細胞
（３Ｔ　３　ｃｅｌｌ）に対して増殖活性を示すことか
ら、その使用の目的で分離されていたが、その後、血管
内皮細胞、副腎細胞等の中胚菓起源の多くの細胞に対し
ても増殖促進活性を示すことが判明し、極めて特異性の
乏しい増殖因子であることが明らかとなった。またこの
塩基性ＰＧＦはｉｎ　ｖｉｖｏのテストで血管内皮細胞
増殖促進作用とともに血管内皮細胞の機能調節も行なう
ことが知られている。更に多くの腫瘍細胞が塩基性ＦＧ
Ｆを産生じていることが報告されてあり、いわゆる腫瘍
血管新生因子である可能性も示唆されている。

塩基性ＦＧＰのｃＤＮ＾は既にクローニングされており
、塩基性ＰＧＰは９個のアミノ酸よりなるリーダーペプ
チドを有し、その後に１４６個のアミノ酸よりなるペプ
チドが連なる構造を有していることが知られている。一
方、組織から分離された塩基性ＦＧＦには、Ｎ末端が１
番目又は６番目のアミノ酸から始まる２種類の構造のも
のが存在する。

更に塩基性ＰＧＦはヘパリンに対して強い親和性を有し
、ヘパリンと５５％のアミノ酸レベルでの相同性を示し
、ヘパリンアフィニティーカラムクロマトを用いて分離
することができる。またインターロイキン−１とも弱い
相同性を示す。

酸性ＦＧＦは当初Ｍａｃｉｎｇにより内皮細胞成長因子
（Ｂｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　
Ｆａｃｔｏｒ　；　ＢＣＧＦ）として牛の神経組織より
分離された。その後ＢＣＧＦには酸性のＥＩＣＧＦと塩
基性のＢＣＧＦとが存在し、さらにそれらはＧｒｏｓｐ
ｏｄａｒｏｗｔｚらが分離した２種のＦＧＦ　。

すなわち前述の塩基性ＦＧＦ並びに酸性ＰＧＦとに対応
することが判明した。酸性ＦＧＦはまた（ａｙｅ−ｄｅ
ｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　　ｆａｃｔｏｒＩＩ　）及
び（ａ　−ｒｅｔｉｎａ　−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗ
ｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　）などとも同一のものであること
が・わかっている。酸性ＦＧＦは前述の塩基性ＦＧＦと
類似の物質であり、ヘパリンに対して強い親和性を示し
、ヘパリンアフィニティーカラムクロマトにより容易に
分離される。しかし、酸性ＦＧＦの血管内皮細胞増殖作
用はヘパリンの存在下で促進されるのに対し、塩基性Ｆ
ＧＦの作用はヘパリン存在の有無で影響を受けないこと
や、酸性ＦＧＦは塩基性ＦＧＦと異なって神経組織のみ
に存在することが知られている。

ヒト酸性ＦＧＦのｃＤＮ八は１５５個のアミノ酸をコー
ドする。一方、純化された牛の酸性ＦＧＦは１０番目の
Ｐｈｅから始まるアミノ酸組成を有しくαＦＧＦ−１．
β−ＥＩＣＧＦ）　、また２２番目のＡｓｎから始まる
アミノ酸組成のもの（αＦ　Ｇ　ｔｉ−２、α［ＩＣＧ
Ｆ）　も報告されていて、明らかなシグナルペプチドは
認められていない。α−ＦＧＦはインターロイキン−１
と約３０％の相同性を示すほか、ニューロメリン、ボウ
ベシン、サブスタンスになどとも相同性を有している。

〔発明が解決しようとする課題〕

血管内皮細胞成長因子は、動脈硬化等の血管性の病気に
対し、治療薬として期待される他、臨床検査用試薬や研
究用試薬として重要なものである。

そこで、新規な血管内皮細胞成長因子及びこれを効率よ
く得る技術の開発が熱望されていた。

〔課題を解決するための手段〕

斯かる実状において、本発明者は上記課題を解決すべく
鋭意研究を行った結果、人手の容易なヒト胎盤の培養上
清より得られた物質が、優れた血管内皮細胞の増殖促進
活性を有し、新規な血管内皮細胞成長因子であることを
見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は次の理化学的性質を有する血管内皮
細胞成長因子及びその製造方法を堤供するものである。

（イ）分子量ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法による測定で約４５．０００（ロ）下記のアミノ
酸組成を有する。

アミノ酸　　　　　　１００残基当りの含有量アスパラ
ギン酸（Ｄ）　　　　　６．２トレオニン（Ｔ）　　　
　　　　　３．５セリン（Ｓ）　　　　　　　　６．１グル９ミ”ＪＨ＜Ｅ）　　　　　　１１．５プロリン　
（Ｐ）　　　　　　　　　８．２グリシン（Ｇ）　　　
　　　　１１．７アラニン（Ａ）　　　　　　　　１３
．２システイン（％）　　（Ｃ）　　　　　２．５ヴア
リン　（Ｖ）　　　　　　　　　　６．９メチオニン（
Ｍ）　　　　　　　　１．５イソロイシン（１）　　　
　　　　２．４０イシン（Ｌ）　　　　　　　　１４．
５フエニルアラニン（Ｆ）　　　　　１．４ヒスチジン
（Ｈ）　　　　　　　　１．２リジン（Ｋ）　　　　　
　　　　２．５アルギニン（Ｒ）６．６（ハ）Ｎ末端またはＮ末端近傍に下記のアミノ酸配列の
部分構造を有する。

ＡＰＰＡＰＧＤＦＳＧＥＧ本発明の血管内皮細胞成長因子（以下、「本発明因子」
と称する）は、例えばヒト胎盤を無血清培地にて培養し
、その培養上清を ■　硫酸アンモニウム沈澱、 ■　陰イオン交換クロマトグラフィー ■　ゲル濾過、 ■　ハイドロキシアパタイトゲルクロマトグラフィー、
次いで ■　アルキルスーパーロースカラムクロマトグラフィー
に付し、血管内皮細胞の増殖促進活性を有する画分を採
取することにより製造される。

本発明におけるヒト胎盤の培養は、通常のヒト組織の培
養と同様の条件で実施することができる。

培地は無血清培地であり、特にダルベツコ改変イーグル
培地とハムのＦ１２培地との等量混合液にインスリン１
μｇ／ｍｌ、）ランスフェリン１μｇ／ｍ！、上皮細胞
成長因子１０　ｎｇ／　ｍｌ及び抗生物質を加えた培地
が好ましい。ここで抗生物質としてはベニリシンカリウ
ム、アムホテリシンＢ１ゲンタマイシンなどが挙げられ
る。培養温度は３６〜３７．５℃が、また、培地のＰＨ
は６．８〜７．５が好ましい。更に培養方法としては静
置培養が好ましい。培養は通常３日毎に培養上清を一部
回収しながら、継続するのが好ましい。

次に得られた培養上清から本発明因子を採取する方法を
説明する。まず、培養上清を限外濾過器にて約２．００
０〜５．０００倍に濃縮した後、この上清に硫酸アンモ
ニウム（５０％）を加えて沈澱物を分取する。これを隘
イオン交換クロマトグラフィー担体に吸着せしめ、塩化
ナトリウム濃度勾配で分画する。ここで、陰イオン交換
クロマトグラフィー担体としては、ＤＢＡＩＥセファロ
ース等が挙げられる。

次に、得られた画分をトリス塩酸＆ｌ衡液に対して透析
し、凍結乾燥後高速液体クロマトグラフィー装置に装着
したゲル濾過（実効分画範囲ｉ、　ｏｏ。

〜３００．０００ダルトン）に付す。

更に、高速液体クロマトグラフィー装置に装置したハイ
ドロキシアパタイトゲルクロマトグラフィーに付してリ
ン酸塩の濃度勾配で分画する。次いで硫酸アンモニウム
溶液中で疎水クロマトグラフィーであるアルキルスーパ
ー痣−スゲルに吸着させ、硫酸アンモニウムの濃度を徐
々に低下せしめて溶出させ、血管内皮細胞成長因子活性
画分を回収し、説塩して凍結乾燥を行なえば、本発明因
子を得ることができる。

尚、本発明に用いた血管内皮細胞成長因子の活性の測定
法は次の通りである。ヒト請書静脈または豚大動脈の血
管を切除後両端を糸で納札し、内腔に０．２％コラ−ゲ
ナーゼ液（ワーシントン社製、ハムのＦ１２培地で溶解
）を注射器で注入し、３０〜９０分、３７℃でインキュ
ベートした後、注入したコラ−ゲナーゼ液を回収し、遠
心分離（１００ｘｇ）で遠心して、血管内皮細胞を得る
。得られた血管内皮細胞をＦ１２培地に１０％牛脂児血
清及び線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）５μｇ／ｒｎｌ加
えた培地に分散して、３７℃５％炭酸ガスインキュベー
ターで培養する。このようにして得られた血管内皮細胞
を０．２５％トリプシン溶液（ギブコ社製）で常法によ
り分散させて、遠心分離で回収した後に０゜５％牛脂児
血清を添加したハムのＦ１２に分散して、２４穴の培養
プレート（ファルコン社製）の各ウェルに５Ｘ１０３個
（１，０ｍ１）ずついれて、３７℃５％炭酸ガスインキ
ュベーターで２４時間培養する。２４時間後、各ウェル
に測定試料を入れ、更に１６時間３７℃で５％炭炭酸ガ
スインユニベーター培養する。更に１６時間後にトリチ
ウムＭＡ識サイミジンにューングランドニュクリアー社
製）を０．５μＣｉずつ各ウェルに入れ、更に４時間同
じ条件で培養する。培養後、各ウェルに４℃に冷やした
１０％トリクロル酢酸を１、ｏｍｉずつ加え１時間常温
に放置する。各ウェルより液体をすてて、更につ′エル
を５％トリクロル酢酸で洗浄し、乾燥後１規定の水酸化
ナトリウム溶液を加え、１０分間放置後１規定の塩酸で
中和後、その一定量をとって１０倍量のアクアゾールを
加えて液体シンチレーションカウンターで放射活性を測
定し、各ウェル内の血管内皮細胞のＤＮＡ合成促進活性
を測定し、これを血管内皮細胞の増殖促進活性（血管内
皮細胞成長因子の活性）とした。

斯くして得られた本発明因子の性質は以下の通りである
。

（イ）分子量分子量は約４５．０００である。

精製した本発明因子はドデシル硫酸す）　ＩＪウムーポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、分子量
を測定すると、４５．０００付近の単一バンドを示す。

（ロ）アミノ酸組成本発明因子のアミノ酸分析をした結果を下記第１表に示
す。

第　　１　　表（ハ）アミノ酸配列Ｎ末端またはＮ末端近傍に下記のアミノ酸配列の部分構
造を有する。

ＡＰＰＡＰＧＤＦＳＧＥＧ（ニ）等電点等電点はｐｌ＋４．０〜４．８を示す。

（ホ）温度安定性０〜５６℃で安定、７０℃以上で失活。

（へ）　ｐＨ安定性ｐＨ５〜９で安定、２１１３以下で失活。

（ト）酵素に対する安定性トリプシン、プロナーゼで失活、ＲＮ、、ｓ、、ノイラ
ミニダーゼでは失活せず。

（チ）酵素に対する安定性ヘパリンに親和性を示さず、線維芽細胞の増殖は促進し
ない。また、ジチオスレイトールなどにより還元処理を
行なっても活性を失なわない。

〔実施例〕

以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に表明する。

実施例１ヒト胎盤の初代培養正常満期産の胎盤を無菌的にはさみで２〜３　ｍ＋ａ角
に細切し、培養液（ダルベツコ改変イーグル培地とハム
のＦ１２培地の等量混合液にインスリン１、ｕｇ／ｍｆ
、トランスフェリンｌｕｇ／ｍｊ’、上皮細胞成長因子
＜ＥＧＦ）　　１０ｎｇ／　ｔｒ＃ｌ、ペニシリンカリ
ウム１００単位／ｍｌ、アムホテリシン８２μｇ／ｍｉ
！、ゲンタマイシン５０ｔｔｇ／ｍａｌを加えたもの）
で洗浄し、組織片１００ｇに対し培養液１βを加えて３
７℃で炭酸ガスインキュベーター　（炭酸ガス濃度５％
、湿度１００％）中にて３日間インキュベートした後に
、半量だけ培養液を交換した。更に３日毎に３回培養液
を交換し、採取した培養液は一２０℃に保存した。培養
器はプラスチックのフラスコ（培養面積１５０ｃｆｆｌ
）に培養液１０ｍｊ！を入れて用いた。

実施例２胎盤由来血管内皮細胞成長因子の単離上述のごとくして得られた培養上清５０１のホロファイ
バー装置（旭化成社製）　八Ｉｈ−１０１０にて約３０
倍に濃縮し、更にこれをベリコンラボカセットにＰＴＩ
Ｏ９０００フィルター（ミリポア社Ｉｌ）をつけた装置
にて１００倍に濃縮した後にこれを以下の順序で精製し
た。

（１）硫酸アンモニウム沈澱硫酸アンモニウム（５０％）を加え、ρ１１を７．０に
保ったまま４℃で３時間放置後、３０００Ｘ　ｇで２０
分間遠心分離し、沈渣を集めて０．０２％ツイーン２０
及び０．０２％窒化アジドを加えたトリス塩酸緩衝液（
０，ＯＬＭ、　ｐＨ７，２）　５０　　ｍｊ！にて溶解
した。

（２）　　陰イオン交換クロマトグラフィー硫酸アンモ
ニウム沈澱で得られた活性画分をＤＢ八へセファ０−ス
ＣＬ−６Ｂカラム（５（１ｍｆ！。

ファルマシア社製）に吸着させ、トリス塩酸塩緩衝液（
０，ＯＩＭ、ｐＨ７，２）　　１５０　　ｍｌでカラム
を洗浄後、塩化ナトリウムの濃度勾配を０〜３０〇−Ｍ
まで直線的に上昇させることで溶出を行った。

溶出は毎分２．５＋ｎｆで４℃で行った。活性画分は１
００〜１５０ｍＭの塩化ナトリウム濃度の位置に対応し
て得られた。

（３）ゲル濾過ＯＦ！ＡＨセファロースクロマトグラフィーで得られた
活性画分をトリス塩酸塩緩衝液（［］、　０１　Ｍ、　
ｐｔ１７．２）に対し透析し、更に凍結乾燥後、蒸留水
１００　　ｍｌに溶解し、スーパーロース１２カラム（
ＨｆｌｌＯ／３０、ファルマシア）にゲル濾過クロマト
グラフィーに付した。緩衝液はトリス塩酸塩緩衝液（０
，０１Ｍ、ｐＨ７，２）で１５０ｄの塩化す１−　ＩＪ
ウムを含む、又カラム流速は５００μｌ／ｒｏｌｌであ
った。カラムのキカリブレーションはあらかじめ牛血清
アルブミン（分子ｉ６７、ｏｏＯ）　、オボアルブミン
（分子量４５．０００）　、チトクロームＣ（分子、１
１１２．４００）にて行った。活性画分は分子量的４５
、０００の位置に認められた。

（４）　　ハイトロキシルアパタイトクロマトグラフィ
ゲル濾過クロマトグラフィーで得られた活性画分を更に
高速液体クロマトグラフィー装置につけたハイトロキシ
ルアパタイトカラム０．７８２５　ｍ＋ｅ（東亜燃料）
０．５ｍ／ｍｎにて４℃（０，５ｍＭリン酸塩緩衝液）
に吸着させ、リン酸塩の温度を０．５→５０ｍＭまで直
線的に勾配をかけて溶出させた。活性画分は約４０ｍＭ
のリン？Ｉｌ！２濃度に一致して溶出された。

（５）　　アルキルスーパーロースカラムクロマトグラ
フィーハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィーで得られ
た活性画分を、更に硫酸アンモニウム（２Ｍ）にてアル
キルスーパーロースカラム（ファルマシア社製）に結合
させ、これを１．２Ｍから０．５Ｍまでの硫酸アンモニ
ウムの濃度勾配で溶出させると約０６９Ｍの位置に活性
画分が得られる。

この両分を脱塩し、凍結乾燥したものを最終標品とした
。

実施例３理化学的性質実施例２で得た本発明の血管内皮細胞成長因子の理化学
的性質を調べるために以下の分析を行った。

（１）分子量ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（５Ｏ５−ＰＡＧＩＥ）により分析した。電気泳動
装置はＧＥ２／４　　（ファルマシア社製）ゲルはＴ＝
１５％、Ｃ＝２．６％のポリアクリルアミドスラブゲル
（７０市ｘ？０酎Ｘ３ｍｍ）及び濃縮ゲル（Ｔ＝３％、
Ｃ＝２０％）を用いた。試料はあらかじめ０．５Ｍ２−
メルカプトエタノールにドデシル硫酸ナトリウム濃度を
２％になるように加えた溶液中で３分間煮沸後、尿素を
４Ｍになるように添加することにより、変性させておい
たものを２μｇ用いた。１２０Ｖで３時間泳動した後に
ゲルを取り出し、メタノール：酢酸：水（４：　１　：
　５）にて固定し、銀染色（Ｓｉｌｖｅｒ　５ｔａｉｎ
：バイオラッド社製）によりバンドを検出した。

分子ｌマーカーとして牛血清アルブミン（分子量６７．
０００）　、オボアルブミン（分子量４５．０００）　
、チトクロームＣ（分子量１２．０００）を同様に処理
して用いた。この結果、分子置駒４５．０００の単一バ
ンドが認められた。測定結果を第１図に示す。

（２）　　アミノ酸組成試料を真空中６Ｍの塩酸で１１０℃にて２０時間加水分
解し、続いてアミノ酸測定をした結果、新規な活性物質
は前記第１表記載のアミノ酸組成（合計のパーセント）
を示した。

（３）温度安定性試料を０．ＯＩＭ）リス塩酸緩衝液（ｐｔ１７．２　）
に溶解し、■、０μｇ／ｌｎｌの蛋白＊、ａ度とした。

この試料を０℃、３７℃、４５℃、５６℃、７０℃及び
１００℃にてそれぞれ３０分間処理した後、残存する血
管内皮綿１抱増殖促進活性を検討した。

この結果、０〜５６℃では安定であり、７０℃以上で失
活した。

（４）　　ｐＨ安定性試料を蒸留水にて溶解し、１０μｇ／ｍ１の濃度とし、
０．２％の牛血清アルブミンを含むｐｌ）１．３．５．
７．９の各緩衝液にて１０倍に希釈し、それぞれ水中で
４時間処理した。処理終了後、それぞれ１ｍｌを０．０
１Ｍ１−リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，２）にて２４時間透
析し、残存する血管内皮細胞増殖促進活性を測定した。

この結果、ｐｌｌｌ、３では失活したが、ＰＨ５、？、
９では安定であった。

（５）酵素に対する安定性試料を１μｇ／ｍｌの濃度で０．ＯＩＭ）リス塩Ｗ１緩
衝液（ｐＨ６，５）に溶解し、トリプシン（Ｔｒｙｐｓ
ｉｎ）、プロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ）、ノイラミニダ
ーゼ（Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）　、ＲＮａ５ｅを
各１．ｕｇｉ加し、３７℃１時間反応させた。反応終了
後、それぞれ０．１ｍＡをとり０．５％牛血清アルブミ
ンを加え、ハムのＦ１２培地１　　　ｍＩｌにて希釈後
、それぞれの血管内皮細胞増殖促進活性を測定した。こ
の結果、本発明の血管内皮細胞成長因子はトリプシン及
びプロナーゼで失活したが、ＲＮａ５ｅ、ノイラミニダ
ーゼでは失活しなかった。

（６）　　アミノ酸配列の決定試料を気相式シークエネーター（アプライドバイオシス
テム社製）を用いてエドマン（Ｂｄｍａｎ口）分解し、
得られたＰＴＨアミノ酸を高速液体クロマトグラフィー
装置（ベックマンインストルメンツ社製）及びＵｌｔｒ
ｏｐｈｅｒｅ　−ＯＤ　Ｓカラム（ベックマンインスト
ルメンツ社製）を用いて常法により分析した。カラム（
５μｍ直径４．６　ｍｍ　、長さ２５０ｍｍ）を開始緩
衝液（１５ｍＭｉ！８酸す）　ＩＪウム緩衝液。

ｐＨ４，５，４０％アセトニトリルを含む水溶液）にて
平衡化した後、検体（２０μｌの開始緩衝液にて溶解）
注入して、開始緩衝液によるイソクラティック溶出によ
る分離を行った。流速は１．４ｍβ／分、カラム温度は
４０℃に１．確定した。Ｐ　Ｔ　Ｈアミノ酸の溶出は２
６９　ｎｍと３２０　ｎｍの紫外部吸収を利用した。あ
らかじめ標準Ｐ　Ｔ　Ｈアミノ酸（シグマ社製〉各２ｎ
ｍｏｌを同一の系で分離して保持時間を決定し、被検検
体の保持時間から同定を行った。この結果、Ｎ末端から
１５残基目までのアミノ酸配列は次のごとく決定された
。

ＡＰＰＡＰＧＤＦＳＧＥＧ＊＊Ｇここで＊は未同定であることを示す。

実施例４比活性値の測定実施例２で得られた本発明の血管内皮細胞成長因子のヒ
ト請書由来血管内皮細胞に対する比活性値を、前述した
血管内皮細胞の増殖促進活性の測定法に従って測定した
結果、最大刺激活性は約２０ｎｇ／ｎ＋ｔｌＳ最大活性
の５０％は５ｎｇ／＋＋＋ｊ！であった。

〔発明の効果〕

血管内皮細胞の成長因子は塩基製ＦＧＦ及び酸性ＦＧＦ
というヘパリン親和性の２つの因子が分離され、その構
造が明らかにされているが、本発明因子はドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による
分子量が４５．０００であること、アミノ酸組成がＦＧ
Ｆとは異なること、又Ｎ末端部分のアミノ酸配列がＦＧ
Ｆを含めて他の報告されているヒトの蛋白質と異なるこ
となどから、新規な血管内皮細胞成長因子である。

本発明因子は臨床検査用試薬として、又研究用試薬して
使用しつる。又、本因子は血管内皮の傷害がその発症に
関与しているとされている動脈硬化症、高血圧症などの
疾患の予防及び治療剤として有用である。更には骨折や
組織の傷害の際に局所に投与する組織修復剤として有用
である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明因子の電気泳動における、移動距離と分
子ｌとの関係を示す図面である。以　　上第１図１　　２　３　　４　　５（ｃ！ｒＬ）移動距離 ◎二本発明の血管内皮細胞底長因子

Claims

【特許請求の範囲】１、次の理化学的性質を有する血管内皮細胞成長因子。（イ）分子量ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法による測定で約４５，０００（ロ）下記のアミノ酸組成を有する。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ （ハ）Ｎ末端またはＮ末端近傍に下記のアミノ酸配列の
部分構造を有する。ＡＰＰＡＰＧＤＦＳＧＥＧ２、ヒト胎盤を無血清培地にて培養し、その培養上清を（１）硫酸アンモニウム沈澱、（２）陰イオン交換クロマトグラフィー、（３）ゲル濾過、（４）ハイドロキシアパタイトゲルクロマトグラフィー
、次いで（５）アルキルスーパーロースカラムクロマトグラフィ
ーに付し、血管内皮細胞の増殖促進活性を有する画分を
採取することを特徴とする、請求項１記載の血管内皮細
胞成長因子の製造方法。