JPS62169799A - マクロフア−ジ分化増殖促進物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｌｌ」３へ机」１口し 本発明は、骨髄細胞に作用してマクロファージの分化増
殖を促進させる活性を有する新規な物質に関する。

従　　来　　の　　技　　術 従来より、感染症その他の種々の原因により、骨髄細胞
が変化をうけて白血球が減少する疾病は知られている（
白血球減少症）。また制癌剤を投与された癌患者におい
ても、殆んどの場合に共通した副作用として、造血臓器
障害に起因する白血球の減少が認められる。このような
疾病に対して、白血球の減少を阻止する目的で、正常な
骨髄細胞に作用してその増殖分化を促進する活性を有す
る物質であるコロニー　ステイミュレイテイングファク
ター（Ｃｏｌｏｎｙ　ＳｔｉｍｕｌａｔｉｎｇＦａｃｔ
ｏｒ　。

以下Ｃ８Ｆと呼ぶ）の有効性が検討されつつある。

該Ｃ８Ｆは、また正常骨髄細胞に作用して顆粒球マクロ
ファージ等の分化増殖を促進させる生物活性を有してお
り、従って種々の感染症の予防及び治療薬としてや骨髄
移植治療用薬剤としても有効である。

しかして、Ｃ８Ｆは例えば胎児細胞、牌細胞等の培養液
、人尿、種々の株化培養細胞の培養液等にその活性が認
められ、該活性画分として分離、利用されているが、い
ずれの起源のものも該起源に由来する夾雑物質等の混在
及びＣ８Ｆ活性物質自体の濃度の低さが障害となり、そ
の単離及び構造の解明は未だなされるには至っていない
。　−発明が解決しようとする問題点 従って、本発明の目的は、上記の通り各種の疾病等に対
する予防及び治療薬として有用なＣ８Ｆを単離し、その
構造を解明し、純粋な物質としてのＣ８Ｆを提供する点
にある。

本発明の共同研究者は、先にＣ８Ｆを常時均質な状態で
多量産生することのできる、ヒト白血病Ｔ細胞由来の培
養株化細胞であるｒＡＧＲ−ＯＮＪを確立し、該細胞に
係わる発明を特許出願したく特開昭５（１１６９４８９
号公報）。

本発明者らは、上記ＡＧＲ−ＯＮの産生ずるＣ８Ｆにつ
き、更にその精製を重ねた結果、該Ｃ８Ｆを純粋な形で
簡単にしかも高収率で収得する方法を開発し、またかく
して得られるＣ８Ｆの構造的特徴及び理化学的特徴を解
明し、ここに本発明を完成するに至った。

問題点を解決するための手段 本発明は、正常骨髄細胞に作用してマクロファージの分
化増殖を促進させる活性を有する糖蛋白質であって、下
記の理化学的性質を有することを特徴とする物質（以下
この本発明物質をＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ８ＦＪと呼ぶ）に係
わる。

ａ）分子量： 非還元条件下でＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
により、３３０００〜４３０００ダルトンであり、 非還元条件且つＳＯ８存在下でのゲルか過て、２３００
０〜４００００ダルトンである、ｂ）蛋白質部分のＮ端
アミノ酸配列： 次の一次構造式で表わされる配列を有する。

Ｖ　ａｔ　−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　ｌｕ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｃｙ
ｓ　−Ｓ　ｅｒ−Ｈｉｓ　−Ｍｅｔ−１ｌｅ　−Ｇ　ｌ
ｙ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｈｉｓ　−Ｌｅｕ　−Ｇ
Ｉｎ−８ｅｒ　−Ｌ　ｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒａ−Ｌｅｕ−
１ｌｅ　−Ａ　Ｓ＋１−　Ｓ　ｅｒ−Ｇ　ｌｎ−Ｍ　ｅ
ｔ　−Ｇ　ｌｕ−Ｔ　ｈｒ本明細書において、ペプチド
及びアミノ酸の表示は、ＩＵＰＡＣにより採択されてい
るアミノ酸命名法における略号乃至当該分野で慣用され
ているそれに従うものとする。

本発明ＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ８Ｆは、上記生物活性、理化学
的特徴及び構造的特徴を有する他に、下記特性を有する
ことによっても特徴付けられる。

Ｃ）ヒトＴ細胞培養株化細胞ＡＧＲ−ＯＮにより生産さ
れ、後記実施例に示す方法により単離端製される。

ｄ）りＯマドフォーカシングによる等電点（ｐＩ）が４
．０〜４．６である。

ｅ）その蛋白質部分が、後記実施例に示されるアミノ酸
組成を有している。

以下、本発明ＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ８Ｆにつき、これを製造
法より詳述する。

本発明物質は、ＡＧＲ−ＯＮの培養により誘導産生され
る。ここで起源細胞として利用するＡＧＲ−ＯＮは、特
開昭５９−１６９４８９号公報に記載された特性を有す
るヒト白血病Ｔ細胞由来のヒト培養株化細胞であり、こ
れはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（
ＡＴＣＣ）にｒＡＴｃｃ受託Ｎｏ、ＣＲＬ−８１９９Ｊ
として受託されている。

上記ＡＧＲ−ＯＮの培養は、この種細胞培養に通常使用
される培地を用いて実施される。該培地としては、例え
ば、ＯＥＭ培地、ＣＭＲＬ−１０６６培地、ＤＭ−１６
０培地、イーグルの最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ　　
ＭＥＭ）　、オートクレーブ可能ＭＥＭ、フィッシャー
の培地（Ｆ　１ｓｈｅｒ’ｓＭｅｄｉｕｍ　）　、Ｆ　
−１０，Ｆ　−１２培地、Ｌ−１５培地、ＮＣＴＣ−１
０９培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等を単独で用いるか
又は必要に応じて２等培地に牛脂児面清（Ｆｅ２）等の
血清やアルブミン等の血清成分を添加して利用できる。

ＡＧＲ−ＯＮの上記培地に対する使用量は、特に制限は
ないが、通常約ｌＸ１０４〜１×１０７個／鵬の濃度範
囲とするのがよい。培養条件も特に限定はなく、通常の
炭酸ガス培養法等と同様のものとすることができる。一
般には、約３０〜４０℃程度、好ましくは約３７℃前後
で１〜５日間を要して培養すればよい。上記培養により
、培養上清中に本発明物質が生産蓄積される。

培養上清の分離は、常法に従い例えば遠心分離等の手段
により行ない得る。かくして得られる培養上清からの本
発明物質の分離は、基本的には、この種バイオロジカル
物質からの蛋白様物質の分離に利用される方法に準じて
、例えば目的とする物質の物理的性質、化学的性質等を
利用した各種の操作に従い実施できる（［生化学データ
ーブックＩ［Ｊ、第１１７５〜１２５９頁、第１版第１
刷、１９８０年６月２３日、株式会社東京化学同人発行
参照）。該方法としては、具体的には例えば通常の蛋白
沈澱剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラ
フィー（ゲルか過）、吸着クロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィー、アフイニテイクロマトグラフ
イー、高速液体クロマトグラフィ＝（ＨＰＬＣ）等の各
種液体クロマトグラフィー、透析法、之等の組合せ等を
採用できる。

特に好ましい分離方法においては、まず培養上清より予
め目的とする物質を部分精製する。この部分精製は、例
えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリ
ウム等の塩析剤を用いる処理及び／又は透析膜、平板膜
、中空繊維膜等を用いる限外濾過処理等により行なわれ
る。之等の各処理の操作及び条件は、通常のこの種方法
のそれらと同様のものとすればよい。

次いで上記で得られた粗精製物を、吸着クロマトグラフ
ィー、アフイニテイクロマトグラフイー、ゲル濾過、イ
オン交換りＯマドグラフィー、逆相クロマトグラフィー
等に付すことにより、又は之等各操作の組合せにより、
目的物質の活性が認められる両分を収得し、かくして目
的物質を均質な物質として単離することができる。

上記吸着クロマトグラフィーは、例えばフェニル−セル
ロース、オクチル−セルロース等を担体として実施でき
る。

アフイニテイクロマトグラフイーは、例えばＣ０ｎＡ−
セルロース、レンチルレクチン−セファロース（ファル
マシア社製）等の担体を利用し、Ｃ８Ｆのレクチンに対
する親和性を利用したクロマトグラフィーにより実施で
きる。

ゲル濾過は、例えばデキストランゲル、ポリアクリルア
ミドゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミド−アガ
ロースゲル、セルロース等を素材として用いて実施でき
る。上記ゲル濾過剤の具体例としては、セファデックス
Ｇタイプ、セファロースタイブ、セファクリルタイプ（
以上、ファルマシア社製）、セルロファイン（チッソ社
製）、バイオゲルＰタイプ、同Ａタイプ（バイオラド社
製）、ウルトロゲルＡｃ　Ａ　（ＬＫＢ社製）、ＴＳＫ
−Ｇタイプ（東洋曽達社製）等の市販品を例示できる。

イオン交換クロマトグラフィーは、例えばジエチルアミ
ノエチル（ＤＥＡＥ）等を交換基とする陰イオン交換体
を利用したクロマトグラフィーにより実施できる。

逆相クロマトグラフィーは、例えばＣ１、Ｃ３、Ｃ４等
のアルキル基、シアノプロピル基、フェニル基等の官能
基がシリカゲル等の基体に結合された担体を用いて実施
できる。より具体的には例えばＣ４ハイボア一逆相ＨＰ
ＬＣカラム（ＲＰ−３０４、バイオラド社製）を用いて
、移動相としてアセトニトリル、トリフルオロ酢酸（王
ＦＡ）、水等及び之等の混合溶媒を用いて実施できる。

上記方法によれば、容易に高収率、高純度で所望の本発
明物質ＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ８Ｆを、工業的規模で製造でき
、かくして得られる物質は、前記ａ）〜ｅ）に示した特
徴を有している。

上記方法に従い得られる本発明物質は、その生物活性を
利用して、種々の感染症その弛の白血球減少を伴う疾病
の予防及び治療薬として、医薬分野で有用である。特に
本発明のＡＲＧ−ＯＮ・Ｃ８Ｆは、毒性が低く、しかも
その精製工程等での活性低下もなく、従って、上記医薬
として特に有効である。

本発明物質を医薬として用いるに当り、該物質はその有
効量を、薬理的に許容される通常の無毒性担体と共に含
有する薬理組成物の形態に調製され該形態に応じた各種
投与経路で投与される。その製剤形態としては、液状形
態例えば溶液、懸濁液、乳濁液等が通常採用され、之等
は一般に経口、静脈内、皮下、陵内、筋肉的投与される
が、特に之等の形態及び投与経路に限定されず、上記本
発明物質は、他の通常採用される経口、非経口投与等に
適した各種の製剤形態に調製することもでき、また使用
前に適当な担体の添加により液状となし得る乾燥品とす
ることもできる。各種形態の製剤の投与量は、所望の薬
理効果、疾病の種類、患者の年齢、性別、疾患の程度等
に応じて適宜決定され、特に限定はないが、通常有効成
分とする本発明物質を蛋白量として約０．００１〜１１
１１（＋／ｋ（１／日となる量で１日に１回乃至数回に
分けて投与すればよい。

実　　　施　　　例 以下、本発明ＡＲＧ−ＯＮ−Ｃ８Ｆの製造法及び得られ
る物質の特徴を、実施例を挙げて更に詳述する。

尚、各個で得られる試料のＣ８Ｆ活性は以下の方法によ
り測定されるものとする。

＜Ｃ８Ｆの活性測定法〉 牛胎児血清（ＦＣ８）２０ｍｌｌ！、α−培地３０鵬及
び２倍濃度α−培地２０−を混和して得られる溶液を３
７℃にて保温し、その２３．３１１１０を予め５０℃に
保温した１％寒天（ディフコ社製）溶液１０ｍＱと混合
して３７℃に保温する。

一方ＢＡＬＢ／Ｃ系マウス大腿骨より採取した骨髄細胞
（ＢＭＣ）を、ハンクス液で２回洗浄後、α−培地にて
ｍ胞Ｉｌ痕が１０７個／鵬となるように調製し、その１
鵬を上記３７℃に保温しである寒天培地に加え、よく混
和した後、３７℃に保温し、次いでその０．５ｍＧを、
予め５０μＱの供試試料を入れたウェル（ティッシュカ
ルチャークラスター１２、コスタ−社製）に加えて手早
く混和して室温に放置する。各ウェルの寒天が固型化す
るのを待って炭酸ガスインキュベーターに移し、更に３
７℃で７日間培養する。

かくして生じたコロニー数を実体顕微鏡を用いて計測し
、Ｃ８Ｆ活性の指標とする。尚、上記で生じるコロニー
は、形態学的観察の結果いずれもマクロファージコロニ
ーであった。

実施例１ ■　ＡＧＲ−ＯＮ培養液の調製 ヒトＴ細胞培養株化細胞ＡＧＲ−ＯＮ （ＡＴＣＣ受託Ｎｏ、ＣＲＬ−８１９９）を、５％新生
子牛血清（ＮＣ８＞　、２０ｍ　Ｍ　　Ｎ−２−ヒドロ
キシエチルピペラジン−Ｎ’　−２−エタンスルホン酸
（ＨＥＰＥＳ）　、１００μｇ／或ストレプトマイシン
、１００単位／噌ペニシリンＧ１５０μｇ／ｍｆ２ゲン
タマイシン、５ｘ１０−５Ｍ２−メルカプトエタノール を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（フローラボラトリー社
製）にて、約２〜４Ｘ１０５個／戚の細胞濃度に調製し
、その２Ｑを、２Ｑ容カルチコアフラスコ（柴田バリオ
硝子社製）にて、３７℃で培養し、約１〜２×１０６個
／誦の細胞濃度に到達するまで約４日間培養した。

次いで上記で培養された２Ｑ容力ルチユアフラスコ４本
内の細胞を遠心（　１　０００ｐｐｍ　、　５分）にて
洗浄分離後、ＮＣＳを含まない上記ＲＰＭＩー１６４０
培地８Ｑを入れた８Ｑ容カルチユアフラスコ（柴田バリ
オ硝子社製）にて、更に３７℃で４日間培養した。得ら
れた培養液を、遠心（１　００００ｐｐｍ　、５分）し
て目的とする培養上清を得た。

上記と同一操作を繰返し行なって得られる培養上清的１
９２９を、ペリコンカセットシステム（ミリポア社製、
分子量カットオフ：　１　００００）を用いて濃縮し、
濃縮液約１６Ｑを得た。以下この濃縮液を原料液とする
。

■　ＡＧＲ−ＯＮ　−　ＯＳＦの分離、精製（１）フェ
ニルセファロースクロマトグラフィー上記■で得た原料
液５Ｑに、硫酸アンモニウムを終濃度が１モルとなるよ
うに加えて溶解後、１ＮＮＨ４０Ｈにてｐｌ−１６．８
に調整した。

一方、フェニルセファロース（ファルマシア社製）約１
Ｑを直径５．１ｃｍのカラムに充填し、０、００５％ポ
リエチレングリコール（分子量６０００）及び１Ｍ硫酸
アンモニウム含有０、００５Ｍナトリウムリン酸緩衝液
（ｐＨ６６８）約５Ｑで平衡化後、上記で調整された原
料液をアプライした（流速的２４０ｒｔｌ／ｈｒ）。全
サンプルをアプライし終えた後、更に上記平衡化用緩衝
液約１９にて洗浄し、濃度勾配作成装置としてウルトラ
ブラッド（ＬＢＫ社製）を用いて、以下の条件で硫酸ア
ンモニウムの直線濃度勾配で溶出を行なった。

溶離液Ａ：０．００５％ポリエチレングリコール（分子
量６０００）及び１Ｍ硫酸アンモニウム含有０．００５
Ｍナトリウムリン酸緩衝液（ｐｌ−１６．８） 溶離液Ｂ：０．００５％ポリエチレングリコール（分子
量６０００）含有０．００５Ｍナトリウムリン酸緩衝液
（ｐ　Ｈ６．８＞流　　速　　：２４０ｍＱ／ｈｒ フラクション容積：６００ｍＱ／チューブ１度勾配：第
１図に示す。

溶出部の結果を第１図に示す。図において縦軸は、グラ
フ（１）で示されるＣＳＦ活性（コロニー数／プレート
）、曲線（２）で示される２８０ｎｍにおける蛋白の吸
光度（Ａ　２８０）及び線（３）で示される硫酸アンモ
ニウムの濃度勾配を各々示し、横軸はフラクションＮＯ
．を示す。

第１図より明らかなようにＣＳＦ活性は、フラー１アー クジョンＮＯ．７〜１３にかけて認められる。

上記■で得た原料液の残りについても同様に処理し、Ｃ
ＳＦ活性画分を一括してプールし、引続く（２）の方法
に供した。

（２）ＣｏｎＡ−セファロースクロマトグラフィーＣ　
ｏｎＡ−セファロース（ファルマシア社製）約２００ｍ
Ｇを、直径５．１０１１１のカラムに充填し、０、００
５％ポリエチレングリコール及び０、０２％Ｎａ　Ｎ３
含有リン酸塩緩衝生理食塩液（ＰＢＳ−”）約２９にて
平衡化した後、上記（１）で得られたＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ
ＳＦ活性画分をアプライした。全試料をアプライし終え
た後、カラム通過液の２８０ｎｌでの紫外吸収が０．０
３以下に低下するまで、平衡化に用いた上記緩衝液にて
洗浄を行なった。次いで０．５Ｍメチル−α−Ｄ−マン
ノシドを含む上記平衡化用緩衝液を溶出用緩衝液として
用いて、流速２ｍＧ／分、フラクション容積１５ＷｆＪ
／チユーブの条件で溶出を行なった。

ＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ８Ｆ活性は、フラクションＮｏ、１１
〜２１をピークとして、フラクションＮ０．１１〜１３
０にわたって認められた。該活性を有する全フラクショ
ンをプールした。

（３）ウルトロゲルＡＣＡ４４クロマトグラフィー 上記（２）で得た活性画分を、ＹＭ−１０膜（アミコン
社製）を用いて限外濾過濃縮し、その濃縮液を２回に分
けて、以下の条件でウルトロゲルＡｃ　Ａ４４　（ＬＢ
Ｋ社製）を用いたゲル濾過に供した。

カラム：　８７０ｍＸ４．４０ｍＢ径 溶離液：０．００５％ポリエチレングリコール、０．０
２％ＮａＮ３及び０．３Ｍ Ｎａ　ＣＱ含有リン酸塩緩衝生理食塩液流　速：１較／
分 フラクション容積：１５ｍＱ／チューブ上記クロマトグ
ラフィーの結果（１回目）を第２図に示す。図において
縦軸は、グラフ（１）で示されるＣ８Ｆ活性（コロニー
数／プレート）及び曲１ｊｌ　（２）で示される２　８
０　ｎｍにおける蛋白の吸光度（Ａ　２８０）を各々示
し、横軸はフラクションＮｏ、を示す。但し、Ｃ８Ｆ活
性は各フラクションノの２１倍希釈液についてのもので
ある。また、第２図には、スタンダードとして牛血清ア
ルブミン（６，７万）、卵白アルブミン（４，３万）、
キモトリプシノーゲン（２，５万）及びチトクロム−〇
（１，２４万）を用いることにより決定された分子量を
矢印を付して示しである。

上記の結果、２回ともＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ８ＦＷＩ性は、
分子量約２．５万〜１３万の広い範囲に亙って認められ
たが、主な活性は約３万〜５万の分子量領域に認められ
た。このうち、比活性の高いフラクションＮｏ、５５〜
６１をプールして、これを以下の方法に使用した。

（４）ＤＥＡＥ−５ＰＷ高速液体クロマトグラフィー（
ＤＥＡＥ−５ＰＷ　　ＨＰＬＣ）上記（３）で得られた
フラクションＮ０．５５〜６１を、ＹＭ−１０膜を用い
て限外濾過濃縮し、５回に分けて以下の条件で陰イオン
交換の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し
た。

カラム：ＴＳＫゲルゲルＡＥ−５ＰＷ　（７，５ｃｍＸ
７．５ｍｍ直径、東洋曽達工業社製）溶離液Δ：０．０
０５％ポリエチレングリコール含有０．０２Ｍトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０） 溶離液Ｂ：０．００５％ポリエチレングリコール及びＩ
Ｍ　　ＮａＣａ含有０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ　
１−１８．０） 流速：０．８ｍＱ／分 フラクション容積：０．８１１１２／チユ一ブ／分濃度
勾配：　　　時間（分）　　％Ｂ Ｏ〇 各回とも、同じ結果が得られたが、その１回目の結果を
第３図に示す。図において、縦軸は、グラフ（１）で示
される各フラクションの５１倍希釈液についてのＣ８Ｆ
活性（コロニー数／プレート）、曲線（２）で示される
２　８０　ｎｍにおける蛋白の吸光度（Ａ　２８０）及
び線（３）で示される塩（１−←トリウム濃度（Ｍ）を
各々示し、横軸はフラクションＮｏ、を示す。

第３図よりＡＧＲ−ＯＮ　−Ｃ８Ｆ活性は、フラクショ
ンＮｏ、２２〜４０にかけた広い範囲に亙り認められる
ことが判る。これらの活性フラクションの内、Ｎｏ、２
６〜３６をプールし、以下の方法に供した。

−２２＝ （５）逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ） 上記（４）Ｔ−１？られるＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ８Ｆ活性画
分を、ＹＭ−１０膜を用いて限外濾過濃縮後、２回に分
けて以下の条件でＲＰ−ＨＰＬＣを行なった。

カラム二０４ハイボアー逆相カラム（ＲＰ−３０４、バ
イオラド社製、２５０　ｍｍｘ４．６ｍｍ直径） 溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ 溶離液Ｂニアセトニトリル：１％ＴＦＡ＝９　：　１流
　速：１ｍ１２／分 フラクション容積：１ｍＱ／チューブ／分濃度勾配：　
　　時間（分）　　％Ｂ ２回とも、同じ結果が得られたが、その１回目の結果を
第４図に示す。図において、縦軸は、グラフ（１）で示
される各フラクションの５１倍希釈液についてのＣ８Ｆ
活性（コロニー数／プレート）、曲線（２）で示される
２８０ｎｍにおける蛋白の吸光度（Ａ２８０）及び線（
３）で示される溶離液Ｂの濃度（％）を各々示し、横軸
はフラクションＮｏ、を示す。

第４図より明らかなように、活性はフラクションＮ０．
２９〜３８にかけて認められた。この内フラクションＮ
０．３２〜３５を集め、減圧下に濃縮乾固した後、０．
００５％ポリエチレングリコール含有リン酸ｍｌ衝生理
食塩液に溶解し、以下の方法に供した。

（６）ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ　　）ＩＰＬｃ上記（
５）で得られた活性画分を、セントリコン−１０（アミ
コン社製）を用いて遠心濃縮した後、これに等量のサン
プルバッファー（蒸留水５或、０．５Ｍトリス塩酸緩衝
液（ｐ　Ｈ６，８）１戒及び１０％ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）１．６ｍ１２の混液）を加え、３７℃で
３０分間処理し、以下の条件でゲル濾過のＨＰＬＣを行
なった。

カラム：　ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ、６０ｃｍｘ７．
５ｍｍ直径、東洋曹達工業社製） 溶離液：０．０５％ＳＤＳ含有０．１Ｍナトリウムリン
酸緩衝液（Ｉ））−１７，０＞ 流　速：０．２ｍＧ／分 フラクション容積：０．２５ｍ１ｌ！／チユ一ブ／１分
１５秒 結果を第５図に示す。図において、縦軸は、グラフ（１
）で示されるＣ８Ｆ活性（コロニー数／プレート）及び
曲線（２）で示される２　８　Ｏｎ１１における蛋白の
吸光度（Ａ　２８０）を各々示し、横軸はフラクション
Ｎｏ、を示す。但し、グラフ（１）で示されるＣ８Ｆ活
性は、各フラクションの１００倍希釈液については−・
−で表わし、同フラクションの２００倍希釈液について
は一〇−で表わす。

また図には、分子量マーカーとしてフォスフォリラーゼ
ｂ　　（９，４万）、牛血清アルブミン（６，７万）、
卵白アルブミン（４，３万）、カーボニックアンヒドラ
ーゼ（３，Ｏ万）、ソイビーントリプシンインヒビター
（２，０１万）及びα−ラクトアルブミン（１，４４万
）を用いて、同様に処理した場合の分子量値を各々矢印
を付して示す。

上記各マーカーの分子量を基準とすれば、ＡＧＲ−ＯＮ
−Ｃ８Ｆ活性は、分子量２．３〜４万の両分（フラクシ
ョンＮｏ、５９〜６６）にかけて、２８０　ｒ＋ｍの吸
収ピークと一致する形で認められた。

このピークを集めることにより、本発明ＡＧＲ−ＯＮ　
−Ｃ８Ｆを得た。

■　ΔＧＲ−ＯＮ−Ｃ８ＦのＳ［）Ｓ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）レムリの方法（
Ｌａｅｍｍｌｉ、　ＩＪ、　Ｋ、、Ｎａｔｕｒｅ　。

２７７．６８０　（１９７０））に従い、上記■の（６
）で得たフラクションＮｏ、６２の１０μＱを、乾固し
た後、レムリのサンプルバッファー（２−メルカプトエ
タノールを含まない）に溶解し、３７℃で３０分間処理
した後、以下の条件で５ＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。

ゲ　ル：厚さ０．７５ｎ＋ｍの１２％ポリアクリルアミ
ドゲル 電気泳動装置：モデル３６０ミニ垂直スラブセル（バイ
オラド社製）を用いた。

泳動条ｆｌ：：定電流２０ｍＡで約１時間泳動させた。

染　色ニジルバースティンキット（バイオラド社製）を
用いた。

分子量マーカー：分子量測定用キット（ＬＭＷＫ　ｉｔ
Ｅ　、ファルマシア社製）を用いた。

上記５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果、本発明ＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ
８Ｆは、分子量３．３万〜４．３万にわたるバンドとし
て認められた。

なお、上記において、サンプルとして前記■の（６）で
得たフラクションＮｏ、６４を用い、５％２−メルカプ
トエタノールを含む上記サンプルバッファーを使用した
以外は同様の条件を採用して、還元条件での５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを行なったところ、分子量２万〜２．４万にわた
るバンドを与えた。

■　ＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ８Ｆのクロマトフオーカシング 上記■の（５）で得られた活性画分の一部を、０．００
５％ポリエチレングリコール含有リン酸塩緩衝生理食塩
液に溶解した後、以下の条件でＨＰＬＣによるクロマト
フオーカシングに供した。

カラムニーＥ／　（Ｍｏｎｏ　）　Ｐ　　ｌ」Ｒ５／２
０　（ファルマシア社製） 溶離液Ａ：０．００５％ポリエチレングリコール含有０
．０２５Ｍヒストリスーイミノニ酢酸緩衝液（ｐＨ７，
１） 溶離液Ｂ：０．００５％ポリエチレングリコール含有１
０％ポリバッファー７４−−イミノニ酢酸緩衝液（ｐＨ
１４，０＞ 流　速二０．８較／分 フラクション容積：０．８＋１１２／チユ一ブ／分溶出
プログラム　　　時間（分）　　％８５．１　　１００ ６０、１　　　　０ 結果を第６図に示す。図において、縦軸は、グラフ（１
）で示される各フラクションの６倍希釈１（７）Ｃ８Ｆ
活性（コロニー数／プレート）及び曲線（２〉で示され
るｐＨを各々示し、横軸はフラクションＮｏ、を示す。

尚、上記ｐＨは各フラクションをＩ）−Ｈメーターで測
定した。

コノ結果より、ＡＧＲ−ＯＮ　−Ｃ３Ｆ（７）Ｉ電点は
、ｏ　Ｉ＝４．０〜４．６であると認められた。

■　ＡＧＲ＝ＯＮ−Ｃ３Ｆのアミノ酸組成比上記■の（
６）で得られたＡＧＲ−ＯＮ・Ｃ８Ｆ活性画分のフラク
ションＮ０．６２の一部を試料として、加水分解（４Ｎ
　　メタンスルホン酸、２４時間）後、オルトフタルア
ルデヒド（ＯＰＡ）法により、アミノ酸アナライザー（
日立製作断裂）を用いてアミノ酸組成比の分析を行なっ
た。

その結果、ＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ８Ｆは、Ｐｈｅを基準（１
１個含まれると仮定して）として、下記第１表に示すモ
ル比で各アミノ酸を含有するものであることが確認され
た。

尚、上記分析条件下においては、ｐｒｏ及びＣｙｓは測
定されない。またＳｅｒ及びＴｈｒは同条件下で約５〜
１０％程度分解することが知られている。

第　　１　　表 ア　　　ミ　　　ノ　　酸　　　　　　　　　　　　モ
　　ル　　比ＡＳＤ及び／又はＡｓｎ　　　　　　２５
．６Ｔｈｒ　　　　　　１０．８ Ｓｅｒ　　　　　　１４．１ Ｇ１１】及び／又はＧｌｎ　　　　　　３０．１Ｇｌｙ
　　　　　　５．２ Ａｌａ　　　　　　８・６ Ｖａｌ　　　　　　１０．５ Ｍｅｔ　　　　　　５．３ Ｉｌｅ　　　　　　８．３ Ｌｅｕ　　　　　　２２．０ Ｔｙｒ　　　　　　５．２ Ｐｈｅ　　　　　　（１１） Ｌｙｓ　　　　　　１５．２ Ｈｉｓ　　　　　　４・３ Ｔｒｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　あ　
　リＡｒｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　７．
５■　Ａ　Ｇ　Ｒ−ＯＮ　−ＣＳ　Ｆのアミノ酸配列上
記■の（６）で得られたＡＧＲ−ＯＮ・Ｃ８Ｆ活性画分
くフラクションＮｏ、６２及び６３）を混合後、気相シ
ークエンサー（アプライドバイオシステム社製）を用い
て、そのＮ端アミノ酸配列を決定した。

その結果、ＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ３ＦのＮ端２７個のアミノ
酸配列は、以下のものであることが明らかとなった。

Ｖ　ａｌ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｃ
ＶＳ−８ｅｒ　−ｔ−１ｉｓ　−Ｍｅｔ　−Ｉ　１ｅ−
Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　
Ｉｎ−８ｅｒ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　Ｉｎ−Ａｒｇ　−Ｌ
ｅｕ　−１ｌｅ　−Ａ　Ｓｔ）　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　Ｉ
ｎ　−Ｍ　ｅｔ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｔ　ｈｒ尚、Ｎ末端よ
り５番目のアミノ酸は、ＰＴＩ−１アミノ酸として検出
されなかったことがらＣｙｓと推定した。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第６図は、各々本発明実施例に従う方法にお
けるフェニルセファロースクロマトグラフィーの溶出部
の結果、ウルトＯゲルＡｃＡ４４クロマトグラフィーの
結果、ＤＥＡＥ−，５ＰＷ高速液体クロマトグラフィー
（ＤＥＡＥ−５ＰＷＨＰＬＣ）の結果、逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（ＲＰ−Ｈ’ＰＬＣ）の結果、ＴＳＫ
ゲルＧ３０００ＳＷ　　ＨＰＬＣの結果及びクロマトフ
オーカシングの結果を示すものである。 （以　上）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）骨髄細胞に作用してマクロファージの分化増殖を
   促進させる活性を有する糖蛋白質であつて、下記理化学
   的性質を有する物質。 ａ）分子量： 非還元条件下でＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
   により、３３０００〜４３０００ダルトンであり、 非還元条件且つＳＤＳ存在下でのゲルろ過で、２３００
   ０〜４００００ダルトンである、ｂ）蛋白質部分のＮ端
   アミノ酸配列： 次の一次構造式で表わされる配列を有する。 【遺伝子配列があります】