JPH02283276A - トランスジェニック塊茎形成双子葉植物の製法、発現カセットを含有する植物細胞、パタチンプロモータ配列及び発現カセット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 腫采上の利用分野 本発明は、ジャガイモ塊茎？Ｃ特異的な調圓城が局在す
る発現カセットの′＃現ＤＮＡ配列、韮ひにこのＤＮＡ
配タＩノ金他吻ゲノゲノＶＣ転移減生物としてアグロバ
クテリウムｍ　ｖＭ　（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
）を便用して転移することに関する。このＤＮＡ配列は
バタチン麿伝子プロモータＴ：督するバメチン遺伝子を
含有する。このＤＮＡ　ｒｃｌｘ、培植物中で内生産物
の調節にも外米産物の装造にも役立つ。

従来の技術 世界人口が絶えず＃Ｉｍすることによって生じる連続的
に高ｌる食料品及び原料に対する請求により、最期的Ｖ
こ予測すると枡地面積が減少するので有用植物及びその
内容成分の生産高を上昇させるということが増々大きな
バイオテクノロジーの研死味題となっている。生産高の
上昇は植物に対する胃否動橿物及び４［物の病気及び／
又は不利な土用状態に対する有用種物の抵抗性を強める
ことにより連せらｒＬる。抵抗性の強化は、働えば植物
を肪発し、沫護物貢の形成倉増大させるようにすること
Ｖこよｐ迷せられる。

このためｌ／ｃに他物の代謝全操作しなけれはならない
。このことは特にａ胞核甲に貧有されるデ万キシリボ核
皺（ＤＮＡ、ｌの変化により惹起ざルる。

Ｍ物の１つ又は仮数の部分領置中での転与に、又は捕物
成長サイクルにおける一定の時期Ｖζおける転写に関与
するＤＮＡ片に作用を与えることがしばしば有利でるる
。従って、内生捕複産物の転写又ａ＃５ｆｊＡに関与す
る種物ゲノム中のＤＮＡ配列のＩｃＴ１足にａ大きな興
味が寄せられる。この櫨のＤＮＡ配列ｒ児い出すために
、ｌず初めすこ細胞酸量サイクルの一定期間ＶＣ１又は
−足の他物部分に現われる腫物でざがざなげればならな
い。

これに補する遺伝子ｔ−同足し、単離したならば、この
配列の十分な１責と特に所望の転写調節領域の同定及び
単離が必要で必る。引続いて、七の機能が実験により証
明されなげればならない好適なモデルｔつくしなけ几ｒ
ｌ：ならない。この檜のＤＮＡ配列の同定は、多くのｇ
Ａｐと不確ρ無きを伴なう挑戦的な研死課題である。植
物を遺伝学的ＶＣ変史するといシｏＪ能性への鳥体は一
膚大きくなり１　このことζ、こＩＬと関連する、転写
配列の同定及び−足の用途へのその配クリの操作に伴な
５費用及び努力を正当化するものでｂる。

双子葉及び単子巣ｍｗの遺伝′ｆ−的メ史法はｊ−でに
公知でのり（ヨーロッパ’＃ｄ第２６７１５９号明細ｆ
）、史に多くの文献が出ている（　　Ｃｒｏｕａｈ等者
−工Ｑ、：　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　ＥＦＯｒｍ　　
ａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　
Ｇｅｎｏｍｅ　、　＠ｔ４４、ｖａｎＶＯｌｔｅｎ−Ｄ
ｏｔｉｎｇ　、　Ｇｒｏｏｔ　ａｎｄ　Ｈａｌｌ　、Ｐ
ｌｅｎｕｍＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、、１ソ８
５年、処５５５〜５６６頁；　Ｃｒ０ｕｃｆｉ及び５ｕ
ｓｓｅｘ者、Ｐｌａｎｔａ　５１９８１年、第１５６巻
、第６４〜７４頁；Ｃｒｏｕｃｈ　４著、　：ｒ、Ｍｏ
１．　　Ａｐｐｌ、Ｇｅｚａｔ　％　　１９８３年、第
２き、第２７３〜２８３貞；及びＳｉｍｏＢ寺者、　　
Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ１０ｌ０ｇ７．　
　ｉ　　９５５年、第５巷、第１９１〜２Ｌ１１頁（前
記の文献中にはＢｒａＳＳｉＣａ　ｎａｐｕ１３中の蓄
槓蛋白員の種々の形’ｋｄ己叔し−Ｃいる：　Ｂｅａｃ
ｈ７寺者、ＥＭＢＯＪ、　。

１９８５年、第４巻、第３０４７〜６Ｕ５７頁；Ｓｓｎ
ｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎ寺者、Ｐｒｏｃ＊　Ｎａｔ
ｘ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ　、σｓＡ、Ｉｓ＞８５年、第８２＠、第６６２
Ｕ〜５３２４　Ａ　＋　Ｇｒｓｅｎｗｏｏｄ及びＣｈｒ
ｉｓｐｅｅｌｓ　看、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　
１９８５年、第７９舎、第６５〜７１貞及びＣｈｉｎ寺
看、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　　１９　Ｂ　６年、
第８３（？、Ｍａａ６ｕ〜８５６４貞（前６ｄ文献中に
は櫨子蓄積蛋白負及び遺伝学的操作を包含する実験が記
ｍｇれている）及びＥａｋｅｓ寺着、Ｍｏ１．　（）ｅ
ｎ。

Ｇｅｎｅｔ、、１９８６年、ｍ２１Ｊ５舎、第１４〜２
２貞及びＥｌ’１ｕｈｒ　”４者、５ｃｉｅｎｃｅ、　
　１９８６＃−％第２６２＠、編１１０６〜１１１２頁
（これらの文献は元誘発性植物遺伝子の改伝学的操作を
記載している〕〕。

発明の構成 ところで、本発明において発現カセットの新規ＤＮＡ配
列が提供され、このＤＮＡ配列にはジャガイモ塊茎特異
性！１４〜城が局在してンシ、かつバタテン（Ｐａｔａ
ｔｉｎ　）　１１ｉ伝子プロモータを胃するパタチン遺
伝子ｔ−を有する。

塊′４特異性のための一頗転写開始城を甘しこの開始域
の配列の後に、該当する細細組域の衣曳城の変更及び内
生生成葡の形成遍ひに濾分相又はψｔしい機能のための
外米注発現生底物の形成のためのｆ／ｌ＠’を有する配
列が接続してよい。

転写域及び終止＠を転写方向ｅこおいて、この配列を挿
入するための制限部位１個又は数１−を含有するリンカ
−又はポリリンカーにより作成すると有利である。一般
に、リンカ−は？ｌ１ｌＪ限部位１〜１０個、殆んどの
場会１〜８蘭、殊に２〜６個を有する。一般に、リンカ
−はＩＬｌ［Ｊｂｐよジ少ない大きざ、しばしば６　Ｕ
　ｂｐより少なく、シかしながら少なくとも５　ｂｐの
大＠ざを■する。転写開始域は宿主植物に対して天然も
しくは相同性であっても、１九異種もしくは非相同性で
のってもよい。特に１要なことは、ジャガイモのほふく
茎の形成から熟成した塊茎１でのジャガイモ塊茎の全成
長にわたって発現するジャガイモ（ンラヌム・ツベロス
ム：　Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｏｅｒｏｓｕｍ　）バタチン
ａ云子と心付している転写−姑城でめる。転与カセット
の中味に５’−６’の転写方向において、その植ｍｖこ
典型的な転写及び翻訳のための城、任意の配列及び転写
及び翻訳の終止城でめる。軽圧＠は任意Ｖこ交遺司粍で
ある。

ＤＮＡ配列は、任意のペプチドのプーベてのｉＴ能な転
写屏抗枠も、また１　１＋ｔ１１又は数個のイントロン
も含有していてよい。例として次のものが挙げられる：
酵素のための配列ｙａ）祇写屏絖枠でりつでもよいゲノ
ム配列に対して、ｂ）イントロンに対して、Ｃ）コード
しないリーダー配列（Ｌｅｉｔｓｅｑｕｅｎｚ　）に対
して、ｄ）相補性によジ転写、ｍＲＮＡグロセツシング
（例工ばスプライシング）又は翻訳を阻害する配列に対
して相補性である配列。所望のＤＮＡ配列τ曾成しても
よいし、または天然でるってもよく、もしくは合成りＡ
ＴＡ成分と天然ＤＮＡ成分とからの混廿物七合有しても
よい。一般に、４１１９Ｊにおいて優先的で４ｂるコド
ン’ｔ−Ｎする台ａ　ＤＮＡ配列を生成する。

この４［′＃において優先するコドンは、殆んどの興味
深い橿物橿において発現する、最大蛋白質＃ｊ４度のコ
ドンから決足することができる。転写カセットの生成の
際に、櫨々のＤＮＡフラグメントを操作して、有利に止
しい方向で屏耽しかつ止しい解絖枠を有するＤＮＡ配列
τ得ることができる。ＤＮＡフラグメント相互のＡ＆＆
には、フラグメント末端でアダプター又はリンカ−ｔｉ
ｔ用することができる。史に、通曾する刺限部泣全供給
し九ジ又は余分のＤＮＡ又は制限部位１ｃ除去したりと
いつ操作ｔ″通用ることができる。挿入、欠失又は例え
ばトランジション及びトランバージョンのような置換が
該当する場什には、試１噴管内突然変異、プライマー・
１５復、制限又は連Ｍ’を適用することができる。

例えば制限、チューイングバック（Ｃｈｅｗｉｎｇ−ｂ
ａｃｋ　）又はプラント末４　（ｂｌｕｎｔ−ｅｎａ　
）の突出部分金満／ζ丁ような好適な操作では、−緒に
して１！！結するためのフラグメントの相補性末端′？
ｔ１ｊ！用することができる。異なる工程七夷適するに
当ｆ）、ＤＮＡ菫を高めかつ望よしい処理結果を確保す
るのに有用なりＮＡ分析ｔするＶこはクローン化が必要
Ｃりる。凹、コリ中の慎装機構及び形ＩＸ転換した細胞
の選択Ｃ町距にするマーカーｔｔｔ！：＄以のククーン
化用ベクターｋｆ用ｆることができる。ベクターは−ん
ばｐＢＲ３３２、ｐｔｙｅシリーズ、Ｍ　１３　ｍｐシ
リーズ、ｐＡＣＹ０１８４等ｔ′ざむ。それに相応して
配列を過当な？ｆｆ１ｊ限部位でベクター中に導入する
ことができる。

得られたグラスミドをＥ、コリ中で形質転換するために
使用する。Ｅ、コリ細胞を好適な培地中で培養し、引続
いて収穫しかつ溶出する・プラスミド倉吉び取得する。

分析法としては、−般に配列分析、制限分析、ＨＬ′Ａ
ｖ！ｃ動及び他の生化学的−分子生物学的方法全実施す
る。各操作後に、使用したＤＮＡ配列を制限しかつ次の
ＤＮＡ配列と結合する。それぞ几のプラスミド配列を同
一の又は他のグラスミド中でりａ−ン化す゛ることかで
きる。所望の遺伝子を他物中ｒ（導入する方法に応じて
池のＤＮＡ配列が必要となるはずで必る・例えば形質転
換に植物細胞のＴ１−又μＲ１Ｒ１グラスミドτ便用＠
ｊ＆、少なくとも石側の境界、しかししなしは５右の境
界’１Ｔｉ−及びＲ１グラスミドに導入すべき遺伝子の
フランケン城（１ａｎｋｅｎｂｅｒｅｉｃｈ　）として
ｄ台ざイなけれμｌらな＾。槓ｖｌＪ細胞の形質転換の
ためにＴ−ＤＮＡ’に便用することについては熱ルに研
死されかつヨーロッパ％ａ’ｆ第１２Ｌ１５１６号明細
書；　ａｏｅｈｅｍａ　Ｌ、　　Ｔｈｅ　Ｂｉｎａｒｙ
　ｐｌａｎｔ；　ｖｅｃｔｏｒＳｙｓｔｅｍ　０ｆｆｓ
ｅｔ−ｄｒｕｋｋｅｒｉｊ　Ｋａｎｔｅｒｓ　Ｂ、Ｖ、
　。

Ａｂｌａｓｓｅｒｄａｍ　（１９８５）＊　ｍＶｊｔ；
　Ｅ’ｒａｌｅｙ等着、　　Ｃｒ１ｔ、　Ｒａｙ、　Ｐ
ｌａｎｔ　Ｓｃｉ、、　４合、１〜４６頁及びＡｎ　９
者、　　ＥＭＢＯ：ｒ、　（１９８５）　４Ｌ２７７〜
２８１ｔに十分に記載式れでいる。

導入されたＤＮＡがゲノム中に組込２れると、ＤＮＡは
そＣでも比較的安定で必ジかり一般的にはもはやとび出
さない。ＤＮＡに通常、殺生物剤もしくはカナマイ７ン
、０４１８、プレオマイシン、ヒグロマイシン又はクロ
ラムフェニコール寺のよりな仇生物負１ｔこ対する耐性
τ形Ｘ伝換他′４！ｉｌＪ細胞Ｖこ付与する選択マーカ
ー【貧有する。

−ｅｎｉ、マーカーは形３に歓戻し九細胞を、尋人ＤＮ
Ａが欠損している細胞から選択するの上口Ｊ能Ｖこする
。

ＤＮＡζ植吻禾省主細胞中に導入するために、多数のｆ
ｉ句″が便える。この技何には形負転洟手設としてアグ
ロバクテリウム・ツメ７アチエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）又はアグロバ
クテリウム・リグｒネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｒｈｉｚｏｇｅｎｅａ　）　’ｃ使うＴ−ＤＮＡによる
形質伝慎、Ｉａ廿、注入又はエレクトロポレーション寺
カある。形質転換にアグロバクテリウム禰困を使う場合
、尋人すべさＤＮＡ　ｔｌ−特別なグラスミド中ｌこ、
つｌす中間ベクター（ｉｎｔｅｒｍａｄｉａｅｒｅｒ　
Ｖｅｋｔｏｒ　）又はバイナリ−（ｂｉｎａｅｒｅｒ　
）ベクター中・シＣクローン化ナベきである。中間ベク
ターは％　　Ｔ−ＤＮＡ中の配列に相同の配列に基づい
°Ｃ相間組み換えによ、９　Ｔｉ−又はＲ１グラスミド
中に組込むことができる。史に、ＣのグラスミドはＴ−
ＤＮＡの転移に必要なＶｌ、ｒ憤域を有する。中間ベク
ターはアグロバクテリウム１４−中では複製しない。ヘ
ルパーグラスミドＶこよって中間ベクターは７グロバク
テリウム・ツメ７アチエンスに転＠５せることができる
（接台）。バイナリーベクターンユＢ、コリ中でも、７
ダロバクテリウム属困中でも直軸し得る。それは、右側
及びＺＥ　ｍ　Ｃ１）　’ｒ−ＤＮＡ限界域にとり１暑
れる遇択マーカー凍伝子及びリンカ−又はポリリンカー
七゛す有する。七ノｔらｔ直播アゲａバクテリクムＪＩ
ｔ４田中に形質転換させることができる（　Ｈｏ１ｓｔ
ｅｒｓ寺者、　Ｍｏｌ。

Ｇａｐ、　Ｇｅｎｅｔ、　（ｉ　９７８年）、　１６３
＠、　１８１〜１８７頁〕。宿王則胞として有用なアグ
ロバクテリウムｆ４鉋は、　　Ｔ−ＤＮＡが植物細胞中
に転移するのに必要なりｉｒ域を有するグラスミドｒ含
催すべきであり、その際に付加的なＴ−ＤＮＡが含１れ
ていてもよい。このように形＊ｗｉｘ換された細ａ！ｉ
ｔ−植物細胞の形質転換に使用する。ＤＮＡの植物細胞
中への転移には、植物外植片を有利にアグロバクテリウ
ム・ツメファテエンス又は７グロバクテリウム・リゾｒ
ネスと一緒に培養することがでさる。感染した植ｖｌＪ
材料（例えは篤茎、＠るるいはグロトグブスト又は浮遊
培養した細胞）から好４な培地（これｅよ選択のために
抗生物質又は殺生剤を含有していても工い）中で４１１
１物全体を再生することかでさ、その恢この植ｍｉｓ人
ざ几たＤＮＡの仔在にりいて試験することがでざる。注
入及びエレクトロポレーションの場廿は、グラスミドに
対して搭別な賛件はなく、例えはｐσＣｄ４体のような
簡単なグラスミドを使用することができる。

外米遺伝子金種物中に導入するために多くの可能性が明
らかでりるが、例えば血漱因子；リンホカイン；コロニ
ー刺、＆Ｊ−ｆ−；インターフェロン；プラスミノ−ｒ
ンアクチベータ；例えばスーパーオキシドジスムターゼ
又はキモシンのような酵素；ホルモン；ラント乳からの
チオエステラーゼ−２又はヒト血清アルブミンのような
哺乳動物生産物の遺伝子の発現が特に舛床際い、他のり
能性は、塊Ｘ蛋白負、籍に最４なアミノ戚組取（必須ア
ミノ＃りを有する突然変異諷茎蛋白負の量を高めること
でめり、かつＣのようにして塊過の栄養価ｔ″高めるこ
とかでさる。

一定の内生産物のｆｉ’ｔ−低減しようとする場合に、
更に、プロモータに対して偽万同つけで遺伝子又は七の
一部を発現ざぜることが均んられ、これは内生但伝子全
体又はその一部に相Ｍ注でのるＲＮＡの合成に案内し、
それ故この處伝子の転写もしくは内生ｍＭＡのグロセツ
シング及ヒ／又は翻訳ｔｍ害することができる。

形質転換した細＃Ｉは４１１吻内で常法で成長する（　
ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ等着、　　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　
Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９８６年）、５舎、８１〜８４貞も
診照〕。

これらの植物は正常に成育させることができかつ形ｉ吠
侠した同じ遺伝素質又は他の遺伝木質ｔ−有する植物と
交叉させることができる。そのＭ未発生するハイブリッ
ド一体は相応する発現型特性ｔ′；ｆｉ１する。この発
現屋特性か確渠に保持されかつ遺伝するように、２世代
又はそれ以上成育δせるべさでろる。゛よた、４実に札
応する発現型又は他の時性がざｌｎているようにする友
めに、―子もまた収穫すべさでめる。塊芸特異注兄境用
の宿主ａ物としてはすべての晶業−又は塊成形戟他物種
、特にソラヌム・ツベロスム刀為好進でめる。

有用／ｉ：転写囲始餉城の１１足は多くの方法で行なう
ことがでとる。地線この際に、植物の一部の部分（諷茎
）２７為ら単離したｍＲＮＡ全便用する。

待兵的ＶＣ蝿峨又ζ桶吻の段階に関連するｍＰｌｈの付
Ｕ口的な磯度上夕＋のためにｃＤＮＡ　ｚ　ｄ　表する
ことがでさ、での際しここのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに非
特異的なｃＤＮＡ　ｋ池の組截又μ植物段階（例えば塊
茎／巣）から取り除くことができる。残りのｃＤＮＡｔ
％相浦ａ配列のゲノムのグローブ検ｉ　（Ｓｏｎｄｉｅ
ｒｕｎｇ　）のために、好適な植物ライブラリーの利用
下に使用することができる。蛋白質が単離されているか
又は単離されるところでは部分的に配列することができ
、それにより４１　ｍ　ＤＮＡライブラリー中の相応す
る配列を直接同定するためのグローブに！４１造するこ
とができる。引続いて、グローブによｐハイブリッド形
成゛する配列上単離しかつ煉作することがでさる。

史に、コード付け’ｆＡ＠ｆ：伴なり未翻訳５′城を単
離しかつ発現カセット中で未翻訳の５′城の転写活性を
同定するために使用することができる。

未翻訳５′城ｔ”便用する、得られた発現カセットを框
吻中で形Ｘ転換することかでさ（削ａご一照入そ７ＬＫ
よって外米構造遺伝子（未翻訳の５′城を伴なり野生盤
の転写ｙｓ＃ｌｔ枠とは別のもの）含有するその愼能性
及び塊茎特異性を試験する。このよりにして、３）Ｌ蟲
にｔ？＃異的な転写に公費な特Ａ的配列を同定すること
ができる。待に皇要な発現カセットはバタチン遺伝子の
転写開始部位【含む。

略語 ｄ、ｋ（Ｌ＝ダルトン、キロダルトン ｂｐ＝塩基対 ＤＮＡ　　＝デオキシリボｊＩＡｒｊＲ％遺伝情報の担
い手 ｃＤＮＡ　＝リバース・トランスクリグターゼによジ装
造δれたｍＲＮＡのコピー ｍＲＮＡ　＝メツセンジャーリボａｍ Ｔ−ＤＮＡ＝＝移ＤＮＡ　（アグロバクテリウム・ツメ
フアチエンスのＴ１プラスミド上 に局在） ａ　　念 プラント末端＝２つのＤＮＡ鎖が正罐に同じ長さである
ＤＮＡ末端 チューイングバック−ＤＮＡ分子の相抽圧鎖よりよシ民
いＤＮＡ鎖のヌクレオチドの 酵素的除去 電気泳動＝大きざ及び荷電によｐ蛋白質及び核酸を分店
する九めの住化学分４法 晃現　；遺伝子の活性 遺伝子＝遺伝因子、塘伝物の単位、一定の特性の部分情
報の担い手、遺伝子は核 ＠（例えばＤＮＡ　、　　囮Ａ）より成る。

ゲノム＝細胞の染色体上に局在する全遺伝子ゲノム配列
＋ゲノムのＤＮＡ配列で、連続して韮ぶ６個のヌクレオ
チド塩基（トリ ブレット）が、一定の７ミノ＊ｒコ ード付はするコドン金形欣する。

ＲＮＡＮラスイシング士直伝子ｒよいつも−ａきの単位
として存在するわけではなく、 コード付けしない配列（イントロン） 倉含有していてもよい。

非相同遺伝子又はＤＮＡ士外来遡伝遺伝に外来ＮＡ 相同遺伝子又はＤＮＡ＝遺伝子又はＤＮＡが同じ種に出
来する。

クローン４単一ｆ＃細胞に由来する細胞果団、子係は遺
伝子型が同じでめる。クロ ーン化により細廁系杭の単一性を尚 めることができる。

連結　＝　ＤＮＡの５′−ホスフェート基と３′−ヒド
ロキシル基との間のホスホジエス テル結合の＃素的形成 リンカ−、ポリリンカー＝　ｉ！ｉｉＪ限切断部位１個
又は数１−を直接的な順序で含Ｍする 台成りＮＡ配列 ノデンブａット、サデンプロット＝電気尿動で分４よし
たＭＡ又にＤＮＡ　ｔ−ニトロ七ルロース族又はナイロ
ン膜上に転移 させかつ固定すること バタチン〒ジャガイモ塊蟲の主要蓄槓歳白賞の誠用名、
分子賃約４　（Ｊ　ｋｄのグリコ蛋白質 発曳型＝遺伝子益とは反対に生体中で祝われる全特性 プラスミド＝細−細胞中（場合によっては真核生物中）
の付′ＭＪ釣な染色体外ＤＮＡ遺伝子担体で、これは細
―染色体と は関廠なく倍加する。プラスミドは イ也の宿主ＤＮＡ中に組み込むことができる。

グライマー＝開始部分；他のヌクレオチドをつぎ足すこ
とのできるポリヌクレオ チド鎖 プロモータ＝相同又は外米のＤＮＡ１ｌ伝子配列の−４
１”沫砒するＤＮＡ元現の劃−配列 複線　菖ＤＮＡ配列の培加 駒＠　＃　ｇ　＝エンドデオ中シリボヌクレアーゼの血
族でめる側限エンドヌクレアー ＋！Ｓ（例えＨＪ！ｉ、コリからの＃ｃｏＲＩＧ↓ＡＡ
ＴＴＣ及びｊｃｃｏ現↓ＣＣ（仝）ＧＧ）はｉ′ｉ！［
を認識する高い特異性によジ優れている（↓＝切断部位
）。

制限部位±特異的に側隈酵索によシ生成される切断部位 終止　ミボリペプチド鎖ｔ−完成する蛋白負合成のｔ＆
終工程 形質砿＊＝細−の外米ＤＮＡ忙受容細胞中に挿入 転写　＝　ＤＮＡ上にのっている遺伝学的情報をＲＮＡ
　Ｋ転写 翻訳　；核酸の鎖状塩基配列の形で蓄積されている遺伝
情報の翻訳 転位　−４Ｘ麺対置美、グリンービリミジンがプリン−
ピリミジンに、例えはＡ− ＴがＧ−Ｃによジ 転換　＝塩基対直侠、プリン−ピリミジンがピリミジン
−プリンｖＣｓ例りはＡ− ＴがＴ−Ａにより 欠失　＝１−文は畝個の塩基対の除云 御人　＝１−又は数１固の塩ｉ対の導入；転位、転換、
欠失及び挿入は点突然変異で ある。

ベクター；遺伝子を受答し、これｔ池の細胞に運搬する
信王特異円な、愼袈町拒 な構造。グラスミドにベクターとし て使用することができる。

１９８８年１２月１６日付けで、ドイツ倣生ｖＪ沫存囁
１関（ＤＳＭ　；西ドイツ１、ブラウンシュヴアイク在
）に次の微生物を寄託し九（寄託番号）ニ ブラスミドｐＢ工１０１−Ｂ３３に含臀するアグロバク
テリウム・ツメフアチエンスＬＢＡ４４Ｕ３、Ａ−ｔｕ
ｍ　Ｂ　３３　（ＤＳＭ　５　Ｌｌ　８９　）。

本発明ｔベースとする実施例を理解し易くするために、
この実数に必要な公知の方法を予め記載する： １、クローン化ベクター クローン化のために、ベクターｐＵｃｌｄ／１９及びＭ
　１３　ｍｐ　Ｉ　Ｂ　／　１９　［Ｙａｎｉ、５ｃｈ
−Ｐｅｒｒｏｎ　苛＠、Ｇｅｎｅ（１９８５年）、　５
５４！−、ＩＬＩ３〜１１９頁］を使用した。

ｍｗ形貞転換のために、遺伝子構造物ｔバイナリーベク
ターＢ工Ｎ　ｉ　９　（Ｂ＠ｖ５１ｎ著、　　Ｎｕｃｌ
。

Ａｃ１ｃＬａ、　Ｒｅｓ、　（１９８４年）、１２舎、
　８７１１〜８７２０貞〕中にクローン化Ｌｌ。

２、細−一体 ｐ［ＪＣ−及びＭ１３ベクターには兄、コリー株ＢＭＨ
７１−１８ＣＭｅｓｓｉｎｇ等著、　　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔ。

Ａａ３ａ、　ＳＯｌ、ＵＳＡ　Ｃ１９７７年）、２４舎
。

６６４２〜６３４６貞〕又はＴ８１を使用した。

ベクターＢＩＮ１９には専ら菌株ＴＢｌｔ″便クムＴＢ
りは１休、ＴＭＩＬ１１の組換えマイナス、テトラサイ
クリン耐注誘尋体Ｔ″める（　Ｙａｎｉａｃｈ−Ｐｅｒ
ｒｏｒｌ　４者、　　Ｇｏｎｅ　（１９８５年Ｌ３３４
！Ｉ。

ＩＬ１３〜１１９頁〕。ＴＢｌ劇休の体伝子緘は（Ｂａ
ｒｔ　Ｂａｒｒｅｌ　、　　ｐａｒｓ、　Ｍｉｔｔｅｉ
ｌｕｎｇ　）　：？’　（ｔｒａＤ　３６　、　　ｐｒ
ｏ　ＡＢ、　　１ａｃｌ　、　　１ａＯＺΔＭ１５ン。

Δ　（ｌａｃ、　　ｐｒｏ　　）、　　　５ｕｐｊＣ，
ｔｈｉｓ、　　ｒｅｃＡ、　　Ｓｒ１：二Ｔｎ　１　Ｕ
　（ＴｃＲ）　テｈ；ｂ。

他物の形負転俣はアグロバクテリウム・ツメフアチエン
ス劇体ＬＢＡ　４４　Ｌｌ　４　（Ｂｅｖａｎ　、　　
Ｍ、。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１２
４ａ、　　８７１１〜８７２１頁（１９８４年）；Ｂ工
Ｎ１９−４体〕を用いて実施した。

媒地 ＹＴ培地：酵母エキス０．５優、ＮａＣｊ　Ｏ，５’４
、バクトートリグトン０．８優、場合 ンこよシ基大１．５係 ＹＩＢ　培地：牛肉エキス［Ｊ、５４　、酵母エキスＵ
、１優、ペプトンＵ、５％、サッカ ロースＯ−５釜、ＭｇＳＯ４２ｍＭ％、　ｊｆｉＡ会に
より寒天１．５優 Ｍ８培地二Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋＯＯｇによる（
　　Ｐｈｙａｉｏｌｏｇｉａ　　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ　
　（１ゾロ２年）、１５舎、４７６〜４９７頁〕 ＆アグロバクテリウム・ツメフアチエンスの形質転洪 Ｂｉｎ　１９　ｔｌｉｍ体ではアグロバクテリウム属囚
中へのＤＮＡの導入ｔａ、Ｈｏ１ｓｔｅｒ　等の方法（
Ｍｏｌ。

Ｇ＠ｍ、　　（）ａｎｅｔ、　　（１９７８年ン、　　
１６３８Ｆ、　　１８１〜１８７貞〕で直接形質転換に
より行なり。形質転換されたアグロバクテリウム属−の
グラスミドＤＮＡ　？ｃＢｉｒｎｂｏｉｍ及びＤＯ’１
７の万ｅ　（Ｎｕａｌ。

Ａｃ１ｄａ、　Ｒｅ５−（１９７９年）、７１！Ｐ、１
５１３〜１５２６貞〕によシ単蟻しρ為つ好適な制限切
断Ｖこよりｒル電′Ａ体動で分離する。

４、植物形質転換 ジャガイモ滅菌栽培の小葉１Ｕ枚金スカルベルで協つけ
て、それを、選択下に成長したアグロバクテリウム・ツ
メフアチエンスーー晩培Ｓ物３０〜５０μｅを含有する
、サッカ含有ス２％含有Ｍ８培地ＩＬｌｄ中に浸した。

３〜５分間経＜＃Ｒ處した佼でベトリ皿’ｔ−２５°Ｃ
暗所で恒温保持した。２８俊、葉ｔグルコース１．６１
％で７チンリボース２ダ／ｌ、ナフチル酢＃ｉｌＵ、Ｌ
１２ダ／ｊ％ジベレリン［Ｌｌ、Ｕ２号／Ｊ、クラホラ
ン（ｃｌａｆｏｒａｎ　）　５　Ｕ　Ｌｌ　”／／　ｌ
　ｓカナマイシン５ＬＪＩＱ／ｌ及びバクト課大０．８
１３１−ｔＮｊるＭＳ培地上にのせたｏ　２５　ｖｓ　
　３　Ｕ　ＬＩ　ＬＩ　Ｌｕｘ　テ１週間恒温保持した
俊で培地中リクラホランー度を手分に低めた。

ｓ、　ＩＪｌ伝子公子植物からのデノムＤＮＡの分析ゲ
ノム槓’ＰＪ　ＤＮＡの単ｍ　ｋ　ＲＯｇｅｒａ及びＢ
ｓｎｄｉＯｈＣｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂ１１１．　（
１９８５年〕、５舎。

６９〜７６頁〕により行なった。

ＤＮＡ分１ノ；ＩＭ（：　ＤＮＡ　１　（ｊ　〜２　Ｕ
　ＤＩ　を好４な制限切期後にサデンプロットにより検
出すべきＤＮＡ配列の組込みについて試験した。

６、　ａｌ伝公子換植物からの全ＲＮＡの分析植物の全
ＲＮＡの単Ｉ４はＬｏｇｅｍａｎｎ　”Ｊｉ　［Ａｎａ
ｌｙｔ−１ｃａｌ　Ｂｉｏａｈｅｍ−（１９８７年）、
１６３咎、１６〜２０頁〕により行なった。

分析に当り、１回当Ｄ　５　Ｕ　１４１の全ＲＮＡ／ノ
デンプａットによ少目的の転写物の存在を試験した０ ＺＧＵ８試験 遺伝子転換ａ９１Ｊ中のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ
）の活性ｆ　Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ法Ｃｐｌａｎｔ　Ｍｏ
ｌ。

Ｂｉｏｌ、　Ｒａｐ−（１９８７年）、５轡、３８７〜
４（Ｊ５貞〕にエリ創建した。蛋白質測定はＢｒａｄｆ
ｏｒｄ　６　（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９
７６年）。

７２＠、２４８〜２５４頁〕により行なった。

Ｇ［７Ｂ活性の測定には蛋白質５ｕμＩを便用し、恒温
保持’ｔ　３７−０で６Ｕ分間行なった。

実施例 久の実施例にニジジャガイモ塊茎からのバタチンプロモ
ータの単一及び同定並びに截粍及び使用について詳説す
る。

実施例１ ンラヌム中ツベロスムからのパタチン遺伝子のクローン
化及び構造分析 ジャガイモのバタチン蛋白質ｔ：ｌ−ドするｃＤＮＡ　
−ｌローン金ジャガイモのに種ベロリーナ（Ｂｅｒｏｌ
ｉｎａ　）から単４しかつ配列した（　Ｒｏｓａｈｌ寺
！、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　ｏｅｎｅｔｉｃｓ　（１９
８６年）、２ｔＪ３合、２１４〜２２ＬＩ貞〕。このｃ
ＤＮＡ−クローンは、内生ｒノムバタチンクローンでジ
ャガイモの変種ベロリーナ（Ｍａｘ−Ｆｌｍｃｋ−工ｎ
５ｔ１ｔｕｔ　　ｆｕｅｒ　　ｚｕｅｃｈｔｕｎｇａｒ
ｏｒｓｃｈｕｎｇ、　　Ｋｏｅユｎ在）かり単離するの
に背用でめった。

夾Ｉ！１ｊ例２ ｒノムバタチンクローンのクローン化、１ｉｆｆＪｆｆ
ｌ及び−欠構造 λファージから誘導されたベクターＸＭＢＬ　Ｊ甲で形
成された、ジャガイモの変種ベロリーナからの［ＤＮＡ
のゲノムライブラリー？バタチンａＤＮＡ　ｐｃＴ　５
８によりスクリーニングした。１３−の独立したクロー
ンが得られ、ぞルらのうち部分配列後にりａ−ンＢ３３
倉それ以後の操作に使用した。クローンＢ３３の制限地
図は第１図に図示した。ｊｌに公子の一部を配列し、転
写調節に１要な領域の配列は第２図に図示し之。

実施例５ 塊茎ＶＣ％異的なバタチン遺伝子Ｂ３３の発曳に関与す
る。Ｓ１４節領域の同定 位置＋１４と−１５１６との間に局在している１−５２
７ｋｂのＤｒａ工／　Ｄｒａｍ−フシグメント（第２図
参照〕七グラスミドｐＢ工ＩＵ１（ＪｅｆｆｅｒＢｏｎ
寺ｉｔ　　ＥＭＢｏ、７．　（１９Ｅｌ　７年）。

６舎、６９０１〜３９Ｕ７貞〕のＳｍａｍ切工切断部位
中入した。これにより、バタチン逍公子Ｂ３．５のこの
プロモータブラグメントハＥ、コリからの！−グルクａ
ニダーでのコード付は領域及びツバリンシンターゼａ公
子のボＩＪ　−Ａ含有領域と融会し九（第６図−照）。

この構成物をアグロバクテリウムＭ菌Ｉ、ＢＡ　４４　
ｕ　４　Ｃジー。

Ｍ、　＠、　Ｎｕｏｌ、　Ａｃ１ａａ　Ｒｅｓ、　（１
９Ｂ　４年）。

１２舎、８７１１〜８７２１頁〕中に転移させ、かクキ
メラバタチン遺伝子と含有するアグロバクテリウム属菌
をジャガイモの葉の形質転換に使用する。

再配列てれなかった完全なキメラのバタチンーグルクロ
ニダーゼ遺伝子の存在をサデンブロント分析によシ検出
した、独立して侍られたＩＬＩＩ園のＦｉｔ買転換体に
ついて葉、茎、塊茎及び根のβ−グルクロニダーゼ活ａ
ｔ試験した。

結果？を表１に記載し九。このデータかり、β−グルク
ロニダーゼ遺伝子と一合したバタチン遺伝子Ｂ３３のＬ
）ｒａ工／　Ｄｒａニー７ラグメントが強力な塊墓特異
的Ｉ−グルクロニダーゼ活性を誘発することが盆く明っ
かで必る０ 表　　１ 形貴徴侠体 ３６ｔ）−１３ ５６Ｇ−１９ ３Ｇ−２１ ６Ｇ−２３ ６Ｊ−２４ ，５３（）−２７ ６６Ｃｋ−５６ ３Ｇ−５２ ３３Ｃｋ−６１ 根 υ ｕ 塊茎 ２υ４７ ９４７ｉ ５６Ｕ ｄ６４ ４９ｉ６ ８６２Ｕ ｃ　、ｖ、　　Ｄｅｓｉｒｅｓ 活性にメチルランベリフェロール２モル／蛋白貴３１？
／かで記載した。

ｃ　、ｖ、　Ｄｅｓｉｒｅｓは形質転換されなかったジ
ャガイモの相応する右柱を示す。

【図面の簡単な説明】

第１図はバタテン遺伝子Ｂ３３’にコード付けするケ”
ツムクローンのｆｔｊＪ限地図の図、貧２図はバタナン
週公子の、転写調節に貞女である領域の４Ａは配列で示
す図でめジ、配列中、Ｄｒａ工／Ｄｒａｍ−フラグメン
トの立直、・工＋１４と−１５１６との間で矢印で示し
、マで示すＡＴＧ　ｖよ一訳開始点Ｃｔ！’）、ａ３図
は２．υｋｌ）のカナマイシン耐性遺伝子％１−５２７
ｋｋ＋のバタチンプロモータＢ６６．２．Ｕ　ｋｂのＩ
−グルクロニダーゼ聰公子及びツバリンシンターゼター
ミネータｔその中に含む１３−５　ｋｂのプフスミドｐ
ｇ工１Ｕ１−Ｂ５３の構造を示す図でめる。 Ｈ に Ｅ＝ＥｃｏＲｘ Ｈ＝Ｈｉｎｄｌｌ に＝Ｋｐｎｌ Ｂ＝−ＢａｍＨＩ Ｓ＝Ｓｓｔｌ Ｖ＝ＥＣＯＲＶ 人−＝Ｘｂａｌ Ｃ二＝Ｃｚａ　Ｉ ＤこＤｒａｌ ｉ ９・１ Ｂ ＳＶ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ジャガイモ塊茎に特異的な調節領域を含みかつ植物
   ゲノム中に導入することができることを特徴とする、発
   現カセットのＤＮＡ配列を含有するアグロバクテリウム
   属菌。 ２、アグロバクテリウム・ツメフアチエンスであること
   を特徴とする、請求項１記載のアグロバクテリウム属菌
   。 ３、発現カセットのＤＮＡ配列中にバタチン遺伝子を含
   むことを特徴とする、請求項２記載のアグロバクテリウ
   ム・ツメフアチエンス。 ４、ＤＮＡ配列がソラヌム・ツベロスムからのバタチン
   遺伝子Ｂ３３を含むことを特徴とする、請求項３記載の
   アグロバクテリウム・ツメフアチエンス。 ５、バタチン遺伝子Ｂ３３がバタチン遺伝子Ｂ３３プロ
   モータの長さ１．５２７ｋｂのＤｒａ I ／Ｄｒａ I −
   フラグメントを含むことを特徴とする、請求項４記載の
   アグロバクテリウム・ツメフアチエンス。 ６、Ｄｒａ I ／Ｄｒａ I −フラグメントがＫｎｐ I
   ／ＨｉｎｄIII−フラグメントの＋１４〜−１５１３の
   ヌクレオチド配列中に含まれることを特徴とする、請求
   項５記載のアグロバクテリウム・ツメフアチエンス。 ７、Ｄｒａ I ／Ｄｒａ I −フラグメントがβ−グルク
   ロニダーゼ遺伝子及びパリンシンターゼ遺 伝子と融合していることを特徴とする、請求項５記載の
   アグロバクテリウム・ツメフアチエンス。 ８、バタチン遺伝子Ｂ３３プロモータの長さ１．５２７
   ｋｂのＤｒａ I ／Ｄｒａ I −フラグメントを含む、長
   さ１３．５ｋｂのＤＮＡ配列より成ることを特徴とする
   、プラスミドｐＢ I １０１−Ｂ３３。 ９、アグロバクテリウム・ツメフアチエンス中に含まれ
   ることを特徴とする、プラスミド ｐＢ I １０１−Ｂ３３。 １０、ジャガイモ又はタバコのゲノムが該当することを
   特徴とする、植物ゲノム。 １１、ジャガイモがジャガイモ塊茎に特典的な調節領域
   が含まれている発現カセットのＤＮＡ配列を含有するこ
   とを特徴とする、請求項１０記載の植物ゲノム。 １２、ジャガイモが発現カセットのＤＮＡ中に、バタチ
   ン遺伝子Ｂ３３プロモータの長さ１．５２７ｋｂのＤｒ
   ａ I ／Ｄｒａ I −フラグメントを有するソラヌム・ツ
   ベロスムからのバタチン遺伝子Ｂ３３を含有しているこ
   とを特徴とする、請求項１１記載の植物ゲノム。 １３、アグロバクテリウム・ツメフアチエンスＬＢＡ４
   ４０４Ａ−ｔｕｍＢ３３（ＤＳＭ５０８９）。 １４、バタチンＢ３３遺伝子を使用することを特徴とす
   る、栽培植物の形質転換法。 １５、栽培植物がジャガイモであることを特徴とする、
   請求項１４記載の方法。 １６、バタチンＢ３３遺伝子を使用することを特徴とす
   る、栽培植物の内生産物の調節及び外来産物の製造方法
   。