JPH02283278A - 抗体産生細胞の製法及び抗体の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、マウス又はラットの腫瘍細胞内にヒト型モノ
クローナル抗体産生細胞由来の核及び／又は微小核体を
包含する細胞の製法、および該細胞をｉｎ　ｖｌｖｏま
たは１ｎ　ｖｌｔｒｏにて培養することによる、ヒト型
モノクローナル抗体の製法に関するものである。本発明
により産生されるヒト型モノクローナル抗体は、広く臨
床的に治療や診断に応用する事ができる。

［従来の技術］ 従来のモノクローナル抗体生産方法としては、免疫した
生体のリンパ球と腫瘍細胞とを融合して作製されるハイ
ブリドーマによってモノクローナル抗体を生産するＧ、
ＫｏｈｌｅｒとＣ１Ｍ　ｉ　１　ｓ　ｔ　ｅ　ｉ　ｎの
方法（Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５頁、１９７５年
）が知られている。

さらに近年、遺伝子組換え技術を用いて、各揮微生物、
酵母、及び動物細胞に目的のモノクローナル抗体の遺伝
情報を組み込んで、これらの細胞の培養によりモノクロ
ーナル抗体を生産することも広く試みられるようになっ
た（例えば、Ｊ、Ｖ。

Ｂｒｕｎｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　　３巻、１
９１頁、１９８５年）。

［発明が解決しようとする課Ｅコ マウス・マウスハイブリドーマの培養によるモノクロー
ナル抗体の生産は、マウス腹水を用いる１ｎ　ｖｉｖｏ
培養法において１１当たり０．５〜１０ｍｇのモノクロ
ーナル抗体を含む腹水が２〜１０ｍ１程度得られるのが
通常である。しかし、従来の方法により作製したヒト・
ヒトハイブリドーマ（ある種の疾病に感染したヒトの末
梢リンパ細胞とヒトの腫瘍細胞とから作製されたハイブ
リドーマ）、ヒト・マウスハイブリドーマ（ある種の疾
病に感染したヒトの末梢リンパ細胞とマウスの腫瘍細胞
とから作製されたハイブリドーマ）又はヒト・ラットハ
イブリドーマ（ある種の疾病に感染し、たヒトの末梢リ
ンパ細胞とラットの腫瘍細胞とから作製されたハイブリ
ドーマ）のヒト型モノクローナル抗体（ある種の疾病に
感染したヒトの末梢リンパ細胞由来のモノクローナル抗
体）産生細胞によるヒト型モノクローナル抗体の産生は
、１ｎｖｉｖｏ培養法において該細胞がマウス又はラッ
ト腹水中で増殖することができずヒト型モノクローナル
抗体の生産は出来ない。一方該細胞の１ｎｖｌｔｒｏ法
の培養においては、培養液１　ｍｌ中に０．５〜１０μ
ｇ程度のヒト型モノクローナル抗体しか得られない。今
のところヒト型モ、ツクローナル抗体の生産は、このＩ
ｎ　ｖｌｔｒｏ培養法以外に適切な方法は無く、培養液
組成の検索や培養装置の改良等を通して細胞の高密度化
や増殖速度の上昇、抗体分泌因子の探索が試みられてい
るが、これらの試みは、いずれも容易ではない。

本発明は、目的のヒト型モノクローナル抗体を効率よく
産生ずる抗体産生細胞の製法、及び、目的のヒト型モノ
クローナル抗体を効率よく生産する方法を提供すること
を目的とするものである。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、上記課題について鋭意検討したところ、
従来の方法による課題を解決するために次のような方法
を発明した。即ち本発明は、ヒト型モノクローナル抗体
産生細胞（１）から得た核及び／又は微小核体と、マウ
ス又はラットの腫瘍細胞とを融合することを特徴とする
ヒト型モノクローナル抗体産生細胞（ＩＩ）の製法、及
び、該製法で作製したヒト型モノクローナル抗体産生細
胞（ＩＩ）を、ｉｎ　ｖｌｖｏまたはＩｎ　ｖｉｔｒｏ
にて培養し、ヒト型モノクローナル抗体を採取すること
を特徴とするヒト型モノクローナル抗体の製法である。

本発明において核及び／又は微小核体を得るヒト型モノ
クローナル抗体産生細胞（１）の作製は、方法自体公知
であるＧ、ＫｏｈｌｅｒとＣ１Ｍ１ｌｓｔｅｉｎの方法
によって行うことができる。ヒト型モノクローナル抗体
産生細胞（りとしては、ヒト・ヒトハイブリドーマ、ヒ
ト・マウスハイブリドーマ、ヒト・ラットハイブリドー
マなどがあげられるが、ヒト型モノクローナル抗体を産
生ずる細胞であればよく、これらに限定されるものでは
ない。

また本発明で用いられるヒト型モノクローナル抗体産生
細胞（１）の核を分離する方法は、特に限定されないが
、例えば、細胞をサイトカラシンＢを含むフィコール濃
度勾配を用いて遠心分画し、脱核された細胞質体と核体
とを分離するＭ、Ｈ。

Ｗ　ｉ　ｇ　ｌ　ｅ　ｒらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙ、Ｃｅ１ｌ、Ｒｅｓ、、７１巻＝４８０頁
、１９７２年）に準じて行うことが出来る。

また、フィコールの代わりにＣｏ１１ｏｉｄａｉ　５ｌ
ｌｃａの濃度勾配を用いて行うＢｏｓｓａｒｔらの方法
（Ｅｘｐ、Ｃｅ１１．Ｒｅｓ、、９６巻二３６０頁、１
９７５年）も用いることが出来る。

さらに、ヒト型モノクローナル抗体産生細胞（Ｉ）の微
小核体を分離するには、細胞をコルヒチンで処理する方
法等を用いることができる。

ヒト型モノクローナル抗体産生細胞（Ｉ）がら得た核及
び／又は微小核体と腫瘍細胞とを融合する方法にも特に
限定はないが、例えば、ポリエチレングリコールを用い
て融合するＴ。

Ｓｅｋｉｇｕｔｉらの方法（第３２会日本細胞生物総会
：ｇ演要旨、１９７９年）に準じて行うことができる。

またＨＶＪ　　（センダイウィルス）を用いて融合する
Ｆ、Ｈ，Ｒｕｄｄｌｅらの方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１
．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、７４巻、３１９〜３２３頁、１９７７年）、電
気融合又は電気穿孔による方法、さらにはリン酸カルシ
ウム法も用いることが出来る。

このようにして作製されたヒト型モノクローナル抗体産
生細胞（ｎ）を、ｉｎ　ｖｔｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒ。

で培養することにより、目的とするヒト型モノクローナ
ル抗体を効率よく得ることができる。培養法としては特
に限定されることはなく、通常のハイブリドーマの培養
方法に準じて行えばよい。例えば、Ｉｎ　ｖｌｖｏ培養
の場合は、ヒト型モノクローナル抗体産生細胞（Ｉりを
マウス、ラットなどの腹腔に移植し、精製した腹水を精
製して目的とするヒト型モノクローナル抗体を得ればよ
い。またｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養では、適当な培養液中で
、必要に応じて抗体分泌促進因子などを添加してヒト型
モノクローナル抗体産生細胞（ｎ）を培養し、細胞や培
養液を精製することによって目的とする抗体が得られる
。

［発明の効果］ 本発明によればヒト型モノクローナル抗体産生細胞（ｎ
）の１ｎ　ｖｉｔｒｏにおける高密度培養、高増殖、抗
体の高分泌が、さらには、マウス、ラットなどの腹水中
でのｉｎ　ｖｌｔｒｏでの増殖が可能となり、効果的に
ヒト型モノクローナル抗体を生産することができる。

［実施例］ 以下、本発明を実施例にて詳細に説明するが、本発明は
これら実施例のみに限定されるものではない。

（Ａ）ヒト型モノクローナル抗体産生細胞（Ｉ）の調製 ヒト型モノクローナル抗体産生細胞（１）としては、ヒ
ト肺腺癌（以下ＨＬＡと省略する）患者のリンパ節細胞
とヒトリンパ腫細胞とを、Ｇ、　ＫｏｌｅｒとＣ，Ｍｉ
ｌｓｔｅｉｎらの方法に準じて融合させた抗ＨＬＡ抗体
（ＩｇＭ）産生細胞（Ｉ）を用いた。抗ＨＬＡ抗体産生
細胞（Ｉ）の培養には、該細胞から核及び／又は微小核
体を分離する日まで、１５％ウシ胎児血清（以下ＦＣ５
と省略する）を含むＤＭＥＭ培地を用いた。

（Ｂ）マウス腫瘍細胞の調製 マウス腫瘍細胞としては、Ｂａ１ｂ／ｃマウス由来の８
−アザグアニン耐性株として、ＳＰ２１０−Ａｇ１４（
以下Ｓ　Ｐ　２１０と省略する）を使用した。該細胞の
培養は、細胞融合する日まで１５％ＦＣＳを含むＤＭＥ
Ｍ培地を用いた。

（Ｃ）抗ＨＬＡ抗体産生細胞（１）の核の分離まず最初
に終濃度１０μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢと終濃度０
．５％のＤＭＳＯを含む１２．５〜２５％の濃度勾配の
フィコール−ＤＭＥＭ　（ｐＨ７，４）を滅菌した遠心
管に２ｍ１（２５％）、２ｍｆ　　（１７％）、０．５
ｍ１（１６％）、０．５ｍｌ　（１５％）、２ｍ１（１
２，５％）の濃度変化で段階的に作製した。

フィコール濃度勾配を作製した遠心管は、少なくとも６
時間以上ＣＯ２インキュベーターに放置してＥ）Ｈを平
衡化した。

抗ＨＬＡ抗体産生細胞（Ｉ）は、ＤＭＥＭ培地に懸濁し
、無菌的に１１００Ｏｒｐで５分間遠心して調製した。

この細胞を１２．５％フィコール−ＤＭＥＭ培地１培地
１細ｌ数が０．５〜３．０×１０７になるように懸濁し
、フィコール濃度勾配に重層した。さらに細胞層の上に
サイトカラシンＢ含有の血清なしＤＭＥＭ培地を静かに
重層し、遠心管の上端部３ｍｍ位下まで満たした。この
時、細胞層と１６％フィコール層に０．０２５９６）リ
バンブルーを添加し、層の位置のマーカーとし、た。

遠心管をローターに入れ、滅菌したグリースを塗り蓋を
した。遠心条件は、３０度で２００００〜３００００回
転で１〜２時間遠心した。遠心後細胞層には、細胞破砕
物や断片が多く、１２．５〜１６％層には完全な細胞や
細胞質体、１７〜２５％には核が、主として含まれた。

完全な細胞及び細胞断片はベレットとして底部に集まっ
ていた。各濃度のフィコール層を壊さないように分画採
取した。ＤＭＥＭでフィコール液を希釈して、２．５０
０ｒｐｍで５分１１１１遠心後Ｄ　Ｍ　Ｅ　）、４で二
回洗浄した。

（Ｄ）抗１（ＬＡ抗体産生細胞（Ｉ）の核とマウス腫瘍
細胞の融合 上記（Ｂ）および（Ｃ）項で調製したマウス腫瘍細胞と
抗ＨＬＡ抗体産生細胞（Ｉ）の核とを１；１の割合で混
合した後、遠心（１，０００ｒｐｍ、１０分）し細胞ペ
レットを集めた。遠心管を軽くたたいて細胞ペレットを
壁面にうずく広げた。その中に３７℃に暖めておいた５
０％ＰＥＧ　（ＭＥＲＫ社製ポリエチレングリコール４
．０００）と１０％ＤＭＳＯと５μｇ／ｍｌポリアルギ
ニン（分子ｍ６０，０００）を含むＤＭＥＭ溶液０．５
ｍｌを遠心管を回しながら少しずつ滴下させた。１分間
ゆっくりと遠心管を回転させ混合した後、３０秒に１ｍ
ｌの割合で遠心管を回転しながら３７℃に加温しておい
たＤＭＥＭを１０回加えた。つぎにＦＣＳを２ｍｌゆっ
くりと入れ、１１０００ｒｐ、１０分間遠心した。細胞
ベレットを１５％ＦＣＳとｌＸｌ０　　　Ｍヒボキサン
チン、４Ｘ１０　　　Ｍアミノプテリン、１．６Ｘ１０
　　　Ｍチミジンを含むＤＭＥＭ　（以下ＨＡＴ培地と
省略する）で２回遠心洗浄（１，ＯＯＯｒｐｍ、１０分
間）した。この培養液を９６ウエルマイクロタイタープ
レート（ファルコン社製＃３０４２）にＩ×１０５細胞
個／ウェルになるように２００μｌずつ分注した。３日
目ごとにＨＡＴ培地を１００μｌ／ウエル交換した。３
週間後からは、１×１０　　Ｍヒポキサンチン、１．６
Ｘ１０　　　Ｍチミジンと１５％ＦＣ３を含むＤＭＥＭ
　（以下ＨＴ培地と省略する）を培地交換に用いた。

（Ｅ）ハイブリドーマの選択 ９６ウエルマイクロタイタープレートに細胞コロニーが
認められる１００日目後から固相酵素免疫測定法を行い
、培養上清に抗ＨＬＡ抗体が存在するかどうか調べた。

９６ウエルマイクロタイタープレート（平底）（ファル
コン社製）に、ＨＬＡ細胞を１５％ＦＣＳを含むＤＭＥ
Ｍ培地で培養した。０．０６％グルタルアルデヒドを含
むＰＢＳ溶液を１００μｌ／ウェル分注し、室温で１５
分間、細胞の固定処理をした。ウェルに残っている溶液
を除去し、リン酸緩衝化生理食塩水（０，８５％ＮａＣ
１ａ有０．０１％リン酸緩衝液、ｐＨ７，２７以下ＰＢ
Ｓと省略する）に０．０４％ツイン（ｔｗｅｅｎ）−２
０を含んだ溶液（以下ＰＢＳ−Ｔと省略する）で３回洗
浄しり後、３．０％ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと
省略する）を溶解したＰＢＳ−Ｔ溶液３００μｌを各ウ
ェルに加えて、３７℃で１．０時間ブロッキング処理し
た。ウェルに残っている溶液を除去し、ＰＢＳ−Ｔで３
回洗浄した後、各ウェルにハイプリドーマ培養上清を１
００μｌずつ分注し、３７℃で１．５時間静置した。こ
れらのウェルをＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した後、０．
１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ溶液で４．０００倍希釈し
たペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＭ抗体（タ
ボ社製）溶液を５０μｍ／ウェルずつ分注し、３７℃で
１．５時間静置した。ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄したの
ち、基質溶液（１，２％２．２−７ジノジー（３−エチ
ルベンズチアゾリン硫酸）−ジアンモニウム塩（ＡＢＴ
Ｓ）及び０．０１％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含有する
０、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，１））を各ウェルに
１００μｌ添加した。３０分間室温で放置し、２００ｍ
Ｍシュウ酸溶液を１００μｍを加えて酵素反応を停止さ
せた。４１５ｎｍでの吸光度を測定し、酵素活性が認め
られたウェルに抗ＨＬＡ抗体を産生ずるヒト型モノクロ
ーナル抗体産生細胞（ｎ）が存在することがわかった。

以上のようにして、抗体価の強いモノクローナル抗体産
生細胞（ｎ）を取得した。

（Ｆ）コンデシジニングメデウムの調製２６ゲージの注
射針をつけた注射器に１０ｍ１の冷蔵しておいた０、３
４Ｍサッカロース溶液を吸い取った。Ｂａ１ｂ／ｃマウ
ス（♂）をを椎脱臼させ、無菌的に腹腔内に上記溶液を
注入した。

注入後５分以内に左側腹部に１８ゲージの注射針をつけ
水冷しておいた注射器にて腹腔内溶液を回収した。氷冷
しておいた遠心管に上記回収液を流し込み、１１０００
ｒｐで５分間遠心分離した。

遠心後上清を廃棄し、細胞ベレットに１５％ＦＣＳ−Ｄ
ＭＥＭを加え攪拌しプッシュに入れた。

３７℃、５％炭酸ガス濃度、９５％湿度で一晩培養した
。培養上清を集め、０．２２μｍのメンブレンフィルタ
ーで濾過し、これをコンデショニングメデウムとした。

（Ｇ）クローニング 上記（Ｅ）項で調製した抗ＨＬＡ抗体産生細胞（ＩＩ）
について限界希釈法を用いて単一クローンにした。上記
ＣＦ）項で作製したコンデショニングメデウムを１ｍｌ
含むＨＡＴ培地２０ｍ１を用意した。クローニングした
い抗ＨＬＡ抗体産生細胞（■）を各ウェルに１個になる
ように上記培養液中に調整し、２００μｍ／ウェルずつ
９６ウエルマイクロタイタープレート（ファルコン社製
＃３０４２）に分注した。培養１００日目後から細胞コ
ロニーが認められるウェルについて、上記（Ｅ）項に記
載した固相酵素免疫７１）Ｊ定法に準じて抗ＨＬＡ抗体
産生細胞（Ｉりを選択し、再度クロニングを繰り返し単
一な抗ＨＬＡ抗体産生細胞（ｎ）を樹立した。

（Ｈ）抗ＨＬＡモノクローナル抗体のｉｎ　ｖｌｔｒｏ
での生産 １　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌインスリンと７ｍｇ／ｍ！）ラ
ンスフェリンと４ｍＭエタノールアミンと０．５μＭ亜
セレン酸ナトリウムを含んだＤＭＥＭ培地に、上記ＣＧ
）項で樹立した抗ＨＬＡ抗体産生株を３×１０５細胞個
／ｍｌで懸濁し、島原５ＨＣ−１を用い潅流培養した。

（１）培養液中のモノクローナル抗体量の測定（ａ）抗
マウスＩｇＭ抗体の固定化 未処理９６ウエルマイクロタイタープレート（インター
メッド社製）の各ウェルに０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ９，６）に溶解した３μｇ／ｍｌのマウス由来
の抗マウスＩｇＭ抗体の溶液２００μｌを加えて、４℃
−夜インキユベートした。次に、各ウェルの溶液を除去
し、ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した後、０，１％以下Ｂ
ＳＡを溶解したＰＢＳ−Ｔ溶液３００μｌを各ウェルに
加えて、４℃でブロッキング処理しそのまま保存した。

（ｂ）試料中のモノクローナル抗体の定量（ａ）で記述
した方法で作製したマイクロタイタープレートを室温に
もどし、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した後、マウスＩｇＭ抗
体を含む標準試料を各ウェルにそれぞれ２０μｌ加えた
。つぎに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社
製：以下ＨＲＰと略す）で標識した抗マウスＩｇＭ抗体
をＰＢＳ−Ｔ溶液で希釈し、各ウェルに２００μｌずつ
添加した。そのまま室温で３時間インキュベートした後
、溶液を除去しＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。それに
、１．２％　２，２−アジノジー（３−エチルベンズチ
アゾリン硫酸）−ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び０
．０１％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含有する０、１Ｍク
エン酸緩衝液（ｐＨ４，１）から成る基質溶液を各ウェ
ルに２００μｌ添加し、室温で３０分間酵素反応させた
後、２００ｍＭシュウ酸溶液を１００μｍ加えて酵素反
応を停止させた。上記マイクロタイタープレートの各ウ
ェルについて、波長４１５ｎｍ％対照波長４９２ｎｒｎ
の吸光強度を自動マイクロタイタープレートリーダーＭ
ＰＲ−Ａ４　（東ソー株式会社製、商品名）で測定した
。この標準試料における濃度と吸光強度との関係から検
量線を作成した。

上記（Ｈ）項で得られた培養５日目の培養液を用いて同
様に測定した結果、ヒト型抗ＨＬＡモノクローナル抗体
が５μｇ　／　ｍｌで産生されていることがわかった。

（Ｊ）染色体分析 上記（Ｇ）項で樹立した抗ＨＬＡ抗体産生細胞（ｎ）の
染色体分析を行なった。その結果、該細胞はヒトの染色
体を含有することが確認された。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト型モノクローナル抗体産生細胞（ I ）から
   得た核及び／又は微小核体と、マウス又はラットの腫瘍
   細胞とを融合することを特徴とするヒト型モノクローナ
   ル抗体産生細胞（II）の製法。
2. （２）ヒト型モノクローナル抗体産生細胞（ I ）がヒ
   ト・ヒトハイブリドーマ、ヒト・マウスハイブリドーマ
   又はヒト・ラットハイブリドーマである特許請求の範囲
   第１項記載の方法。
3. （３）特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法で
   作製したヒト型モノクローナル抗体産生細胞（II）を、
   ｉｎ　ｖｉｖｏまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏにて培養し、ヒ
   ト型モノクローナル抗体を採取することを特徴とするヒ
   ト型モノクローナル抗体の製法。