JPS5933295A

JPS5933295A - 抗ヒトフイブロネクチン抗体

Info

Publication number: JPS5933295A
Application number: JP14414482A
Authority: JP
Inventors: Shoichi Adachi; 正一足立
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1982-08-20
Filing date: 1982-08-20
Publication date: 1984-02-23

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は新規なヒトフィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　：以下１−　Ｆ　Ｎ　Ｊと
略称する）ノモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ　ａｎｔ、１ｂｏｄｙ）に関する。

ＦＮは細胞表面、デラスマあるいは体液等に存在する粘
着性の糖蛋白質で、サブユニットα及びβが２個のジス
ルフィド結合している約４０万以上の高分子物質であわ
、コラーダン、ヘパＩＩ　ｙ、フィブリンに結合性を示
し、細胞の粘着及び増殖を促進し、更に免疫応答の環境
作りに関与する性質を有する［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａ
ｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　。

２９　、１０３−１２８　（１９８’０　）　；　Ｏｏ
ｌｌａｇｅｎＲｅｓ、　、　１　、９５−１２８　（１
９８１）　；　Ｎａｔｕｒｅ２７５　、１７９−１８４
　（１９７８）　；　Ｂｌｏｏｄ　。

５６．１４５−１５８（１９８０））。

また、近年ＦＮは癌化との関係で注目されるようになっ
たが、これには未だ不明な点が多く、その構造、動態、
生体内活性について多くの研究が行われている。この研
究には、一般の生理活性物質と同様に、その特異抗体を
使用するのが有利であるが、常法によって得られるＦＮ
−抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）は
認識部位が雑多であり、他種のＦＮとも反応すると共［
ＦＮの種々の生理活性をほとんど中和してしまう等の非
特異的なものであったため、上記研究には使用できなか
った。

斯かる実情において、本発明者は長期に亘り鋭意研究を
行った結果、ヒ）ＦＨに特異的に反応し、その反応部位
及びＦ　Ｎの生理活性中和能が明確なモノクローナル抗
体を得ることに成功した。

すなわち、本発明は、ヒトフィブロネクチンで免疫した
哺乳軸物の免疫細胞と骨髄腫細胞との融合によって形成
されろバイブ１）ドーマより生成される、（ａ）本質的
にヒトの全てのフィブロネクチンと特異的に反応し、（
ｂ）ヒトフィブロネクチンをサーモリジ／で開裂した分
子量（ＳＤＳ　／ポ１）アク】）ルアミドデル電気泳動
法）　１　ｓ　０．００６及び１４０．００．０又は４
０．ＯＧ　ＯのＰメインと特異的に結合するモノクロー
ナル抗体を提供するものである。

斯かる本発明の抗ヒトフィブロネクチン抗体はヒトＦＮ
の研究のために有用であると共に、通常の抗体の一般的
用途、例えば精製、測定等に使用できる。

本発明の抗ヒトフィブロネクチン抗体は、ヒトＦＮで免
疫した咄乳動物の免疫細胞を骨髄肝細胞と融合させてバ
イブＩＩ　Ｐ−マを形成させ、これより上記モノクロー
ナル抗体な分離することによって製造される。

本発明において、ノ・イブ１）ＩＳ−マの調４１、自体
公知ノ方法、例えばＮａｔｕｒｅ　、　２５６　、４９
５−４９７（１９７５）に記載の方法に準じて行われ木
。

抗原のヒ）ＦＮとしては血漿、羊水等の体液、細胞表面
等に由来するものカー使用されろカ；、特にヒト血漿Ｆ
Ｎが好ましい。これらのヒトＦＮ＆主チンカラム、ヘパ
１１ンカラム）等により単肉毘精製するか、あるいは市
販のり１１オデレシビテート（血液凝固第■因子製剤）
よりｍ離することによって得られろ。

ヒトＦＮを免疫する哺乳動物（′！、特に限定されない
が、細胞融合に使用する骨髄腫細胞との適合性を考慮し
て選択するのが好ましく、一般に（まマウス、ラット等
が使用される。免疫も一般的方法によって行われ、例え
ばヒトＦＮを生理食塩水等で適当濃度に希釈し、フロイ
ントの補助液等との懸濁液とし、動物に成因注射等によ
って投与する。

投与は１〜２週間毎に数回行い、総投与量が７５〜１０
０■／マウス程度になるようにするのが好ましい。免疫
細胞としては、最終免疫約６日後に摘出した肺臓細胞を
使用するのが好ましい。

の細胞、例えばマウスにおけるＭＳ−１、Ｐ３、Ｐ　３
−　Ｕｌ、ＭＰＯ−１１、ｓｐ２、Ｘ　６３．６．５．
３、ラットにおけるＹ　３　、　Ａｇ　１　、２　、３
等が使用される。融合反応は公知の細胞融合方法に進じ
て行われ、例えば融合促進剤の存在下培地中でインキュ
ベートすることによって行われる。

融合促進剤としては、例えばポ１１エチレングリコール
（ＰＥＧ）、センダイウィルス（Ｈ’Ｔ’Ｊ）等が使用
され、更に所望により融合効藁を高めろためにジメチル
スルホキシド等の補助剤を添加することができる。免疫
細胞と骨髄肺細胞との使用比は一般の方法と変りがなく
、例えば骨髄腫細胞に対し、免疫細胞を約１〜１０倍程
度用いればよＡ０上記融合時の培地としては、例えば骨
髄腫細胞株の増殖に用いられるようなＭＦｉＭ培地、そ
のげルペラコ改質培地、ｐｐＭｘ　−１６４０培地、そ
の他この橡の細胞培養に利用される通常の各種培地を利
用でき、通常はＦｅ２等の血清補液を抜いておくのがよ
い。

融合は、上記免疫細胞と骨髄腫細胞との所定階を手記培
地内でよく混ぜ、遠沈後上清を除去し、予め３７°Ｃ程
度に加温したＰＥＧ溶液、例えば平均分子量１．［１０
ｎ−１，０１１［１程度のものを通常培地に約６０〜６
０ｗ／ｖ％の＃度で加えてまぜあわせろことにより行々
われる。以後、適当な培地な逐次添加して遠沈し、上清
を除去する操作を繰り返すことにより）１イデリドーマ
が形成される。

所望のハイプリｒ−マの分離は、上記細胞融合後の細胞
を、通常のノ・イブ１ｊドーマ選別用培地で培養するこ
とにより行なわれる。前記した骨髄腫細胞株はヒポキサ
ンチンホスホ１１ボシルトランスフエラーゼ（）（Ｃ）
ＰＥＴ　）欠招株であり、したがってＨＡＴ　培地（ヒ
ボキサンチン、アミノブチ１１ン及びチミジンへ・含む
培地）中では生育できない。従つい。該ＨＡＴ培地での
細胞の培養は、目的−するノ・イブリドーマ以例の細胞
（未融合細胞等）が死滅するのに充分な時間、通常数日
〜数週間行えばよい。

このバイブ１１ドーマはヒボキサンチン及びチミジンを
含むＨＴ培地で１〜２週間程度培養した後、通常の培地
で培養すればよい。

かぐして得られるハイプリドーマは通常の限界希釈法に
従い、目的とする抗体の産生株の検索及び拒−クローン
化が行なわれる。かくして得られる本発明のモノクロー
ナル抗体を産生するバイブ１ｊドーマは、通常力培地で
継代培養でき、また液体窒素中で容易に長期間保存が可
能である。本発明者は、このハイプリドーマの代表とし
て、後記実施例によってイ（ＪられるＤ５及びＨ５の夫
々を自ら分誼可能な状態に保持している。

このようにして得たハイプリドーマが目的のモノクロー
ナル抗体を産生するかどうかの検索は、例えばＫＬ工Ｓ
Ａ法ＣＥ１１ｇ’Ｖａｌｌ　、　Ｌ　；　Ｍ８ｔｈ、　
Ｆｉｎｚｙｍｏｌ。

７０．４１９−４３９（１９８０）］ｘ準じて行われろ
。すなわち、抗原としてヒトｙ′Ｎの特定のドメインを
固定化Ｉ７たマイクロタイターウェルに、ハイプリドー
マ培養上清な加えインキュベートすることにより、上清
中の抗体とウェル表面に固だしておいた抗原（ヒ）ＦＮ
の特定のドメイン）と反応させろ。その後、種々の酵素
で標識した抗マウス抗体（免疫細胞がマウスの場合）回
抗ラット抗体（免疫細胞がラットの場合）あるいは、同
プロティンＡを加えインキュベーションし、よく洗浄後
、各ウェル中の酵素活性を調べろことにより行なわれる
。

一ヒ記ヒ）ＦＨの特定のドメインは、すでに本発明者が
その生理活性と共に報告■、ているＣ　ＴｈｅＪｏｕｒ
ｎａｌ　　　ｏｆ　　Ｂｉｏｌｏｇｊ、ｃａｌ　　　Ｏ
ｂｅｍｉｓｔｒｙ　　　、　　　Ｖａｌ、　　　２５　
６　。

扁１２．ＤＴ）−＜’）４５２　６４６２（１９８１）
：］スナわちヒトＦ　Ｎ　ｋ　Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ
　（プロテアーゼ。

ｔｙｐｅ　Ｘ　；シゲマ社）によって開裂したドメイン
であり、本発明においては、その中で、ＳＤＳ　７ポリ
アクリルアミｌ′８Ｉ）ｆルミ気泳動法〔（例えば、Ｌ
ａｅｍｒｎｌｊ　　、Ｕ、　　Ｋ、　　、　　Ｎａｔｕ
ｒｅ　２２７．６８０−６Ｆ３５（１９７［］　）参照
〕による分子積が１５０，０００及び１４０．ｎ　Ｏｎ
　（以下、ドメインＡとする）及び４０．０００（以下
、団メインＢとする）のドメインを使用する。このドメ
インは、それらの物理化学的ホ）るｈは、生理活性に基
づいて精製単離され、例えば、カラムクロマトグラフィ
ー、透析等により分離される。該ドメインの生理活性を
第１表に示す。

第１表また、種々の酵素で標識した抗マウス抗体、同抗ラット
抗体あるいは同プロティンＡは市販のものを、あるいは
常法によって調製したものを使用すればよい。史にまた
、該検索法においては、上述のＥＬＪＥＡ法に限らず一
般圧この種の分野で常用されるプラーク法、スポット法
、凝集反応法、０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ法、ＲＩＡ法等
の抗体の検出に用いられる種々の方法を採用することが
できる〔［バイブ１１ドーマ法とモノクローナル抗体」
参照；■Ｒ＆Ｄプランニング発行、５７年６月５日〕。

上記のようにして得た特定のバイブ１１ドーマから本発
明の抗ヒトフィブロネクチン抗体を得るには、ハイデリ
ー−マを常法に従って組織培養し、培養上清から分離す
る方法、あるいはバイブＩ）ドーマなこれと適合性のあ
る哺乳動物に投与し増殖させ、その腹水から分離、する
方法等が採用される。

前者の方法は高純度のものを得るのによく、後者の方法
は大壕生産に優れてＡる。

斜上の如くすると、バイブ１１Ｖ−マＨ５からはドメイ
ンＡに、またハイプリドーマＤ５からはドメインＢに特
異的に結合する本発明の新規な抗ヒトフィブロネクチン
抗体が得られる。従来公知のモ／　／７　ｏ−ナル抗体
［５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２　＋３
６１−６３７　（１９８０）　ｉ　Ｃｅ１ｌ　Ｊｏｌｏ
ｇｙ工ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｓｐｏｒｔｓ、　
４　、７３４　（１９８０）；Ｃｅ１ｌ　　、　２５　
、　１３３−１４１　（１９８１）　　；Ｃｅ１ｌ　、
　２６　、２５９−２６７　（１９８１）　）はドメイ
ンＡ又はげメインＢに特異的に結合するものは知られて
いない。

次に参考例及び実施例を挙げて説明する。

参考例１　ヒトプラスマフイプロネクチンフイブロネク
チン多含有上清〔ヒト血液凝固筒■因子の精製時の副産
物であるフラクションニー１（ｒ）／ｌ’＋Ｊシフ沈殿
化後の上清；　Ｄｒ、　Ｋ、Ｆｕｊｌｋａｗａ（ワシン
トン大学）より入手〕を、常法により作成したデラチン
ーセファロースカラム〔ケ１ラチン（５ｗ１ｎｓ　５ｋ
ｉｎ　、　ｔｙｐｅ工；シグマ社〕、セファロ−Ｃ４Ｂ
（ファルマシア社）　；　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｌｊｎｚｙ
ｍｏｌ。

２２．３４５−３７８（１９７１）参照〕に付しく３〜
４Ｗｒラチン／　ｍｅデル；ベラＨ＋　＄　１１ウム約
４０　ｍｌ　）、０．５ｍＭ　ＩＴＡ　、　１５０’　
ｍＭ　Ｎａ１１　、１　ｍＭフェニルメチルヌルホニル
フルオライドの２５ｍＭトリス緩衝液ＣｐＨ＝７．６）
で十分に洗浄後、１Ｍ尿罵を會む上記緩衝液で更に洗浄
する。４Ｍ尿素を含む上記緩衝液でフイプロネクチンケ
溶出し、０．５　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　５　Ｑ　ｍＭ　
Ｎａｏｌの１０　ｍＭト＋＋ヌ緩蛸＊　（ｐＨ＝　７．
６　）で４℃、６日間透析する。７５＼くして得たヒト
デラスマフイプロネクチン（ま、−８０’０に保存した
。

参考例２　）・イブ＋＋　Ｓ−マの製造■　Ｂａ１ｂ／
ｃマウスに参考例１で得たヒトプラスマフイプロネクチ
ン３．５　’？　／　ｔｎｌのフロイント完全アジュバ
ントを７５〜１００μｌ／マウス皮下注身寸する。１０
日間隔で計４回同量投与し、最終免疫の３日後に肺臓を
摘出し、牌糸口１月ＮをＲＰＭニー１６４　ｎ培地で６
回洗浄する。

マウ−’（ｆ％ｆｉｌｌｔｍ細胞株ＮＳ／ｌ　（Ｎａｔ
ｕｒｅ　Ｖａｌ、　２５ＹＳ。

Ａｕｇｕｓｔ　７　（１９７５）　）を同様に洗浄後、
このＩｓ／１　１　Ｘ　Ｉ　０７個と上記牌艇口胞４　
Ｘ　ｉ　Ｏ’イ固を５０−遠心管に入れ混合する。２′
００×２．５分遠心後、上清をパスツールピペットで除
去する。

３７℃に保温した。　＋３？　＋１エチレンク０１１コ
ール１５００（Ｆｆａｓｔｍａｎ　＊工ｎｃ、）５０ｗ
／ｖ％のＲＰＭニー１６４０溶４液１°Ｉｄを滴下し、
２分間ゆっくり混合する。

３７℃ＶＣ保ＷＡＬｊｃ　１５　％　ｙｏｓ　、　１　
ｍＭ％！′ルペートのＲＰＭＩ　−１６４０（以下［完
全ＲＰＭニー１６４０Ｊとする）１ｍｌを加え１分間、
更に同量の完全ＲＰＭ：ｒ−１６４０を加え１分間、次
いで８−の完全ＲＰＭＩを滴下し、２分間ゆつくりと攪
拌する。２００×２．５分遠心後、上清な除去し、３７
℃保温完全ＲＰＭＩ−１６４０に細胞Ｉ　Ｘ　１０７個
／カＩｅとなる様に懸濁シ、マイクロテスト−■・プレ
ート（ファルコン社）に１００μ！ずつ接種し、３７°
Ｃ１５壬炭酸がスインキュベーター内で培養する。２４
時間後１．０　Ｘ　１０−４　Ｍヒボキサンチン、４．
ＯＸ、１０−７Ｍアミノデテ１１ン、Ｃ６ｘ　１０−６
　Ｍチミジンを含む上記完全ＲＰＭＩ　−１６４１１（
以下「ＨＡＴ培地」とする）１００μｌを各ウェルに添
加する。以後上清の半分を第２．３．５．８及び１１日
目に、夫々、新しいＨＡＴ培地に換え、１４日目に同様
に上清の半分を、１．ＯＸ　１０−’　Ｍヒボキサンチ
ン、Ｃ６Ｘ　１０−５　Ｍチミジンを含む完全ＲＰＭニ
ー１６４０（以下（−’ＨＴ培地」とする）に換えろ。

同様に第１８．２２．２５及び２６日目に上清の半分を
ＨＴ培地に換え、第２８日月に上清の半分を完全Ｒｋ”
ＭＩ−１６４０に換える。以後、この完全ＩＲＰＭニー
１６４０で増殖維持する。かぐして得られるハイプリド
ーマは、これを限界希釈法によりクローニング化した。

即ち、ハイプリドーマ２．５　Ｘ　１０個／　ｍｌ、Ｂ
ａ１ｂ／ｃ−ｒウス胸腺細胞４　Ｘ　１０６個／ｍ７！
となる様に完全ＲＰＭニー１６４０にｉＩＭＩＭシ、こ
れをハイプリｒ−マ５個／ウェルとなる様に２Ｆ）０ウ
エルのプレートにまき培養した。増殖してくるノ・イブ
リドーマを更に同様にハイプリドーマ０．２５個／ウェ
ルとしてクローニング化した。各クローンの培養上清な
、後記試験例（３）と同様にして得たドメインＡ又はド
メインＢを不溶化したＵ字型マイクロタイタープレート
に加え、室温で５時間静置後培養上清ケ除去し、ゾ１／
−トをＰＢＳで４回洗浄した。５０、ｕｌのパーオキシ
ダーゼ標識プロティンＡ　（Ｌ　Ｙ。

ラボラド１１−社製）を加え、室温で２時間反応援これ
を除去し、ＰＢＳで４回洗浄した。各ウェルに０．０３
係Ｈ２Ｏ２の０．２Ｍクエン酸−リン酸塩緩衝液（ｐＨ
＝　５．０　）　、［１，５−及び４　”Ｉｔ’　／　
ｍｅオルトフェニレンジアミンの生理食塩水１．０−を
加え、室温で１０分インキュベートする。１Ｎ　Ｈｏｔ
水溶液を加えて反応を停止して、吸光度により、所望の
抗体を産生ずるクローンを検索し、かくしてクローンｆ
Ｊｏ、Ｈ５及びＤ５の単一クローン株を得た。

両細胞株はその産生てるモノクローナルは抗体により特
定され、それは後記試験例に示す特性を有する。両細胞
株は、夫々液体窒素中で安定に保存されている。

実施例１１１）　　常法通りに上記Ｈ５又はＤ５を完全ＲＰＭＩ
　−１６４０にて３７℃下、５％炭酸ガスインキュベー
ター内で４８時間培養後遠心分離（３ｎ　００　ｒｐｍ
。

１０分）して、Ｈ５産生モノクローナル抗体（抗体Ａ）
又はＤ５産生モノクローナル抗体（抗体Ｂ）を夫々含む
培養上清を得た。

（２１Ｂａ１ｂ／ｃ　？ウスに、上記Ｈ５又はＤ５の１
×１０’個／マウスをＲＰｕｘ　−１６４０培地０．５
ｍ／［懸濁し、腹腔内投与する。２〜３週間後蓄積した
腹水を採取Ｉ７て２〜５π７！／マウスの抗体Ａ又は抗
体Ｂを含む腹水を得る。

抗体濃度は、いずれも０．２〜１■／−程度である。

試験例（１）免疫グロブリンクラス各棟マウス免疫グロブリンクラスに対するウサギ抗体（
Ｌｉｔｔｏｎ　、　Ｂｉｏｎｅｔｉｃｏ　、　Ｉｎｃ、
　、　Ｋｅｎｓｉｎｇｔｏｎ　。

ＭＤ２０７９５　）及び１２５工標識プロテインＡを使
用してＹｅｈ等の方法に率じて行った（Ｍｉｎｇ−Ｙａ
ｎｇＹｅｈ　ｅｔａｌ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　、　ＶＯｌ、７＜Ｓ。

Ｎｏ、６．ｐｐ、２９２７−２９３１．（１９７９））
。

結果を第１図に示す。

（２）特異性試験ポリスチレン　マイクロタイタープレートをヒトデラヌ
マフィプロネクチン１μｆ／ｒｎｌの１３７ｍＭＮａ０
ｔ、　２．７　ｍＭ　ＫＣｌ、　８．１　ｍＭ　Ｎａ２
ＨＰＯ４、１，５ｍＭＫＨ、、ＰＯ、を含むリン酸塩緩
衝液（以下ＰＢＢとする）と２時間インキュベート後５
係ＢＳＡのＰＢＳで、更に２時間インキュベートする。

プレートｙ７　ＰＢＳで６回洗浄後ＦＢ＋３で段階希釈
した神々のフィブロネクチンを加えた前記実施例１−（
２）で得た抗体Ａと同様にインキュベートする。プレー
トをＰＢＳで洗浄後ウサギ抗マウス免疫グロブリン抗体
、次いで１２−）　Ｉ　、−−ｙ°ロチインＡと同様に
インキュベートして固相競合法によるＲＩＡ法によって
抗体Ａの特異性を試験した。上記においてプレートをヒ
トデラスマフイプロネクチン０．１μＬ／／ｄ　ＰＩ３
８　トインキユベートする事と抗体Ａの替わりに抗体Ｂ
を使用すること以外は同様圧して、抗体Ｂの特異性を試
験した。結果を第２図に示す。

図中、ヨコ軸は４ル々のフィブロネクチンの濃度を、タ
テ軸は１２５ニープロテインＡの結合率（フィブロネク
チンを加えない時の結合カウント数を１００係とする）
を夫々示す。

図中のマークは以下を表す。

○；ヒトプラスマフイブロネクチン・；ヒト細胞フィブロネクチン Δ；、牛胎児デラスマフイデロネクチンム；牛新生児プ
ラスマフイプロネクチンロ；モルモットデラスマフイプ
ロネクチン■；チキン細胞フィブロネクチン；マウスプラスマフイデロネクチン尚、各プラスマフイデロネクチンは各動物より常法によ
り得た血漿又は血清より前記参考例１と同様にして、デ
ラチンーセファロース知よるアフィニティークロマトグ
ラフィーにより精製したものを使用した。ヒト′細胞フ
ィブロネクチンは酊−３８の培養液より同様に分離した
ものを使用した。

チキン細胞フィブロネクチンは　ｙａｍａａａ等の方法
に従って得た。［Ｙａｍａｄａ　、　Ｋ、　Ｍ、　、　
Ｂｉｏ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

１６：５５５２−５５５９（１９７７））、該図より、
本発明の抗体Ａ及びＢはヒトのフィブロネクチンに特異
的な抗体であることが判る。

（３）特異性試験前記参考例１と同様にして得たヒトデラスマフイーｆロ
ネクチンを室温下に、トリプシン処理（Ｗｏｒｔｈｉｎ
ｇｔｏｎ社；　１１１？／ｍｅ　、　３　Ｑ分）又はサ
ーモリシン処理（ｐｒｏｔｅａｓｅ　、　ｔｙｐｅ　Ｘ
　、　’ｙグア社；５μ？／ｒｎｅ、４時間）して、各
々ヒトフィブロネクチン−メインを得る。〔８ｅｋｉｇ
ｕｃｈｉ　、　Ｋ、　ｅｔａｌ　。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｏｈｅｍ、　２５６　、６４５２−
６４６２（１９８１））、上記、各Ｉ−メイン及び未処理ヒトデラスマフィプロネ
クチンを５ＤＳ−ポリアクリルアミシダ９ル電気泳動に
付す。第１群は、これをコマーンープルーにて染色した
。〔パネル（１）〕他の２群は、ニトロセルロースに吸
着後抗体Ａ〔パネル（２）〕父は抗体Ｂ（パネル（３）
〕とインキュベートし次いで、ウサギ抗マウス免疫グロ
デリン抗体続いて１２５１−プロティンＡとインキュベ
ーションした。ＣＩ（ａｒｒｙＴｏｗｂｉｎ　ｅｔａｌ
、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、
　ＵＳＡＶｏｌ、７６　、Ａ９　　Ｔ）ｌ）、４３５０
−４３５４、（１９７９）参照〕、結果を第３図に示す。

図中ｖ　−ｙ　ａ　ハ、未処理ヒトデラスマフイブロネ
クチン、レーンｂは、トリプシン処理ヒトデラスマフイプロネク
チンレーンＣは、サーモＩＪシン処理ヒトデラスマフイプロ
ネクチンを示す。

読図より、抗体Ａは、サーモリシン処理ヒトデラスマフ
イデロネクチンの１５０．０００及び１４１］、［）　
００ドメイン（ドメインＡ）に特異的に結合することが
、又抗体Ｂは、同４０．０００ドメイン（ドメインＢ）
に特異的に結合することが判る。

尚、ト１１デシン処理ヒトデラスマフイプロネクチンの
２００．０００及び１８０．００　（］げメインは、上
記ドメインＡ及びドメインＢの両ドメインを含む。

（４）　　ポリスチレンマイクロタイタープレートをヒ
トデラスマフイプロネクチン５μ２／−のＰＢＳと２時
間インキュベート後、５　Ｌｔ）ＢＳＡのＰＢＳで更に
２時間インキュベートし、プレートをＰＢＳで３回洗浄
する。これを、ＰＢＳで段階希釈した前記実施例１−（
２１で得た抗体Ａ又は抗体Ｂの５０μＥと同様にインキ
ュベートし、プレートをＰＢＳで洗浄後１２５１−デラ
チｙ”１０１１ｃＶｍｌのＰＢＳ’５Ｑμ）と同様にイ
ンキュベートする。プレートをＰＢＳで洗浄後者ウェル
を切り離し、その放射活性（１）を測定した。

抗体濃度がＯの時の放射活性を１０として、抗体Ａ又は
抗体Ｂのフィブロネクチン−ｒラチン結合の抑制案を下
記式にて賀出した。

上Ｏ結果を第４図に示す。

図中、タテ軸は抑制率を、ヨコ軸は抗体の希釈倍数を示
し、・−・は抗体Ａを　αつは抗体Ｂを示す。

１ｙより抗体Ｂが、ｒラチンのフィブロネクチンへの結
合を抑制することが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の抗体の免疫グロブ１１ンクラスを示
す図面、第２図は、本発明の抗体の特異性を示す図面、
第３図は、本発明の抗体が結合するヒトフィブロネクチ
ンドメインを示す図面、第４図は本発明の抗体によるヒ
トフィブロふクチンーデラチン結合の阻害を示す図面で
ある。以上ｙＩ：　１図０　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　１（
１。放射２占性、　ｃｐｍ　Ｘ　１０−” ｊ尼２図フィブ゛口不クチ”　（１’！Ｊ／ｍｅ）第：３図ｆｉ＋　　　　　　　　　（２１（３１コマ−７−１’
ｔ’＋、体Ａ１几イ本ｌ）フルー４ＱＫ−□

Claims

【特許請求の範囲】

（１）　　ヒトフィブロネクチンで免疫した哺乳動物の
免疫細胞と骨髄肺細胞との融合によって形成されるハイ
プリドーマ上り生ぽされる、（ａ）本質的にヒトの全て
のフィブロネクチンと特異的に反応し２、（ｂ）ヒトフ
ィブロネクチンをサーモ１１シンで開裂した分子量（Ｓ
ＤＳ　／ポリアクリルアミｒダヤ電気泳動法）　１５０
．０００及び１４０．００　ＣＪ又は４［１，０００の
ドメインと特異的に結合するモノクローナル抗体。