JPH02283294A - ヒトモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皇１上旦剋里立野 本発明は、緑膿菌に対するヒトモノクローナル抗体とそ
の製造方法、および、その用途に関する具体的に４よ、
血清型Ａおよびト（緑膿菌の０抗原中に存在する共通構
造部分を、特異的に認識することにより、複数の血清型
の緑膿菌に対して、結合性を示すヒトモノクローナル抗
体、その製造方法と用途、および該抗体を産生ずるハイ
ブリドーマに関する。本発明の抗体は、緑膿菌を含む感
染症の予防治療剤として有用である。

従来の　　および解　すべ　課題 細菌感染症の治療において問題とする病原菌は抗生物質
の開発とともに変化している。すなわち臨床上用いられ
る抗生物質の種類の変遷に伴ない細菌感染症を引き起こ
す細菌、いわゆる起炎菌が交代し、できた。従来、低病
原性または弱毒性といわれた細菌、なかでも、特に緑膿
菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に
よる感染例が増加し、緑膿菌は近年、主要な病原菌の一
つとなっている。緑膿菌感染は、免疫抑制剤の投与を受
は免疫能の低下している患者、又は癌患者や熱傷患者お
よび新生児などの免疫不全・低下症の患者において重篤
な症状を引き起こし死に至らしめる場合が多い細菌感染
として知られている。

細菌感染を予防・治療する方法として、まず第一にあげ
られるのが、抗生物質および合成抗菌剤を用いた化学療
法である。ストレプトマイシン、カナマイシン、ペニシ
リンやセファロスポリンなど幾多の抗生物質が開発され
、その多くはぶどう球菌を代表とするほとんどのグラム
陽性球菌や、大腸菌などのダラム陰性閑に感受性を示し
、著効な臨床効果を示してきた。しかしながら、今日ま
での多くの研究開発にもかかわらず、緑膿菌に感受性を
示す薬剤は依然少ないのが現状であり、しかも、今日、
感受性を示すとされる薬剤でも、そのほとんどが、緑膿
菌に対してその増殖を単に阻害するいわゆる静菌的に作
用するのみで、殺菌力に欠けており、臨床の場において
著効な治療効果を示すに至っていない。ところで、細菌
感染症を予防および治療することができる療法として、
免疫グロブリン製剤の投与、いわゆる抗体療法があり、
抗生物質療法と併用される、又は、それに代わるものと
して注目されている。ウマやウサギ等の動物を能動的に
免疫することによって抗体価の高い血清を得ることがで
き、その血清を投与する抗体療法は、各種の動物を用い
た実験的感染症において著効な治療効果を示すことが多
くの実験にて実証されている。ヒト以外の動物由来の血
清を用いた抗体療法がヒトにおいても有効性を示すこと
は、ジフテリア毒素や蛇毒の例で周知のことである。し
かしながら、ヒト以外の動物から得られた異種蛋白をヒ
ト体内へ移入するこの方法は、アナフィラキシーやその
他のアレルギー反応などの重篤な副作用を引きおこし一
般細菌感染症の治療法として採用されるに至っていない
。

かくして、′ａ菌に対して高い抗体力価を有し、細菌感
染症の治療効果の大きいヒト免疫グロブリンの開発が望
まれている。

従来のヒト免疫グロブリン製剤は、健常人又は細菌、略
染既応患者から血液を採取し、既知の方法にて免疫グロ
ブリン画分を分取・精製した後にポリエチレングリコー
ル添加、蛋白分解酵素処理、スルホン化、ＤＥＡＥ−カ
ラムクロマトグラフィー等の、凝集物を除去する方法に
より筋肉注射用のみならず、静脈注射用に製剤化された
ものである。

これらヒト免疫グロブリン製剤には、ヒト以外の異種動
物由来の免疫グロブリンを投与した時にみられるアナフ
ィラキシ−等の副作用は無い等の利点をもつが、幾つか
の欠点をもつ。第一に、細菌に対する抗体価が低く、必
ずしも充分な治療効果を期待しえない。第二に、高力価
の免疫グロブリンを大量に安定して供給することが難し
い。

健常人ボランテ、イアや患者より採取された血液を材料
に製造されており、高い力価の血清を一定して入手する
ことは極めて難しく、製造ロット毎に、抗体価が変動す
ることがある。第三に、任意のヒトの血液を材料に製造
されることにより、免疫グロブリン製剤にＨＢウィルス
などの肝炎ウィルスやＡｄｕｌｔ　Ｔ　ｃｅｌｌ　Ｉｅ
ｕｋａｅｍｉａｖｉｒｕｓ＜ＡＴＬＶ、ＨＴＬＶ）など
が混入することがあり得る。これらの問題を解決すべく
、従来のヒト免疫グロブリン製剤やマウスモノクローナ
ル抗体に代わるものとして、細菌感染症の予防および治
療に有効且つ有用なヒトモノクローナル抗体の作製およ
びその応用が望まれている。

抗体が細菌の表層へ結合すると、貧食細胞による細菌の
貧食が促進されたり（オプソニン化による貧食能の促進
）、又は補体による細菌の溶解が惹起される。抗体療法
のターゲットとなる緑膿菌の表層抗原としては、ＬＰＳ
、外膜蛋白質、ペン毛および線毛が知られている。この
うち外膜蛋白についてはＳａｗａｄａらがこれらを認識
するマウスモノクローナル抗体はＬＰＳを認識するマウ
スモノクローナル抗体に比べ感染防御に対して極めて多
ユの抗体量を必要とすることを示した（Ｊ、　ｌｒ＋４
ｅｃｔ。

Ｄｉｓ、、　　１５０．５７０−５７６、１９８４）。

Ｌ　Ｐ　Ｓは、〇−抗原を規定する〇−多糖体、菌種に
よっである程度の共通性がある外コア（ｏｕｔｅｒ　ｃ
ｏｒｅ）オリゴ糖、その構成糖成分（ｈｅｐｔｏｓｅ及
びＫＤＯ）が腸内細菌族に共通である内コア（ｉｎｎｅ
ｒｃｏｒｅ）オリゴ塘、およびリピドＡより成る。

このうち菌の菌体表層で最も外側に存在する、〇−抗原
（〇−多糖体）と呼ばれる多糖体の構造は２〜５残基の
糖から成る繰り返し単位が重合しており、多種多様であ
る。現在までに後述するいくつかの血清型標準株に対し
て、その〇−抗原の構造が解析され報告されている（Ｅ
ｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１０６゜６４３−６
５１．１９８０：　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
、　１２５．２２９−２３７、１９８６；　Ｅｕｒ、　
Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５０．５４１−５５０゜
１９８５；　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１
５５．６５９−６６９．１９８６；Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、、　旦５４９−５６１．１９８７）。

しかしながら、〇−抗原の構造決定には、多大の労力を
必要とする為に、現在、緑膿菌の分類には、標準株の〇
−抗原に対して調製された抗血清又はマウスモノクロー
ナル抗体が利用されている。すなわち、それらの抗体（
抗血清）との免疫学的反応性の差異によって分類される
。血清型による分類と呼ばれる。

水量による血清型１−１７　（１７種類）の分類（Ｊｐ
ｎ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　４４．１．１９７４
）　、Ｆｉｓｈｅｒによる血清型１〜７（７種類）の分
類（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

９８、８３５．１９６９）、日本緑膿菌研究会血清型別
検討委員会による血清型Ａ−Ｍ（１３種類）の分類（、
Ｉｐｎ、　　Ｊ、　　Ｅｘｐ、　　＼ｌｅｄ、　　４６
．　３２９．　　１９７６）　　、　Ｉｎｔｅｒｎａｔ
ｏｎａｌ　ＡｎＴｉｇｅｎｉｃ　Ｔｙｐｉｎｇ　Ｓｙｔ
ｅｍ（ＩＡＴＳ）による血清型１−１７（１’ｌ！類）
の分類（Ｉｎｔ、　、Ｊ、　５ｙｓｔ。

口ａｃｔｅｒｉｏ！、、　３３．２５６．１９８３）等
が知られている。

品々の分類およびその相互関係を表１に示す（Ｊｐｎ、
　　Ｊ、　　ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、　　４６．　３２９
．　　１９７６）　　。

表１　緑膿菌血清型別分類 Ｊａｐａｎｅｓ　Ｃｏｍｍ１ｔｔｅｅ”　　ｌｉｏｍｍ
ａ　　　ＩＡＴＳ　”　　Ｆｉｓｈｅｒｊ＼　　　　　
　　　　１３ Ｂ　　　　　　２，７．１３，１６　２，５．＋６Ｃ３
８ Ｄ　　　　　　　　　１　　　　９ Ｅ　　　　　　　　　　５　　　　１１Ｆ　　　　　　
　　　　６　　　　　４Ｇ　　　　　　　　　　８６ Ｈ９１０ Ｊ　　　　　　　　　　１１　　　　１５Ｋ　　　　　
　　　　１２　　　　１３Ｌ　　　　　　　　　　１４ Ｍ　　　　　　　　　１５．１？ ７、１２．１４．１７ 一般に、〇−抗原に対する抗体は、対応する血清型の緑
膿菌に対しで、特異的に結合性を示し、かつ、その対応
する血清型の緑膿菌による感染症に対しては、他の緑膿
菌表層抗原に対する抗体と比較して、優れた予防・治療
効果を示すことが知られている。しかしながら、その他
の対応しない血清型の緑膿菌に対しては結合性を示さず
、予防・治療効果も見られない。

そこで、〇−抗原に対するモノクローナル抗体を用いて
、緑膿菌感染症予防・治療剤を開発する場合に、いくつ
かの血清型の〇−抗原に特異的なモノクローナル抗体を
複数個混合（カクテル）することにより、その適用範囲
を広くする必要が生じる。

しかし、このようなカクテル製剤を構成するモノクロー
ナル抗体の種類を多くすることは、それだけ、モノクロ
ーナル抗体産生細胞株の培養、モノクローナル抗体の精
製等の製造工程が、増加しかつ、複雑となる結果、生産
性及び製造コスト面において、問題点が生ずる。

前述の通り、一般に坑外膜蛋白モノクローナル抗体は、
結合範囲は広いが、強い予防治療効果は期待できず、ま
た、公知のＬＰＳのコアオリゴ糖に対する抗体について
も同様の傾向がある。そこで優れた効果の期待できる抗
〇−抗原モツクローナル抗体のカクテル製剤の前述の、
生産性および製造コスト面での問題点の解決が望まれる
。つまり、〇−抗原を認識し、優れた予防、治療効果を
示しかつ、複数の血清型の緑膿菌に対して結合性を示す
モノクローナル抗体を得ることができれば、カクテル製
剤の生産において、カクテル化するモノクローナル抗体
の種類を少なくすることが可能となる、あるいは、同数
のモノクローナル抗体のカクテル化により、より広い血
清型の適用範囲をカバーする抗〇−抗原モツクローナル
抗体カクテル製剤の生産が可能となる。

福田らは、緑膿菌のＯ抗原に対して、複数に反応するヒ
トモノクローナル抗体が得られたと報告している（Ｗ０
８８１０４６６９）。しかし、この報告においては、得
られたモノクローナル抗体が２種の血清型録膿菌標準株
由来ＬＰＳに対して結合することが示されたにすぎず、
そのモノクローナル抗体が、緑膿菌ＬＰＳ中の〇−抗原
を特異的に認識するとはいえない。さらに、１〜２種の
標ｑ株由来ＬＰＳに対する反応性のみで、モノクローナ
ル抗体がその血清型特異的に結合すると結論づけること
も不十分である。また、この報告に示されたモノクロー
ナル抗体は、ＨＰｓ　１．２．４．５．６．７．８．９
．１．０．１１．１２の１１種であり、おのおの、緑膿
菌血清型りとＩ、　　ＥとＦ、　Ａとり、　ＧとＨ，Ｅ
とＦ、　ＡとＦの標準法由来ＬＰＳに対して、結合性を
示しており、緑膿菌血清型ＡとＨのＬＰＳ、しかもそれ
らＬＰＳ中の〇−抗原に対して、特異的に認識するモノ
クローナル抗体に関する記述はない。

また、Ｚｗｅｅｒｉｎｋらは、血清型Ｂ及びＣ（Ｆｉｓ
ｈｅｒの血清型による分類において３．６及び７）の緑
膿菌由来ＬＰＳに対して、結合するヒトモノクローナル
抗体を樹立したと報告している　（Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、　５６．１８７３−１８７９．１９８８）
（特開昭６３−１０７９９９）。

しかし、この報告においても、前述の福田らの報告と同
様に、そのモノクローナル抗体の認識する抗原がＬＰＳ
中に存在することのみが示されているにすぎない。

孟里解迭Ω土Ｒ こうした状況に鑑み、本発明者らは、前述の問題点を改
善すべく、緑膿菌感染症に有効なヒトモノクローナル抗
体および、それを含む高力価ヒト免疫グロブリンおよび
それを安定的かつ大量に製造する方法を確立するために
鋭意研究し、その結果、血清型の異なる緑膿菌の〇−抗
原中に存在する共通構造部分を特異的に認識することに
より、複数の血清型の緑膿菌に対して結合性を示し、緑
膿菌感染症に対して強い予防・治療効果を示すヒトモノ
クローナル抗体を得た。

具体的には、該モノクローナル抗体は、血清型Ａ及び血
清型Ｈ緑膿菌の〇−抗原中に存在する共通構造部分を、
特異的に認識することにより、血清型Ａ及び血清型Ｈに
分類される緑膿菌臨床分離株のほとんどすべてに対して
結合性を示し、かつ、対応する緑膿菌の感染症に対して
強い予防・治療効果を示す。さらに、血清型Ａ標準法ｒ
［Ｄｌｏｏｌの０抗原の構造（Ｊ、　８ｉｏｃｈｅｍ、
、１０４．６７１−６７８．１９８８）及び血清型Ｈ標
準味１１０１００９のＯ抗原の構造（Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１０５．３５−３８．１９８９）
は、いずれも解析されており、それらの報告より、Ｎ−
アセチル−し−ガラクトサミヌロン酸残基を中心とした
共通構造部分を見出すことができる。（第１図）すなわ
ち、該モノクローナル抗体は血清型Ａおよび血清型Ｈ緑
膿菌の０抗原中に存在するＮ−アセチル−Ｌ−ガラクト
サミヌロン酸残基を中心とした共通構造部分を特異的に
認識している。なおＮ−アセチル−し−ガラクトサミヌ
ロン酸残基は非常に特徴的な糖残基であり、現在までに
、血清型Ａ及びＨ緑膿菌の０抗原に見出された以外には
報告されていない。通常の手法により、血清型標準法の
〇−抗原に対して調製された抗血清には、前述のような
、０抗原中の共通構造部分を強く認識する性質は認めら
れない。また、マウス及びヒトモノクローナル抗体にお
いても、該モノクローナル抗体のような、血清型Ａ及び
血清型Ｈ緑膿菌のＯ抗原中に存在する共通構造部分を特
異的に認識する性質を示すものは、現在までその報告も
なかった。本発明者らは、初めて該モノクローナル抗体
を引立した。

また、モノクローナル抗体の認識する抗原の構造を詳細
に決定する技術、及び、０抗原の共通構造部分に注目す
ることにより、該モノクローナル抗体の特異的に認識す
る抗原構造が前述のとおりであることが確認された。ヒ
トモノクローナル抗体を予防・治療剤あるいは、診断薬
として開発する場合、そのヒトモノクローナル抗体の認
識する抗原構造が明確に決定されていることは、重要な
要因であり、この点においても、該モノクローナル抗体
は有用性が高い。本発明は、血清型Ａ及び血清型Ｈ緑膿
菌のＯ抗原中に存在する共通構造部分を特異的に認識す
ることにより、該血清型の緑膿菌に対して結合し、かつ
、対応する血清型の緑膿菌感染症に対する予防、治療効
果のあるヒトモノクローナル抗体及びそれを少なくとも
一種類含む高力価免疫グロブリン製剤及び、その特異抗
体を連続的に産生じ得るヒト細胞株及びその細胞を培養
することを含む特異抗体の製造方法を提供する。該モノ
クローナル抗体の具体例として後述の実施例記載のＴＳ
３Ｇ２があげられる。

本発明によって得られる抗体とは、血清型Ａ及び血清型
Ｈ緑膿菌に結合する能力をもつ、一つの抗体産生細胞ク
ローンが産生ずるヒトモノクローナル抗体である。方法
としては生体内又は、生体外にて緑膿菌（生菌又はホル
マリンや加熱による死菌菌体）、好ましくは、緑膿菌に
由来するＬＰＳによって感作されたヒトリンパ球Ｂ細胞
を骨髄腫細胞（ミエローマ：　ｍｙｌｏｆｆｌａ）又は
Ｂリンパ芽球様細胞（Ｂｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ
　ｃｅｌｌ）と細胞融合することにより、試験管内にて
連続的に細胞増殖し、かつ所望の特異抗体を連続的に産
生ずる細胞株を樹立する。これらの樹立株を試験管内培
養し、培地中に分泌される抗体を精製することにより抗
体を大量に製造する。

血清型とは、緑膿菌の各血清型標準法に対して作製され
た特異的に反応する抗血清又はマウスモノクローナル抗
体を用いた、免疫化学的反応の差異に基づ（緑膿菌の分
類法で、ここでは日本緑膿菌研究会血清型別検討委員会
による分類を指す。

ＬＰＳとは、リポ多糖のことでダラム陰性菌外膜の主要
な構成成分であり、リピドＡと呼ばれる糖脂質に、２−
ケト−３−デオキシオフトン酸、ヘプトース、エタノー
ルアミン、リン酸等を構成成分とする内コアオリゴ糖部
分、および菌種によって異なる成分を有し、緑膿菌にお
いては、グルコース、ラムノース、ガラクトサミン、ア
ラニン等を構成成分としている外コアオリゴ糖部分が結
合しており、更にその先に血清型を規定している〇−抗
原と呼ばれる多糖鎖が結合したものを指す。

モノクローナル抗体とは、細胞融合法（Ｎａｔｕｒｅ。

匡、１り５．１９７５）あるいはＥＢウィルス・トラン
スフォーメーション法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、、　７０．１９０．１９７３）などにより得ら
れる、単一な抗体産生細胞クローンにより産生される、
均一な分子構造を有する抗体を指す。

本発明を以下、更に詳細に説明する。

本発明に含まれるヒトモノクローナル抗体の製造方法は
、基本的に、以下の諸過程にわけることができる。■抗
原感作されたヒトリンパ球Ｂ細胞の調製、■無制限増殖
能力の賦与によるモノクローナルな特異抗体産生細胞株
の樹立、■モノクローナルな特異抗体産生細胞株の培養
、■培養液からのモノクローナルな特異抗体の精製、■
モノクローナルな特異抗体を含む高力価免疫グロブリン
製剤の調製。順次、以下に説明する。

ヒトのリンパ球Ｂ細胞とは、血清型ＡおよびＨ緑膿菌の
Ｏ抗原中に存在する共通構造部分を特異的に認識する抗
体を産生ずるヒトリンパ系細胞で主として末梢血液より
リンフォプレップ、モノポリ分離液などのリンパ球分離
液を用いた遠心分離法によって分離されるが、各種疾患
の診断および治療の目的で摘出されたリンパ節、肺臓な
どの臓器や請帯血由来のリンパ球Ｂ細胞を材料に用いる
こともできる。緑膿菌による感染症を患ったことがあり
、生体内で感作された既応症のヒト由来のリンパ球Ｂ細
胞を用いることが望ましい。あらかじめ、血清中の緑膿
菌ホルマリン死菌あるいは緑膿菌由来のＬＰＳにたいす
る抗体価を測定することにより適切なリンパ球提供者を
選別することができる。また、別の方法として、緑膿菌
症の有無を問わず、ヒトリンパ球Ｂ細胞を採取し、試験
管内にて緑膿菌ホルマリン死菌、好ましくは緑膿菌ＬＰ
Ｓを混合することによって感作せしめることができる。

すなわち、抗原としての緑膿菌ホルマリン死菌、好まし
くは緑膿菌ＬＰＳをリンパ球Ｂ細胞に添加する。更にア
メリカヤマゴボウレクチン（ＰＷＭ）などの植物レクチ
ン、Ｃｏ　ｗａｎ　Ｉなどの菌体成分、又はヒトリンパ
球の混合培養液や肺臓、胸腺細胞や謄帯血細胞培養液な
ど、Ｂ細胞増殖因子およびＢ細胞分化因子等のリンフ才
力イン類を含む溶液を同時に、又はそれぞれの組み合わ
せで添加することによって試験管内にて抗原感作し、引
き続き抗体産生細胞へと増殖・分化させたヒトリンパ球
Ｂ細胞を用いることができる。これらのヒトリンパ球Ｂ
細胞は、ある限られた期間小玉の抗体を分泌することが
可能であるが、無制限に増殖することはできないことを
特徴とする。抗原感作されたヒトリンパ球Ｂ細胞を無限
に連続して増殖可能な細胞株とする方法としては、抗原
感作されたヒトリンパ球細胞と骨髄腫細胞とをポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）の存在下に細胞融合する方法
を用いる。用いられる骨髄腫細胞はＰ３Ｘ　６３−Ａｇ
８（Ｐ３　）、Ｐ３　Ｘ　６３−Ａｇ　８．６５３など
の、マウス骨髄腫細胞由来のヒポキサンチン・グアニン
・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＰＴと略
）欠如変異株、ヒト骨髄腫細胞Ｕ−２６６由来のＨＧＰ
ＲＴ欠如変異株又は、マウス骨髄腫細胞とヒト骨髄腫細
胞、もしくは、ＳＨＭＤ−３３などのマウス骨髄腫細胞
とヒトリンパ球Ｂ細胞との細胞融合により得られるマウ
ス・ヒトへテロ骨髄腫細胞由来のＨＧＰＲＴ欠如変異株
などを指す。骨髄腫細胞の代わりにヒトＢリンパ芽球細
胞由来のＨＧＰＲＴ欠如変異株を用いることもできる。

ＰＥＧとしては、ＰＥＧ　１．０００〜６．０００を３
０〜５０％（ｗ／ｖ）の濃度で用いる。レクチン、ポリ
ーＬ−リジンやＤＭＳＯなどを添加することにより融合
効率を高めることもできる。融合方法は、マウス細胞同
志を融合し、マウスモノクローナル抗体を産生ずるハイ
ブリドーマを取得したＫｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　ｙｉ＋ｓ
ｔｅ；ｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ　２５６．４９５．１
９７５）に準する。簡単に記述すれば、抗原感作された
ヒトリンパ球細胞とＨＧ　Ｐ　ＲＴの欠如した骨髄腫細
胞もしくは、マウス・ヒトへテロ骨髄腫細胞とを３〜ｌ
：ｌの割合にて混合し、４５％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ１５０
０〜６０００を０．５〜１分間に少量ずつ加え、３０秒
〜３分間静置する。その後、５〜１０分間にｌＯ〜５０
１ｎｌ！の血清不含培地を加え、２−のＦＣＳを加え、
３７℃にて１０〜６０分間インキュベートする。遠心後
、培地を加え５ｘｔｏ’〜５ＸｌＯ’個細胞／ｍｌの濃
度に調製し、９６穴マイクロプレートにｌウェルあたり
５ＸＩＯ’〜５ｘｌＯ’個の細胞を播種する。ハイブリ
ドーマの選択にはヒポキサンチン・アミノプテリン・チ
ミジン含有培地（ＨＡＴ培地と略）又、ホキサンチン・
アザセリン含有培地（ＨＡｚ培地と略）を使用し、５％
ＣＯ２，３２〜３７°Ｃにて培養する。約ｌθ〜２０日
間新しいＨＡＴ培地又はＨＡｚ培地に、続いて約３〜６
日間ヒポキサンチン・チミジン含有培地（ＨＴと略）又
は、ヒポキサンチン含有培地（Ｈ培地と略）に、３日毎
に半型ずつ交換を続は約２〜３週間培養して、増殖して
くるコロニー、いわゆるハイブリドーマを得る。ＨＧＰ
ＲＴ欠如変異株を用いることはなく、代謝阻害剤を組み
合わせることによってハイブリドーマを選択することも
可能である。

ハイブリドーマの培養液中の１７種類の血清型別パネル
から成る１７種類の緑膿菌ホルマリン死菌あるいはＬＰ
Ｓに対する抗体価をＥＬＩＳＡ法又はラジオイムノアッ
セイ（ＲＩＡと略）によって測定し、更には、ウェスタ
ン・プロッティングの手法を併用することにより、複数
の血清型の緑膿菌に対して結合性を示すヒトモノクロー
ナル抗体産生株を選別する。限界希釈法又は軟寒天法に
よって、２〜３回クローニングを繰り返し、増殖の早い
、特異体産生量の多い、安定した細胞株を得る。

以上、細胞融合法（ｃｅｌｌ　ｆｕｓｉｏｎ　ｍｅｔｈ
ｏｄ；ｈｙｂｒｉｄｏｍａｍｅｔｈｏｄ）を用いて、抗
原感作ヒトリンパ球Ｂ細胞より樹立された細胞株は、連
続的に増殖することができること、しかも、特異抗体を
安定的に、かつ大】に産生じ得ることを特徴とする。こ
れら樹立されたハイブリドーマ（０，５〜５Ｘ１０’個
細胞／ｄ）を通常の動物細胞培養培地にて００２インキ
ユベーターを使用して２〜ｌＯ％ＣＯ２，３２〜３７℃
の条件のもとて培養フラスコやプレート等の容器内で静
置培養又は回転培養する。特に大量に培養する時は、動
物細胞用に設計されたジャーファーメンタ−やホロファ
イバーシステム等を用いることもできる。通常の動物細
胞培養培地とは、ウシ胎児、仔ウシ、ウシ、ウマおよび
ヒトなどの血清を２〜２０％含有するＲＰＭＩ　１６４
０、Ｅａｇｌｅ’　ｓ　ＭＥＭに代表される培地、又は
、インシュリン、トランスフェリン、エタノールアミン
、セレナイト、ウシアルブミン、リビドなど細胞の増殖
に必要な微量成分を含む無血清培地を指す。

上記の試験管内細胞培養以外に、ハイブリドーマをヌー
ドマウスなどの動物体内へ接種することによって細胞を
腹腔などの体内にて培養することも可能である。マウス
やヌードマウスの場合、１匹あたり０．５〜２．５Ｘ１
０’個の細胞を腹腔内投与する。この場合、細胞接種前
に、プリスタンや抗アシアロＧＭ、抗体を投与すること
が望ましい。Ｘ線照射や摘牌手術も有効の場合がある。

抗体の精製は通常の生化学的手法を組み合わせることに
よってなされる。すなわち、硫安沈澱分画法、エタノー
ル沈澱分画法、ＰＥＧ分画法、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過法、アフィニティクロマトグラフィー
、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動法等である。

精製過程において、凝集物の形成や抗体活性の低下を防
ぐ工夫が必要である。例えば、ヒト血清アルブミン（Ｈ
３Ａと略）を０．０５〜２％の濃度で添加する。

その他グリシンやＬ−アラニンなどのアミン酸類、特に
リジン、アルギニンやヒスチジンの塩基性アミノ酸、グ
ルコースやマンニトールなどの糖類、塩化ナトリウムな
どの塩類を添加することが好ましい場合がある。

精製されたヒトモノクローナル抗体は、生物学的製剤の
製剤化に通常用いられる方法によって製剤化される。基
本的には、メンブレンフィルター等による濾過除菌操作
の後に、安定化剤とともに滅菌バイアルに凍結乾燥され
る。

該ヒトモノクローナル抗体製剤は、緑膿菌感染予防・治
療剤として血清型の異なる緑膿菌のＯ抗原中に存在する
共通構造部分を特異的に認識する１種類のヒトモノクロ
ーナル抗体より成ることも可能であるが、更に好ましく
は、他の緑膿菌０抗原を認識するヒトモノクローナル抗
体と２種類以上混合して用いられる。また、これら以外
の緑膿菌表層抗原、例えばＬＰＳ中の〇−抗原以外の抗
原構造部位、外膜蛋白、ペン毛あるいは線毛、さらには
、緑膿菌由来の病原因子である、外毒素、エラスターゼ
、プロテアーゼなどの外酵素などを認識するヒトモノク
ローナル抗体あるいは従来型のヒト免疫グロブリン製剤
と混合して使用される。

更には、緑膿菌以外の細菌、ウィルス、真菌、原虫、癌
細胞に帯するヒトモノクローナル抗体、あるいは、従来
型のヒト免疫グロブリン製剤と混合して使用することも
可能である。

従来のヒト免疫グロブリン製剤に、本発明により得られ
るヒトモノクローナル抗体を添加して、緑膿菌に帯する
高力価免疫グロブリン製剤とされる。

該ヒトモノクローナル抗体は、血清型の異なる緑膿菌の
Ｏ抗原中に存在する共通構造部位への結合を介して緑膿
菌表層へ結合して、菌体をオプソニン化することにより
貧食細胞による貧食・殺菌作用の増強、又は補体を活性
化することによる溶菌作用等により緑膿菌による実験的
マウス感染症を治療することができる。

緑膿菌による感染症および、その細菌を含む混合細菌感
染症の治療・予防に用いられる時、該ヒトモノクローナ
ル抗体は、通常、成人に対し約０．５〜５００ｍｇ、好
ましくは５〜５０ｍｇが投与される。

以上、詳しく述べたように、本発明によって得られるヒ
トモノクローナル抗体は血清型Ａ及び血清型Ｈ緑膿菌の
０抗原中に存在する共通構造部分を特異的に認識するこ
とにより血清型Ａ及び血清型Ｈ緑膿菌の複数の血清型の
緑膿菌に対して結合性を示し、対応する血清型緑膿菌を
用いたマウス実験的感染症の系で優れた治療効果を示す
ことが第一の特徴である。その他、ヒト由来の蛋白であ
ることにより、異種蛋白の投与時にみられるアナフィラ
キシ−等の副作用の少ないことが期待されるし、特定の
細胞より生産・精製される抗体であることにより、不特
定多数のヒト血液より製造された従来の免疫グロブリン
製剤にくらべ、未知のバイオハザードが混入してくる可
能性の低いことが特徴である。又、本モノクローナル抗
体の製造方法としては、生体外で、大量に、高力価の抗
体を安定して製造することが特徴であり、従来のヒト血
液より製造する方法にくらべ高力価など生物活性の点で
、安定的供給ができるなど品質管理の点で優れる。

以上、本発明の基本となるものである。

次に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが
、本発明はこれのみに限定されないことは言うまでもな
い。

実施例１ ヒト・マウス細胞融合によるヒトモノクローナル抗体Ｔ
Ｓ３Ｇ２産生株の樹立 （１）ヒト末梢血からのリンパ球の調製、及び培養血清
中の緑膿菌表層に対する抗体価が高い健常人ボランティ
ア、ドナーより末梢血１００−を採取した。遠心管（住
友ベークライト、５〇−容積）に１５艷のモノポリ分離
液（Ｆｌｏｗ、　Ｌａｂ、）を入れその上に更に末梢血
２０１ｎｌを静かに重層した。低速遠心機（トミー精工
、Ｒ３−２０ＢＨ）を用い、ｌ、　５００ｒｐｍ（ロー
ターＴＳ−７）で、室温３０分間遠心分離し、赤血球と
リンパ球を分離した。リンパ球を含む部分を回収し、Ｄ
ｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭＥＭ（以下Ｄ−
ＭＥＭと略す）で、３回洗浄した後、細胞数を計算した
。その結果、１．ｌＸｌ０”ケのリンパ球を得た。

得られた末梢血リンパ球１．ｌＸｌ０”細胞を抗原とし
てホルマリン処理緑膿菌死菌（Ｉ［Ｄｌｏｏｌ（Ａ型）
、ｌＩＤ１００２（Ｂ型）各０．０００２Ｘ）を含む５
５−のリンパ球培養用培地（後述）に懸濁し、ｌウェル
あたり２ＸｌＯ’ケのリンパ球細胞となるように２４ウ
エルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、　＃３４２４）
に分注し、５％ＣＯ２，３７°Ｃにて、６日間培養した
。

上記のリンパ球培養用地とは、非動化したウシ胎児血清
（以下ＦＣＳと略す）を２０％（Ｖ／Ｖ）、ピルビン酸
ナトリウム（０，０５ｍｇ／ｄ）　、２−メルカプトエ
タノール（５ＸｌＯ−’Ｍ）、ウシ血漿由来トランスフ
ェリン（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、）３０ｇｇ　／ｙｔｌ　、アメリ
カヤマゴボウ由来植物レクチン（以下ＰＷＭと略す）　
（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂ、　）０、０２Ｘ（ｖ／ｖ）を含
有するＲＰＭＩ−１６４０培地を指す。

（２）細胞融合 ヒト・マウス・ヘテロ・ミエローマ細胞Ｂ胞ＳＨＭ−Ｄ
３３（ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＲＬ　１６６８）をＤ−ＭＥ
Ｍ（１５％ＦＣＳを含む）で継代しておき、そのうち４
ＸｌＯ’ケの細胞をＤ−ＭＥＭにて２回洗浄した。

一方、実施例１−（１）の記載通り、末梢血リンパ球を
６日間培養後、２４ウエルマイクロプレートより回収し
細胞数を計算したところ、８Ｘ１０’ケのリンパ球が回
収された。このリンパ球をＤ−ＭＥＭにて３回洗浄し、
上記のヒト・マウス・ヘテロ・ミエローマ細胞と混合し
、遠心により細胞を沈査とした。この沈査にｌｄのポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）溶液（０，４５ｇ　ＰＥ
Ｇ４０００　Ｍｅｒｃｋ。

０．４５ｄ　ＰＢＳ（−）、　０．　１−ジメチルスル
フオキシド）を約１分かけて、遠心管を回転しつつ添加
し、室温にて１分間静置した。

次に、Ｄ−ＭＥＭを１分間２−の割合で遠心管を回転し
つつ添加し、これを４回繰り返し、更に、ｌＯ％ＦＣ３
を含むＤ−ＭＥＭで同様の操作を３回繰り返す。最後に
１．５ｄＦＣ３を加えた後、３７℃にて２０分間静置し
た。静置後、遠心により細胞を沈査として集め、１５％
ＦＣ３，０，０５ｍｇ／−ピルビン酸ナトリウム、０．
２Ｕ／−インスリン、０．１５ｍｇ／−オキザロ酢酸、
ｌｔ１ｇ／−アザセリン、１００μＭヒポキサンチンを
含む４０ｄのＤ−ＭＥＭ培地（以下ＨＡｚ選択培地と略
す）に懸濁して、ｌウェルあたりｌＸｌ０’ケのミエロ
ーマ細胞となるように、９６ウエルマイクロプレート（
Ｆａｌｃｏｎ　＃３０４０）に１００ｕｌずつ分注した
。マイクロプレートには、あらかじめ、保護細胞として
各ウェルマウスＢＡＬＢ／Ｃ肺臓細胞ｌＸ１０５ケ及び
マウスＢＡＬＢ／Ｃ腹腔浸出細胞ｌＸｌ０’ケとなる様
に前出の培地に対する懸濁液を１００μｌずつ分注し、
５％ＣＯ□、３７℃にて１日培養しておく。このマイク
ロプレートを５％Ｃ０２３７℃にて培養し、２〜３日ご
とにＨＡｚ選択培地にて半量を培地交換した。１週間後
に、ＨＡｚ選択培地に替えて、ＨＡｚ選択培地よりアザ
セリンを除いたＨ−培地にて、半量を培地交換した。

その後、アザセリン・ヒポキサンチンを含まないハイブ
リドーマ培養様Ｄ　−Ｍ　Ｅ　Ｍ培地（１５％ＦＣ３，
０，０５ｍｇ／−ピルビン酸ナトリウム、０．２０／−
インスリン、０．１５ｍｇ／−オキザロ酢酸を含むＤ　
−Ｍ　Ｅ　Ｍ培地）にて、２〜３日ごとに半量を培地交
換した。融合後約２６８目の時点に増殖のみられたウェ
ルの培養上清について、緑膿菌をグルタルアルデヒドに
より固定した９６ウエルマイクロプレート（Ｆａｌｃｏ
ｎ　＃３９１２）を用いて酵素免疫測定法（ＥｎＺｙｍ
ｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　５ｏｒｎｅｎｔＡｓ
ｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）により、緑膿菌表層抗原に対する
抗体産生の有無を調べた。緑膿菌は水量の分類による１
７種類の血清型の標準株（ＡＴＣＣおよび東大医科学研
究所微生物株保存施設から入手可）を用いた。ｌウェル
で、血清型Ａ及び血清型Ｈの標準株に対して強く反応す
るＩ　ｇ　Ｇ抗体を産生じていることが確認できた。こ
のウェル中のへテロ・ハイブリドーマを拡大培養および
、限界希釈法（ｌｉｍｉｔｔｉｎｇ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ
）によりクローニングを行い安定にヒＨｇＧ抗体を産生
ずる細胞株ＴＳ３Ｇ２が得られた。以下、細胞株ＴＳ３
Ｇ２の産生ずるヒトモノクローナル抗体に対してもＴＳ
３Ｇ２の名称を用いる。ハイブリドーマＴＳ３Ｇ２は工
業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第２３７２
号として寄託した。ヒトモノクローナル抗体ＴＳ３Ｇ２
はＩｇＧ（γ１、に）であった。

実施例２ ヒトモノクローナル抗体Ｔ３３Ｇ２のＥＬＩＳＡによる
結合スペクトラムの検討 （１）ＥＬｉＳＡによる抗緑膿菌抗体価の測定抗緑膿菌
表層抗原抗体価の測定は以下の方法で行なった。波長６
００ｎｍにおける吸光度が０゜２となる様に緑膿菌を燐
酸緩衝液（ｐＨ７，２、組成ＮａＣ１（８ｇ／Ａ）　、
ＫＣＬ　（０，２ｇ／ｆ）　、ＮａＨＰＯｌ・１２Ｈ２
０（２，９９ｇ／ｌ）およびＫＨ，ＰＯ，（０，２ｇ／
ｌ）：ＰＢＳと略）へ懸濁し、９６ウエルマイクロプレ
ート（フアシヨン＃３９１２）　（マイクロプレートと
略）にｌウェル当たり５０７１１ずつ分注、２．００Ｏ
ｒｐｍ　［５分間遠沈した。２％ゲルタールアルデヒド
を１ウエル当たり５０μβずつ添加し菌体をマイクロプ
レートに固定した。マイクロプレートから菌体溶液を除
去した後３％ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略称す
る）ＰＢＳ溶液をｌウェルあたり１２０μβずつ分注し
３７℃にて３０分間インキュベートすることにより菌体
の未吸着部分をブロッキングした。マイクロプレートを
抗原吸着プレートとして以後の操作に用いた。必要に応
じてこの段階で一２０℃に保存した。アッセイ前に抗原
吸着プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０含有ＰＢＳ
　（以下ＰＢＳＴと略）で３回洗浄した。その後１％Ｂ
ＳＡ含有ＰＢＳＴをｌウェルあたり５０μβ分注、必要
に応じ１％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴで適宜希釈した試料（培
養上清又は精製ＩｇＧ抗体）をｌウェルあたり５０μｌ
加え、３７℃で２時間インキュベートした。その後試料
を除去し、ＰＢＳＴで３回洗浄した。続いて第２抗体液
をｌウェルあたりｌＯＯμβずつ加え、３７℃で２時間
インキュベートした。第２抗体として１％ＢＳＡ含有Ｐ
ＢＳで５００〜ｌ、　０００倍希釈したホスファターゼ
標識アフィニティ精製抗ヒト免疫グロブリン抗体ｆＫｉ
ｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂ、　Ｉｎｃ
、　）を用いた。ＩｇＧ、ＩｇＭ抗体価の測定にはそれ
ぞれホスタフアーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒト１ｇ
Ｍ抗体を用いた。

第２抗体を除去し、ＰＢＳＴで３回洗浄後、発色基質溶
液（３ｍｇのＰ−ニトロフェニルリン酸−２＝ナトリウ
ム塩を１−のＮａＮ５（０，２ｍｇ／ＩＪ）ＭｇＣｌ＝
　・６Ｈ２０（０，１ｍｇ／ｉ）を含む１０％ジェタノ
ールアミン緩衝液ｐＨ９，１に溶解した水溶液）をｌウ
ェルあたりｌＯＯμβずつ加え、３７℃で反応させた。

反応後のＯＤ　ｔｏｓをマルチスキャン（Ｔｉ　ｔｅｒ
ｔｅｋ）で測定した。

（２）緑膿菌血清型別標準法との結合性ＴＳ３Ｇ２と緑
膿菌血清型別標準法（東京大学医科学研究所菌株保存施
設より分与）との反応を実施例２ｉ１）のごと＜ＥＬＩ
ＳＡ法で調べた。菌株はハートインフュージョン寒天培
地を用いて培養した。結果を表２に示す。Ａ型及びＨ型
録膿画面清型標準株に選択的に結合した。

血清型別　　　　菌　株　　　ＥＬＩＳＡ値＜００４８
５）（３）緑膿菌臨床分離株との結合性 ＴＳ３Ｇ２のＡ型及びＨ型録膿菌標準株との結合が確認
された。そこで、血清型Ａ型に分類された緑膿菌臨床分
離株１９株、及び血清型Ｈ型に分類された緑膿菌臨床分
離株１２株に関して結合性を検討した。結果を表３に示
す。血清型Ａ型に分類された１９株及び血清型Ｈ型に分
類された１２株すべてに対して、結合することが確認さ
れた。

また、臨床分離頻度の高い、Ｂ型、Ｅ型、Ｇ型、Ｉ型及
びＭ型に関しても、約２０株程度の臨床分離株に関して
結合性を検討したが、全く結合性は〜（ ０、０３ 表３ 血清型 ＴＳ３Ｇ２の臨床分離株への結合性 菌　　株　　　　　ＥＬＩＳＡ値（ＯＤ４゜、）ネガテ
ィブ・コントロール　　　（−）０、０２ 実施例３ ヒトモノクローナル抗体ＴＳ３Ｇ２が認識する抗原のＥ
ＬＩＳＡにおける競合反応による解析（１）ＬＰＳ標品
の調製 緑膿菌血清型別標準法＋１０１００１　（Ａ型）、＋１
０１００９（Ｈ型）のＬＰＳはＷｅｓｔｐｈａｌとＪａ
ｎｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　
Ｃｈｅｍ、、　５．８３−９１１９６５）に準じて行っ
た。即ち、まず緑膿菌をハート・インフュージョン・ブ
イヨン培地（田水製薬）を用いて対数増殖後期まで培養
し、遠心によって菌体を集めた。湿菌体を４５％フェノ
ールで６８°Ｃにて処理した後、３０００　ｒｐｍ、　
１０°Ｃ，１５分遠心分離し、水層にリポ多糖を抽出し
た。この水溶性画分を臭化セチルトリメチルアンモニウ
ムで脱核酸した後、エタノール沈澱をＬＰＳ標品とした
。

（２）ＥＬＩＳＡにおける競合反応によるＴＳ−３６２
の認識する抗原の解析 実施例３−（１）において調製された緑膿菌１１０１０
０１及び１１０１００９由来ＬＰＳ標品を競合物質とし
て用いて、ＴＳ３Ｇ２の認識する抗原をＥＬＩＳＡ競合
反応により検討した。

方法は、競合物質とヒトモノクローナル抗体ＴＳ３Ｇ２
を混和し、３７℃１時間インキュベートした後、緑膿菌
１１０１００９菌体を固定したマイクロプレートでＥＬ
ＩＳＡを行ない、各競合物質（ＬＰＳ）濃度における反
応阻害の割合を測定した。結果を表４に示す。

結果はＴＳ３Ｇ２のｌＩＤ１００９菌体に対する結合性
がｌｌＩＤ１００Ｉ及び［ＤＩＯ０９由来ＬＰＳにより
、濃度依存的に阻害を受けることを示しており、ＴＳ３
Ｇ２の特異的に認識する抗原構造はｌＩＤ１００Ｉ及び
Ｉ　Ｉ　Ｄ　１．００９由来ＬＰＳ中に存在することが
確認された。

実施例４ ヒトモノクローナル抗体ＴＳ３Ｇ２が認識する抗原のウ
ェスタン・プロッティングによる解析実施例３−　（１
）で得られたｌＩＤ１００Ｉ及び１１Ｄ１００９のＬＰ
Ｓ標品をサンプルバッファー（３１ｍＭ）リスバッフｙ
−ｐＨ６，８／１．５％５ＤＳ１５％グリセロール／２
．５％メルカプトエタノール７０．００５％ＢＰＢ）で
１００℃、５ｍ１ｎ処理後、０．２％ＳＤＳを含む１２
．５％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動後、デュラ
ポア・フィルター（ミリポア）にトランスファーした。

このフィルターで上でアルカリホスファターゼ標識ヤギ
抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂ、　Ｉｎｃ＋
、　）を用いた酵素抗体染色法により、ヒトモノクロー
ナル抗体ＴＳ３Ｇ２が認識している抗原を同定した。対
照として、同一試料を泳動し、　ゲルを銀染色法（Ｂｉ
ｏ　Ｒａｄ製キット）により染色した。

銀染色の結果、高分子量部分に〇−多多糖有するスムー
ス型ＬＰＳのハシゴ状の一連のバンドが見られた。この
ＬＰＳに特徴的なバンドは、Ｏ多糖の繰り返し単位の数
の不均一さに起因している。

更に、低分子量部分には、ブロードなシングルバンドも
しくは数本のバンドが見られ、これらは０多塘をもたな
いもしくは繰り返しを数単位しかもたないラフ型、セミ
ラフ型ＬＰＳのバンドである。

その結果ｌＩＤ１００ＩＳ　ｌＩＤ１００９両株のＬＰ
Ｓ共に、高分子量部分即ち、〇−多糖繰り返し構造をを
するスムース型ＬＰＳのハシゴ状のバンドに相当する部
分に、強い発色が認められた。また、〇−多糖を数単位
しかもたないセミラフ型ＬＰＳに相当する部分にも発色
が見られた。しかし、〇−多糖を全くもたないラフ型Ｌ
ＰＳに相当する部分には、発色は全く見られなかった。

この結果は、ヒトモノクローナル抗体ＴＳ３Ｇ２がｌ［
）＋００１及びＩｒＤＩ００９由来ＬＰＳ中の〇−抗原
（〇−多糖）を特異的に認識している可能性を強く示唆
するものである。

実施例５ 緑膿菌リポ多糖の多糖部分の単離および分画とヒトモノ
クローナル抗体ＴＳ３Ｇ２の各画分に対する結合性の検
討 （１）緑膿菌ｌＩＤ１００Ｉ株及びｌＩＤｌ００９株Ｌ
ＰＳの多糖部分の単離及び分画 緑膿菌ｌＩＤ１００Ｉ株及びｆＩＤ１００９株のＬＰＳ
からＷｉｌｋｉｎｓｏｎとＧａ１ｂｒａｉｔｈの方法（
Ｓ、Ｇ、　Ｗｉｌｉｎｓｏｎ　＆　Ｌ、　Ｇａ１ｂｒａ
ｉｔｈ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｒａ　　５２
．３３１　（１９７５）により多糖部分の単離及び分画
を行った。すなわち、ＬＰＳ（１０ｎ＋ｇ）を１０ｄの
１％酢酸に溶解し、１００°Ｃで９０″分の条件で処理
をして、ＬＰＳの内コア中のケトデオキシオフトン酸（
ＫＤＯ）残基のケトシト結合を選択的に加水分解をした
。更に、反応溶液を等量のクロロホルムによって抽出し
、このクロロホルム画分をリピドＡ標品とした。遊離リ
ビドＡを抽出除去した水溶性画分を５０ｍＭピリジン・
酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）で平衡化した５ｅｐｈａｄｅ
ｘ＠　Ｇ　−５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａ
ｌａ）のデキストランを担体とするカラムクロマトグラ
フィー（カラムサイズＩＸ７０ｃｍ）によって分画した
。多糖、セミラフ型及びラフ型コアオリゴ糖の溶出位置
は以下に示す比色定量法で検出した。中性糖はフェノー
ル・硫酸法（Ｍ、　Ｄｕｂｏｉｓ、　ｅｔａｌ、、　Ａ
ｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、　２８．３５０゜１９５６）、ア
ミノ糖は試料を２規定硫酸で１００℃、２時間加水分解
した後ＭＢＴＨ（３−メチル・２−ベンゾチアゾリノン
ヒドラゾン塩酸塩）法（Ａ。

Ｔｓｕｊｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍ
、　Ｂｕｌｌ、、　１７．２１７゜１９６９）によった
。その結果、〇−多糖の繰り返し構造を含む、多糖画分
を得た。また、〇−多糖を数単位しか含まないセミラフ
型コアオリゴ糖と〇−多糖を含まないラフ型コアオリゴ
糖とは、分画が不十分であったため、混合して、セミラ
フ・ラフ型コアオリゴ糖画分とした。それぞれの画分を
凍結乾燥し回収した。

（２）ヒトモノクローナル抗体ＴＳ３Ｇ２のリポ多糖由
来各画分への結合性 ＥＬＩＳＡにおける競合反応によって実施例５−（１）
で得られた緑膿菌ｌＩＤ１００Ｉ株及びｌＩＤ１００９
株由来の、多糖画分セミラフ・ラフ型コアオリゴ糖画分
、およびリビドＡ画分を競合物質として用いて、ＴＳ３
Ｇ２との結合を検討した。

方法は、競合物質と抗体を混和し、３７℃、１時間イン
キュベートした後、緑膿菌１１Ｄ１００Ｉ菌体及びｌＩ
Ｄ１００９菌体を固定した９６穴プレートでＥＬ　Ｉ　
ＳＡを行い、阻害の割合を測定しｔｒｏｔｏｏｔ株及び
ｌＩＤ１００９株、いずれの場合においても、ＴＳ３Ｇ
２の菌体吸着プレートに対する結合は、多糖画分により
強く阻害され、セミラフ・ラフ型コアオリゴ糖画分によ
っては、高濃度を用いた場合にのみ、限られた割合で阻
害が認められた。この結果より、阻害活性は〇−多糖構
造に由来すると考えられる。

また、リピドＡ標品を競合物質として用いた場合、５０
μｇ　／ｙｒｌの濃度でもＥＬ　Ｉ　ＳＡの発色の阻害
が認められず、ＴＳ３Ｇ２はリピドＡに対しての結合性
は、ないと考えられる。

以上の結果より、ヒトモノクローナル抗体ＴＳ３Ｇ２が
ｌＩＤ１００Ｉ及びｌＩＤ１００９由来ＬＰＳ中の〇−
抗原（〇−多糖）を特異的に認識していると結論した。

両血清型標準株の構造に見出されるＮ−アセチル−し−
ガラクトサミタロン酸残基を中心とする共通構造部分を
特異的に認識していると考えられる。

実施例６ ヒトモノクローナル抗体ＴＳ３Ｇ２によるマウス実験的
緑膿菌感染症の治療効果 緑膿菌臨床分離株血清型Ａ型２株、Ｈ株２株について、
マウス実験的感染系でのヒトモノクローナル抗体ＴＳ３
Ｇ２の治療効果を検討した。５％ムチンを共存させた菌
の懸濁液をＩＣＲマウス（４週令、雄、−群１０匹）の
腹腔内に接種し、感染させた。感染１時間後に、ヒトモ
ノクローナル抗体ＴＳ３Ｇ２を０．６あるいは、０．４
μｇ／ｈｅａｄ腹膣内投与し、−週間後の生存率をもっ
て、治療効果を判定した。その結果を表６および表７に
示す。Ｔ８３Ｇ２は、Ａ型、Ｈ型いずれにおいても複数
の異なる菌株に対して、実験的感染症において、有効な
治療効果を示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は血清型Ａ及び血清型ＨＲ＠菌のＯ抗原の構造を
示す。上段が血清型Ａ緑膿菌を、下段が血清型Ｈ緑膿菌
を示す。 Ｃ

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）緑膿菌感染症に予防・治療効果があり、血清型Ａ
   及び血清型Ｈ緑膿菌のＯ抗原中に存在する共通構造部分
   を特異的に認識することにより、血清型Ａ及び血清型Ｈ
   緑膿菌に結合性を示すヒトモノクローナル抗体
2. （２）ヒトモノクローナル抗体がＩｇＧ又はＩｇＭであ
   る第１請求項記載のヒトモノクローナル抗体
3. （３）ヒトモノクローナル抗体ＴＳ３Ｇ２
4. （４）第１、第２あるいは第３請求項記載のヒトモノク
   ローナル抗体を少なくとも一種類含有するヒト免疫グロ
   ブリン製剤
5. （５）第１、第２あるいは第３請求項記載のヒトモノク
   ローナル抗体を少なくとも一種類含有する細菌感染症予
   防治療剤
6. （６）第１、第２あるいは第３請求項記載のヒトモノク
   ローナル抗体を少なくとも一種類含有する緑膿菌感染症
   診断薬
7. （７）第１あるいは第２請求項記載のヒトモノクローナ
   ル抗体を産生するハイブリドーマおよびその子孫細胞系
8. （８）ハイブリドーマＴＳ３Ｇ２ （微工研条寄第２３７２号）およびその子孫細胞系
9. （９）第１、第２あるいは第３請求項記載のヒトモノク
   ローナル抗体を産生する能力をもつ、ヒトＢリンパ球細
   胞をマウス由来ミエローマ細胞、又はヒト・マウス由来
   のヘテロ・ミエローマ細胞とを細胞融合させることによ
   り、ハイブリドーマを形成させ、このハイブリドーマを
   増殖させることにより、抗体を生産し、これを取得する
   ことを、特徴とする第１、第２あるいは第３請求項記載
   のヒトモノクローナル抗体を製造する方法