JPH02299594A - ヒトモノクローナル抗体およびその製法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、緑膿菌に対するヒトモノクローナル抗体、そ
の製造法およびその用途に関する。

更に具体的には、緑膿菌の鞭毛に対して特異的に結合し
、０抗原による血清型が異なる緑膿菌さらには、Ｏ抗原
の存在しない血清型（日本緑膿菌研究会血清型別検討委
員会におけるＭ型）に属する緑膿菌に幅広く結合し、マ
ウス実験的緑膿菌感染症において５μｇ／ｋｇ体重以上
の投与量で治療効果を示すヒトモノクローナル抗体であ
る。本発明の抗体は、緑膿菌を含む感染症の予防治療剤
および緑膿菌感染症の診断用試薬として有用である。

従来の技術および解決すべき課題 細菌感染症の治療において問題となる病原菌は、抗生物
質の開発とともに変化している。すなわち、臨床上用い
られる抗生物質の種類の変遷に伴ない細菌感染症を引き
起こす細菌、いわゆる起炎菌が交代してきた。従来、低
病原性または弱毒性といわれた細菌、なかでも、特に緑
膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）
による感染例が増加し、緑膿菌は近年、主要な病原菌の
一つとなっている。緑膿菌感染は、免疫抑制剤の投与を
受は免疫能の低下している患者、又は、癌患者や熱傷患
者および新生児などの免疫不全・低下症の患者において
重篤な症状を引き起こし死に至らしめる場合か多い細菌
感染として知られている。

細菌感染を予防・治療する方法として、まず第一にあげ
られるのが、抗生物質および合成抗菌剤を用いた化学療
法である。ストレプトマイシン、カナマイシン、ペニシ
リンやセファロスポリンなど幾多の抗生物質が開発され
、その多くはぶどう球菌を代表とするほとんどのグラム
陽性球菌や、大腸菌などのダラム陰性菌に感受性を示し
、著効な臨床効果を示してきた。しかしなから、今日ま
での多くの研究開発にもかかわらず、緑膿菌に感受性を
示す薬剤は依然少ないのが現状であり、しかも、今日、
感受性を示すとされる薬剤でも、そのほとんどが、緑膿
菌に対してその増殖を単に阻害するいわゆる静菌的に作
用するのみで、殺菌力に欠けており、臨床の場において
著効な治療効果を示すに至っていない。ところで、細菌
感染症を予防および治療することができる療法として、
免疫グロブリン製剤の投与、いわゆる抗体療法があり、
抗生物質療法と併用される、又は、それに代わるものと
して注目されている。ウマやウサギ等の動物を能動的に
免疫することによって抗体価の高い血清を得ることがで
き、その血清を投与する抗体療法は、各種の動物を用い
た実験的感染症において著効な治療効果を示すことが多
くの実験にて実証されている。ヒト以外の動物由来の血
清を用いた抗体療法がヒトにおいても有効性を示すこと
は、ジフテリア毒素や蛇毒の例で周知のことである。し
かしながら、ヒト以外の動物から得られた異種蛋白をヒ
ト体内へ移入するこの方法は、アナフィラキシ−やその
他のアレルギー反応などの重篤な副作用を引きおこし一
般細菌感染症の治療法として採用されるに至っていない
。かくして、細菌に対して高い抗体力価を有し、細菌感
染症の治療効果の大きいヒト免疫グロブリンの開発が望
まれている。従来のヒト免疫グロブリン製剤は、健常人
又は細胞感染親心患者から血液を採取し、既知の方法に
て免疫クロプリン画分を分取・精製した後に、ポリエチ
レンクリコール添加、蛋白分解酵素処理、スルホン化、
ＤＥＡＥ−カラムクロマトクチフィー等の、凝集物を除
去する方法により筋肉注射用のみならず、静脈注射用に
製剤化されたものである。これらヒト免疫クロプリン製
剤には、ヒト以外の異種動物由来の免疫グロブリンを投
与した時にみられるアナフィラキシー等の副作用は無い
等の利点をもつか、幾っがの欠点をもつ。第一に、細菌
に対する抗体価か低く、必ずしも充分な治療効果を期待
しえない。第二に、高力価の免疫グロブリンを大量に安
定して供給することが難しい。健常人ボライティアや患
者より採取された血液を材料に製造されており、高い力
価の血清を一定して入手することは極めて難しく、製造
ロット毎に、抗体価が変動することがある。第三に、任
意のヒトの血液を材料に製造されることにより、免疫グ
ロブリン製剤にＨＢウィルスなどの肝炎ウィルスやＡｄ
ｕｌｔ　Ｔ　ｃｅｌｌ　Ｌｅｕｋａｅｍｉａｖｉｒｕｓ
（ＡＴＬＶ、　ＨＴＬＶ）なとが混入することがあり得
る。

そこで、従来のヒト免疫グロブリン製剤にがゎるものと
して緑膿菌に対し強い感染防御能を有するヒトモノクロ
ナール抗体の製造が望まれている。

緑膿菌の菌体表層には、多種の抗原が存在する。

現在までに、緑膿菌に起因する感染症の治療、及び予防
を目的とするワクチンあるいは抗体療法のターゲットと
して、いくつかの抗原か検討されている。代表的なもの
としては、外膜に存在する○抗原及び外膜蛋白質、さら
に外側に存在する線毛、すなわちピリ（ｐｉｌｉ）ある
いはフィンブリエ（ｆ　ｉｍｂｒｉａｅ）、鞭毛及びム
コイド等が知られている。

Ｏ抗原に関しては、緑膿菌の血清型による分類に広く用
いられている。主として、外膜中に存在するりポポリサ
ッカライト（ＬＰＳ）中の０−多糖体部分（〇−抗原）
の繰り返し単位の構造（組成、配列、配位）の差に対応
している。

不問による血清型１〜１７（１７種類）の分類（Ｊａｐ
ａｎ、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　４４．１　、１９７４）
　、Ｆｉｓｈｅｒによる血清型１〜７（７種類）の分類
（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　９８゜８３５、１９６
９）、日本緑膿菌研究会血清型別検討委員会による血清
型Ａ−Ｍ（１３種類）の分類（Ｊａｐａｎ、Ｊ、Ｅｘｐ
、Ｍｅｄ、　４６，３２９．１９７６）、Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ　Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　Ｔｙｐｉｎｇ　
Ｓｙｔｅｍ（ＩＡＴＳ）による血清型１〜１７（１７種
類）の分類（Ｉｎｔ、　Ｊ、　５ｙｓｔ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、　３３．２５６．１９８３）
、等が知られている。　。

各々の分類およびその相互関係を表１に示す（Ｊａｐａ
ｎ、Ｊ、Ｂｘｐ、Ｍｅｄ、４６．３２９．１９７６）。

表１　緑膿菌血清型別分類 血清型特異抗原である〇−抗原に対する抗体は、対応す
る血清型の緑膿菌による感染症に対しては、優れた予防
・治療効果を示すこと、しかしながら、その他の対応し
ない血清型緑膿菌に対しては効果−７＝ の無いことが知られている。さらには、Ｏ抗原の存在し
ないＭ型菌に対しては、いずれの血清型に対応するＯ抗
原に対する抗体も効果はない。１３〜１７種類のＯ抗原
による血清型のすべての緑膿菌に効力を発揮する為には
、各々の１３〜１７種類のモノクロール抗体を混合して
用いることが考えられるが、極めて煩雑であり、実用化
は困難である。

一方、外膜蛋白質の主なるものは、緑膿菌に共通な抗原
であることが報告されている。例えば、Ｈａｎｃｏｃｋ
らは、外膜蛋白質として、８種類（Ｄｌ。

Ｄ２．　Ｅ、　Ｆ、　Ｇ、旧、１１２およびＩ）を確認
し、その性状の一部を明らかにしている。（Ｊ、　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ。

−レ四工９０２．１９７９）。また、それら外膜蛋白質
に対する抗血清を用いた検討等により、Ｆ、　Ｈ２，Ｉ
かワクチン等の候補として、重要であることを示しくＪ
、　Ｉｎｆｅｃ、　Ｄｉｓｅａｓｅ、−レ１６．７７０
．　１９８２）　、さらに、Ｈ２，Ｉに対するマウスモ
ノクローナル抗体（Ｉｎｆｅｃｔ、　　Ｉｍｍｕｎ、、
　３７．１６６、１９８２）、及びＦに対するマウス・
モノクローナル抗体を取得し、（Ｉｎｆｅｃｔ、　　Ｉ
ｍｍｕｎ、、４２．　１０２７．　１９８３）　、Ｆに
対する−　８　＝ マウス・モノクローナル抗体が、マウス・実験緑膿菌感
染症モデルを用いたｉｎ　ｖｉｖｏ感染治療実験におい
て、有効であることを確認している（Ｂｕｒ。

Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　４．２２
４．１９８５）。

また５ｏｋｏ　ｌ　らは、ｆｅｒｒｉｐｙｏｃｈｅｌｉ
ｎ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＢＰ）が緑膿菌
共通抗原であり、かつ、ＦＢＰに対するマウス・モノク
ローナル抗体がマウス実験緑膿菌感染症モデルにおいて
有効であることを示している（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍ
ｕｎ、、　５１）８９６．１９８６）。

しかし、現状では個々の緑膿菌外膜蛋白質の性状、機能
等が十分に解明されているとは言えず、特に、緑膿菌の
病原性との関係が解明されていない。一方、外膜の外側
に存在する線毛、鞭毛、及びムコイトに関しては、それ
らの有無が緑膿菌の病原性に関係することか知られてい
る。たとえばＷｏｏｄｓらは線毛が緑膿菌の気管上皮細
胞（ｕｐｐｅｒｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｅｐｉｔｈｅ
ｌｉｕｍ）に対する吸着、及びｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏ
ｎに関係していることを報告している（Ｉｎｆｅｃｔ、
Ｉｍｍｕｎ、　２９．１１４６．１９８０）。

またＲａｍｐｈａｌ　らは気管上皮細胞への緑膿菌の吸
着が、線毛及びムコイドと関係していることを報告して
いる（　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　４４．３８．
　１９８４　；Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎｚ　４７．１
）　１９８５）。緑膿菌における鞭毛と病原性との関係
に関しては、Ｍｅ　Ｍａｎｕｓら（Ｂｕｒｎｓ、　６．
２３５．１９８０）及びＣａｒｖｅｎら（Ｃａｎ、Ｊ、
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　２５．４５８．　１９８１）
により、鞭毛に起因する緑膿菌の運動性（ｍｏｔｉｌｉ
ｔｙ）が病原性に関係していることが報告されている。

さらにＭｏｎｔｉｅらは、鞭毛を有する緑膿菌とその緑
膿菌に由来する突然変異により鞭毛を失なった変異株と
の熱傷マウスを用いたモデル感染系における毒性の比較
により、鞭毛が重要な病原因子であることを報告してい
る（Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　３８．１２９６゜１
９８２）。緑膿菌の鞭毛及び鞭毛に対する抗血清の緑膿
菌感染症の予防及び治療への応用の可能性に関しては、
Ｍｏｎｔｉｅらが鞭毛に対する抗血清を用いたｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏの実験により、鞭毛に対する抗血清が緑膿菌の
運動性を抑制することを報告している（Ｉｎｆｅｃｔ、
Ｉｍｍｏｎ、　３５．２８１）１９８２）　ｏまた、Ｈ
ｏ１ｄｅｒらにより、熱傷マウスを用いた緑膿菌モデル
感染系において、調製された鞭毛の、ワクチンとしての
有効性が報告されている（Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、
　３５゜２２０、１９８２）。また、Ｄｒａｋｅらによ
り、鞭毛に対する抗血清が熱傷マウスを用いた緑膿菌モ
デル感染系において有効であることが示されている（Ｃ
ａｎ、Ｊ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　３３，７５５−７
６３．１９８７）　ｏさらに、Ｌｏｓｔｒｏｍらにより
、緑膿菌鞭毛に対するマウスモノクローナル抗体を産生
ずるバイブリド′−マ細胞株及び同様に緑膿菌鞭毛に対
するヒトモノクローナル抗体を産生ずるＥＢウィルス形
質転換細胞株が得られ、それら細胞株の産生ずる緑膿菌
鞭毛に対するマウスおよびヒトモノクローナル抗体がマ
ウス実験的緑膿菌感染症において治療効果を有すること
が報告されている（特開昭６３−１０２６９７）。しか
しながら、該報告によればマウス、実験的緑膿菌感染症
において治療効果を示すために用いられたヒトモノクロ
ーナル抗体の投与量はバクテリアと抗体を予備混合し、
同時に皮下投与する場合に１匹あたり１０μｇ、バクテ
リア感染２時間前に抗体を静脈内投与する場合に４０μ
ｇ＝　１１− （０，５〜２ｍｇ／ｋｇに相当）であり、かなりの高投
与量を必要としている（特開昭６：３−１０２６９７、
実施例８．１０、■１および１２）。また、細菌感染症
予防、治療剤としてヒトに対して投与される場合を想定
した抗体の治療的有効量は約１〜２００ｍｇ／ｋｇであ
り予防的有効量は約０．１〜２５ｍｇ／ｋｇであるとし
ている。現在用いることか可能な動物細胞培養技術及び
モノクローナル抗体精製技術を前提にした場合、ｉ、ｏ
ｓｔｒｏｍらの報告に記載の方法で緑膿菌感染症予防、
治療剤を開発すると、製品コストがあがり、製品を充分
に供給できない等、製品コストおよび供給量において困
難な問題か生じる。これらの問題を解決するためには、
予防有効量および治療有効量の低いヒトモノクローナル
抗体、すなわち効力の高いヒトモノクローナル抗体の作
製が必要である。

又、緑膿菌感染症において高い死亡率を示し難病と考え
られる、膿胞性線維症（Ｃｙｓｔｉｃ　　ｆｉｂｒｏｓ
ｉｓ）および、その類似のひまん性汎細気管支炎（Ｄｉ
ｆｆｕｓｅ　　ｐａｒｂｒｏｎｃ−１２＝ ｈｉｏｌｉｔｉｓ；ＤＰＢ）において、０抗原の存在し
ない血清型Ｍ型菌か起炎菌として高頻度に分離されてい
る（Ｉｎｆ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　　４２．１７０−１７
７、１９８３）。Ｍ型菌に治療効果を示す抗体の報告は
、今までに無いのが現状である。膿胞性線維症による病
気の重篤性を考えると、血清型Ｍ型菌に対して治療効果
を示す抗体の実用船が強く望まれている。

課題解決の手段 こうした状況に鑑み、本発明者らは、緑膿菌の０−抗原
による血清型別に特定されず、Ｏ抗原の存在しないＭ型
菌を含めて、幅広い緑膿菌に対して結合能を有する緑膿
菌の鞭毛に対するヒトモノクローナル抗体であって、マ
ウス実験的緑膿菌感染症において５μｇ／ｋｇ体重以上
の低投与量で治療効果を示すヒトモノクローナル抗体を
作製し、本発明を完成した。すなわち、　本発明は、緑
膿菌の鞭毛と特異的に反応し、Ｏ抗原による血清型別に
特定されず、幅広い緑膿菌に対して結合し、マウス実験
的緑膿菌感染症において５μｇ／ｋｇ体重以上の低投与
量で治療効果を示すヒトモノクローナル抗体、該抗体を
連続的に産生じ得るヒト細胞株およびその子孫細胞株、
該細胞株を１ｎｖｉｔｒｏに培養することを含む特異抗
体の製造方法、該特異モノクローナル抗体を少なくとも
一種類含むヒト免疫グロブリン製剤、感染予防・治療剤
に関するものである。

細菌の鞭毛すなわちフラジエラ（ｆｌａｇｅｌｌａ）と
は、運動性の細胞小器管であり、この運動により細菌は
推進力を得る。細菌の鞭毛は、菌体から突出したらせん
状の繊維、菌体の表層に埋れた基底小体、およびそれら
を連絡するフックから成っている。緑膿菌の場合、その
繊維は１種類のフラジェリンから成り、それが疎水結合
によりらせん状に連なって円筒構造を形成している。

フラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）とは、鞭毛繊維を
構成する粒状蛋白質である。緑膿菌においては、Ｐｉｔ
ｔらの調製法により（Ｊ、Ｍｅｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、　１４゜２５１、１９８１）粗精製品が容易に得られ
る。また、該ヒトモノクローナル抗体を用いたアフィニ
ティーカラムクロマトグラフィーを用いて容易に精製さ
れる。ところで緑膿菌の鞭毛に関する生化学的検討とし
ては、Ｍｏｎｔｉｅらにより鞭毛を構成するフラジェリ
ンのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（以下５ＤＳ−ＰＡＧＥと略す）における見か
けの分子量が５３０００から４５０００の範囲にあるこ
となどが報告されている（ Ｉｎｆｅｃ、Ｉｍｍｕｎ、４９，７７０．１９８５）。

また、Ｌａｎｙ　ｉ　らにより、緑膿菌の分類に用いら
れる凝集法で検出される易熱性抗原（Ｈ−抗原）は、主
に鞭毛に起因することが示され、その血清型による分類
が報告されている（Ａｃｔａ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｈｕｎｇ、、　１７．３５．１９７
０）　ｏ同様の検討がＡｎｓｏｒｇら　（Ｚｅｎｔｒａ
ｌｂｌ、　Ｂａｋｔｅｒｉ。

１、　Ｐａｒａｓｉｔｅｎｋｄ、　Ｉｎｆｅｋｔｉｏｎ
ｓｋｒ、　Ｈｙｇ、　Ｅｒ５ｔｅ　Ａｂｔ。

ｏｒｉｇ、　Ｒｅ１ｈｅ　Ａ　Ｍｅｄ、Ｍｉｋｒｏｂｉ
ｏｌ、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、２４２゜２２８、１９７８
）及びＰｉｔｔら（Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ、　１４゜２５１、１９８１）により報告されている
。

３者の鞭毛の血清型の対応は明確ではないが、Ｐｉｔｔ
らによれば、Ｐｉｔｔ　Ｈ３がＬａｎｙｉ旧、　Ａｎｓ
ｏｒｇＨｂに対応し、Ｓｕｂｇｒｏｕｐのない単一抗原
に対する血清型であること、Ｐｉｔｔ旧、Ｈ２，旧、　
、Ｈ５，＋（６かＬａｎｙｉ　Ｈ２，Ａｎｓｏｒｇ　Ｈ
ａに対応し、Ｓｕｂｇｒｏｕｐの存在する複合抗原と反
応する血清型であると報告されている。

モノクローナル抗体とは、細胞融合法（Ｎａｔｕｒｅ。

亜６．４９５．　１９７５）あるいは、ＥＢウィルス・
トランスフォーメーション法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
Ａｃ１ｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、、７０．１９０．１９７３
）などにより得られる、単一な抗体産生細胞クローンに
より産生される、均一な分子構造を有する抗体を指す。

抗体は、抗原と特異的に結合する糖蛋白で、リンパ球Ｂ
細胞によって産生される。

ＩｇＧ、　ＩｇＭ、　ＩｇＤ、　ＩｇＡおよびＩｇＢの
クラスに分類されている。例えばＩｇＧは、分子量約５
０．０００の重鎮（Ｈ鎖）２本および分子量約２５．０
００の軽鎖（Ｌ鎖）２本から成る約１５０．０００の分
子量を有する。

各々の重・軽鎖は、ジスルフィド残基によって共有結合
されている。　ＩｇＧの１分子は、２分子の抗原を特異
的に結合する。

マウス実験的緑膿菌感染症におけるヒトモノクローナル
抗体の治療効果の判定は以下のように行う。マウスの所
定濃度のヒトモノクローナル抗体投与群において、緑膿
菌の接種菌量を段階的に設定し、統計学的に該抗体投与
量における接種菌のＬＤ、、値（半数のマウスが死亡す
る接種菌量）及び９５％信頼限界でのＬＤ５ｏ値の上限
と下限値の範囲を算出する。一方、対照としてヒトモノ
クローナル抗体無投与あるいはＢ　Ｓ　Ａ　（ｂｏｖｉ
ｎｅｓｅｒｕｍ　ａｌｕｂｍｉｎ）投与群において同様
にＬＤ５ｏ値及び９５％信頼限界でのしＤ５ｏ値の上限
と下限値の範囲を算出する。抗体投与群と対照群のＬＤ
５．値の範囲が重なることない場合、すなわち、有意差
をもっている場合に、マウス実験的緑膿菌感染症におけ
るヒトモノクローナル抗体の治療効果があるものと判定
する。

本発明を以下詳細に説明する。

本発明の緑膿菌の鞭毛に対するヒトモノクローナル抗体
は、緑膿菌の鞭毛を構成するフラシエＩＪンを抗原決定
基として特異的に認識し、緑膿菌の鞭毛に特異的に結合
し、熱傷マウスを用いた実験的緑膿菌感染症において５
μｇ／ｋｇ体重以上の静脈内投与で明確な感染治療効果
を示す、１つの抗体産生細胞クローンに由来する単一な
（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ　）ヒト型の抗体を指す。また
本抗体は、〇−抗原による血清型別に特定されずＯ抗原
の存在しないＭ型菌を含めて幅広（結合しうろことを特
徴とする。

例えば、後述の実施例にあるように、ハイブリドーマＩ
Ｎ−２Ａ８により産生される抗体は、緑膿菌の臨床分離
株のうち、〇−抗原による血清型Ａ型の５０〜６５％、
Ｂ型の５０〜６０％、Ｈ型の４０〜５０％、■型の約３
０％、Ｍ型の約３５％に結合し、血清型Ｂ型およびＧ型
にはほとんど結合せず、Ａ、　Ｂ、　Ｅ、　Ｇ、　Ｈ，
Ｉ及びＭ型を含む臨床分離株全体では３０％以上に結合
する。本ヒトモノクローナル抗体は、〇−抗原による血
清型別に特定されず、幅広い緑膿菌を認識する為に、緑
膿菌の分離・鑑別に用いることができる。更に、ＩＮ−
２Ａ８の産生ずる抗体は、Ａｎｓｏｒｇの鞭毛による血
清型分類すに対応する鞭毛及びその構成成分であるフラ
ジェリンに対して特異的に結合する。　従って、本ヒト
モノクローナル抗体は低濃度投与により、補体や貧食細
胞の関与を経た殺菌作用により、あるいは、鞭毛運動に
よる菌の運動性を抑制、緑膿菌を弱毒化することにより
、０−抗原による血清型別に特定されず、幅広く緑膿菌
感染症を予防・治療することが出来る。

本ヒトモノクローナル抗体は、主としてクラスＩｇＭに
属するがこれに限定されるものではない。

本発明のヒトモノクローナル抗体の製造方法は、基本的
に、以下の諸過程にわけることができる。

■抗原感作されたヒトリンパ球Ｂ細胞の調製、■無制限
増殖能力の賦与によるモノクローナルな特異抗体産生細
胞株の樹立、■モノクローナルな特異抗体産生細胞株の
培養、■培養液からのモノクローナルな特異抗体の精製
、■モノクローナルな特異抗体を含む高力価免疫グロブ
リン製剤の調整順次、以下に説明する。

ヒトのリンパ球Ｂ細胞とは、緑膿菌鞭毛に対する抗体を
産生ずるヒトリンパ系細胞で、主とじて末梢血液よりリ
ンフォプレップ、モノポリ分離液などのリンパ球分離液
を用いた遠心分離法によって分離されるが、各種疾患の
診断および治療の目的で摘出されたリンパ節、肺臓など
の臓器や謄帯血由来のリンパ球Ｂ細胞を材料に用いるこ
ともできる。緑膿菌による感染症を患ったことかあり、
生体内で感作された親心症のヒト由来のリンパ球Ｂ細胞
を用いることが望ましい。あらかじめ、血清中の緑膿菌
ホルマリン死菌あるいは緑膿菌の鞭毛に対する抗体価を
ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法、ラジオイムノアッセイ法等を用いて
測定することにより適切なリンパ球提供者を選別するこ
とができる。また、別の方法として、緑膿菌症の有無を
問わず、ヒトリンパ球Ｂ細胞を採取し、試験管内にて緑
膿菌ホルマリン死菌、好ましくは緑膿菌の鞭毛を混合す
ることによって感作せしめることかできる。すなわち、
抗原としての緑膿菌ホルマリン死菌、好ましくは緑膿菌
の鞭毛をリンパ球Ｂ細胞に添加する。

更にアメリカヤマゴボウレクチン（ＰＷＭ）などの植物
性レクチン、Ｃｏｗａｎ　Ｉなどの菌体成分、又はヒ一
　２０− トリンパ球の混合培養液や肺臓、胸腺細胞や屑帯血細胞
培養液など、Ｂ細胞増殖因子およびＢ細胞分化因子等の
リンフ才力イン類を含む溶液を同時に、又はそれぞれの
組み合わせで添加することによって試験管内にて抗原感
作し、引き続き抗体産生細胞へと増殖・分化させたヒト
リンパ球Ｂ細胞を用いることができる。このように、血
清中の緑膿菌の鞭毛に対する抗体価を測定し、リンパ球
提供者を選別すること及び試験管内にて緑膿菌の鞭毛に
対し感作することは、細胞融合後の特異抗体産生細胞を
高い頻度で得るのに有効である。これらのヒトリンパ球
Ｂ細胞は、その細胞表面に抗体分子を有し、ある限られ
た期間少量の抗体を分泌することが可能であるが、無制
限に増殖することはできないことを特徴とする。抗原感
作されたヒトリンパ球Ｂ細胞を無限に連続して増殖可能
な細胞株とする方法としては、例えば抗原感作されたヒ
トリンパ球細胞と骨髄腫細胞とをポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）の存在下に細胞融合する方法を用いる。用
いられる骨髄腫細胞はＰ３Ｘ６３−Ａｇ８（Ｐ３）、Ｐ
３ｘ６３−Ａｇ、８．６５３なとの、マウス骨髄腫細胞
由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリホシルトラ
ンスフェラーセ（ＨＧＰＰＴと略）欠如変異株、又は、
マウス骨髄腫細胞とヒト骨髄腫細胞、もしくは、マウス
骨髄腫細胞とヒトリンパ球Ｂ細胞との細胞融合により得
られるマウス・ヒトへテロ骨髄腫細胞由来のＨＧＰＰＴ
欠如変異株などを指す。ＰＥＧとしては、ＰＥＧ　１，
０００〜６．０００を３０〜５０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で
用いる。レクチン、ポリーＬ−リジンやＤＭＳＯなどを
添加することにより融合効率を高めることもできる。融
合方法は、マウス細胞同志を融合し、マウスモノクロー
ナル抗体を産生ずるハイブリトーマを取得したＫｏｈｌ
ｅｒ　ａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ
　２５６．４９５．１９７５）に準する。簡単に記述す
れば、抗原感作されたヒトリンパ球細胞とＨＧＰＲＴの
欠如した骨髄腫細胞とを３〜１：１の割合にて混合し、
４５％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ　１５００〜６０００を０．５
〜１分間に少量ずつ加え、３０秒〜３分間静置する。そ
の後、５〜１０分間に１０〜５（Ｗの血清不含培地を加
え、２艷のＦｅ２を加え、３７℃にて１０〜６０分間イ
ンキュベートする。遠心後、培地を加え１０５〜１０６
個細胞／−の濃度に調製し、９６穴マイクロプレートに
１ウエルあたり２ＸｌＯ’〜２Ｘ１０’個の細胞を播種
する。翌日、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジ
ン含有培地（ＨＡＴ培地と略）又は、ヒポキサンチン・
アザセリン含有培地（ＨＡｚ培地と略）に半量交換し、
５％ＣＯ□、３２〜３７℃にて培養する。約ｌＯ〜２０
日間新しいＨＡＴ培地又はＨＡｚ培地に、続いて約３〜
５日間ヒポキサンチン・チミジン含有培地（ＨＴと略）
又は、ヒポキサンチン含有培地（Ｈ培地と略）に、３日
毎に半量ずつ交換を続は約２〜３週間培養して、増殖し
てくるコロニー、いわゆるハイブリトーマを得る。ＨＧ
ＰＰＴ欠如変異株を用いることな（、代謝阻害剤を組み
合わせることによってハイブリドーマを選択することも
可能である。ハイブリドーマの培養液の緑膿菌ホルマリ
ン死菌あるいは緑膿菌の鞭毛に対する抗体価をＥＬＩＳ
Ａ法又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡと略）によって
測定し、更には、ウェスタン・プロッティングの手法を
併用することにより、緑膿菌の鞭毛を構成するフラジェ
リンに対する特異抗体産生株を選別する。限界希釈法又
は軟寒天法によって、２〜３回クロりニンクを繰り返し
、増殖の速い、特異抗体産生量の多い、安定した細胞株
を得る。　以上、細胞融合法（ｃｅｌｌｆｕｓｉｏｎ　
ｍｅｔｈｏｄ；ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ｍｅｔｈｏｄ）を
用いて、抗原感作ヒトリンパ球Ｂ細胞より樹立された細
胞株は、連続的に増殖することができること、しかも、
無血清培地において大量培養が可能であり、特異抗体を
安定的に、大量に産生じ得ることを特徴とする。

これら樹立されたハイブリトーマ（０，５〜５Ｘ１０’
個細胞／ｄ）を通常の血清含有培地、或いは無血清培地
にてＣＯ２インキュベーターを使用して２〜ｌＯ％ＣＯ
□、３２〜３７°Ｃの条件のもとて培養フラスコやプレ
ート等の容器内で静置培養又は回転培養する。通常の血
清含有培地とは、ウシ胎児、仔ウシ、ウシ、ウマおよび
ヒトなどの血清を２〜２０％含有するＲＰＭ１１６４０
、Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭＢＭに代表される培地を指し、無
血清培地とは、インシュリン、トランスフェリン、エタ
ノールアミン、セレナイト、ウシアルブミン、リピドな
ど細胞の増殖に必要な微量成分を含む無血清培地を指す
。

大量に培養するときは、動物細胞用に設計されたジャー
ファーメンタ−やホロファイバーシステム等を用いるこ
とができる。　抗体の精製は通常の生化学的手法を組み
合わせることによってなされる。すなわち、硫安沈澱分
画法、エタノール沈澱分画法、ＰＥＧ分画法、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲル濾過法、アフィニテイクロ
マトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、電気泳
動法等である。精製過程において、凝集物の形成や抗体
活性の低下を防ぐ工夫が必要である。例えば、ヒト血清
アルブミン（Ｈ３Ａと略）を０．０５〜２％の濃度で添
加する。その他グリシンやα−アラニンなどのアミン酸
類、特にリジン、アルキニンやヒスチジンの塩基性アミ
ノ酸、グルコースやマンニトールなどの糖類、塩化ナト
リウムなどの塩類を添加することが好ましい場合がある
。　ＩｇＭ抗体の場合、特に凝集しやすいことがしられ
ている。

β−プロピオニラクトンや無水酢酸などで処理すること
は、凝集を阻止することができ静脈内投与も可能とする
。

精製されたヒトモノクローナル抗体は、生物学的製剤の
製剤化に通常用いられる方法によって製剤化される。基
本的には、メンブレンフィルター等による濾過除菌操作
の後に、安定化剤とともに滅菌バイアルに凍結乾燥され
る。

該ヒトモノクローナル抗体製剤は、緑膿菌感染予防・治
療剤として、緑膿菌の鞭毛を構成しているフラジェリン
に対する１種類のヒトモノクローナル抗体より成ること
も可能であるが、更に好ましくは、フラジェリン分子の
異なる抗原決定部位を認識しうる、２種類以上のヒトモ
ノクローナル抗体と混合して用いられる。又、緑膿菌の
鞭毛以外の緑膿菌表層抗原、例えば、外膜蛋白質、ある
いは、リポ多糖構成成分中の〇−抗原など、さらには、
緑膿菌由来の病原因子である外毒素、エラスターゼ、プ
ロテアーゼなどの外酵素などを認識するヒトモノクロー
ナル抗体あるいは従来型のヒト免疫グロブリン製剤と混
合して使用される。更には、緑膿菌以外の細菌、ウィル
ス、真菌、原虫、癌細胞に対するヒトモノクローナル抗
体、あるいは従来型のヒト免疫グロブリン製剤と混合し
て使用することもできる。従来のヒト免疫り′ロブリン
製剤に、本発明により得られるヒトモノクローナル抗体
を添加して、緑膿菌に対する高力価免疫グロブリン製剤
とされる。また、上述のような混合細胞感染症において
は、従来より用いられている抗生物質、あるいは合成抗
菌剤との併用も考えられる。

本発明によって得られるヒトモノクローナル抗体は、フ
ラジェリンを特異的に認識して緑膿菌の鞭毛に結合する
ことにより菌体をオプソニン化して貧食細胞による貧食
・殺菌作用の増強、又は補体を活性化することによる溶
菌作用あるいは鞭毛運動をおさえて緑膿菌の運動性を抑
制することにより、その病原性を低下させる等の作用に
より緑膿菌による実験的マウス感染症を治療することが
でき、しかも５μｇ／ｋｇの低投与量で十分な冶＝　２
７− 療効果を示す。緑膿菌による感染症および、その細菌を
含む混合細菌感染症の治療に用いられる時、マウス感染
症治療実験における有効投与量より予測して、該ヒトモ
ノクローナル抗体は、通常、成人の体重１ｋｇ当たり０
．０５〜１ｍｇが投与される。また、予防には、成人の
体重ＩＪ当たり０．００５〜０、１ｍｇが投与される。

本発明によって得られるヒトモノクローナル抗体は、緑
膿菌の鞭毛に対して特異的に結合するここにより、表層
にＯ抗原を有しないＭ型菌（緑膿菌研究会血清型別検８
」委員会）に対しても、マウス実験的感染症の系で優れ
た治療効果を示す。鞭毛に対するモノクローナル抗体で
、Ｍ型菌感染者に対して治療効果を示した最初の例であ
る。また０抗原に対するモノクローナル抗体は無効であ
った。

一方、緑膿菌感染症による死亡率が高い膿胞性線維症お
よびその類似のＤＰＢにおいて、血清型Ｍ型菌が起炎菌
として、特徴的に高い頻度で分離されている。膿胞性線
維症およびＤＰＢ以外の緑膿−２８＝ 菌感染症においても数％の頻度で起炎菌として分離され
ていることを考慮すれば、血清型Ｍ型菌に対しても治療
効果を有する該ヒトモノクローナル抗体も実用化が望ま
れる。

また、該ヒトモノクローナル抗体は実施例１１に示すよ
うに、緑膿菌に対しである程度感受性を示す抗生物質、
あるいは合成抗菌剤と併用することにより、緑膿菌感染
症に対する治療効果が顕著に増強する。しかも、その併
用効果は、明らかに相乗的である。この、抗生物質ある
いは合成抗菌剤との顕著な相乗効果は、該ヒトモノクロ
ーナル抗体が単に、菌体をオプソニン化し、殺菌作用を
誘導するのみに留まらず、鞭毛運動をおさえ、緑膿菌の
運動性を抑制することにより、その病原性を低下させる
作用を有することに起因している可能性が考えられ、本
発明によって得られる緑膿菌の鞭毛に対しても特異的に
結合するヒトモノクローナル抗体の特徴と考えられる。

現在、臨床上その重篤な症状を引き起こすことにより問
題とされている緑膿菌感染症において、多くの場合が、
他の細菌を含む混合細菌感染症の形をとる。このような
場合、従来より用いられている抗生物質および合成抗菌
剤を用いた化学療法と該ヒトモノクローナル抗体を含有
するヒト免疫クロプリン製剤との併用が考えられる。す
なわち、上述のように、該ヒトモノクローナル抗体か、
抗生物質あるいは合成抗菌剤との相乗的な併用効果を明
確に示しつる点は、臨床上、特に緑膿菌を含む混合細菌
感染症に対する治療効果に関して、重要な意味を持つこ
とになる。

以上、詳しく述べたように、本発明によって得られるヒ
トモノクローナル抗体は緑膿菌の鞭毛に対して特異的に
結合しマウス実験的感染症の系で５μｇ／ｋｇ体重上の
低投与量で優れた治療効果を示すことが、第一の特徴で
ある。治療有効量あるいは予防有効量が低量でよいため
、製剤化のさいに、低コストで大量にクロプリン製剤を
供給できる。第２に、血清型特異抗原である〇−抗原に
よる血清型別に特定されず、Ｏ抗原の存在しないＭ壁画
も含めて幅広い緑膿菌に対して結合能を有する。従って
、複数の異なるＯ抗原による血清型緑膿菌に対して治療
効果を得るために、各々の緑膿菌に対するモノクローナ
ル抗体を各種混合して用いる煩雑さから解放される。

第３に、ヒト由来の蛋白であることより、異種蛋白の投
与時にみられるアナフィラキシ−等の副作用の少ないこ
とが期待されるし、特定の細胞より生産・精製される抗
体であることより、不特定多数のヒト血液より製造され
た従来の免疫グロブリン製剤にくらべ、未知のバイオハ
ザードが混入してくる可能性の低いことが特徴である。

本発明の抗体産生細胞株は、大量培養において、細胞の
増殖性及び抗体産生性ともに良好であって、連続的に増
殖することができることを特徴とする。

さらに、無血清培地においても大量培養が可能であり、
特異抗体を安定的に、大量に産生じ得ることを特徴とす
る。後述の実施例８に示すように、ヒト・マウスヘテロ
ハイブリドーマ細胞株ＩＮ−２Ａ８は、６Ｌのジャーフ
ァーメンタ−を用いた大量培養において、細胞の増殖性
及び抗体産生性ともに良好であった。ヒトモノクローナ
ル抗体を工業的に生産する場合、細胞株の大量培養にお
ける細胞の増殖性および抗体産生性は特に重要な要素で
あり、この点においてヒト・マウスヘテロハイブリトー
マ細胞株ＩＮ−２Ａ８は、特に優れた細胞株である。

また、ヒト・マウスヘテロハイブリドーマ細胞株ＩＮ−
２Ａ８の産生するＩｇＭ抗体の鞭毛を介した緑膿菌に対
する結合性は、後述の実施例１１に示すように、Ｃａｌ
゛イオン濃度に依存して変化する特徴を有する。１００
μＭの濃度で最も強い結合性を示し、１μＭ以下では、
はとんど結合性を示さない。

本発明の抗体産生細胞株を培養することにより、本モノ
クローナル抗体を生体外で、大量に、高力価の抗体を安
定して製造することが可能であり、従来のヒト血液より
製造する方法にくらべ高力価など生物活性の点で、安定
的供給ができるなど品質管理の点で優れる。次に実施例
をあげてさらに具体的に説明するが、本発明はこれのみ
に限定されないことは言うまでもない。

実施例１ ヒト・マウス細胞融合によるヒト抗フラジェリンモノク
ローナル抗体産生株の樹立 ｌ）ヒト末梢血からのリンパ球の調製、培養および試験
管内特異Ｂ細胞活性化 血清中の緑膿菌（ホルマリン死菌）に対する抗体価が高
い健常人ボランティア供血者、ドナー、ＩＮより末梢血
１００７ｎｌを採取した。遠心管（住友ベークライト、
５〇−容積）に１５ｄのモノポリ分離液（Ｆｌｏｗ、　
Ｌｉｂ、）を入れ、その上に更に末梢血２０１ｎｌを静
かに重層した。低速遠心機（トミー精工、Ｒ３−２０Ｂ
Ｈ）を用い、２．５００ｒｐｍ　（ローターＴＳ　−７
）で、室温１５分間遠心分離し、赤血球とリンパ球を分
離した。リンパ球を含む部分を回収し、Ｄｕｌｂｅｃｃ
ｏ改変Ｅａｇｌｅ’　ｓ　ＭＥＭ　（以下Ｄ−ＭＥＭと
略す）（日永製薬）で、３回洗浄した後、細胞数を計算
した。その結果、１）２Ｘ１０８ケのリンパ球を得た。

得られた末梢血リンパ球１）２Ｘ１０”細胞を、抗原と
してホルマリン処理緑膿菌死菌を含む６０ｍ１のリンパ
球培養用培地（後述）に懸濁し、１ウエルあたり２Ｘ１
０’ケのリンパ球細胞となるように、２４ウエルマイク
ロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、　＃３４２４）に分注し、
５％ＣＯ２，３”ｔ℃にて、６日間培養した。

上記のリンパ球培養用地とは、非動化したウシ胎児血清
（以下ＦＣ３と略す）を２０％（ｖ／ｖ）、ピルビン酸
ナトリウム（０，０５ｍｇ／Ｊ）　、２−　、ｌ　ルア
’Ｊ　’７’トエタノール（５Ｘ　１０−５Ｍ）、２０
ｍＭ　　Ｎ　−（２−１＝ドロキシエチル）ピペラジン
−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（以下ＨＥＰＥＳと略す
）、アメリカヤマゴボウ由来植物レクチン（以下、ＰＷ
Ｍと略す）（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂ、　）０．０１％（ｖ
／ｖ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（白水製薬）
を指す。

２）細胞融合 マウス・ミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３− Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＩ、１５８０．Ｊ、ｆ
ｍｍｕｎｏｌ、、　１２３．１５４８゜１９７９）をＤ
−ＭＥＭ　（１０％ＦＣ８を含む）で継代しておき、そ
のうち、４Ｘ１０’ケの細胞をＤ−ＭＥＭにて２回洗浄
した。

一方、実施例１−１）の記載通り、末梢血リンパ球を６
８間培養後、２４ウエルマイクロプレートより回収し、
細胞数を計算したところ、８ＸｌＯ’ケのリンパ球が回
収された。このリンパ球をＤ−ＭＥＭにて３回洗浄し、
上記のマウス・ミエローマ細胞と混合し、遠心により細
胞を沈査とした。この沈査に、１７ｎｌのポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）溶液（０，４５ｇ　ＰＥＧ４００
０　Ｍｅｒｃｋ、０．４５ｉ　ＰＢＳ（−）、　０．１
ｉジメチルフオキシド）を約１分かけて、遠心管を回転
しつつ添加し、室温にて１分間静置した。

次に、Ｄ−ＭＵＭを１分間２ｍｌの割合で遠心管を回転
しつつ添加し、これを７回繰り返した。最後に２１ｎｌ
ＦＣ３を加えた後、３７°Ｃにて２０分間静置した。

静置後、遠心により細胞を沈査として集め、■５％ＰＣ
３，０，０５ｍｇ／　ｍｌピルビン酸ナトリウム、０．
２ｕ／ｄインスリン、０．１５ｍｇ／７ｎＡ’オキザロ
酢酸、１００μＭアザセリン、１００μＭヒポキサンチ
ンを含む５゜ｄのＤ−ＭＢＭ培地（以下ＨＡｚ選択培地
と略す）に懸濁して、ｌウェルあたり８Ｘ１０”　ケの
ミエローマ細胞となるように、９６ウエルマイクロプレ
ート（Ｃｏｒｎｉｎｇ　ｇｌａｓｓ　ｗｏｒｋｓ、　＃
２５８６０　ＭＰ）に分注した。

＝　３５− 同時に、フィーダ一層として、マウスＢＡＬＩ３／Ｃ牌
臓細胞１×１０′ケ、及び、マウスＢＡＬＢ／Ｃ腹腔浸
出細胞６．５Ｘ　１０”　ケを各ウェルに添加した。こ
のマイクロプレートを、５％ＣＯ２，３７°Ｃにて培養
し、２〜３日ごとにＨＡｚ選択培地に半量を培地交換し
た。

１週間後に、ＨＡｚ選択培地に替えて、ＨＡｚ選択培地
よりアザセリンを除いた旧培地にて、半量を培地交換し
た。その後は、アザセリン・ヒポキサンチンを含まない
ハイプリドーマ培養用Ｄ−ＭＥＭ培地（１５％ＦＣ３，
０，０５ｍｇ　／　ｍｌピルビン酸ナトリウム、０．２
ｕ／７ｎｌインスリン、０．１５ｍｇ／ｉオキザロ酢酸
を含むＤ−ＭＥＭ培地）にて、２〜３日ごとに半量を培
地交換した。融合後約３週間の時点に増殖のみられたウ
ェルの培養上清について、緑膿菌をクルクルアルデヒド
により固定した９６ウエルマイクロプレート（Ｂｅｃｔ
ｏｒ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｌａｂ、　＃３９１２）を
用いて酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　
Ｉｍｍｕｎｏ　５ｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ
）により、緑膿菌表層抗原に対する抗体産生の有無を調
べた。２ウエルで緑膿菌１１Ｄ１００２　（水量血清型
２型標準株、ＡＴＣＣおよび東大医科学研究所微生物株
保存施設がら入手可）に対して強く反応するＩｇＭ抗体
を産生じていることが確認できた。これらのウェル中の
へテロ・ハイプリードーマを、９６ウエルマイクロプレ
ートを用いて拡大培養及び、限界希釈法（ｌｉｍｉｔｉ
ｎｇｄｉｌｕｔｉｏｎ）によりｌウェルあたり単一細胞
となるような条件でクローニングを行い、安定にヒトＩ
ｇＭ抗体を産生ずる細胞株ＩＮ−２Ａ８及びＩＮ−５［
１６が得られた。以下、細胞株ＩＮ−２Ａ８及びＩＮ−
５０６の産生ずるヒトモノクローナル抗体に対しても、
ＩＮ−２Ａ８及びＩＮ−５０６の名称を用いる。ハイブ
リートＩＮ−２Ａ８は、工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第９９６０号として寄託されている。

実施例２ ヒト・マウス細胞融合によるヒト抗フラジェリンモノク
ロナール抗体産生株の樹立 血清中の緑膿菌ホルマリン死菌に対する抗体価が高い健
常人ボランティア供血者、ドナー：ＺＩの末梢血を用い
て、実施例１と同様にリンパ球の調整、培養、試験管内
特異Ｂ細胞活性化及び細胞融合を行うことにより、緑膿
菌１１Ｄ１００２に対して強く結合する　ＩｇＭ抗体産
生ヒト・マウス・ヘテロハイブリドーマ細胞株Ｚ１３Ａ
８か得られた。以下、細胞株ＺＩ−３Ａ８の産生ずるヒ
トモノクローナル抗体に対しても、Ｚｌ−３Ａ８の名称
を用いる。

実施例３ ハイブリドーマＩＮ−２Ａ８．　　ＩＮ−５Ｄ６及びＺ
ｌ−３Ａ８の産生ずるヒトモノクローナルＩｇＭ抗体の
水量血清型別標準株（東大医科学研究所微生物株保存施
設から入手可）に対する反応性の検討 ＥＬＩＳＡによりＩＮ−２Ａ８．　ＩＮ−５０１３及び
Ｚ［−３Ａ８の産生ずる　ＩｇＭ抗体の水量血清型標準
株に対する反応性を検討した。その結果を表２に示した
。ＩＮ−２Ａ８．　ＩＮ−５Ｄ６及びＺ［−３Ａ８の産
生ずるＩｇＭ抗体は不問の血清型標準法ｌＩＤｌ００２
（２型）、ｌＩＤ１００９（９型）、ｌＩＤ５１４１（
１，４型）、ｌＩＤ５００４（１６型Ｌ　ｌＩＤｌ０１
５（１７型）に対して強い結合を示した。またハイブリ
ドーマＩＮ−２Ａ８．　ＩＮ−５Ｄ６及びＺ１３Ａ８の
産生ずるヒトモノク０−す／ｌｚ１ｇＭ抗体は相互に同
一の結合パターン（結合スペクトラム）を示した。

表２　ハイブリドーマＩＮ−２Ａ８．　ＩＮ−５Ｄ６及
びＺｌ−３Ａ８の産生ずる　ＩｇＭ抗体の血清型標準法
への結合性−３９一 実施例４ ハイトリドーマＩＮ−２Ａ８１Ｎ−５Ｄ６及びＺｌ−３
Ａ８の産生ずるヒトモノクローナルＩｇＭ抗体の臨床分
離株に対する反応性の検討 ＥＬＩＳＡにより、ハイブリドーマＩＮ−２Ａ８．　　
ＩＮ−５Ｄ６及びＺｌ−３Ａ８の産生ずるヒトモノクロ
ーナルＩｇＭ抗体の臨床分離株に対する反応性を検討し
た。結果を表３に示す。臨床分離株は分離頻度の高い血
清型Ａ、　Ｂ、　Ｅ、　Ｇ、　Ｈ，Ｉ、　Ｍ（Ｊａｐａ
ｎｅｓｅ　Ｃｏｍｍ１ｔ　ｔｅｅによる血清型分類）を
用いた。

表３よりＩＮ−２Ａ８．　ＩＮ−５Ｄ６及びＺｌ−３Ａ
８の産生ずるＩｇＭ抗体は、Ａ型臨床分離株の５８％、
Ｂ型臨床分離株の５５％、■型臨床分離株の３０％、Ｈ
型臨床分離株の４６％、Ｍ型臨床分離株の３５％に結合
を示した。Ｅ型及びＧ型臨床分離株に対しては結合が見
られなかった。またハイブリドーマＩＮ−２Ａ８．　　
ＩＮ−５Ｄ６及びＺｌ−３Ａ８の産生ずるヒトモノクロ
ーナルＩｇＭ抗体は、相互に同一の結合パターン（結合
スペクトラム）を示した。このことによりハイブリドー
マＩＮ−２Ａ８．　　ＩＮ−５Ｄ６及びＺｉ３Ａ８の産
生ずる　ＩｇＭ抗体は同一の抗原を認識していると考え
られる。

その抗原の存在は、０抗原による血清型別との関連が、
ある程度みられるものの、完全に一致することはなかっ
た。

ＳＰ　９７６３　　　Ａ　　　　　Ｏ，０６０，０５０
，０５ＳＰ　１００２９　　　Ａ　　　　　１）５０　
１）０９　１）７２ＳＰ　１０６４８　　　Ａ　　　　
　Ｏ，０３０，０２０，２３ＳＰ　１０６７６　　　Ａ
　　　　　Ｏ，０５０，０５０，０４ＳＰ　９７２２　
　　Ｂ　　　　　１）７３　２．２１　０．０４ＳＰ　
９７３７ａ　　　Ｂ　　　　　１）６９　１）８７　２
．５５ＳＰ　９７５６　　　Ｂ　　　　　Ｏ，０２０，
０７０，０５表３　（つつき） ＩＮ−２Ａ８１Ｎ−５Ｄ６　Ｚｌ−３Ａ８３Ｐ　９７７
０　　　Ｂ　　　　　Ｏ，０３０，０３０，０５ＳＰ　
９７９１　　　Ｂ　　　　　’０．０５　０．０５　０
．０８ＳＰ　１００３６　　　Ｂ　　　　　１）２７　
１）４８　２．２７ＳＰ　１００５２　　　Ｂ　　　　
　１）８０　１）８３　２．５８ＳＰ　１００６５　　
Ｂ　　　　Ｏ，７６０，７１１，旧ＳＰ　１００６９　
　　Ｂ　　　　　１）０２　０．９０　１）３８ＳＰ　
１０６５８　　　Ｂ　　　　　０．０６　０．０４　０
．０２ＳＰ　１０６８０　　　Ｂ　　　　　Ｏ，０８０
，０５０，０７ＳＰ　６８９７　　　Ｂ　　　　　１）
７６　１）８０　２．３９ＰＡＯＩ　　　　Ｂ　　　　
　２．０３　１）９８　２．３１Ｍ２　　　　　Ｂ　　
　　　２．０３　１）７３　２．５２ＴＬ　２４２３　
　　Ｂ　　　　　Ｏ，０２０，０３０，０７ＴＬ　２４
６ＯＢ　　　　　０．１７　０．’１４　０．１６ＳＰ
　６７４７　　　Ｂ　　　　　１）６０　１）５６　２
．３６ＳＰ　９７０２　　　Ｅ　　　　　Ｏ，０６０，
０６０，００ＳＰ　９７１５　　　Ｅ　　　　　Ｏ，１
００，１００，００ＳＰ　９７２０　　　Ｅ　　　　　
Ｏ，０７０，０７０，００ＳＰ９７２３　　　Ｂ　　　
　　Ｏ，１００，１００，０８ＳＰ　９７２６　　　Ｅ
　　　　　Ｏ，０６０，０６０，００ＳＰ　９７３３　
　　Ｂ　　　　　Ｏ，０５０，０５０，０１ＳＰ　９７
４０　　　Ｅ　　　　　Ｏ，０５０，０５０，００ＳＰ
　９７５４　　　Ｅ　　　　　Ｏ，０７０，０７０，０
１ＳＰ　９７５９　　　Ｅ　　　　　０．０７　０．０
５　０．０３ＳＰ　９７７１　　　Ｅ　　　　　Ｏ，０
５０，０５０，００ＳＰ　９７８３　　　Ｅ　　　　　
Ｏ，０６０，０５０，００ＳＰ　９７８７　　　Ｅ　　
　　　Ｏ，０５０，０５０，００ＳＰ　９７９０　　　
Ｂ　　　　　Ｏ，０５０，０５０，００ＳＰ　１００４
３　　　Ｅ　　　　　Ｏ，０５０，０５０，００表３　
（つづき） ＳＰ　１００５９　　１Ｅ　　　　　Ｏ，０５０，０４
０，００ＰＡ　１０３　　　　Ｅ　　　　　Ｏ，０５０
，０６０，００ＰＡ　１０３−２９　　Ｅ　　　　　Ｏ
，０７０，０５０，０１ＮＣ５Ｂ　　　　　Ｏ，０６０
，０４０，００Ｔｌ、２０９２　　　Ｅ　　　　　Ｏ，
０８０，０６０，０２ＴＬ　２１５８　　　Ｅ　　　　
　Ｏ，０６０，０６０，０２ＳＰ　９７０１　　　Ｇ　
　　　　Ｏ，０００，０００，００ＳＰ　９７０９　　
　Ｇ　　　　　Ｏ，０００，０００，００ＳＰ　９７１
２　　　Ｇ　　　　　Ｏ，０００，０００，００ＳＰ　
９７１４　　　Ｇ　　　　　Ｏ，０００，０００，００
ＳＰ　９７１７　　　Ｇ　　　　　Ｏ，０００，０００
，００ＳＰ　９７１８　　　Ｇ　　　　　Ｏ，０００，
０００，００ＳＰ　９７３８　　　Ｇ　　　　　Ｏ，０
００，０００，００ＳＰ　９７８５　　　Ｇ　　　　　
Ｏ，０００，０００，００ＳＰ　９７４３　　　Ｇ　　
　　　Ｏ，０００，０００，００ＳＰ　９７９２　　　
Ｇ　　　　　Ｏ，０００，０００，００ＳＰ　９７５５
　　　Ｇ　　　　　Ｏ，０００，０００，００ＳＰ　９
７６１　　　Ｇ　　　　　Ｏ，０００，０００，００Ｓ
Ｐ　９７６７　　　Ｇ　　　　　Ｏ，０００，０００，
００ＳＰ　９７７２　　　Ｇ　　　　　Ｏ，０００，０
００，００ＣＴＮｌ１１８７　　　Ｇ　　　　　Ｏ，０
００，０００，００ＴＬ２３７８　　　Ｇ　　　　　Ｏ
，０００，０００，００ＴＬ　２４２４　　　Ｇ　　　
　　Ｏ，０００，０００，００ＳＰ　６７８８　　　Ｇ
　　　　　ｔ）、００　０．００　０．００ＳＰ　９７
２８ａ　　　Ｇ　　　　　Ｏ，０００，０００，００表
３　（つづき） ＳＰ　１０６８１　　　ＨＯ，４５０，９８１，２０Ｓ
Ｐ９７７６　　１　　　　０．００　０．００　０．０
３表３　（つつき） ＩＮ−２Ａ８１Ｎ−５Ｄ６　Ｚｌ−３Ａ８ＳＰ　１０６
７０　　１　　　　０．２７　０．２６　０．２９（−
）　　　　　　　　　０．０１　０．０４０．０２実施
例５ ハイブリドーマＩＮ−２Ａ８の産生ずるヒトモノクロー
ナルＩｇＭ抗体の認識する抗原の検討■）緑膿菌由来鞭
毛の粗精製品の調製 Ｐｉｔｔらの菌体からの鞭毛粗精製品の調製法（Ｊ、Ｍ
ｅｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１４．２５１）１９８１
）に従って鞭毛を粗精製した。

菌株は、ＥＬＩＳＡにおいてハイブリドーマＩＮ−２Ａ
８゜ＩＮ−５０６及びＺｌ−３Ａ８の産生ずる　ＩｇＭ
抗体が結合するＬ（Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｃｏｍｍ１ｔｔ
ｅｅによる血清型Ｂ型、Ｈｏ１ｄｅｒ；５ｈｒｉｎｅｎ
ｓ　Ｂｕｒｎｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｃ１ｎｃｉｎ
ｎａｔｉ、　０ｈｉｏ、より入手、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ
、　Ｄｉｓ、　１３１）６８８．１９７５）、及び臨床
分離株５Ｐ６８１８　　（血清型Ａ型）を用いた。　ま
ず、緑膿菌ヲハート・イン・フュージョン・アガー培地
（日永製薬）を用いて１８時間培養し、アガー培地表面
からかき取り、１０艷のリン酸緩衝生理食塩水（カルシ
ウム・マグネシウム不含）（ＰＢＳ（−）と略す）に懸
濁し、４°Ｃ１５０００Ｘ　ｇ　、　１５分間遠心する
ことにより、菌体を沈査とする。次に沈査を５１ｎｌの
ＰＢＳ（−）に再度懸濁しＶｏｒｔｅｘ　ｍ１ｘｅｒを
用いて、３分間混合することにより、菌体より鞭毛を遊
離させる。これを４°Ｃ１１６０００Ｘ　ｇ　、　１５
分間遠心し、菌体を沈査として除き、その上清を再度、
４℃、４００００Ｘ　ｇ、３時間遠心することにより、
鞭毛を沈査とする。この沈査を４００μｐのＰＢＳ（−
）に懸濁し、鞭毛粗精製品とした。

２）鞭毛粗精製品の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動による解析 実施例５−１）により得られたＭ２及び５Ｐ６８１８株
由来の鞭毛粗精製品及び分子量測定マーカー用蛋白標品
５０μβとサンプルバッファー（６，２５ｍＭ　ｌ−’
）スバッファーｐＨ６，８７２％ＳＤＳ／１０％２−メ
ルカプトエタノール７１０％グリセロール１０．００１
％ＢＰＢ）５０μｌとを混合し、９５°Ｃ１５分間熱処
理を行い、０．２％ＳＯ３を含む１０％ポリアクリルア
ミドゲルにて電気泳動後、クマシーブルーにより染色し
た。Ｍ２及び５Ｐ６８１８株由来鞭毛粗精製品のいずれ
においても分子量５２．０００の位置に主バンドか確認
された。また分子量約６０．０００の位置にわずかな不
純物のバンドも確認された。Ｍｏｎｔｉｅらは（、Ｉｎ
ｆｅｃ、　　Ｉｍｍｕｎ、３５゜２８１、１９８２）同
様の方法によりＭ２株より、鞭毛を精製し、そのフラジ
ェリンの分子量を５３．０００と報告しており、我々の
結果とほぼ一致している。

３）ウェスタン・プロッティングによるハイブリドーマ
ＩＮ−２Ａ８の産生ずるヒトモノクローナルＩｇＭ抗体
の反応性に関する検討 ウェスタン・プロッティング（ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、７
６、３１１６．１９７９）の手法を用いてＩＮ−２Ａ８
の産生ずる　ＩｇＭ抗体の鞭毛粗精製品への結合性を検
討した。

実施例５−２）と同一の条件により、Ｍ２及び５Ｐ６８
１８株由来、鞭毛粗精製品を電気泳動した後、デュラポ
ア、ポリビニリデン・ジフロライド膜（日本ミリポア・
リミテッド）に電気的にトランスファーした。この膜上
での酵素抗体染色法により、ハイブリドーマＩＮ−２Ａ
８の産生ずるＩｇＭ抗体が実施例４−２）に示した、Ｍ
２及び５Ｐ６８１８株由来鞭毛粗精製品中の分子量５２
．０００のフラジェリンに対応する主バンドと反応する
ことを確認した。

なお、この鞭毛粗精製品を蛋白分解酵素（Ｐｒｏｔｅｉ
ｎａｓｅ　Ｋ）により３７℃、２時間処理後、同様にウ
ェスタン・プロッティングによる検討を行う−４８〜 と、　ＩＮ−２Ａ８の産生する　ｒｇＭ抗体との反応性
か消失した。

以上の結果より、ＩＮ−２Ａ８の産生ずる！ｇＭ抗体は
いずれも緑膿菌の鞭毛を構成する粒状蛋白質であるフラ
ジェリンを特異的に認識し、その結果、緑膿菌の鞭毛に
対して特異的に結合することか示された。同様の検討に
よりＩＮ−５Ｄ６及びＺｌ−３Ａ８の産生ずるＩｇＭ抗
体も同じくフラジェリンを認識することが確認されてい
る。

以上の結果よりハイブリドーマＩＮ−２Ａ８．　ＩＮ−
５Ｄ６及びＺｌ−３Ａ８の産生するＩｇＭ抗体は、Ｍ２
由来のフラジェリンに結合することがウェスタン・プロ
ッティングにおいて確認され、さらに、実施例４に示し
たようにＥＬｒＳＡにおいて、緑膿菌Ｍ２及びＰＡＯ−
１（ＡＴＣＣ２５２４）株に対して、結合が確認されて
いる。ところでＭ２及びＰＡ’Ｏ−］株はいずれも、Ａ
ｎｓｏｒｇの鞭毛による血清型分類すに対応する鞭毛を
有することが報告されている。（Ａｌｌｉｓｏｎ、　Ｉ
ｎｆｅｃ、　Ｉｍｍｕｎ。

■、　７７０．１９８５）このことは、ＩＮ−２Ａ８．
　ＩＮ−５０６及びＺｒ−３Ａ８の産生ずる［ｇＭ抗体
は、Ａｎｓｏｒｇの鞭毛にょる血清型分類すに対応する
鞭毛及びその構成成分であるフラジェリンに対して特異
的に結合すると考えられる。

実施例６ ハイブリドーマＩＮ−２Ａ８の産生ずるヒト・モノクロ
ーナルＩｇＭ抗体によるマウス実験的緑膿菌感染症の治
療効果（１） ＩＣＲマウス（４週令、雄、静岡県実験動物農業協同組
合、１群１０匹）の背部の毛を刈り取り、麻酔後、グラ
スファイバー紙にエタノールを染み込ませ、点火し、１
０秒間マウスの背部に押しあてることにより、熱傷マウ
スを作製した。この熱傷マウスに対して、熱傷によるシ
ョックをやわらげるために生理食塩水を０．３ｍ　ｌを
腹腔内（ｉ、　ｌ）、　）投与したのち、線膜菌株Ｍ２
（０抗原血清型別Ｂ）および緑膿菌臨床分離株５Ｐ１０
０５２（Ｏ抗原血清型別Ｂ）を所定の接種菌量　となる
ように生理食塩水に懸濁し、０．２ｍ　ｎを熱傷部位に
皮下接種することにより感染させた。１時間後ハイブリ
ドーマＩＮ−２Ａ８の産生ずるヒトモノクローナル抗体
精製品を所定の濃度となるようにＰＢＳ（−）により希
釈し、０．２ｍ　ｎを静脈内（ｉ、　Ｖ、　）投与し、
７日後のマウスの生存率をもって、治療効果を判定した
。結果を表４に示す。

緑膿菌鞭毛に対するヒトモノクローナル抗体ＩＮ−２Ａ
８はマウス実験的緑膿菌感染症において、無投与群と比
較し、０．１　μｇ／ｈｅａｄ、　１　μｇ／ｈｅａｄ
の投与量で明確な生存率の増加か確認された。

また、表４に示された５Ｐ１００５２及びＭ２の各接種
菌量における生存率から統計学的に算出される、各ＩＮ
−２Ａ８１ｇＭ投与量におけるＬＤ５１１値（半数のマ
ウスが死亡する接種菌量）及び９５％信頼限界における
ＬＤ５．値の上限値と下限値の範囲を表５に示す。

表５に示すようにＩＮ−２Ａ８　ＩｇＭを０．　Ｉ　ｕ
　ｇ／ｈｅａｄ、あるいは１μｇ／ｈｅａｄマウスに投
与した群は無投与群あるいはＢＳＡ投与群に比較して、
高いＬＤ５ｏ値を示した。また、統計学的に算出される
９５Ｎ信頼限界におけるＬＤ、。値の上限値と下限値の
範囲（かっこ内の数値）は、各濃度の抗体投与群と無投
与群あるいはＢＳＡ投与群の間で重なりがなく、有意差
を示した。この結果は、ＩＮ−２Ａ８１ｇＭの０．１μ
ｇ／ｈｅａｄ、あるいは１μｇ／ｈｅａｄ投与量での明
確な感染治療効果を示すものである。

実施例７ ハイブリドーマＩＮ−２Ａ８の産生ずるヒト・モノクロ
ーナルＩｇＭ抗体によるマウス実験的緑膿菌感染症の治
療効果（２） 実施例６と同様の熱傷マウスを用いた実験的緑膿菌感染
症における、０抗原血清型別の異なる緑膿菌に対するハ
イブリドーマＩＮ−２Ａ８の産生ずるヒト・モノクロー
ナルＩｇＭ抗体の治療効果を検討した。ＩＮ−２Ａ８　
ＩｇＭ　１μｇ／ｈｅａｄ投与での生存率およびＬＤ、
、値を表６に示す。

緑膿菌鞭毛に対するヒトモノクローナル抗体ＩＮ−２Ａ
８は熱傷マウスを用いた実験的緑膿菌感染症において、
Ｏ抗原血清型別の異なる緑膿菌に対して幅広く感染治療
効果を示すことが確認された。

いずれの場合もＩＮ−２Ａ８　（ｇＭ　ｔμｇ／ｈｅａ
ｄ投与群と無投与群との間で９５％信頼限界におけるＬ
Ｄ５．値の上限値と下限値の範囲に重なりがなく、有意
差を示した。この結果は、明確な感染治療効果を示すも
のである。

実施例８ ジャーファンメーターを用いたハイブリドーマＩＮ−２
Ａ８の大量培養 ジャーファンメーター（容量６Ｌ、型番ＭＣＴ−３Ｓ、
丸菱バイオエンジ）を用いて、ハイブリドーマＩＮ−２
八８の大量培養を行った。培地は市販無血清培地セルク
ロツサーＨ（闇黒研究所）にグルコース（最終濃度　４
ｍｇ／ｍＩり　、Ｆｅ２２％を添加したものを用いた。

４．４βの上記培地に細胞濃度１　ｘ　ｌ　Ｏｌ′ｃｅ
ｌｌｓ／ｍＡで植え込み、３日間の培養により細胞濃度
は４．　ｌ　Ｘ　１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＡに増殖し、培
養上清中のヒトモノクローナルＩｇＭ抗体の濃度は５．
３μｇ７ｍ（ｌであった。また、２〜３日ごとに一時攪
拌を停止し、細胞を沈澱させたのち、上部の細胞を含ま
ない培養上清を新鮮な培地と交換することにより、連続
的に培養を行い、細胞濃度１ｘ　１０６ｃｅｌｌｓ／ｍ
β以上を保持することか可能であった。その時の培養上
清中のヒトモノクローナルＩｇＭ抗体の濃度は１０μｇ
／ｍｎに達した。

実施例９ 特異抗体の精製 実施例８に示したようにハイブリドーマＩＮ−２Ａ８細
胞株を６１ジャーファーメンタ−を用いて３％ＦＣ３含
有セルクロツサーＨ培地により大量培養を行った。その
培養上清５．５１を限外濃縮により１００ｍＡ（蛋白質
量２．６ｇ）とした後、ＰＢＳ（−）により平衡化した
Ｑ−ｓｅｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（ファルマシア。

直径２．６ｃｍＸ長さ３０ｃｍ、容量１５０献）に負荷
した。

約５培容量の０．１５Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６，８）で
洗浄後、０，３Ｍリン酸緩衝液で溶出し、　ＩｇＭ画分
を得た。

次に限外濃縮を行ない、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　５３００
ＨＲ（ファルマシア、直径２．６ｃｍｘ長さ９０ｃｍ、
容量４５１１Ｗ）に負荷し、ＰＢＳ（−）で溶出した。

このゲル濾過での各画分の抗鞭毛抗体価をＢＬＩＳＡ法
を用いて測定し、活性画分を回収した。ヒトモノクロー
ナルＩｇＭ抗体の蛋白としての回収率は１）２％で比活
性は約６０培に上昇した。

実施例ＩＯ ハイブリドーマＩＮ−２Ａ８の産生ずるヒトモノクロー
ナルＩｇＭ抗体によるマウス実験的緑膿菌感染症の治療
効果（３） 熱傷および感染の４日前に、顆粒球の減少を誘導する為
に、サイクロフォスフアミド（塩野義製薬）・２５０　
ｍｇ／　ｋｇを腹腔内投与したのち、実施例６と同様の
手法により熱傷マウスを作成し、表層にＯ抗原を有しな
いＭ壁画に対するノ＼イブリドーマＩＮ−２Ａ８の産生
ずるヒトモノクローナル抗体の治療効果を検討した。

ＩＮ−２Ａ８　１ｇＭ　１　ｕ　ｇ／ｈｅａｄ投与での
生存率およびＬＤ、。値を表７に示す。

＼１、 ＼、 緑膿菌鞭毛に対するヒトモノクローナル抗体ＩＮ−２Ａ
８は、上述の顆粒球減少・熱傷マウスを用いた実験的緑
膿菌感染症において、血清型Ｍ型菌に対しても、強い、
感染治療効果が確認された。ＩＮ−２へ８１μｇ／ｈｅ
ａｄ投与群と無投与群との間で９５％の信頼限界におけ
るＬＤ、。値の上限値と下限値の範囲に重なりがなく、
有意差を示した。この結果は、明確な感染治療効果を示
すものである。

実施例１０ ハイブリドーマＩＮ−２Ａ８の産生ずるヒトモノクロー
ナルＩｇＭ抗体によるマウス実験的緑膿菌感染症の治療
効果（４） 抗生物質イミペネムとの併用効果 実施例６と同様の手法により熱傷マウスを用いた実験的
緑膿菌感染症において、ハイブリドーマＩＮ−２Ａ８の
産生ずるヒトモノクローナルＩｇＭ抗体とカルバペネム
系抗生物質イミペネム（チェナム、萬有製薬）との併用
効果を検討した。ただし、上述のイミペネムには、その
腎臓での不活化及び腎毒性の抑制の為に、等重量のシラ
スフチンを含有する。抗体および抗生物質は感染１時間
後に、静脈内（ｉ、ｖ、）投与し、７日後の生存率によ
り、治療効果を判定した。各サンプル投与群における生
存率およびＬＤ、。値を表８に示す。

ＩＮ−２Ａ８　Ｉ　ｇ　Ｍ　ｌ　μｇ／ｈｅａｄ投与に
おける生存率あるいはＬＤ、、値、イミペネム１００　
μｇ／ｈｅａｄ及び５００μｇ／ｈｅａｄ投与における
生存率あるいはＬ　Ｄ　ｉ。値と比較して、両者の併用
投与における生存率あるいはＬＤ、、値は顕著に良好な
治療効果を示し、両者の相乗効果を明確に示す結果であ
る。

実施例１２ ハイブリドーマＩＮ−２Ａ８の産生ずるヒトモノクロー
ナルＩｇＭ抗体の結合性に及ぼすＣａ”イオン濃度の影
響 緑膿菌ＩＤＤ１００２を固定した９６ウエルマイクロプ
レートを用いたＥＬＩＳＡにより、ハイブリドーマＩＮ
−２Ａ８の産生ずるヒトモノクローナルＩｇＭ抗体の結
合性にＣａ”′イオン濃度がどのように影響するかを検
討した。抗原−抗体反応か行なわれている時のｂｕｆｆ
ｅｒ中のＣａ＋＋イオン濃度に、ハイブリドーマＩＮ−
２Ａ８の産生ずるヒトモノクローナルＩｇＭ抗体の鞭毛
に対する結合性は、大きく影響を受けることか確認され
た。結果を表９に示す。

表９ ＥＬＩＳＡ値（ＯＤ、。５） １μＭ以下のＣａ＋１イオン濃度においては、この抗体
は鞭毛に対して結合しないことより、その結合にＣａ”
＋イオンの必要性が示された。結合の極太は、Ｃａ＋Ｉ
イオン濃度１００μＭ（−Ｊ近と考えられ１ｍＭ以上の
濃度では、結合性は減少する傾向を示す。

また、Ｍｇ＋１イオンを用いた同様の検討では、すべて
の濃度において結合は見られなかった。２価カチオンの
なかでも、上述の要求性はＣａ”イオン選択的であると
考えられる。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）マウス実験的緑膿菌感染症において５μｇ／ｋｇ
   体重以上のモノクローナル抗体投与で治療効果を示すこ
   とを特徴とする、緑膿菌の鞭毛に対して特異的に結合す
   るヒトモノクローナル抗体
2. （２）表層にＯ抗原を有しない日本緑膿菌研究会血清型
   別検討委員会の血清型別分類におけるＭ型菌を用いた、
   マウス実験的緑膿菌感染症において治療効果を示すこと
   を特徴とする、緑膿菌の鞭毛に対して特異的に結合する
   ヒトモノクローナル抗体
3. （３）ハイブリドーマＩＮ−２Ａ８ （微工研菌寄第９９６０号）またはその子孫細胞株によ
   り産生されることを特徴とする請求項１または２記載の
   ヒトモノクローナル抗体
4. （４）請求項１、２または３記載のヒトモノクローナル
   抗体を少なくとも一種類含有するヒト免疫グロブリン製
   剤
5. （５）請求項１、２または３記載のヒトモノクローナル
   抗体を少なくとも一種類含有する細菌感染症予防治療剤
6. （６）請求項１または２記載のヒトモノクローナル抗体
   を産生するハイブリドーマまたはその子孫細胞株
7. （７）ハイブリドーマＩＮ−２Ａ８ （微工研菌寄第９９６０号）またはその子孫細胞株
8. （８）請求項６または７記載のハイブドーマまたはその
   子孫細胞株を培養し、抗体を産生、回収することを特徴
   とする請求項１）２または３記載のヒトモノクローナル
   抗体の製造方法