JPH02286086A - 組換遺伝子の発現法 - Google Patents
組換遺伝子の発現法Info
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- JPH02286086A JPH02286086A JP2072261A JP7226190A JPH02286086A JP H02286086 A JPH02286086 A JP H02286086A JP 2072261 A JP2072261 A JP 2072261A JP 7226190 A JP7226190 A JP 7226190A JP H02286086 A JPH02286086 A JP H02286086A
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- codon
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6462—Plasminogen activators u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/0102—Alpha-glucosidase (3.2.1.20)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はアルギニンに関するＡＧＡ−コドン又は／及び
ＡＧＧ−コドンを有する組換遺伝子を含有する発現ベク
ターで形質転換することによシ、この＃１換遺伝子を大
＋１１ｍ中で＠現１せる之めの方法に関する。
ＡＧＧ−コドンを有する組換遺伝子を含有する発現ベク
ターで形質転換することによシ、この＃１換遺伝子を大
＋１１ｍ中で＠現１せる之めの方法に関する。
従来の技術
蛋白質又は蛋白質含有遺伝子生産物の遺伝子工学的製造
は現代バイオテクノロジーの主目的の１つである。特に
原核生物は容易に発酵可能である丸めに多量の蛋白質製
造に好適であるので、すでに数多く実験されており、原
核生物中で真核生物遺伝子を発現させることも研死され
ている。しかしながら、この際原核細胞中で＾植生物蛋
白質はしばしば非常に僅かな量でのみ製造され、かつこ
の細胞は高められた蛋白質の生産において発酵／生長困
Ｓを示すという問題が生じる。
は現代バイオテクノロジーの主目的の１つである。特に
原核生物は容易に発酵可能である丸めに多量の蛋白質製
造に好適であるので、すでに数多く実験されており、原
核生物中で真核生物遺伝子を発現させることも研死され
ている。しかしながら、この際原核細胞中で＾植生物蛋
白質はしばしば非常に僅かな量でのみ製造され、かつこ
の細胞は高められた蛋白質の生産において発酵／生長困
Ｓを示すという問題が生じる。
発現におけるこの糧の問題は特に組織（ｔｌｓｓｕｅｔ
ｙｐｅ ）−シラスミノ−ｒンーアクチペータートＰＡ
Ｋ Ｐいてみられる。しかしながら、この蛋白質は臨
床テストにおいて梗塞疾患の治療のために好適でめると
して認められているので、この蛋白質の製造は努力しか
いのめる目的でるる。
ｙｐｅ ）−シラスミノ−ｒンーアクチペータートＰＡ
Ｋ Ｐいてみられる。しかしながら、この蛋白質は臨
床テストにおいて梗塞疾患の治療のために好適でめると
して認められているので、この蛋白質の製造は努力しか
いのめる目的でるる。
大ｙｌｋｍ細胞がシラスミド又はベクター上に挿入され
たトＰＡ−ｃＤＮＡ を十分量で′Ｒｈ現し、Ｌ−ＰＡ
ｔ生産することができるのではあるが、この細詔は発酵
の間バイオマスの形成にかいて強く減少し、こうして全
体でｔ−ＰＡの生産は、個々の細＠ｇ）生産から予想す
る水準まで達しない、更に、大腸ｉ１ｍ廊中０！ラスミ
ド安定性は小さく、かつコードするシラスミドの損失に
よｐ生産率０Ｔ能であった（Ｒｏ ｔｈｓ ｔｅｌｎ及
びＢｅｒｉ＋Ｏｎムｓ ％（）ｅｎｅ 。
たトＰＡ−ｃＤＮＡ を十分量で′Ｒｈ現し、Ｌ−ＰＡ
ｔ生産することができるのではあるが、この細詔は発酵
の間バイオマスの形成にかいて強く減少し、こうして全
体でｔ−ＰＡの生産は、個々の細＠ｇ）生産から予想す
る水準まで達しない、更に、大腸ｉ１ｍ廊中０！ラスミ
ド安定性は小さく、かつコードするシラスミドの損失に
よｐ生産率０Ｔ能であった（Ｒｏ ｔｈｓ ｔｅｌｎ及
びＢｅｒｉ＋Ｏｎムｓ ％（）ｅｎｅ 。
第６１巻、１９８７年、＠４１〜５０貞）６発明が解決
しようとする課題 従って、本発明の課題は従来公知の方法によシその発現
が明らかに低下した宿主細胞の生長及びシラスミド不安
定性に導びき、その結果遺伝子生成物の僅かな収率に導
び〈組換遺伝子を高め比奴率で発現させることを可能と
する方法を提供することでめる。
しようとする課題 従って、本発明の課題は従来公知の方法によシその発現
が明らかに低下した宿主細胞の生長及びシラスミド不安
定性に導びき、その結果遺伝子生成物の僅かな収率に導
び〈組換遺伝子を高め比奴率で発現させることを可能と
する方法を提供することでめる。
課題を解決するための手段
本発明の昧聴はアルギニンに関するＡＧＡ−コドン又は
／及びＡＧＧ−コドンｔ−有する組換遺伝子を含有する
発現ベクターで形質転換することによシこの組換遺伝子
全大腸直中で発現させる九めに、１ｍ供遺伝子中のＡＧ
Ａ−コドン又は／及びＡＧＧ−コドンの含ｔが６−を越
えるざいに、これらのコドンの量を遺伝子中のコドンの
全量に対して最高で５ｔｓｒｃ低下させることにより解
決する。
／及びＡＧＧ−コドンｔ−有する組換遺伝子を含有する
発現ベクターで形質転換することによシこの組換遺伝子
全大腸直中で発現させる九めに、１ｍ供遺伝子中のＡＧ
Ａ−コドン又は／及びＡＧＧ−コドンの含ｔが６−を越
えるざいに、これらのコドンの量を遺伝子中のコドンの
全量に対して最高で５ｔｓｒｃ低下させることにより解
決する。
本発明はＡＧＡ−コドン又は／及びＡＧＧ−コドンのパ
ーセンテージを３％又はそれ以下に低下させる時、コド
ンの６−よシ多くをＡＧＡ−コドン又は／及びＡＧＧ−
コドンの形で有する遺伝子において着しく改良され比奴
率が大腸菌中で達せられるという認識にもとず〈。実績
はこれらのコドンの菫の例えば４％から６−への減少は
収率ｔ−８倍に上昇させ、２−への減少は１０倍より大
きな収率への上昇に作用することができるということを
示した。
ーセンテージを３％又はそれ以下に低下させる時、コド
ンの６−よシ多くをＡＧＡ−コドン又は／及びＡＧＧ−
コドンの形で有する遺伝子において着しく改良され比奴
率が大腸菌中で達せられるという認識にもとず〈。実績
はこれらのコドンの菫の例えば４％から６−への減少は
収率ｔ−８倍に上昇させ、２−への減少は１０倍より大
きな収率への上昇に作用することができるということを
示した。
本発明による方法は、従来大腸Ｉ！！［細胞の悪い生長
の之めにその発現が僅かな収率でのみ所望の蛋白質に導
びく、組換遺伝子の生産を明らかに高めた濾で製造する
ことを可能とする。
の之めにその発現が僅かな収率でのみ所望の蛋白質に導
びく、組換遺伝子の生産を明らかに高めた濾で製造する
ことを可能とする。
本発明による方法は、ＡＧＡ−コドン又は／及びＡ（）
Ｇ−コドンｔ−６ｔＩｈよ）多く含有するすべての組換
遺伝子に好適である。真核生物遺伝子、袴にそのｃＤＮ
Ａが表現されるのが有利でめる。
Ｇ−コドンｔ−６ｔＩｈよ）多く含有するすべての組換
遺伝子に好適である。真核生物遺伝子、袴にそのｃＤＮ
Ａが表現されるのが有利でめる。
これらは、例えば人つロ中ナーゼ、ｔ−ＰＡ又はその誘
導体、ＨＩＶ−蛋白質（例えばｇｐ ４１、ｐ２４人酵
母又は大ｒＷｘｍからのα−グルコシダーゼである。こ
の際、本発明による方法の大きな利点は組換遺伝子が構
造的に発現されうるということにもある。
導体、ＨＩＶ−蛋白質（例えばｇｐ ４１、ｐ２４人酵
母又は大ｒＷｘｍからのα−グルコシダーゼである。こ
の際、本発明による方法の大きな利点は組換遺伝子が構
造的に発現されうるということにもある。
特に有利でめるのは本発明によるＬ−ＰＡの製法であシ
、ここでは組換遺伝子としてｔ−ＰＡ −遺伝子（Ｐｅ
ｎｎ１ｃａ尋看、Ｎａｔ、ｕｒｅ ｈａ ５０１巻１１
９８６年、第２１４〜２２１貞）又はその誘導体を発現
する。従来公知の発現率が大腸菌全細胞蛋白質あたりＵ
−ＰＡ約５％でめったのに対して、本発明により収率は
６０％ＩＣ多菫に上昇する。
、ここでは組換遺伝子としてｔ−ＰＡ −遺伝子（Ｐｅ
ｎｎ１ｃａ尋看、Ｎａｔ、ｕｒｅ ｈａ ５０１巻１１
９８６年、第２１４〜２２１貞）又はその誘導体を発現
する。従来公知の発現率が大腸菌全細胞蛋白質あたりＵ
−ＰＡ約５％でめったのに対して、本発明により収率は
６０％ＩＣ多菫に上昇する。
ＡＧＧ−及び／又はＡＧＡ−コドンの言責の減少はこの
ｖＡ種々の方法で実施することができる。
ｖＡ種々の方法で実施することができる。
不発明の有利な実施形において、量ｔ−ｆＪｋ、少させ
るために過剰のコドンを、すなわち残つ九ＡＧＧ−又は
／及びＡＧＡ−コドンの霊が最高６−になるまでの鎗の
コドンを、アルギニンに１＠シてコードする他のコドン
と交換する。アルギニンをコードする他のトリプレット
はＣＧＡ 、 ＣＧＣ％Ｃ（）Ｇ及びＣＧ’Ｉ’である
。この際、Ｃ’（）Ｔ−コドンに対する交換が特に有利
である。
るために過剰のコドンを、すなわち残つ九ＡＧＧ−又は
／及びＡＧＡ−コドンの霊が最高６−になるまでの鎗の
コドンを、アルギニンに１＠シてコードする他のコドン
と交換する。アルギニンをコードする他のトリプレット
はＣＧＡ 、 ＣＧＣ％Ｃ（）Ｇ及びＣＧ’Ｉ’である
。この際、Ｃ’（）Ｔ−コドンに対する交換が特に有利
である。
本発明の他の有利な実施形においては、ＡＧＡ−又は／
及びＡＧＧ−コドン電Ｏ減少のために過剰のコドンを蛋
白質のｒ８性が全く影ｗを受けないか、又はほとんど受
けない他のアミノ酸に関するコドンに交換する。今日組
換形で発現可能な遺伝子及びこれらから得られた蛋白質
の大部分に関しては、どこの蛋白′Ｘ′ｐｆＡ域が活性
にどうしても必要でめるのか、そしてどこの領域が場合
によシ変化してもよいのかということはすでに公知であ
る。こうして例えば、ｔ−ＰＡＫ関しては、蛋白質の活
性に影ｑＩＩ金与えることなく突然変異を実施すること
ができるということは公知である（ Ｆｉｂｒｉｎｏｌ
ｙａｌｓ ％ 第２巻、１９８８年、ｍ１６３〜１４２
貞及びその中に記載された引用文献参照）。
及びＡＧＧ−コドン電Ｏ減少のために過剰のコドンを蛋
白質のｒ８性が全く影ｗを受けないか、又はほとんど受
けない他のアミノ酸に関するコドンに交換する。今日組
換形で発現可能な遺伝子及びこれらから得られた蛋白質
の大部分に関しては、どこの蛋白′Ｘ′ｐｆＡ域が活性
にどうしても必要でめるのか、そしてどこの領域が場合
によシ変化してもよいのかということはすでに公知であ
る。こうして例えば、ｔ−ＰＡＫ関しては、蛋白質の活
性に影ｑＩＩ金与えることなく突然変異を実施すること
ができるということは公知である（ Ｆｉｂｒｉｎｏｌ
ｙａｌｓ ％ 第２巻、１９８８年、ｍ１６３〜１４２
貞及びその中に記載された引用文献参照）。
更に、多くの蛋白質に関しては（例えばヨーロッパ特許
公開１ｉ１４０２７１０５５号公報、画独特７Ｆ第３８
１５６０１号公躍）、１種以上のアミノ酸の交換により
その活性が改良されるということも公知である。従って
、 ＡＧＡ−又は／及びＡＧＧ−コドンを発現される蛋
白質の活性がプラスに影響されるような他のアミノ酸に
関するコドンと交換することが本発明において最も有利
である。
公開１ｉ１４０２７１０５５号公報、画独特７Ｆ第３８
１５６０１号公躍）、１種以上のアミノ酸の交換により
その活性が改良されるということも公知である。従って
、 ＡＧＡ−又は／及びＡＧＧ−コドンを発現される蛋
白質の活性がプラスに影響されるような他のアミノ酸に
関するコドンと交換することが本発明において最も有利
である。
本発明の他の有利な実施ルにおいては、 ＡＧＧ−及び
／又はＡＣ）Ａ−コドンの減少は過剰のコドンを終止コ
ドンに変えることにより達せられ、その場合終止コドン
を抑圧する、大１腸醒株を宿主細胞として使用する。こ
れに関する例は大腸直株Ｃ６００、ＨＢｌ ０１、ＤＨ
２、ＪＭＩ０９、ＪＭｌ ０６（５ｕｐＥ）； ８Ｃ１
２２、Ｋ １ ６５ （ｇｕｐｅ） で お リ 、こ
れらは終止コドンＵＡＡ／ＴＪＡＧ（ｓｕｐｃ）及びＴ
ＪＡＧ（ｓｕｐＥ） ｔｅ抑圧する（Ｅａｃｈｓｒｌｃ
ｈｌａ Ｃｏ１１ ａｎｄ８ａ１ｍｏｎａｌｌａ Ｔｙ
ｐｈｌｍｕｒｌｕｍ、 Ｃｅ１ｌｕｌａｒ ａｎｄＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ％第２巻、編集者Ｆ
’、Ｃ’。
／又はＡＣ）Ａ−コドンの減少は過剰のコドンを終止コ
ドンに変えることにより達せられ、その場合終止コドン
を抑圧する、大１腸醒株を宿主細胞として使用する。こ
れに関する例は大腸直株Ｃ６００、ＨＢｌ ０１、ＤＨ
２、ＪＭＩ０９、ＪＭｌ ０６（５ｕｐＥ）； ８Ｃ１
２２、Ｋ １ ６５ （ｇｕｐｅ） で お リ 、こ
れらは終止コドンＵＡＡ／ＴＪＡＧ（ｓｕｐｃ）及びＴ
ＪＡＧ（ｓｕｐＥ） ｔｅ抑圧する（Ｅａｃｈｓｒｌｃ
ｈｌａ Ｃｏ１１ ａｎｄ８ａ１ｍｏｎａｌｌａ Ｔｙ
ｐｈｌｍｕｒｌｕｍ、 Ｃｅ１ｌｕｌａｒ ａｎｄＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ％第２巻、編集者Ｆ
’、Ｃ’。
Ｎｅ１ｄｈａｒｄｔ、 Ａｍｅｒｌｃａｎ ８ｏｃ１ｅ
Ｌｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ。
Ｌｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ。
１９８７年中、第８０７〜８７６貞及び渠１１９０〜１
２１９貞、Ｂ、 Ｂａｃｈｍａｎｎ ｓ第１２２５〜１
２５０頁Ｓ、Ｒ，Ｋｕｓｈｎｅｒ ）。
２１９貞、Ｂ、 Ｂａｃｈｍａｎｎ ｓ第１２２５〜１
２５０頁Ｓ、Ｒ，Ｋｕｓｈｎｅｒ ）。
もう１つの特に有利な本発明による実施形においては、
ＡＧＡ−又は／及びＡＧＧ−コドンを減少させるために
過剰のコドン金欠失させる。
ＡＧＡ−又は／及びＡＧＧ−コドンを減少させるために
過剰のコドン金欠失させる。
この櫨欠失は、他のアミノ酸をコードするコドンへの交
換のために重要な基準に相応して実施することができる
。しかしながら非常に多くの個々のコドンの欠失によシ
発現される蛋白質の三次構造への作用が生じることかめ
るので、ここでは場合によりこの欠失と、アルギニンを
コードする他のコドン又は他のアミノ酸ｔ−コードする
コドンへの交換と組合わせることができる。
換のために重要な基準に相応して実施することができる
。しかしながら非常に多くの個々のコドンの欠失によシ
発現される蛋白質の三次構造への作用が生じることかめ
るので、ここでは場合によりこの欠失と、アルギニンを
コードする他のコドン又は他のアミノ酸ｔ−コードする
コドンへの交換と組合わせることができる。
ＡＣ）Ｇ−又は／及びＡＧＡ−コドンの他のコドンへの
交換も、これらのコドンの欠失も本発明において有利に
′＃足部位の突然変１４−発（ｓｕｅｄｊｒｅｃｔｅｄ
ｍｕｂａｇｅｎｅｓｉａ 、 モリナガ等著、Ｂｌｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ、 第２４．１９８４年、第６頁、第６
６４〜６６９画参照）により行なわれる。得られた蛋白
質の活性の試験は次いで自体公知法により行なう。
交換も、これらのコドンの欠失も本発明において有利に
′＃足部位の突然変１４−発（ｓｕｅｄｊｒｅｃｔｅｄ
ｍｕｂａｇｅｎｅｓｉａ 、 モリナガ等著、Ｂｌｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ、 第２４．１９８４年、第６頁、第６
６４〜６６９画参照）により行なわれる。得られた蛋白
質の活性の試験は次いで自体公知法により行なう。
ＡＧＧ−及び／又はＡＣ）Ａ−コドンに関する金波を減
少させる之めの更なる可能性、すなわち本発明の他の有
利な実施形は、組換遺伝子中に含有されるＡＧＡ−又は
／及びＡＧＧ−コドンの菫を、所望の蛋白質をコードす
るＤＮＡ配列ｔ５％を越える、待に２−を越えるＡＧＧ
−又は／及びＡＣ）Ａ−コドンに関する含量の回避を考
慮して、化学的に合成することにより減少させるという
方法にもある。このような化学合成は特に比較的短かい
遺伝子において有望であシ、多分作業において最もめん
どうでない。ＡＧＡ ／ ＡＧＧ−コドンの変わシに、
合成の瞳にもコドンの交換のために６げた基単に相応し
て同じように行なわれる。
少させる之めの更なる可能性、すなわち本発明の他の有
利な実施形は、組換遺伝子中に含有されるＡＧＡ−又は
／及びＡＧＧ−コドンの菫を、所望の蛋白質をコードす
るＤＮＡ配列ｔ５％を越える、待に２−を越えるＡＧＧ
−又は／及びＡＣ）Ａ−コドンに関する含量の回避を考
慮して、化学的に合成することにより減少させるという
方法にもある。このような化学合成は特に比較的短かい
遺伝子において有望であシ、多分作業において最もめん
どうでない。ＡＧＡ ／ ＡＧＧ−コドンの変わシに、
合成の瞳にもコドンの交換のために６げた基単に相応し
て同じように行なわれる。
本発明による組換遺伝子の発現のための方法により、そ
の天然の形に訃いて６俤を越えるＡＧＡ−又は／及びＡ
ＧＧ−コドンｔ−含有する遺伝子を効果的に相応する蛋
白質に変換することが達せられる。特に、血栓溶解用医
薬品中の有望な作用物質である蛋白質ｔ、−ＰＡにおい
ては比較的多くのこの葎のコドンが含有されており、本
発明による方法でこれらのコドン′ｆ：１ｊ１＆少させ
ることにより、この蛋白質の発現率の著しく強方な上昇
金主せしめることが達せられる。
の天然の形に訃いて６俤を越えるＡＧＡ−又は／及びＡ
ＧＧ−コドンｔ−含有する遺伝子を効果的に相応する蛋
白質に変換することが達せられる。特に、血栓溶解用医
薬品中の有望な作用物質である蛋白質ｔ、−ＰＡにおい
ては比較的多くのこの葎のコドンが含有されており、本
発明による方法でこれらのコドン′ｆ：１ｊ１＆少させ
ることにより、この蛋白質の発現率の著しく強方な上昇
金主せしめることが達せられる。
実施例
次に図面と関連させて実施例につき本発明を詳説する：
第１図は禰々の遺伝子の発現収率をＡＧＧ／ＡＧＡ−コ
ドンの含量に関連させ九比較グラフ図である。
ドンの含量に関連させ九比較グラフ図である。
例 １
発現すべ話遺伝子中のＡＧＧ／ＡＧＡ−コドンの量と、
それぞれ達せられ九発現収率との比較シラスミドｐＵＰ
Ａ １１０ （シグナルペプチド七有さない人グロウロ
キナーゼに関する配列を含有、Ｈｏｌｍｅａ等、Ｂｌｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ％ｍ ５巻、１９８５年、
第９２５〜９２９貞）、ｐＧＰ４１（人ＨＩＶ−ヴイー
ルスのＧＦ −４１−蛋白質に関してコードする配列を
含有、Ｒａｔｎｓｒ等、Ｎａｔｕｒｅ％第５１６巻、１
９８５年、第２７７〜２８４貞）、ｐＫＫ １７７−５
／ ＧＬＵＣＰＩ （酵母からのａ−ゲルコクダーゼに
関する配列を含有する、ヨーロッパ特許公開第０５００
４２５号公報）、ｐＢ’ｒ１０２ ＣＤ８Ｍ２０９１
） （大腸菌からのα−ガラクトシダーゼ）及びプラス
ミドｐＨＲ２８９（Ｒ’ｕｔｈｅｒ及びＭｉｉｌｌｅｒ
−Ｈｌｌｌ 、 ＨＭＢＯＪ、、第２巻、１９８６年、
第１７９１〜１７９４ｊｉ［）（大１腸閑からのβ−ガ
ラクトシダーゼに関する配列を含有） ｔ ｒｑ−プラ
スミドを含有する大ａＩ醒、Ｄ８Ｍ ６６８９中に形質
転換する。形質転換体Ｃカナマイシフ２５μｇ ／ Ｉ
Ｉｅもしくはアンピシリン５０ｔｒｇ／ａｔτ言有する
ＬＢ−プレート（ＭａｎｎＪａＬ１ｇ寺看、１９８２年
、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣ１ｏｕｉｎＨ： Ａ Ｌａ１）
Ｏｒａｔ＋Ｏｒ７ Ｍａｎｕａｌ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１
ｄ ８ｐｒ１ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ）上で培養し７１：
、 ｆラスミド含有４Ｂ胞ｔ−ＬＢ中で０Ｄｓｓｏ ｎ
ｍ ＝０．５まで培養し、誘発Ｌ （ＩＰ’Ｉ’Ｃ）ｉ
Ｑ ｍ ｍｏｌ／ Ａの添加）、６７℃で発酵させた
。
それぞれ達せられ九発現収率との比較シラスミドｐＵＰ
Ａ １１０ （シグナルペプチド七有さない人グロウロ
キナーゼに関する配列を含有、Ｈｏｌｍｅａ等、Ｂｌｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ％ｍ ５巻、１９８５年、
第９２５〜９２９貞）、ｐＧＰ４１（人ＨＩＶ−ヴイー
ルスのＧＦ −４１−蛋白質に関してコードする配列を
含有、Ｒａｔｎｓｒ等、Ｎａｔｕｒｅ％第５１６巻、１
９８５年、第２７７〜２８４貞）、ｐＫＫ １７７−５
／ ＧＬＵＣＰＩ （酵母からのａ−ゲルコクダーゼに
関する配列を含有する、ヨーロッパ特許公開第０５００
４２５号公報）、ｐＢ’ｒ１０２ ＣＤ８Ｍ２０９１
） （大腸菌からのα−ガラクトシダーゼ）及びプラス
ミドｐＨＲ２８９（Ｒ’ｕｔｈｅｒ及びＭｉｉｌｌｅｒ
−Ｈｌｌｌ 、 ＨＭＢＯＪ、、第２巻、１９８６年、
第１７９１〜１７９４ｊｉ［）（大１腸閑からのβ−ガ
ラクトシダーゼに関する配列を含有） ｔ ｒｑ−プラ
スミドを含有する大ａＩ醒、Ｄ８Ｍ ６６８９中に形質
転換する。形質転換体Ｃカナマイシフ２５μｇ ／ Ｉ
Ｉｅもしくはアンピシリン５０ｔｒｇ／ａｔτ言有する
ＬＢ−プレート（ＭａｎｎＪａＬ１ｇ寺看、１９８２年
、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣ１ｏｕｉｎＨ： Ａ Ｌａ１）
Ｏｒａｔ＋Ｏｒ７ Ｍａｎｕａｌ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１
ｄ ８ｐｒ１ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ）上で培養し７１：
、 ｆラスミド含有４Ｂ胞ｔ−ＬＢ中で０Ｄｓｓｏ ｎ
ｍ ＝０．５まで培養し、誘発Ｌ （ＩＰ’Ｉ’Ｃ）ｉ
Ｑ ｍ ｍｏｌ／ Ａの添加）、６７℃で発酵させた
。
この培養物の生長を細胞密度（ＯＤｓｓｏ）のコントロ
ールによシ規則的な間隔で砿祝した。
ールによシ規則的な間隔で砿祝した。
誘′＠４時間後に細胞を収穫し、超音波処理により破砕
し喪。このようにして得られた細胞−溶解物１−＊気泳
動によシ分析しくコーマシー・デル−で着色した８ＤＳ
−ｒル）、この蛋白質をヤザからのポリクローナル抗
体を用いてウェスタンプロット法で検出し、コーフシー
漬色８Ｄ８−ゲルの一度測定法による評価を介して、先
行し死細胞溶解物の蛋白質測定により定量した。
し喪。このようにして得られた細胞−溶解物１−＊気泳
動によシ分析しくコーマシー・デル−で着色した８ＤＳ
−ｒル）、この蛋白質をヤザからのポリクローナル抗
体を用いてウェスタンプロット法で検出し、コーフシー
漬色８Ｄ８−ゲルの一度測定法による評価を介して、先
行し死細胞溶解物の蛋白質測定により定量した。
ｒｎ ＲＮＡ中のＡＧＧ ／ＡＧＡ−コドン被とそれぞ
れ達せられた発現収音との比較１第１図に表わした。
れ達せられた発現収音との比較１第１図に表わした。
発現すべき組換ｍＲＮＡ中のＡＧ（） ／ ＡＧＡ−コ
ドン０相対祉（％）と発現収率との間に明らかな逆の相
関性があることがこの図から明らかとなる。
ドン０相対祉（％）と発現収率との間に明らかな逆の相
関性があることがこの図から明らかとなる。
ＡＧＧ／ＡＧＡ−アルギニンコドンの量がコドン全数に
対して２１より大に上昇すると、これは明らかな発現能
の賦少に作用する。
対して２１より大に上昇すると、これは明らかな発現能
の賦少に作用する。
例 ２
例１に示した櫃から、ＡＧＧ −＋ ＡＧＡ−コドンの
菫が組換遺伝子の２！ｊからはじめて発現抑制に作用す
るが、それよシ下まわる時はあまシ大きな意ｔＡを有さ
ないということは明らかである。
菫が組換遺伝子の２！ｊからはじめて発現抑制に作用す
るが、それよシ下まわる時はあまシ大きな意ｔＡを有さ
ないということは明らかである。
従って、ＡＧＧ−及びＡＧＡ−アルギニンコドンを他の
アルギニンコドンに変えたｔ−ＰＡ−発現プラスミドを
製造し丸。仁のために出発グラスミドｐｅＰａ １２６
．１ （西ドイツ国特許公開第５８５８６７８号公報）
からのコドンをｂ−ＰＡｃＤＮＡの第１表に示した位置
に、同様に表中に記載した合成デオ・中ジオリプヌクレ
オチドを用いて順次モリナガ等の方法（ＢｌｏＬｅｃｈ
ｎｏｌ、 ２．１ｃｙｓａ年、’ＩＡ６巻、第６６４〜
６６９頁）により特定部位の突然変異ｄ発（ｓｉｔ、ｅ
ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｌｇ ）により
突然変異勿行ナッタ：生じたグラスミドｆ ｐＴＪＢ８
１２６１ｍ１と名づけ比。
アルギニンコドンに変えたｔ−ＰＡ−発現プラスミドを
製造し丸。仁のために出発グラスミドｐｅＰａ １２６
．１ （西ドイツ国特許公開第５８５８６７８号公報）
からのコドンをｂ−ＰＡｃＤＮＡの第１表に示した位置
に、同様に表中に記載した合成デオ・中ジオリプヌクレ
オチドを用いて順次モリナガ等の方法（ＢｌｏＬｅｃｈ
ｎｏｌ、 ２．１ｃｙｓａ年、’ＩＡ６巻、第６６４〜
６６９頁）により特定部位の突然変異ｄ発（ｓｉｔ、ｅ
ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｌｇ ）により
突然変異勿行ナッタ：生じたグラスミドｆ ｐＴＪＢ８
１２６１ｍ１と名づけ比。
例１に記載さｎていると同じ発現粂件下に、ノ５Ｘミド
ｐＵＢ８１２６． ｍｌ を用いると、出発シラスミド
ｐｅｔａ １２６−１を用いる発現（減少した生長にお
いて全細胞蛋白質の約５％）に対してｔ−ＰＡ−生産に
関して全細胞蛋白質の約６０−への明らかな発現上昇及
び油性改良が遅せられる。
ｐＵＢ８１２６． ｍｌ を用いると、出発シラスミド
ｐｅｔａ １２６−１を用いる発現（減少した生長にお
いて全細胞蛋白質の約５％）に対してｔ−ＰＡ−生産に
関して全細胞蛋白質の約６０−への明らかな発現上昇及
び油性改良が遅せられる。
【図面の簡単な説明】
第１南は大腸菌中での組換蛋白質の発現力の発現すべき
ｍＲＮＡ中のＡＣ）Ｇ及びＡＧＡ−コドン数への依存性
を示すグラフ図である。
ｍＲＮＡ中のＡＣ）Ｇ及びＡＧＡ−コドン数への依存性
を示すグラフ図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、アルギニンに関するＡＧＡ−コドン又は／及びＡＧ
Ｇ−コドンを有する組換遺伝子を含有する発現ベクター
で形質転換することによりこの組換遺伝子を大腸菌中で
発現させるために、組換遺伝子中のＡＧＡ−コドン又は
／及びＡＧＧ−コドンの含量が３％を越えるさいに、こ
れらのコドンの量を遺伝子中のコドンの全量に対して最
高で３％に低下させることを特徴とする組換遺伝子の発
現法。 ２、過剰のＡＧＡ−コドン又は／及びＡＧＧ−コドン量
を減少させるために、アルギニンに関してコードする他
のコドンに交換する請求項１記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3909710A DE3909710A1 (de) | 1989-03-23 | 1989-03-23 | Verfahren zur expression eines rekombinanten gens |
| DE3909710.2 | 1989-03-23 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02286086A true JPH02286086A (ja) | 1990-11-26 |
| JPH07102146B2 JPH07102146B2 (ja) | 1995-11-08 |
Family
ID=6377123
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2072261A Expired - Lifetime JPH07102146B2 (ja) | 1989-03-23 | 1990-03-23 | 組換遺伝子の発現法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0388963B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07102146B2 (ja) |
| AT (1) | ATE106099T1 (ja) |
| CA (1) | CA2012632C (ja) |
| DE (2) | DE3909710A1 (ja) |
| DK (1) | DK0388963T3 (ja) |
| ES (1) | ES2054129T3 (ja) |
| IL (1) | IL93851A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011500036A (ja) * | 2007-10-15 | 2011-01-06 | ザ ユニバーシティー オブ クイーンズランド | 構築物系およびその使用 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6335160B1 (en) * | 1995-02-17 | 2002-01-01 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for polypeptide engineering |
| EP2275559A3 (en) * | 1999-09-28 | 2011-03-23 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Optimized messenger RNA |
| AU2001249170A1 (en) * | 2000-03-13 | 2001-09-24 | Aptagen | Method for modifying a nucleic acid |
| KR100696390B1 (ko) | 2000-09-14 | 2007-03-20 | 다카라 바이오 가부시키가이샤 | 내열성 리보뉴클레아제 ｈ |
| CN100497619C (zh) | 2000-09-26 | 2009-06-10 | 宝生物工程株式会社 | 鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因 |
| WO2005118815A1 (ja) | 2004-06-04 | 2005-12-15 | Takara Bio Inc. | Ｄｎａポリメラーゼ活性を有するポリペプチド |
-
1989
- 1989-03-23 DE DE3909710A patent/DE3909710A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-03-20 CA CA002012632A patent/CA2012632C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-22 DE DE59005790T patent/DE59005790D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-22 AT AT90105447T patent/ATE106099T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-03-22 IL IL9385190A patent/IL93851A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-03-22 ES ES90105447T patent/ES2054129T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-22 EP EP90105447A patent/EP0388963B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-22 DK DK90105447.8T patent/DK0388963T3/da active
- 1990-03-23 JP JP2072261A patent/JPH07102146B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NUCLEIC ACIDS RESEARCH=1984 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011500036A (ja) * | 2007-10-15 | 2011-01-06 | ザ ユニバーシティー オブ クイーンズランド | 構築物系およびその使用 |
| JP2014221068A (ja) * | 2007-10-15 | 2014-11-27 | アドメダス ワクチンズ ピーティーワイ リミテッド | 構築物系およびその使用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL93851A0 (en) | 1990-12-23 |
| DK0388963T3 (da) | 1994-08-29 |
| CA2012632C (en) | 1998-07-28 |
| DE3909710A1 (de) | 1990-09-27 |
| DE59005790D1 (de) | 1994-06-30 |
| IL93851A (en) | 1999-01-26 |
| ATE106099T1 (de) | 1994-06-15 |
| CA2012632A1 (en) | 1990-09-23 |
| EP0388963A1 (de) | 1990-09-26 |
| ES2054129T3 (es) | 1994-08-01 |
| EP0388963B1 (de) | 1994-05-25 |
| JPH07102146B2 (ja) | 1995-11-08 |
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