JPH02286100A - 核酸に対する金属酸化物支持体 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は核酸の固定化に有効な支持体に関する。

別の面においては、本発明は生物分子の支持体として使
用される含水金属酸化物を含む金属酸化物に関する。本
発明はまた核酸に対する、たとえば核酸と標識を含む複
合体の形成による酵素標識のような標識の接着に関する
。

発明の背景 核酸の解析に利用される重要な技術は、たとえばＤＮＡ
−ＤＮＡ、あるいはＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリダイゼー
／日ン技術である。ある型の核酸／Ｘイブリダイゼーシ
ジン技術は、サザンらにより述べられたように（Ｊ、Ｍ
ｏ１．旧０１８．９８：５０３−５１７（１９７５））
、固相へのＤＮＡの固定化を必要とする。′サザンブ０
．２ティングとして知られるこの技術はまず、その電気
泳動移動度に基づく互い同士のＤＮＡ分子の分離を必要
トスる；続いてフィルターにトロセルロース、ジアゾペ
ーパーおよびナイロンが広（使用される。

）のような支持体あるいは基質への分離されたＤＮＡ分
子の固定化が行われる。この後、固定化されたＤＮＡの
対応する配列に対して標識開＾の単数または複数のプロ
ーブのハイブリダイゼーションが行われる。９ノーザン
ブロツテイングと呼ばれる技術を用いて、ＲＮＡもまた
電気泳動的に分離され、類似の方法でプロットされる。

標識されたプローブが固定化されたＤＮＡ配列に相補的
なヌクレオチド配列を含むならば、プローブは固定化さ
れた配列に水素結合によりアニール（すなわち“ハイブ
リダイズ″）する。ハイブリダイゼーションの存在によ
りプローブ分子を供給した材料あるいは電気泳動的に分
離された材料の中にあるＤＮＡ配列、たとえば遺伝子ま
たは遺伝子の一部の存在が決定され、順に相関関係が出
される。

固定化された核酸はさらにシークエンシング法や核酸の
合成法のような他の方法に用いられる。

後者の利用の例として、固定化ＲＮＡが逆転写酵素によ
る相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）の生産を促進するのに用
いられた。たとえば、ストラフレットら、５ｃｌｅｎｃ
ｅｓ２３９：４９１−４９４（１９８８）を参照せよ。

各種の支持体、たとえばニトロセルロース、ジアゾペー
パー　ハイトロキシルアパタイト、ナイロンおよび磁気
デイノスフエレスが記述され、核酸を固定化するのに用
いられている（たとえば、マシューズら、Ａｎａｌｙｔ
、　Ｂ１ｏｃｈｅ＋＋１．１Ｂ９：ｌ−２５（１９８８
）を参照せよ）。市販の支持体にはポリスチレン、ポリ
プロピレン、アクリルおよびラテックス微粒子製の支持
体が含まれる。他の入手可能な支持体はファルマシア・
ファインケミカル社（スエーデン国つプサラ）製の”セ
ファクリル５−ｓｏｏ″　１ｌＣＮＢｒ−セファロース
４Ｂ”として知られるセルロース磁気ビーズ、”セファ
デックスＧ−５０”および”ワットマン５４１″ペーパ
ー（ワットマン・インターナシ日ナル社、英国メイドス
トーン）である。

予定された使用に依存して異なる支持体を同定し選択す
る必要が最初に含まれるが、これらの材料の多くの使用
に伴い多くの本来の困難が存在する。たとえば、ニトロ
セルロースフィルターに固定したＤＮＡは通常−回のハ
イブリダイゼーションに用いられるだけである、そして
ＤＮＡは通常、非可逆的にＤＮＡをニトロセルロースに
結合させるために、フィルターに焼き付けられる。さら
にニトロセルロースは低イオン強度の緩衝液では充分に
核酸と結合せず、それ故使用が限定される。

ジアゾペーパーは再使用できるが、準備が困難で、繰り
返し使用するには壊れやすいようである。

同様に、ナイロンは再使用が可能で、サザンブロッティ
ングに最も広く用いられている支持体である。しかしナ
イロンは通常高塩緩衝液中での紫外線照射のような処理
を次の段階で行なわない限り、ＤＮＡの最適な結合は得
られない。　（たとえば、力−ンジャン、Ｂ（ｏｔｅｃ
ｈ、、５：ＩｌＢ５−１６７（１９？）を参照せよ。

ある特許には核酸を結合するのに有効なある金属酸化物
を含む支持体が記載されている。たとえば米国特許第３
．６５２．、．７６１号は、シラン・カプリング剤を介
して無機媒体を含む水酸基に共有結合する、核酸を含む
抗原について記述している。

さらに米国特許第４．１）７２．０４０号は通常組合シ
ランで被覆された金属酸化物磁気中心核をもつ磁気粒子
およびそのような粒子の、とりわけシランに連結した核
酸を用いて核酸ハイブリダイゼーションを実施するため
の利用について記述している。

米国特許第４．７１３．３２６号は照射により核酸に結
合することができ、基質、光化学的に反応する核酸結合
リガンドおよび化学的に基質とリガンドとを連結する二
価ラジカルをもつ固体の支持体を記述している。

米国特許第４．７４８．１２１号は、核酸が含まれるよ
うに広く定義されている生化学的に活性のある物質を固
定化するための、多孔性でシリカを多（含むグラスファ
イバーの利用について記述している。

ファイバーは多量の８２０３と５ｉ０２とともに少量の
アルカリ金属酸化物のＺｒＯ２とＡｌ２Ｏ３を含む構成
物から形成されることが記載されている。　１２１特許
におけるｚ「０２とＡｌ２Ｏ３の最初の結合量はしかし
ながら約９重量パーセントを越えるとは思われない。生
化学的に活性のある物質は吸着あるいは連結剤を用いた
共有結合によりファイバーに接着する。

以前の技術が教えられなかったが、本発明が提供したも
のは、核酸を固定化するために使いやすく、各種の構造
や形態で提供するのに充分なほど用途の広い、経済的で
耐久性のある、再利用可能な物質である。

発明の要約 本発明は新規の複合体をその調製方法およびそれらの使
用方法と同様に提供するもので、その中の複合体は（ａ
）核酸を吸着するのに充分な量の金属酸化物を含む支持
体および（ｂ）核酸が実質的に生物学的な利用性と反応
性を保持するような様式で、支持体の少な（とも有効な
表面部分に吸着する核酸を含む。

この複合体はさらに支持体への付加的な核酸の吸着能を
本質的に取り除（ように、支持体表面の残りの部分に結
合するプロ・ｙキング剤を含む。

好ましい複合体は（１）各種の形態で供給され、（２）
滅菌が可能で、（３）ブロッキング剤を結合すると同時
に、核酸を吸着する、そして（４）ハイブリダイズした
核酸のみを除去し、吸着核酸を再ハイブリダイズするこ
とにより、または同様に吸着した核酸を除去し、新たな
核酸を再吸着させることにより再利用可能である。

驚くべきことに、本発明の支持体は過酷な要求条件下で
さ、え固定状態で、しかし核酸を本質的に生物学的利用
性と反応性を保持する、すなわちハイブリダイゼーショ
ンのような化学的および／または物理的相互作用に対し
て自由なまま、さもなければ利用可能なままでいるよう
にさせる様式で核酸を維持させるほど充分な強さで、核
酸を吸着する。

本発明の複合体は各種の形態、たとえばコロイド粒子、
自由粒子そして多孔性小球体のような粒子として、ある
いは繊維状または固形のモノシリツク体の形態で調製さ
れる。粒子のような形態は、溶液、被覆、あるいは、た
七えば孔の網目に統合された複合構造のような各種の方
法で使用される。

複合体はたとえばハイブリダイゼーション中の核酸の支
持体として、核酸の標識、核酸のシークエンシング、お
よび／または核酸の合成など各種の応用に使用される。

さらに、好ましい複合体はハイブリダイズした核酸を除
去し、元の吸着した核酸を再度使用することにより、あ
るいは吸着した核酸とハイブリダイズした核酸の両者を
除去し、新たな、および／または異なる核酸を再吸着す
るための支持体として用いることにより再使用が可能で
ある。両特性はたとえば生物リアクターやカラムあるい
は連続プロセスにこれらの複合体を使用し、さらに再使
用できるような柔軟性を提供する。

本発明の複合体は使用、多用途性、再利用性および価格
において調製の容易さ、吸着親ｆａ性、吸着能、貯蔵寿
命の安定性の最適な組み合わせを提供する。

詳細な説明 １、複合体 本発明は新規の複合体およびそのような複合体の調製法
を提供し、その複合体は（ａ）核酸を吸着するのに充分
な量の金属酸化物を含む支持体と（ｂ）核酸が実質的に
生物学的利用性と反応性を保持しつづける様式で、支持
体の有効な表面部分に吸着した核酸からなる。

好ましくは、この複合体はさらに核酸が支持体に吸着す
るのを実質的に妨げるように支持体表面の残りの部分に
結合するブロッキング剤を含む。

理論に結び付けるつもりはないとはいえ、核酸が、たと
えば金属酸化物による核酸の官能基のキレ−ジョンを含
む”吸＠”過程により金属酸化物に固定化されると信じ
られている。ここで用いられている”吸着する°′とい
う語句およびその活用形は、目的のために核酸を利用で
きるように金属酸化物に核酸を非共有結合させる現存す
る物理的、あるいは化学的な吸着または吸収の過程を意
味する。

１、ａ、支持体 本発明の”支持体”は、核酸に物理的に近づきやすく、
核酸を吸着するのに充分な量の金属酸化物を含む表面を
もつ。それゆえ支持体は、充分量の金属酸化物を含む完
全な粒子、繊維あるいはモノリス体のような均一な構造
である。支持体はまた被覆構造の金属酸化物を含む層あ
るいは大きな非金属酸化物構造中の金属酸化物部分のよ
うな有効な金属酸化物を含む不均一な構造体の部分を得
るのに使用される。

金属酸化物は、多量の、すなわち複合体の目的のために
希望量の核酸を吸着させるのに充分な量で支持体の少な
（とも表面に存在している。金属酸化物は支持体の有効
表面を含む要素の重量で少なくとも約５０％か、それ以
上存在することが好ましい。さらに金属酸化物は重量で
少なくとも７０％存在し、中に含まれる金属酸化物が支
持体の有効な表面を含む要素の重量の少なくとも約８ｏ
ｚである支持体が特に好ましい。実質的に完全に、たと
えば重量の９９％以上、あるいは少なくとも９０％の金
属酸化物からつくられた支持体が最も好ましいものであ
る。均一な支持体、すなわちその中の金属酸化物の量が
どこでも一定である支持体に存在する金属酸化物の量は
、明細は参考文献として取り入れられている、「誘導結
合プラズマ発光分光性Ｊパート！およびＩＩ　（Ｐ、Ｗ
、Ｊ、Ｍ、ポーマン編、ジジン・ウィリー・アンド・サ
ンズ、二ニーヨーク、１９８７年）に述べられている誘
導結合プラズマ（”　ＩｃＰ”　）発光分光法により測
定される。

支持体、たとえばその中の金属酸化６物の量が表面、表
面直下あるいは他の領域で変化するような不均一な支持
体の表面に実際に存在する金属酸化物の量は、表面解析
により成分構成を測定できる適当な方法で測定される。

本発明の目的のため、その量は、この中で参考文献とし
て組み込まれている”表面解析法”　（「方法と現象−
科学と技術におけるその応用」第−巻、Ａ、ツァンデル
ナ編、エルゼヴイア・サイエンティフィック出版社、１
９７５年）の第４章に述べられているＸ線光電子分光器
（”　ＸＰＳ”　）により測定された。

ｘＰＳでは、集束Ｘ線ビームが標本または試料に照射さ
れ、そのエネルギーと強度の測定が行われる光電子が生
産される。光電子のエネルギーは特定の元素およびその
化学的状態に特異的である。

船釣に、ＸＰＳは標本表面の最も外部の３０から１０（
ｌλの解析ができる非破壊的な技術で、ｏ、ｉから０．
５％の原子濃度の範囲でほとんどの標本に対して検出限
界を伴うが、水素とヘリウムを除く周期律表のすべての
元素に感受性である。解析される表面の領域は一般に直
径１５０ミクロンから３層ｍｌご調整される。

本発明の適当な金属酸化物は、吸着強度、核酸の吸着能
およびこの中で定義されているように、ブロッキング剤
によるその後の”ブロック”能のような性質の最適な組
み合わせを示す。ここで用いられているように、°°金
属酸化物”という用語は含水金属酸化物および水酸化物
同様、金属酸化物および水酸化物を集合的に指している
。ここで用いられている°°含水”という語句は物理的
あるいは化学的に吸着した水を含む金属酸化物または水
酸化物の表面として用いられ、ちなみにここではそのよ
うな水の付加的な存在を示すために用いられる。ここで
用いられる吸着の″強度７は、得られた複合体の使用の
ために、たとえばハイブリダイゼーション実験の条件下
で、金属酸化物に吸着したままでいる吸着核酸の能力を
いう。金属酸化物の°゛吸着能゛°は得られた複合体の
使用のため、単位重量または支持体の表面領域あたりの
、充分な核酸を吸着するための特定の金属酸化物支持体
の能力をいう。

適当な金属酸化物の例には、これに限定はされないが、
マグネシウム、カルンウム、チタン、マンカン、　コバ
ルト、ニッケル、ＩＬ　　イツトリウムおよびランタン
のく含、水）酸化物および水酸化物が含まれる。

好ましい金属酸化物の例には、限定はされないが、アル
ミニウム、鉄、ジルコニウムおよびハフニウムの（含水
）酸化物および水酸化物が含まれる。特に好ましいもの
はジルコニウムの（含水）酸化物と水酸化物である。本
発明の支持体が磁性をもつことが望まれる場合、好まし
い金属酸化物には鉄、コバルトおよびニッケルが含まれ
る。

支持体の有効表面領域は金属酸化物ｔｇあたりおよそ１
１１２以上が好ましく、特に金属酸化物１ｇあたり約５
１２以上の表面をもつ支持体が好ましい。表面積はどの
ような適当な方法ででも測定される。本発明の目的のた
めに、表面領域が、参考文献に入れられている「吸収表
面領域と多孔性Ｊ　　（Ｓ、Ｊ、ブレツブと１（、Ｓ、
　Ｗ、シング、アカデミツクプレス、ロンドンおよびニ
ューヨーク、１９６７年）に述べられているように、窒
素吸収により測定された。

本発明の複合体は核酸の生物学的有効性と反応性を実質
的に残した様式で支持体の少なくともを効な表面部分に
吸着した核酸をもつ。このような状況で用いられている
“°実質的な”という語句は核酸がその目的のために、
ハイブリダイゼーション、標識、シークエンシングなど
に利用されることを意味する。

１、　　ｂ、　　核酸 核酸は支持体の少なくとも有効な表面部分に吸着される
。この意味で用いられているように、らえられたり、コ
ーティングに埋め込まれた金属酸化物粒子のような支持
体にとっては、以下に詳細に述べているように、支持体
自身（すなわち粒子）の有効表面は、たとえば他の粒子
や織目あるいはコーティング自身との接触により、核酸
吸着が物理的に妨げられない表面である。同様に多孔性
粒子のような支持体にとっては、有効表面は核酸に接す
ることができるのに充分な大きさの孔の表面を含む。

本発明の支持体は、ハイブリダイゼーション実験のよう
な目的に役立つ（塩基対の数に基づ（）長さの核酸を吸
着することができる。一般にそのような核酸はおよそ２
００からｔｏｏｏｏ塩基の長さである。吸着した核酸と
ハイブリダイズさせるのに役立つ核酸プローブは一般に
およそ１０から３００００塩基の長さをもつ。

ここで用いられている”核酸°°という用語は、たとえ
ば単鎖または二重鎖のＤＮＡあるいはＲＮＡ、第１／ゴ
ヌクレオチドおよび核タンパク質を含む、分子が支持体
に吸着できるような充分子ｉｔ（たとえば領域）のポリ
ヌクレオチド含む分子と広義に使われる。驚いたことに
、強い吸着はヌクレオシド基が優先的にＤＮＡの内部を
むいて広がっている二重鎖ＤＮＡを用いた場合さえ、本
発明の複合体で得ること、ができた。このことはＤＮＡ
の中軸のリン酸基が核酸の金属酸化物への吸着に重要な
役割を果たしていることを示唆する。

１、Ｃ，ブロッキング剤 本発明の複合体はまた、核酸を付加的に吸着さける支持
体の能力を実質的に妨げるように、支持体表面の残存部
分に結合するブロッキング剤をもつ。支持体表面の”残
存部分”はまだ核酸が吸着していない利用できる表面を
意味する。この中で用いられている“ブロッキング剤”
は、プローブ核酸の支持体への直接的な吸着を妨げるよ
うに支持体の有効表面の残存部分に結合することができ
る化合物あるいは分子のような物質をいう。この中で用
いられている”結合した”という語句は、たとえばハイ
ブリダイゼーション実験の過程で表面へのプローブＤＮ
Ａ配列の望まない吸着を妨げることにより、目的のため
に支持体を使用できるような充分な量と強度をもつブロ
ッキング剤の結合を指す。

適当なブロッキング剤は結合力、結合能および価格のよ
うな性質の最適な組み合わせを示す。適当なブロッキン
グ剤は、限定はされないが、リン酸塩、ホスホニウム塩
、ピロリン酸塩、カルボン酸塩、硫酸塩および７ツ化物
を提供する有機または無機の分子を含む。好ましいブロ
ッキング剤には、限定はされないが、リン酸カリウム、
ピロリン酸カリウム、フッ化カリウム、エチレンジアミ
ン四酢酸（ＥＤＴＡ”）およびラウリル硫酸が含まれる
。

２、支持体の形態 本発明の複合体は、各種の形態の、たとえばコロイド粒
子、自由粒子、多孔性小球体のような粒子として、ある
いは繊維状または固体のモノリスの支持体を用いて調製
される。粒子はどのような大きさでも、たとえばサブミ
クロンのサイズから数ミリメーターまで使用され、そし
て懸濁液、コーティングあるいは繊維の織目に入り込ん
だ廣合構造のような各種の方法で使用される。

２、ａ０粒子 この中で用いられている゛°コロイド粒子°°という用
語は、コロイド懸濁液中で分散する、あるいは分散する
ことができる粒子をさす。ここで用いられている”コロ
イド懸濁液”とは真の溶液（この中で溶質がイオンまた
は分子相に存在している）と大部分の溶質との間の形態
中間体をさす。通常そのような粒子はミクロンまたはそ
れより小さいオーダーの平均粒子サイズをもつ。コロイ
ド粒子は水中で塊にならないものが好まれ、小さいサイ
ズのコロイド粒子は容量比に対して大きい表面を提供し
、結果として高吸着能をもった粒子を供給する。

核酸を吸着し、そこヘハイブリダイズしたプローブの核
酸をもったあるいはもたないコロイド粒子は凝集、沈澱
、　（”　ｒｏｔｏｖａｐｉｎｇ’のような）蒸発また
は遠心による沈降のような各種の方法により水性の媒体
から分離される。この中で述べられている多（の金属酸
化物のコロイド粒子はたとえばナイアコール社（マサチ
＾−セッッ州アシ二ランド）やナルコ社（イリノイ州ネ
イパーヴイル）から市販品として入手可能で、あるいは
技術的に既知の方法により：ＪＡＩ製される。明細書の
中に参考文献としてとられている、たとえば１１．Ｂワ
イザーの「無機コロイド化学」第二巻（ウィリー・アン
ド・サンズ、ニューヨーク、１９４９年）を参照せよ。

たとえば乾燥粉末の形態をしている最小の大きさでミク
ロンかそれ以上のオーダーの平均サイズをもつような遊
離金属酸化物粒子が知られ、本発明に有効である。その
ような粒子は一般的にはコロイド懸ｌｌ１ｉ液の状態を
保つことができないのだが、以下に述べられるように、
マトリックスや他の複合構造に取り込まれると特に有効
である。

多（の金属酸化物の遊離粒子は、たとえば粉末として、
ングマケミカル社（ミズーリ州セントルイス）やアルド
リッチケミカル社（ウィスコノ／ン州ミルウォーキー）
のような種々の供給源から市販品として入手できる。

本発明の好ましい粒子は、およそ１／２から５００ミク
ロンの間の、さらに好ましくはおよそｌから１００ミク
ロンの間の平均粒子直径をもつ多孔性小球体、すなわち
球状粒子を含む。そのような粒子は、参考文献としてこ
の中に取り入れられている明細書である、１９８８年２
月３日に出願された米国申請シリアル番号第１５１．８
１９号と同様に、米国特許箱４．０１０．２４２号およ
び第４．１３８．３３６号に述べられているような各種
の方法により調製される。

２、ｂ、繊維およびモノリス体 粒子の使用に加えて、本発明の支持体はまた繊維の形態
で調製される。各種の金属酸化物の繊維が作られ、市販
されている。たとえば、ＥＰＯ応用技術シリーズ、第３
巻、「無機繊維と複合材料」　（ペルガモンプレス、１
９８４年）を参照せよ。

粒子および繊維の使用に加えて、本発明の支持体はまた
多孔性のあるいは濃厚なモノリス体の形態で調製される
。ここで用いられる”モノリス体”という用語は、たと
えば直接的に処理し、使用されるのに充分な物理的大き
さをもつ、粒子よりも大きい均一な固体として用いられ
る。しかし、モノリス体はポアサイズがコントロールし
に（く、容積に比べ好ましくない表面領域しかないので
、一般に多孔性小球体はど好まれない。

モノリス体の調製は参考文献に入れられている、たとえ
ばキンゲリーらの「セラミクスへの招待」第２版（ウィ
リー・アンド・サンズ、ニューヨーク州二ニーヨーク、
１９７６年）の各種の方法により遂行される。たとえば
、そのような形態はバインダーを用いて希望の形状に適
当な金属酸化物粉末を成形し、適当な多孔性を同時に保
持しながら、焼結（すなわち、粒子の互い同士の結合）
させるための加温による熱処理により調製される。この
形態は、より大きな表面領域をもち、そのためより高い
吸着能をもつように多孔性であることが好まれる。

３、支持体の使用 本発明の支持体は各種の方法で使用される、たとえば粒
子は懸濁液、コーティングあるいは多孔性の網目に組み
込まれた重合体として使用される。

３、ａ、コロイド粒子 以下により充分に述べられるように、コロイド粒子は複
合体を、たとえば粒子が懸濁液の状態にあるままで、核
酸を吸着、ブロッキング、吸着した核酸をハイブリダイ
ズさせることにより調製するために直接的に使用される
。懸濁液に得られた重合体の使用はハイブリダイゼーシ
ョンのキネティクスを最適化させる傾向にある。さらに
、懸濁２＆中のそのような粒子や腹合体の使用は、たと
えば以下に述べられている方法により、希望の時点で溶
液から粒子を分離するのを助長する。

３、ｂ、コーティング 本発明の支持体はまた、重合体、ガラスあるいは金属基
質のような有機、無機の基質のような適当な基質上の金
属酸化物のコーティングとして調製される。金属酸化物
は各種の方法で、た七えば溶液から、あるいは蒸気相か
らコートされる。そのうえ、金属酸化物はコロイドの、
あるいは粉末の金属酸化物として、または（たとえば、
熱処理や水にさらすことによる）適当な処理により金属
酸化物へ変換される金属塩あるいは金属アルカロイドの
ような前駆体としてコートされる。好ましいコーティン
グは薄いフィルム（たとえば、単分子の厚さにまで薄い
コーティング）、多孔性の厚いフィルムおよびメンプラ
ンである。

３、Ｃ１複合構造 本発明の複合体に使用するのに適している支持体はまた
、マトリックスやメンプランのような担体に取り込まれ
たり、これらにより保持されたりして、複合構造の一部
として調製され、使用される。適当な担体は吸着した核
酸およびプローブ核酸の両者に対する金属酸化物の自然
のままの接触性、多孔性、湿潤度、物理的耐久性、化学
的不活性度、大きさの安定性および価格のよう−な性質
について最適の組み合わせを示す。適当な担体の例は、
限定はされないが、ポリエチレン、ナイロンおよびポリ
エステルのメンプランを含む。

好ましいメンプランの例は、参考文献として取り入れら
れている米国特許第４．１５３．６６１号に述べられて
いるように、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ”
）である。そのようなメンプランは本発明の使用の目的
のために、例外的な充填能、化学的安定性および多用途
性を提供する。

米国特許第４．８１０．３８１号に述べられている方法
に従い調製された多孔性のＺｒ０ｇ小球体がＦＴＰＨの
織目に取り込まれているような複合構造が特に好ましい
。そのような複合構造は良好なプロティング能を示し、
強酸と強塩基に安定で、温度上昇にも安定である。その
ような構造が容易に扱え、掃除でき、強酸や強塩基に浸
したり、加熱処理により滅菌できるので、本質的な損傷
を示すことなしに再利用できる。

好ましい複合構造の利点には、核酸の強い吸着を得るた
めの支持体表面の前処理および後処理の必要が排除され
たことである。ＰＴＦＥメンプランは、本質的に粒子の
表面吸着性を妨害することなく、金属酸化物が移動する
のを妨げる物理的トラップとして作用する。この構造は
、本来物理的に強く、温度、強酸、強塩基に耐性である
ために、かなりの回数再生と再利用（たとえば再ハイブ
リダイズ）が可能である。この構造はまた強イオン溶液
と共存でき、使用する湯度範囲では化学的に不活性であ
る。

本発明の複合構造の別の利点は、複合構造自身の形成に
関して適当な時に、たとえば支持体を含む複合構造の形
成前、形成中、形成後で、核酸が金属酸化物支持体に吸
着されることである。

４、複合体の調製と使用 本発明の複合体を調製する方法は、　（ａ）核酸を吸着
するのに充分な量の金属酸化物を含む支持体を準備し、
（ｂ）核酸が本質的に生物学的利用性と反応性を残した
ままで、前記支持体の有効表面部分に核酸が吸着する段
階から成る。

この方法はまた、さらに核酸を吸着させる支持体の能力
を本質的に妨げるように、前記支持体の有効表面の残り
の部分にブロッキング剤を結合させる段階を含むことが
好ましい。

吸着は適当な方法で行なわれる゛。たとえば核酸吸着は
、懸濁液が不安定になることなしに、核酸を粒子と直接
的に懸濁液中で接触させ、ブロッキングとハイブリダイ
ゼーションにより、コロイド粒子の水性ゾル中で行なわ
れる。以下に充分に述べられているように、総吸着能お
よび吸着強度と同様に、支持体に吸着した核酸の量は、
放射標識した核酸の使用によるような、技術者にはなじ
みの技術を用いる各種の方法で算出された。

複合構造に取り込まれた金属酸化物のコーティングまた
は粒子の形態の支持体を用いて、溶液が支持体を湿らせ
る条件下で核酸を含む溶液と支持体を接触させ、それに
より支持体と核酸との間の水分の接触を提供することに
より、吸着が行なわれる。

複合体は各種の応用に、たとえばハイブリダイゼーショ
ン中の、核酸の標識、核酸のシークエンンングまたは核
酸の合成の際の支持体として使用される。

上述の好ましいＺｒ０２−ＰＴＦＩＩ構造のような複合
構造に吸着することにより固定化された核酸は、核酸の
ハイブリダイゼーションへの使用に好ましい。

そのようなアッセイの一つの例がＤＮＡ　（または”サ
ザン″）プロットと呼ばれる。

サザンプロットでは、ＤＮＡは通常ＤＮＡ制限酵素の使
用により、いろいろなサイズの断片に切断され、得られ
た断片はゲル電気泳動を用いて、サイズごとに分離され
る。しばしば、ＤＮＡ断片が電流の影響極へ移動し、よ
り小さい断片はゲルマトリックス中をより速く移動する
ので、ゲルマトリックス内でサイズによる断片の分離と
いう結果となる。

ゲルマトリックス中のＤＮＡ断片は、通常は電気泳動（
°′電気的プロット″）あるいは水溶液を通り過ぎさせ
、　　ＤＮＡを溶出させることによって、直接ゲルから
Ｚｒ０２−ＰＴＦＥＦ１合構造へ移される。ＤＮＡは液
相へ促進的に拡散することにより、ＤＮＡが支持体の金
属酸化物表面に吸着できるところの複合構造へ運ばれる
。

ＤＮＡが支持体に吸着すると、その表面は好ましくは以
前に述べたようなブロッキング剤でブロックされる。本
質的にブロッキングは、さらに核酸分子が結合すること
を妨げる、すなわち残存する有効な結合部位が（たとえ
ばプローブＩ）ＮＡの）結合に有効でなくなるが、前に
吸着した分子の使用は妨げない。

ブロッキング後、吸着分子はハイブリダイゼーションに
用いられる。たとえば、吸着したＤＮＡまたはＲＮＡは
、標識ＤＮＡ配列が吸着した核酸と反応する°“ＤＮＡ
ハイブリダイゼーション法”を用いて、特定の核酸配列
と相同な配列が試験される。標識配列（゛プローブ゛）
は支持体に吸着した相同なりＮＡとハイブリダイズする
。次に、′プローブ″°と相同な配列が（吸着した核酸
に）存在することが、技術者にはなじみの方法で、プロ
ーブ分子中のある遺伝子または核酸の配列の有無と関連
づけられる。

”プローブ°として特定のＤＮＡ配列を用いた特定のハ
イブリダイゼーションの後、支持体表面への１）ＮＡ吸
着に影響することなしに、吸着したＤＮＡにハイブリダ
イズした核酸を除去するために、？Ｊｊ含構造はたとえ
ば沸騰水に３から５分間浸すことにより、洗浄される。

沸騰水で洗浄すると、支持体に吸着したＤＮＡは第二の
、別の異なる標識したＤＮＡプローブとハイブリダイズ
することができる。同様に、複合構造は沸騰水で再び洗
浄される。この構造はこのようにして、繰り返し使用さ
れる。

本発明の好ましい複合体の重要な特性として、吸着した
核酸自身もまた、たとえば少なくともｐＨ１２、好まし
くはｐＨ１３のような非常に高いｐＨにメンプランをさ
らすことにより、支持体から除去することができる。好
ましくはそのような露出はまた、たとえば約１０分かそ
れ以上の間、８０℃のオーダーで加温することであり、
高いｐ旧こさらしたり、加温することは、脱吸着を完全
にするために一回あるいはそれ以上繰り返される。

生物試料の特定核酸配列の定量は、既知の量のＤＮＡが
ドツトまたは直線あるいは曲線のスロット状に支持体に
、たとえば陵合構造中に吸着されるドツトまたはスロッ
トブロッティング技術（たとえば、シュスターら、　ｒ
　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　Ｊ、１５４：３０
９−３１４（１９８６）を参照せよ）を用いて、本発明
の；夏合体で行われる。試料ＤＮＡにハイブリダイズす
るＤＮＡプローブの量は試料に存在する相同配列の量に
比例する。

本発明の複合体はまた、核酸と標識の両者を同時に結合
するのに使用することができ、その結果として、標識と
核酸の間に安定な連結を形成する能力が用意される。構
造的に、そのような結合は、一般に、タンパク質のよう
な標識は核酸部分自身あるいは両者をつなぐ金属酸化物
支持体よりもかなり大きいので、Ｉ＃ｌ識に核酸が”ス
ポット溶接”したのに類似している。

そのような結合は、必要とされる標識の程度に依存した
各種の方法、たとえば、金属酸化物粒子へ標識が結合し
、次に核酸との混合、または核酸分子と標識の混合物と
金属酸化物粒子とを混合することによりつくられる。そ
のような標識は以前に、ハイブリダイゼーシＨン・アッ
セイのようなアッセイで検出手段として使用したような
化学的手段により核酸に直接的に接着している。たとえ
ば、ここで参考文献に取り入れられている、米国特許筒
４．７２９．９４７号の明細書を参照せよ。代表的なタ
ンパク質標識は、抗体、抗原、酵素、アビジンおよびス
トレブアビジンＩＸａｌを含む。アルカリホスファター
ゼ、セイヨウワサビのパーオキシダーゼ、細菌のルシフ
ェラーゼおよびホタルのルシフェラーゼのような酵素標
識は放射活性、蛍光性、磁性、抗原性および化学的触媒
の標識と同様にそのような目的に使用される。

本発明の複合体はまた吸着した核酸の配列を決定する反
応に用いることができる。これはシークエンシング反応
の鋳型として、たとえばＲ，Ｋ、サイキら（５ｃｉｅｎ
ｃｅ、　　２３９：４１１７−４９１（１９８８））に
より述べられているように、ジデオキシ、鎖伸長反応の
鋳型として吸着した配列を用いることにより行われる。

吸着したＲＮ＾転写物はまたＲＮ＾配列の相補的ＤＮＡ
コピーをつくる酵素である逆転写酵素の鋳型として用い
ることができる。これらのＤＮＡコピーはさらにシーク
エンシング反応に用いることができる（ここで参考文献
に取り入れられている、たとえば、Ｅ、Ｓ　　ス　トフ
レ　）　トら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２３９：４９１
−４９４（ｌ’Ｈ１８）を参照せよ）。

本発明の好ましい複合体は、著しい分解なしに、伝統的
な滅菌条件、たとえば蒸気および／′または熱、あるい
は高ｐＨにさらすことができる。メンブランに取り込ま
れたり、メンプランやコート？’ＪＲが滅菌条件に耐え
ることができるように用意された表面ヘコートされたた
とえばＺｒ０ｔ小球体のような好ましい複合構造にとっ
ては本当である。具体例に述べられているように、ＰＴ
Ｆ２メンプランに取り込まれたＺｒＯ２小球体は、著し
い分解なしに、オートクレーブのような伝統的な滅菌条
件にさらすことができる。

本発明に有効で、たとえば異なる型の核酸と吸着した場
合、幅広い複合体をｗ４製するのに役立つ支持体がつく
られ、売られている。そのような支持体は、たとえば支
持体を吸着し、時にはこれをブロックする指示書ととも
に、キットの形でパブクされ、市販されている。

本発明の目的および利点は次の例でさらに示されるが、
これらの例で列挙される特定の物質および量は、他の条
件や詳細と同様に、本発明を不当に限定するようには解
釈されるべきではない。

例 例１ 金属酸化物粉末表面へのＤＮＡ吸着 金属酸化物支持体への核酸の結合の定性的評価は次の手
順により得られた：各種濃度のＤＮＡ（制限酵素Ｂｓｔ
　Ｅｌｆで切断したラムダファージＤＮＡ）を含む緩衝
液がポリプロピレン製のミクロテストチューブ（バイオ
・ラッド、カタログ番号２２３−９５０３、カリフォル
ニア州すッチモンド）に等分された。

代表的な容量はチューブあたり溶法的４０ｕｌで、ＤＮ
Ａ濃度は０．００５．０．０１．　０．０５、Ｏ，ｊｕ
ｇ／ｕｌであった。

種々の形態（粉末、小球体など）をもつ各種の金属酸化
物が一定ｆｉｔ（代表的には、チューブあたり２５ＩＩ
ｇの金属酸化物）それぞれのＤＮＡを含むチューブに添
加された。ＤＮＡ溶液と金属酸化物は６０秒間激しく混
合され、金属酸化物をベレットにするためにＳＯＯＯｘ
ｇで２分間遠心した。上清２０ｕｌがそれぞれのテスト
チューブから取られ、Ｓｕｇ／ｕｌの臭化エチジウムを
含む１％アガロースの電気泳動にかけられた。

上清のアリコート中に存在するＩ）ＩＪＡ濃度が元の溶
液２Ｏｕｌ中に最初に存在した濃度と比較された。得ら
れた溶液の色を比較することにより、定性的評価か金属
酸化物によるＤＮＡの吸着として算出された。

色が強（なれば、溶液中の未吸Ｉ　ＤＮＡが多くなり、
従って支持体に吸着されるＤＮＡが減少する。

次にあげる金属酸化物がスクリーニングされ、本発明の
目的に対して充分な吸着能をもつことが明かとなった：
　Ｃａｂ、　　Ｙ２Ｏ３、ＺｒＯ２、ＨｆＯ２、Ｌａ２
’ｓ、ＴｉＯ２、ＭｇＯｌＭｎＯ２、ａｌｐｈａ−Ｐｅ
ＯＯＨ，ＣｏＯおよび＾１２Ｇｍ。

スクリーニングされた支持体は、すでに手持ちの、ある
いは直ちに入手可能なものである、すなわち、それらは
この例の目的には最適ではなかった。それゆえ、ある特
定の支持体の低吸着性は単に特定の試料の表面領域が小
さい結果で、特定の金属酸化物の本来の吸着強度を示す
必要はないことに注目すべきである。しかし、このスク
リーニング法は、特定の支持体の表面領域とともに、金
属酸化物それ自体の本来の結合強度に関して、本発明の
目的に対し、特定の金属酸化物試料の適合性を評価する
のに役立つ。

ＤＮＡ吸着およびハイブリダイゼーション・アッセイシ
グマケミカル社（カタログ番号Ｚ−２５００、ミズーリ
州セントルイス）製のＺｒＯ２粉末がＤＮＡ吸着の支持
体として用いられた。２２℃で次の手順で実験が行われ
た：　２ｕｇのラムダファージＤＮＡあるいは枯草菌プ
ラスミドルυ旧ｌＯのＤＮＡ（ラムダファージＤＮＡと
は相同ではない）がポリプロピレンのミクロテストチュ
ーブ中で、ミリポア社（マサチューセッツ州ベトフォー
ド）製の”ミリｑ′″システムで精製した、高圧滅菌し
た蒸留脱イオン水１’５Ｏｕｌ中、２５ｍｇのＺｒＯ２
粉末と混合された。ＤＮＡはＺｒＯ２表面に２２℃で３
００分間置させた。チューブを遠心し、上清が除去され
た。

吸着されたＤＮＡをもつ支持体の残りの表面をブロック
するために、得られたペレットがテストチューブの中で
、５％リン酸カリウム溶液（ｐＨ？、０）　２００ｕ１
に再懸濁された。チューブを遠心し、上清を除去し、ペ
レットを二度５％リン酸カリウム（ｐ［、０）ン水２０
０ｕ　Ｉにテストチューブ中で再懸濁した。ペレットを
含むチューブを遠心し、上清を除去、そして沈澱を高圧
滅菌した蒸留脱イオン水２ＱＯｕｌに再懸濁した。

ＤＮＡを吸着したＺｒＯ２粉末は遠心され、上清が除去
され、ペレットが以下の終濃度をもつ溶液ｌ５Ｏｕｌを
含むテストチューブ中で再懸濁された：１ｏｘ″デンハ
ルド′ハイブリダイゼーシッン緩衝液（５０Ｍデンハル
トは１％ポリビニルピロリドン、１％ＢＳＡフラクショ
ンＶおよび１％フィコール）、５にクエン酸ナトリウム
緩衝液（ＳＳＣ”　）　　（１ｘＳＳＣは０．８１塩化
ナトリウム、０．４４％クエン酸ナトリウム）、５０■
ＭトリスヒドロキシメチルアミノメタンＣｐＨ７，５）
、０．１％ビロリン酸ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナ
トリウム（”　ＳＤＳ”　）および５００ｕｇ／ｍｌサ
ケ精子ＤＮＡ。

ブリハイブリダイゼーシ璽ンの平衡化を達成するために
、チューブを５５℃で３時間インキコベートし、その後
遠心して、上清が除去された。ペレットは以下の終濃度
の”ハイブリダイゼーション溶液″１００ｕｌを含むテ
ストチューブ中で再懸濁された：５０％ホルムアミド（
アルドリッチケミカル社、カタログ番号２７０５４−７
、ライスコンシン州ミルウォーキー）、１０％硫酸デ牛
ストラン、５ＸＳＳＣ，ＩＸＸノンルト。ラムダＤＮ＾
とプラスミドｐ［ｌＢ１１０のＤＮＡはアマジャム社（
イリノイ州アーリントン・ハイライッ）裂の”ニックト
ランスレージコン・キット“ヲ用いて％　”Ｐｌ＃識ヌ
クレオチドであらかじめ放射活性標識された。１０ｕ１
の３２ｐ標識したラムダＤＮＡｍ液あるいはｐＵＢｌｌ
ｏのＤＮＡがｌｈｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ１５０ｕｌ
に添加された。チューブは沸騰水中に５分間置かれた後
、水中に５分間置かれた。上述のように、標識されたｐ
ＮＡプローブの溶液のアリコートがハイブリダイゼーシ
ョン溶液中の２ｒ０２粉末に吸着したＤＮＡを含むチュ
ーブに添加された。

ハイブリダイゼーションを行わせるために、混合液は混
合を充分にするためにわずかに攪拌しながら、４２℃で
１２時間インキュベートされた。チューブを遠心し、上
清が除去され、ペレ・ノドが２ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤ
Ｓを３００ｕｌ含むテストチェーブに再懸濁することに
より洗浄された。このチューブは２２℃で１５分間イン
キュベートされた。チューブが遠心され、上清を除去し
、ベレットを４２℃１５分間２ｘＳＳＣ１０，１％ＳＯ
Ｓを３００ｕｌ含むテストチューブに再懸濁した。チュ
ーブを遠心、上清を捨て、ベレットは０．１ｘＳＳＣ１
０，１％ＳＤＳを３００ｕｌ含むテストチューブに再懸
濁し、チューブを４２℃で３０分間インキコベートした
。チューブが遠心され、上清が除去され、ペレットは０
゜１ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳを３００ｕｌを含むテス
トチューブ中で再懸濁され、４２℃で３０分間インキエ
ベートされた。チ１−ブが遠心され、上清が除去され、
ペレットの放射活性がシンチレータ９ンカウンターを用
いて計測された。

添加した放射４１職ＤＮＡの最初の量が約１０１０００
００ｃｐカウント／分）であったとき、ハイブリダイゼ
ーシヨンの最後に残っている放射活性の量は、同じ（す
なわち相同な）ＤＮＡ配列がｚｒ０２粉末に吸着され放
射標識プローブとして用いられたチューブの中において
は、非相同ＤＮＡが吸着されたチューブに比較して少な
くとも５倍大きかった。たとえば代表的な実験では次の
結果が得られた：二連試料の平均１１４０００ｅｐｍが
最初に添加された。相同ＤＮＡ配列を用いたハイブリダ
イゼーションでは５０００ｃｐｍが吸着ＤＮＡにハイブ
リダイズし、その一方で、非相同ＤＮＡ配列のハイブリ
ダイゼーションでは約３５０ｃｐ＋ａが吸着ＤＮＡにハ
イブリダイズする結果が得られた。換言すれば、本発明
の複合体を用いると、非相同プローブと比較して、相同
ＤＮＡプローブは効果的に１１イブリダイズされた。

例３ 酸化ジルコニウム小球体への核酸の結合酸化ジルコニウ
ム小球体が米国特許出願（米国シリアル番号第１５１．
８１９号、１９８８年２月３日出願）に述べられている
方法で調製された。落花生油（３リツトル）が４リツト
ル容のビーカーに入れられ、９０℃に加熱された。攪拌
機が挿入され、落花生油は激しく攪拌された。ナイアコ
ール社（マサチューセッツ州アシ１ランド）製のコロイ
ドＺｒＯ２懸濁液であるナイアコール”Ｚｒ９５／２０
と重量で２０％含有のＺｒＯ２粒子（直径的９５ｎｍの
粒子サイズ）の合計ｌｏＯｇが噴霧器を用いて落花生油
に噴霧された。約３０分後、このパッチがワットマン濾
紙＃５４で濾過された。約１７ｇの固体が回収され、そ
の中で主たる小球体は直径３０ミクロン未満であった。

回収した小球体はａＯＯ℃で６時間加熱された。回収さ
れた小球体の表面積は窒素吸収により３４ｍ２７ｇ−と
決定された。

ＺｒＯ２小球体は例２に述べられているようにハイブリ
ダイズされた複合体を形成するために例２に述べられた
ＤＮＡ吸着法に用いられた。代表的な実験では、ラムダ
ＤＮＡプローブの０．２％がハイブリダイズしたのに比
較して（本来のバックグラウンド）、相同な９７Ｍ６２
４プローブＤＮＡの（ｃｐｓで）４．０％が吸着した９
７Ｍ６２４にハイブリダイズし、０．２％のバックグラ
ウンドに比較して、ラムダＤＮＡプローブの１．９％も
また吸着したラムダＤＮＡにハイブリダイズした。これ
らの結果は例２に述べられている結果と良い相関関係が
ある。

例４ 各種金属酸化物を用いた核酸の吸着と ハイブリダイゼーション ラムダファージＤＮＡの吸着とハイブリダイゼーション
が（例２に従って）各種金属酸化物支持体を用いて行わ
れ、その結果が表１にあげられている。

ＤＮＡハイブリダイゼーションは大腸菌ファージ・ラム
ダのＤＮＡ　（相同）とプラスミドＰＴＭ６２４のＤＮ
Ａ　（非相同）を用いて行われた。

ＺｒＯ２ゾルはナイアコール社から７ナイアコールＺｒ
１００／２０°“コロイド７、ｒ０２（２０％ＺｒＯ２
、ｐｌ＋３、粒子サイズ約１０Ｏｎ＋＋）として得られ
た。

αＦｅ００１１ゾルは約４重量パーセント、ｐ１１３、
粒子サイズ約１００−２００ｎ園で調製された。

４重量パーセントのＡｌ２Ｏ３、ｐＨ３、粒子サイズ約
５５５−８６ｎを得るために、ディスブチル１″アルフ
ァアルミナ−水和物粉末（コンデア）を硝酸とＡＩと硝
酸の比がおよそ８．７５：ｌで分散することによりＡｌ
２Ｏ３ゾルが調製された。

Ｃｏｏはシティケミカル社にューヨーク）、カタログ番
号ＷＢ８９３から粉末として得られた。

ＨｆＯ２粉末はアルドリッチケミカル社、カタログ番号
２０２１１−８から得られた。

表１に見られるように、それぞれの支持体はハイブリダ
イゼーション実験で相同と非相同のブロー表１ ＤＮＡハイブリダイゼーシジン 金属酸化物 支持体 ３２ＰＶＡ識ブローフ ＣＰＭ　　　　　　　添加縁カウントの駕（ソ′ル／Ｐ
ＴＭ６２４） ＺｒＯ２ソ゛ル １ルア７）’ｅ００１１ソ゛ル ＾１２０３ソ′ル Ｃｏｏ粉末 ９７Ｍ６２４ ９７Ｍ６２４ ラムダ゛ ラムダ゛ ９７Ｍ６２４ ９７Ｍ６２４ ラムダ′ ラムダ゛ ９７Ｍ６２４ ９７Ｍ６２４ ラムダ゛ ラムダ゛ ９７Ｍ６２４ ９７Ｍ６２４ ０Ｇ９ １０１．８１１５ ９４、２２４ １３．０３０ １フ、４２Ｓ ３１、　Ｏ５？ ３３、７３１ ０．８５ ０．８ ブＤＮＡとを区別することができる凌合体を形成するの
に有効であった。

例５ Ｚｒ０２−ＰＴＦＥ複合構造の調製 パートＡ：　ＺｒＯ２小球体 例３に述べられているように、：ｉＲ製された多孔性の
酸化ジルコニウム小球体（２０グラム）（平均粒子サイ
ズ約２０ミクロン）は２５０’ｍｌ容ビーカーに入れら
れた。堅い塊が形成されるように緩やかに手で攪拌しな
がら、ＰＴＦＥ水性分散物（′テフロン″３　ＯＢ。

固体含量５９．８％）　３．７ｇが滴下された。攪拌の
強さを大きくし、１分間継続した。その結果得られた部
分的に繊維状の塊はカレンダーにかけられフィルム状に
成形された。ステンレススチールのカレンダーロール（
直径２０ｃｍ、　　長さ３０ｃｍ）の間を５０℃で、５
■の隙間から始めて、約１．２５ａ＋ｍの厚さのフィル
ムが得られるまで連続的に隙間を通すことによりフィル
ムを成形した。このフィルムは４層構造を形成するため
に折り畳まれ、機械方向に９０１！回され、１．０ｍ−
の複合シートが形成されるまで、再び５■の隙間から始
めて、この隙間を減少させながらカレンダーにかけられ
た。カレンダーにかけられたフィルムは、インストロン
張力試験機（インストロン社、マサチューセノツ州カン
トン）で測定した０５メガパスカルの張力をもつ複合フ
ィルムになるように室温で一晩乾燥させた。

パートＢ：　ＺｒＯ２粒子 複合構造が多孔性酸化ジルコニウム小球体のかわりにＺ
ｒＯ２粒子（２０ｇ、　　シグマケミカル社、カタログ
番号７２５０Ｇ）を用いてパートＡに述べられたように
調製された。

得られた複合構造は適当な柔軟性とインストロン張力試
験機のような適当な張力試験機で測定した場合、少なく
とも０．２５メガパスカルの、典型的な値としては０．
５メガパスカルの張力をもっていた。

得られた構造体は柔らかくて強く、すべすべしていて、
なおかざらざらした感じをもつ約０．’５＋ｇｍ　（２
０ｍｉｌ）の厚さの白いシート状の構造であった。

例６ サザンプロツト・ハイブリダイゼーション法へのＺｒ０
２−ＰＴＦＥ腹合構造の利用 ファージラムダのＤＮＡが制限酵素！１ｓＬ　Ｅｌｌで
、ｐＨＢ１１ＧのＤＮＡがＢｃｏ　Ｒ１と１ｌａａ　Ｉ
ＩＩで切断された。得られたＤＮＡ断片はトリス−酢酸
緩衝液（０，４５％トリス、１リツトルあたり１．１４
ｍ１の酢酸）を用いて、１．０％アガロースで電気泳動
された。ＤＮＡ断片はアメリカン・パイオネティクス社
（カリフォルニア州エメリヴイル）製モデル５ＢＤ−１
０００）ランスファーシステムを用いて、例５Ａおよび
Ｂに述べられたように：ＩＩ製されたＰＴＦＥ−Ｚｒ０
２？ｆｆ合構造表面に電気的にプロットされた。この構
造体は連続的に１００■ｌの５％酢酸カリウム（ｐＨ７
，０）で５回洗浄された。その後、例２に述べられた手
順を用いて、しかし各ステップでの溶液量を１００倍に
増加して、放射標識したラムダＤＮＡまたはｐＵＢ　ｌ
　１０のＤＮＡとハイブリダイズさせた。

ハイブリダイズした放射活性プローブ量は−７０’Ｃで
１６時間、Ｘ線フィルムにメンプランを露光させること
により測定した。−ハイブリダイゼーションは構造体の
すべて適当な位置ではっきり現れた。

例７ Ｚｒ０２−ＰＴＦＥ複合構造からの ハイブリダイズしたＤＮＡの除去 例６のＤＮＡハイブリダイゼーシリンに用いられたＰＴ
ＦＥ−Ｚｒｌｈ複合構造体を一回の洗浄あたり５分間、
ＰＴＰＥ−Ｚｒ０２メンプランｌｅｇ２あたり０．３ｍ
ｌ　（３００ｍ１／平方フイート）の沸騰水に溶解して
、連続的に４回洗浄した。放射標識プローブＤＮＡ分子
の使用により測定されたように、吸着させたＤＮＡを相
当量除去することなしに、吸着した配列にハイブリダイ
ズしたＤＮＡプルーブがこの処理により除去される。そ
れぞれの５分間の洗浄で、前のハイブリダイゼーシッン
に用いたプローブの９・５％以上が毎回除去された。実
質的に前に用いたプローブを除去するためには、少なく
とも４回の連続的な洗浄が重要であることが明かとなっ
た。

例８ ＺｒＯ２−ＰＴＦＥ複合構造体の再利用例６で使用され
たＰＴＦＥ−ＺｒＯｐＦＪ！合構造体は、１２時間８０
℃で１．ＯＮの水酸化ナトリウムを用いて処理され、３
時間ずつ３回洗浄された。蒸留水、続いて弱いトリス−
酢酸（１０ｗＭ）緩衝液（ｐＨ７，０）でメンプランを
洗浄した後、使用に際して何の損傷もなしに、例６に従
って、次のＤＮＡ吸着とＤＮＡノ翫イブリダイゼーショ
ン・アッセイに再使用された。

例９ 石英表面にコートされた金属酸化物 ＺｒＯ２が次の方法により石英のモノリス構造にコート
された二石英の顕微鏡スライドがナイアコーｋ　”１０
０／２０：ｌ　ＯイＦＺｒ０２（ナイアコール社）を含
むビーカーに浸され、風乾後、５００℃に加熱された。

この方法が同じスライドで３回繰り返された。

ｚ「０２−石英表面は、遠心の段階なしに一つの溶液か
ら別のものへ移されることを除いて、例２に述べられた
方法を用いて、ＤＮＡを吸着するのに用いられた。

吸着されたＤＮＡはＺｒ０２−石英スライドが遠心なし
に一つの溶液から次へ移されることを除いて、例２に述
べられているのと類似のＤＮＡハイブリダイゼーション
・アッセイに使用された。

煮沸前に、非相同プローブの０．０２％に比！２して、
相同プローブの０．２％がハイブリダイズされたことが
明かとなった。Ｚｒ０ａ−石英スライドの表面はシンチ
レーションカウンターでカウントを減少させるのだが、
ハイブリダイズしたプローブをＺｒｏａ表面から煮沸に
より離すことは約２倍検出されるカウントを増加させる
。

ハイブリダイゼー／ヨン法の最後に、放射活性量が非破
壊的手段、たとえばＸ線フィルムの露光により測定され
るならば、Ｚｒ０ａ−石英表面は２分間沸騰水に入れ洗
浄することができ、固定化されたＤＮＡは放射標識され
た異なるＤＮＡプローブを用いて再ハイブリダイズする
ことが可能である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記（ａ）および（ｂ）からなる核酸付き支持体
   （ａ）核酸を吸着するために、その表面に 充分量の金属酸化物を含む支持体。（ｂ）前記核酸が十
   分に生物学的な利用性と反応性を保持する様式で、前記
   支持体の少なくとも有効な表面部分に吸着した核酸。
2. （２）（ａ）（ｉ）核酸を吸着するのに充分量の金属酸
   化物を含む支持体、（ｉｉ）前記核酸が十分に生物学的
   な利用性と反応性を保持する様式で、前記支持体の少な
   くとも有効な表面部分に吸着した核酸、および（ｉｉｉ
   ）支持体の核酸への付加的な吸着能を実質的に除去する
   ように前記支持体の有効表面の残りの部分に十分に結合
   するブロッキング試薬を含む核酸付き支持体を準備し、
   （ｂ）前記核酸をハイブリダイズ、標識、あるいはシー
   クエンシングする段階からなる核酸をハイブリダイズ、
   標識、および／あるいはシークエンシングする方法。