JPH03500457A - ペプチド及び蛋白質の配列決定用修飾ガラス支持体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチド及び蛋白質の配列分析用修飾ガラス支持体構造物の背景コ 本発明は、ペプチド又は蛋白質の配列分析における、２−（クロロスルホニルフ ェニル）エチル　トリメトキシ　シラン（シリル　Ｃ５Ｐ）、Ｎ−トリメトキシ シリルプロピル−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチル　アンモニウム　クロリド（シリル　 ＴＭＡ）又はそれらの組合わせで修飾されたガラス支持体の使用に関する。

ペプチド又は蛋白質重のアミノ酸の主配列は、通常、ペプチドの１末端から次々 にアミノ酸を除去し同定する段階的化学分解法により決定される。

エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解において、ペプチドのＮ−末端アミノ酸をフェニル イソチオシアネートにカップルさせてペプチドのフェニルチオカルバミル（ＰＴ Ｃ）誘導体を生成させる。次いでＰＴＣペプチドを強酸で処理し、第１ペプチド 結合のところでＰＴＣペプチドを環化させ、Ｎ−末端アミノ酸をアニリノチオシ リノン（ＡＴＺ）誘導体として切離す。ＡＴＺアミノ酸は非常に不安定であって 、より安定なフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）誘導体に変換され、クロマト グラフィにより同定する。残りのペプチドは漸次更なる段階的分解にかけられる 。

エドマン分解反応を、スピンニング　カップの内表面上のフィルム中で行う自動 蛋白配列分析器は公知である。第四級アンモニウム塩、１．５−ジメチル−１， ５−ジアズウンデ力メチレンポリメトブロミド（ポリブレン、Ｐｏ１ｙｂｒｅｎ ｅ）が試料担体として用いられた。

シュレーダ（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ、　Ｍｅｔｈ−Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１１：４ ４５　（１９６７））及びジエンチ（Ｊｅｎｔｓｃｈ、　Ｊｒ、、　Ｐｒｏｃ− Ｆｉｒｓｔ　Ｉｎｔ’ｌ　Ｃｏｎｆ、　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃ ｅ　Ａｎａｌ、　１９３　（１９７５））は、液相のニド？’／分解を、蛋白質 またはペプチドを紙片上に先ず非化学的に定着させることにより改変した。

ロールセン（Ｌａｕｒｓｅｎ、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｎｏｌ、、　２５：３ ４４　（１９７２））は、配列分析の前にペプチドを不溶性樹脂に共有結合的に 固着させた。ウオチナー等（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、　３５：９７　（１９７３ ））は、３−アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した制御された有孔ガラ スビード上にペプチドを不動化させた。生成アミノプロピル　ガラスはペプチド の遊離のカルボキシル基に結合するものである。

ドレイヤー（Ｄｒｅｙｅｒ、米国特許第４．０６５．４１２号）は、ペプチドを 共有結合又は吸着により、ポリスチレン又はガラスの多孔性反応支持体表面上に 不動化させることを推奨している。

フード（Ｈｏｏｄ　、　＊国特許第４．７０４．２５６号及び第４．６０３．１ １４号）は、ガラス繊維シートのような支持体上の薄膜として形成された透過性 の固体マトリックスの中に試料を埋め込むことを数示している。マトリックスは 好ましくは重合性第四級アンモニウム塩であり、それは正電荷の第四級アンモニ ウム基が、負電荷のガラス表面と強く交互反応するからである。

フード特許の第１７Ａ、１７Ｂ及び第１７Ｃ図は、蛋白質またはペプチドを不動 化することによる試料の保持を改良するための三通りの方策を開示している。第 １７Ａ図は、ウアチター（Ｗａｃｈｔｅｒ）におけると同様に、修飾ガラスへの 共有的付加を示し、第１７Ｂ図は、シュレーダー（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ）におけ ると同様に支持体への試料の物理的吸着を示している。第１７ｃ図は、７−ド（ Ｈｏｏｄ）と同様にガラス゛を被覆するマトリックス甲に試料の埋め込みを示し ている。

ソーンダース（Ｓａｕｎｄｅｒｓ、米国特許第３．９８７．０５８号）は、陽イ オン交換体としてスルホン化アラールキルＩａｒａｌｋｙｌＦシリカの使用を開 示する。スルホベンジルシリカのナトリウム塩が焼肉試料のプロリン及び他の成 分からニトロソプロリンを分離するのに用いられた。蛋白質の配列分析には何ら 論議は記載されていない。

グラーチ（Ｇｌａｊｃｈ、米国特許第４．７０５．７２５号）は、特に支持体構 造物に関しており、それはシリカを含み、シリカには、シランのシリコン原子に 結合する少なくとも２個の立体的保護基を含む一官能性シランが共有結合により 付加されている。ペプチド配列分析に使用するために、このシランは、ポリブレ ンのそれと同様な様式でペプチドと交互反応するように第四級アミノ基で置換さ れている。陽イオン交換クロマトグラフィに用いるため、このシランは−＜ｃ　 Ｈｚ）ｓ−ｃ　＠Ｈ４−５Ｏ３Ｈ基で置換されている。

シランは抗原又は抗体をガラスに固定するために用いられた（Ｗｅｅｔａｌｌ、 米国特許第３．６５２．７６１号）。

１発明の摘要コ 従来の気相またはいわゆるパルス液相［ｐｕｌｓｅｄ−１ｉｑｕｉｄ］蛋白配列 分析法は、試料をマトリックスに埋め込む（Ｈｏｏｄ）か支持体に共有結合させ る（Ｌａｕｒｓｅｎ）かによる。これは、液体洗浄の間に試料が支持体から離脱 し移動することを妨げようというのである。共有結合は、試料が反応室口で永久 的に保持され、液相化学処理または洗浄の間離脱する危険がない利点を有する。

不利なことは、反応支持体への試料の結合につき余分な化学反応が起ること、こ れらの結合工程における生来的な低能率性、ならびに支持体への結合に深く関係 する試料における残渣の低回収性である。埋め込み試料法は、共有結合法につき ものの余分な試料の処理を要せず、多かれ少なかれ一般的な不動化法であるとい う利点がある。主たる不利な点は、ＰＴＨアミノ酸同定に用いられる分析系に汚 染の因となる人工物を高水準含んでしまうこと、および実際の試料を負荷する前 に分析器を数サイクル運転する必要性を含むことである。また、試料のＮ−末端 アミノ酸と反応しエドマン分解を阻む筈のこれらのアミノ−反応性不純物の途去 剤として作用するアミンを加えることが慣行である。これらの不純物の多くはＰ ＴＨ分析法の余計なものとして表れるので、分析器は、試料負荷に先んじてこれ らの不純物を減少させるため数サイクル運転しなければならない。この予備サイ クルは、公知のように、高価な薬品と貴重な時間を要する。キャリア法の別の不 利な点は、マトリックスの内へまた外へ浸透しなければならないエドマン薬品及 び洗浄溶剤を必要とすることである。試料はマトリックスの口に捕えられ支持体 の表面に十分露出されないので、反応及び洗浄の有効性はある程度までで斐協さ れるということもある。

本発明者等は、成る種の化学修飾したガラス支持体が・分解工程の貨に分解した ままのアミノ酸誘導体を依然として離脱しつつ、溶剤並びに試薬の供給−試料の 損失を最小にしてペプチドや蛋白質に結合することを見出した。これらは、［シ リルＣ３Ｐｊ　、２−（４−”ロロスルホニル　フェニル）エチル　トリメトキ シシラン、及び、′シリル　ＴＭＡ、、ｌ　、Ｎ−１−リメｉキシシリル　グロ ビルーＮ、Ｎ、Ｎ−トリメチル　アンモニウム　クロリドである。

蛋白質、ペプチドの両者の支持体は、ガラスそれ自体の表面の化学的改変によっ て調製する。この修飾は、共有結合法であってガラス繊維表面の永久的変化とい うことになる。前記シリルＴ　Ｍ　Ａ及びシリルＣ５Ｐは二官能性試薬である。

試薬はシリル基を介してガラスに付加し、他の官能基を蛋白質若しくはペプチド と交互反応するために遊離にしておくのである。試薬は共有結合で付加している ので、またそれはガラス表面上の凰層（モルイヤ）であるので、試料を包みこむ マトリックスを形成することはできない。試薬は静電力及び疎水力の組合わせを 通じて遊離の官能基と反応するに違いない。この種の交互反応は、試料が■接試 薬と交互反応し、薬品が浸透しなければならないマトリックスには邪魔されない ので非常に望ましい。

短鎖のペプチド及び蛋白質両者に働く１種類の修飾ガラス支持体を作ることも可 能であるが、小分子又は大分子いずれかに支持体の表面を調製しておくことが有 利であることを見い出した。シリル−Ｃ５Ｐのみで修飾したガラスは、小分子（ ８０００ダルトン以下の分子量のペプチド）のための宜定剤（アンカー）として 非常によく作用する。より大きいペプチド並びに蛋白質もこの表面によく固着す るが、正電荷の側鎖を有するＰＴＨアミノ酸は、支持体から効果的に取り出され なく、続く分析時に非常に低い価を与える。ガラス表面をまずシリル−Ｃ５Ｐで 、次いでシリル−ＴＭＡで処理すると、表面に試料を保持する能力は影響を受け ることなく、上記の作用が非常に減少する。「問題となる」ペプチドは、ガラス 表面に付加するこれら二種のシランの量比を調整することにより配列分析するこ とができる（第２図）、。

純シリルーＴＭＡ修飾したガラスは、大分子量（分子量８０００ダルトン以上の ペプチド及び蛋白質）の支持体として効果よく作用するが、支持体表面により小 分子量のペプチドを保持するには子分満足とは言えない。

上記シリル修飾支持体のため挙げられた特定の薬品が好ましい態様において用い られるけれども、それら薬品または類似の。

官能基を含む改変された誘導体も同様、もしくはより良好に作用することができ る。例えば、十分低いｐＫａ（＜１）を有する適当な酸基はどんなものでも好ま しい態様甲のスルホン基の代りに用いることができる。この範−に入る他の酸の 例は、就中りん酸、ピクリン酸、塩酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ク ロム酸、ヨウ化不葉酸、ピロリン酸を包含するが、これらに限定されるものでは ない。酸世基の存在はペプチド支持体の性能発揮上決定的であることが認められ た。酸基を欠く７二ネチルトリメトキシ　シランのような化合物を使用すると、 修飾に月いた薬品の百分率には関係なく、ペプチドを保持しない支持体を生ずる こととなる。３−（トリメチルシリル）−１−プロパン　スルホン酸のような化 合物、フェニル基を欠くが酸基を有する化合物を用いると、包成修飾表面はペプ チドを保持する。

これは明らかに酸基の存在であって、試料保持を促進するフェニル環や炭素鎖で はない。しかし、この化合物は室温で固体であるので、シリル−Ｃ５Ｐよりも使 用は大いに不便である。

：発明の詳細な説明］ かくして、本発明は１つの態様において、ペプチＶ８：び／または蛋白質の配列 分析に適当な支持体を調製するため、ポリ（アミノ）酸−反応性基を有するシリ カ−結合性物質の使用を指向する。シリカ−結合性物質は、好ましくはオルガノ シランであり、それは式Ｒ，Ｓ　ｉ　Ｘ（４、）、ここにｎは１〜３であり、Ｘ は無機物質と反応する基である、を有する。Ｘは加水分解可能基、典型的にはア ルコキシ基、アルコキシ基、アミン又は塩素である。最も通常のアルコキシ基は メトキシ及びエトキシ基である。Ｒはアミノ酸と交互反応する官能性を有する非 加水分解性有機基である。

シリカ−結合性物質の溶媒＝の好ましい濃度は、希釈後０．２５〜２％（Ｖ／Ｖ ）である。

支持体は好ましくは、シリル−Ｃ５Ｐの加水分解形のような陰イオン性シラン、 又は陰イオン性シランとシリル−ＴＭＡのような陽イオン性シラン両者で修飾さ れる。

シリル−Ｃ５Ｐ化合物上のクロロスル不ニル基が第−級及び第二級アミン類と反 応することは公知である。そこで、ペプチド又は蛋白質の存在下でこの活性基を 使用すれば、カップリング反応に遊離のアミノ基を必要とするエドマン分解によ る配列分析に対してそれらを閉塞するであろう。この問題を克服するために、ク ロロスルホニル基を定量的にスルホン酸誘導体に変換させる。この加水分解反応 は、シリル−Ｃ５Ｐをガラス表面に付加させる工程口に、都合よく生じるもので ある。

その時ガラス表面は、非常に低いｐ　Ｋａ（（ｌ　）の負電荷のスルホン酸基を 有する。これは正電荷の分子をガラスへ結合するのを容易にする。しかしながら 、実効負電荷のペプチド並びに電荷−世にあるペプチドもまた十分結合し、配列 分析工程中表面から撤去されないことが観察される。他の型の修飾ガラス支持体 を用いて行った寅験から、ペプチドは、エドマン分解の酸分裂工程に統＜ＡＴＺ 溶媒抽出の間に表面から殆ど冷去されることが認められる。この点において、ペ プチドは、十分プロトン付加したＮ−天端′７ミノ基により、その組成がどうで あれ、実効正電荷を有するであろう。表面基のｐＫａが十分低いと、表面は依然 としてペプチドとの静電的交互反応を促進する実効負電荷を有するであろう。Ａ ＴＺアミノ酸誘導体は、これらの条件のもとでは小さな非電荷の疎水性分子であ り、荷電ペプチドから溶媒で容易に抽出し去るであろう。唯一の例外は、実効正 電荷を有し、そのため抽出がより困難であるＡＴＺとスチジン及びＡＴＺアルギ ニンであろう。事笑ガラス表面がスルホン酸基の高すぎる濃度を有すると、ＡＴ Ｚヒスチジンとアルギニンとは抽出の間支持体上に保持されるであろう。

酸性条件下で正に荷電され得るリジンは、ε−アミノ基がＰＩＴＣと反応してε −ＰＴＣ誘導体となり、ＡＴＺリジンを強いｉ５ｉ！本性にし抽出され易いもの にするので、最初のエドマンカップリング反応の後荷電されないであろう。

カップリング反応の間、塩基的環境は支持体上に寅効負電荷を維持する。ペプチ ドも、アミノ末端がＩＩＰ亡ＰＴＣ基に巻き込まれているので、カルボニル基を 通じて負に荷電されるであろう。カップリング反応の副生物の抽出の間、ペプチ Ｖは静電気的状況が好ましくないとみられても、支持体上に残る。

明らかに、数多くの作用が組み合わさって非常に強い牽引力を形成している。お そらく修飾ペプチド内の部分的に正の電荷が、高い負の表面にそれを結合してい る。この非常に望ましい作用は、Ｃ５Ｐ対ＴＭＡの低比率（第３図参照）が、支 持体に対する親和力を低下させ、配列分析がカルボキシ末端に近付くに従ってＰ ＴＨアミノ酸の収率を低下させるので、非常に短い疎水性ペプチドに対してはい くらか相殺される。親木性の高いペプチドでは上記のようにはならないで、Ｃ− 末端近くの収率は依然良好である。

純シリルーＣ５Ｐ支持体では、ガラスに施されるシリル−Ｃ５Ｐ溶液甲の好まし い濃度は１〜２％である。ハイブリッド　シリル−Ｃ５Ｐ／シリルＴＭＡ支持ケ では、好ましいシリル−Ｃ５Ｐの濃度は０．１〜０．２５％であり、好ましいシ リル−ＴＭＡの好ましい濃度は０．５〜２．０％である。純シリル−Ｔ　Ｍ　Ａ も調製することができる。

ガラス表面の調製に用いる方法は、蛋白質の配列分析機における支持体の能力発 揮に対して非常に重要なことを見い出した。

蛋白質配列分析に使用するだめのガラスのシリル修飾に関する公知の方法は、信 頼世に大いに欠けることが証明されている。

これらの方法の多くは、シリル化を成功させるため、種々の酸（いわゆる「アシ ドエツチング」）及び塩基で、修飾すべき表面を広範に前処理することを要攻す る。これらの前処理方法は、全く系必要であり、多くの場合有害であることが本 発明者等によって見い巴された。特に熱処理前の溶媒洗浄は望ましくない。

次の方法は蛋白質及びペプチドに対して一貫して高い親和性を有する表面を製造 する。これらの実施例は不発明の好ましい態様の製造及び使用を説明するもので ある。

］寅実施例二 次の実施例は、約８０００ダルトンを越えるポリ（アミノ）酸に非常に高い親和 性の表面を生成する方法を説明するものである。この方法によれば非常に少ない 量の試料に基づいて配列分析ができる。ＰＴＨ分析において用いられる鑑別法は 、実は、分析試料の量よりもむしろ蚕業限定である。蛋白質支持体として使用す るｊ；めのシリル−ＴＭＡ修飾ガラス表面は次のように調製する： ：、ｉｏＯ＋ｎＱのガラス巨盛シリンダーにＨＰＬＣ級のメタノール９５ｍ１２ を入れ、ＨＰＬＣ級の不５ｍＱを加える。

２、子分混合してメタノール甲のシリルＴＭＡの５０％溶液６ｍαを加える。（ かくして有効濃度はシリル−ＴＭＡ約３％となる） ３、τ分混合し５　ｍｉｎ放置してシリル基の加水分解をおこさせる。５ｍ１ｎ 以上放置しないこと。

４、溶液をガラスペトリ皿に注ぐ。

５、溶液口にガラス繊維ディスク（複数）（例、ワットマンＧＦ　／　Ｆ又はＧ Ｆ／Ｃガラス繊維ディスク）を入れ、ディスクが完全に濡れるように確かめる。

６．５ｍ１ｎインキユベートし、その電時々振動し、要すれば反転してガラスが 溶液に７分さらされることを確かめる。ディスクが溶液で完全に覆われるように することが重要である。

７．５ｍ１ｎの終わりに、ディスクを１１０℃のオーブン田に３０ｍ１ｎつるす 。注意：熱処理前にディスクを溶媒で洗わないこと。

８、オーブンロにディスクがある間に、ペトリ皿の溶液を捨て、新しいメタノー ルとおきかえる。

９、オーブン　インキュベーションの終りに、ディスクを取出し、メタノールを 入れた皿（複数）にそれらを入れ、うすを巻かせて洗う。

１０、各々のディスクをブックナー　フイノ［り漏斗に入れて、メタノールの漏 斗３倍容量で重力下洗浄する。

′１１．洗浄したディスク（複数）を真空苗に入れ里温で少なくとも３０ｍ１ｎ 乾燥させる。

ワットマンＧＦ／Ｆ又はＧＦ／Ｃ濾紙の代わりに他のガラス支持体を月いてもよ い。

この純シリルーＣ５Ｐ支持体が、３０〜４０アミノ酸より少ないペプチドを保持 することは容易でない。純シリルーＣ５Ｐ支持体又はハイブリッド支持体が、短 鎖ペプチドの配列分析には推奨される。

一実施例２２ シリル−Ｃ５Ｐ修飾ガラス支持体は、ペプチド命にヒスチジン及びアルギニンが 存在しない時は、ペプチド支持体としての使用に推奨される。この型の表面は、 ＡＴＺヒスチジン及びＡＴＺアルギニンを強く保持し、それらが反応支持体から 十分拍比されない程である。シリル−ＴＭＡのような化合物を加えることは、実 施例３に記載されるように、おそらくはシリル−Ｃ５Ｐ表面に存在する負部位の ため競争することにより、この作用を大きく減少させる。ペプチド支持体として 使用するための純シリルーＣ５Ｐ支持は、メチレンクロリド田のシリル−ｃｓｐ ｓＯ％溶液２ｍ１２を加えて実施例１のように調製される。（工程２の後、有効 濃度はシリル−ｃｓｐ　１％である。）：実施例３］ シリル−Ｃ５Ｐ／シリル−ＴＭＡ混合修飾ガラス表面は、ペプチド又は蛋白質支 持体用であって、これも調製することができ、これは最も好ましい支持体である 。該混合物は、純シリル−ＣＳＰＰＩ３［シリル−ＴＭＡと２咬して優れたペプ チド月効果発揮を与える。それは、ＰＴＨヒスチジン及びＰＴＨアルギニンがτ 分？Ｅ！＝される反面、疎Δ左の短鎖ペプチドでさえその表面親和性は優れてい るからである。純シリル−ＴＭＡは、たいていの小さなペプチダ類には少しも作 用しない。混合支持体は、まずシリル−ＣＳＰ支持体を実施例２と同様にして調 製するが、シリル−Ｃ５Ｐのメチレン　クロリド５０％溶液Ｑ、５ｍＱを用い、 次いで実施例１の方法に従うが、シリル−ＴＭＡのメタノール５０％溶液４ｍ１ ２を月いるものである。（即ち希釈後２％）。

二実施例４二 第１又は、ペプチド分析片のハイブリッドＣ３Ｐ／ＴＭＡの価値を表している。

デカペプチドＰｒｏ−Ｈ４５−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｆｌｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖ ａ　１−丁ｙｒ−Ｌｙｓ（２００Ｐ　Ｍ）を、自動ガス相配列分析機（ｐｏｒｔ ｏｎｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｐ＋　２０２０）に負荷した。このデカペプチド は、その極めて疏本竺のＣ−末端の故に、大男の自動化ガス又はガス／液相分析 機に対して非常な問題を提供している。

分析機に実施例３のハイブリッドＣ５Ｐ／ＴＭＡ支持体又はポリブレン処理支持 体の何れかを取付けた。後者の支持体は未修飾ガラス繊維支持体上に、７１’＝ ｉ５ｕ１２＋”Ｆポリブレン１．５ｍｐをピペットし、次いで蒸発させることに よって調製されたものである。第１図に見られるように、ポリブレンで処理した 支持体（１ａ）は、最初のサイクルにおいてＣ５Ｐ／ＴＭＡ支持体より非常に不 純物の高い背景度合（＊で示し！；ビーク）を与える。

二実施例５Ｌ 第２！は、ＣＳ　Ｐ’／ＴＭＡ二を０．２５％ＣＳ　Ｐ／２％ＴＭＡ（第２ｂ叉 ）から０．１％ＣＳ　Ｐ／２％ＴＭＡ（第２Ｃ叉）に改変し゛た結果を示す。後 者の比の選択はサイクル２におけるＰＴＨ−ヒスチジンの収量を大きく増加した 。ハイブリッド支持体のシリル−Ｃ５Ｐ成分は通常１％を越えるべきではなく、 ０．２５％が好ましい。：！ｉｓまたはＡｒｇリッチとして知られるペプチドを 分析する場合、低濃度のシリル−Ｃ５Ｐでもこれを使用して調製したハイブリッ ド支持体の使用が望ましい。

：実施例６］ 第３又は、β−ラクーグロブリンについてのガス相分析機の最初の１５サイクル を示し、分析系の分別限に近い試料の量でのシリル−ＴＭＡ蛋白支持体の能力発 揮の優秀性を表している。

８ピコモルにすぎない量の蛋白質を支持体に負荷させたが配列を可視Ｒ察Ｉ：； り容易に決定できる。この寅験Ｉ：おいて、分析機の７ラクシヨン　コレクター に引き渡されたＰＴＨアミノ酸の７５％が分析された。ＰＴＨロイシンのサイク ル１における収率は、６０％より大でありサイクル３及び１５間のそれぞれの収 率は９５％より大である。

［実施例７二 純２％シリル〜Ｃ５Ｐのｉ５０ｕｇのポリブレンでの処理は、ペプチドの保持を 著しく減少させ、そこで分析デカペプチドのＰＴＨ誘導体の収量を減少させた。

しかし１．５ｍｇのポリブレン添加では、ペプチドの保持はポリブレン処理の未 修飾ガラス支持体のそれに匹敵する。

シリル−Ｃ５Ｐ支持体が試料を埋め込むことにより働いｔ；ならば、追加される 埋め込み剤（即ちポリブレン）の少量添加は、試料保持の損失とはならないであ ろう。しかしＰｏｒｔｏｎ支持体が試料と静電交互反応に基づく原理で働くなら ば、ポリ塩基（すなわち正電荷の）物質、例えばポリブレンの少量の添加は、試 料に対する負荷電支持体の静電的牽引を大いに干渉しがちになる筈である。しか しこの／ｐ量のポリ塩基の添加は、試料を埋め込むのに１分ではない。もつと多 量のポリブレン（＞１−５ｍｇ）を添加すれば、支持体上の荷電基を完全に覆い 試料を埋め込むであろう。

図面の簡単な説明 第１図は、（ａ）ポリブレンで処理した支持体又は（ｂ）シリル−Ｃ５Ｐ／ＴＭ Ａ修飾支持体を用いるガス相分析機を用いるデカペプチド分析の第一サイクルに おけるＰＴＨ−プロリンの収率を比較する図である。

第２図は、（ａ）ポリブレン−処理支持体、（ｂ）シリル−Ｃ５Ｐ／ＴＭＡ修飾 支持体及び（ｃ）支持体（ｂ）に関して減少したＣ５Ｐを有するシリル−Ｃ５Ｐ ／ＴＭＡ修飾支持体を用いるガス相分析機を使用して、同じデカペプチドの分析 のサイクル２におけるＰＴＨ−ヒスチジンの収率を比較する図である。

第３図は、シリル−ＴＭＡ支持体を用いる、β−ラクトグロブリンＡの８ピコモ ルについてのガス相分析機の最初の１５サイクルを示す図である。

第１Ｑ図 第１ｂ、図 第２σ３図 第２ｂ、図 第２ｃ図 第３図 第３図 第３図 第３図 第３図 第３図 第３図 第３図 第３図 第３図 第３図 第Ｊ図 第３図 第３図 国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）ペプチド又は蛋白質を支持体上に不動化し、段階的分解によりペプチドま たは蛋白質を配列分析することからなるペプチド又は蛋白質の配列分析法におい て、遊離の酸基を有するシリカー結合性物質で修飾したガラス支持体を調製する こと、しかも前記酸はｐＫａ＜１を有し、前記修飾支持体は前記ペプチド又は蛋 白質を保持することができるものであることよりなる改良法。
2. （２）前記酸基が、りん酸、ピクリン酸、塩化水素酸、トリフルオロ酢酸、トリ クロロ酢酸、クロム酸、ヨード水素酸、ビロりん酸、スルホン酸およびハロスル ホン酸よりなる群から選ばれる請求項１記載の改良法。
3. （３）前記酸基がスルホン酸又はハロスルホン酸である請求項１記載の改良法。
4. （４）前記支持体がガラス支持体を４−クロロスルホニルフエニルアルキルアル コキシシランと共にインキュベートすることにより調製される請求項３記載の改 良法。
5. （５）前記シランが２−（４−クロロスルホニルフエニル）エチルトリメトキシ シランである請求項４記載の改良法。
6. （６）前記シランが３−（トリメチルシリル）−１−プロバンスルホン酸である 請求項４記載の改良法。
7. （７）遊離のスルホン酸基またはハロスルホン酸基を有する第一のシリカ−結合 性物質、及び遊離の第四級アンモニウム基を有する第二のシリカ−結合性物質を もって修節されたシリカ糸支持体よりなり、しかも支持体がペプチドまたは蛋白 質を保持することができることよりなる修飾ガラス支持体。
8. （８）前記第一の物質が２−（４−クロロスルホニルフエニル）エチルトリメト キシシランであり、前記第二の物質がＮ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドである請求項７記載の支持体。
9. （９）ペプチド又は蛋白質を支持体上に不動化し、段階的分解によりペプチド又 は蛋白質を配列分析することなりなるペプチド又は蛋白質の配列分析法において 、ペプチド又は蛋白質を請求項７記載の支持体上に不動化することからなる改良 法。
10. （１０）ペプチド又は蛋白質を支持体上に不動化し、段階的分解によりペプチド 又は蛋白質を配列分析することからなるペプチド又は蛋白質の配列分析法におい て、共有結合でシリカに結合する物質で修節されたガラス支持体を調製し、しか も該物質が第四級アンモニウム基を有し、該修飾された支持体がペプチドまたは 蛋白質を保持することができるものである、ことよりなる改良法。
11. （１１）前記物質がオルガノシランである請求項１０記載の改良法。
12. （１２）前記物質がＮ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル アンモニウムクロリドである請求項１１の改良法。