【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明はDC−45物質を含有してなる抗腫瘍剤
に関する。
さらに詳しくは、本発明は
一般式（）
〔式中、Ｒは式
または水素原子（DC−45−A2）を表わす〕で表
わされるDC−45物質を含有してなる抗腫瘍剤に
関する。DC−45−A1およびA2は新規物質であ
り、例えばストレプトマイセス属の微生物を培地
中で培養すること又はDC−45−Ａから合成する
ことによつて製造することができる。それらの製
造法の詳細は特願昭56−113601号明細書に記載さ
れているが、その一例を後記参考例に示す。
本発明者らは、DC−45物質の抗腫瘍作用につ
いて種々検討した結果、DC−45−A1およびA2が
優れた抗腫瘍作用を有することを見い出し本発明
を完成した。
以下、本発明を詳細に説明する。
DC−45−A1およびA2は新規物質であり、それ
らの理化学的性質が次に示される。
(1) DC−45−A1の理化学的性質
融点：184−186℃（分解）
元素分析値（％）：Ｈ：5.96、Ｃ：57.77
分子量：704
分子式：C34H40O16
紫外部吸収スペクトル（メタノール中）：
第１図
赤外部吸収スペクトル（KBr錠剤法）：第
２図
旋光度：〔α〕25 D＋103゜（Ｃ＝0.5、CHCl3）
PMRスペクトル（CDCl3中、TMS基準）
（ppm）1.07（3H、ｓ）、1.24（3H、dJ＝6.4）
1.50〜2.50（多くのピークが見られる）2.14
（3H、ｓ）、2.60（3H、ｓ）、3.02（1H、dJ＝
5.4）、3.13（1H、dJ＝5.4）、3.46（3H、ｓ）、
3.63（3H、ｓ）、3.84（3H、ｓ）4.50〜5.50（多
くのピークが見られる）、7.43（1H、ｓ）、
1.43（1H、ｓ）
CMRスペクトル（CDCl3中TMS基準）
（ppm）16.9、20.5、20.9、25.7、36.7（２本）、
50.2、56.6、57.0、62.7、63.0、68.0（２本）、
68.9、69.2、69.4、73.3、74.4、98.3、99.0、
100.1、104.1、107.4、114.8、115.4、116.7、
126.5、135.4、143.0、、144.9、151.6、163.0、
170.4、203.1
溶解性：メタノール、エタノール、アセト
ン、酢酸エチル、クロロホルムに可溶、ベン
ゼン、エーテル水に難溶、ｎ−ヘキサンに不
溶
(2) DC−45−A2の理化学的性質
融点：152−158℃（分解）
元素分析値（％）：Ｈ：5.23、Ｃ：57.80
分子量：518
分子式：C25H26O12
紫外部吸収スペクトル（メタノール中）：
第３図
赤外部吸収スペクトル（KBr錠剤法）：第
４図
旋光度：〔α〕25 D＋97.5゜（Ｃ＝0.5、CHCl3）
PMRスペクトル（CDCl3中、TMS基準）
（ppm）1.50〜2.50（多くのピークが見られ
る）、2.61（3H、ｓ）、3.01（1H、dJ＝4.6）
3.13（1H、dJ＝4.6）、3.46（3H、ｓ）、3.62
（3H、ｓ）、3.92（3H、ｓ）、4.50〜5.50（多く
のピークが見られる）7.43（1H、ｓ）14.0
（1H、ｓ）
CMRスペクトル（CDCl3中、TMS基準）
（ppm）20.5、37.3、50.0、56.6、57.0、61.8、
63.1、67.8、69.1、69.4、73.4、99.0、100.0、
104.0、107.4、114.3、115.1、116.2、129.3、
135.5、142.6、144.3、151.4、162.1、203.6
溶解性：メタノール、エタノール、アセト
ン、酢酸エチル、クロロホルムに可溶、ベン
ゼン、エーテル、水に難溶、ｎ−ヘキサンに
不溶
次にDC−45−A1およびA2の急性毒性試験およ
び抗腫瘍作用について説明する。
() 急性毒性試験
体重が19±１ｇのddY雄性マウス（一群５
匹）の腹腔内又は尾静脈に段階希釈して作成し
た本化合物の生理食塩水溶液の0.5mlずつを１
回投与した。投与後、14日間マウスの生死を観
察し、それぞれの死亡率を求め、Behrens−
Ko¨rber法によりLD50を算出した。その結果を
第１表に示す。
The present invention relates to an antitumor agent containing DC-45 substance. More specifically, the present invention relates to the general formula () [In the formula, R is the formula or a hydrogen atom (DC-45-A 2 )]. DC-45-A 1 and A 2 are new substances and can be produced, for example, by culturing Streptomyces microorganisms in a medium or by synthesizing them from DC-45-A. The details of their manufacturing method are described in the specification of Japanese Patent Application No. 113601/1982, and an example thereof is shown in the Reference Example below. As a result of various studies on the antitumor effect of the DC-45 substance, the present inventors discovered that DC-45-A 1 and A 2 have excellent antitumor effects and completed the present invention. The present invention will be explained in detail below. DC-45-A 1 and A 2 are new substances, and their physicochemical properties are shown below. (1) Physical and chemical properties of DC-45-A 1 Melting point: 184-186℃ (decomposition) Elemental analysis value (%): H: 5.96, C: 57.77 Molecular weight: 704 Molecular formula: C 34 H 40 O 16 Ultraviolet absorption Spectrum (in methanol):
Fig. 1 Infrared absorption spectrum (KBr tablet method) Fig. 2 Optical rotation: [α] 25 D +103° (C = 0.5, CHCl 3 ) PMR spectrum (in CDCl 3 , TMS standard)
(ppm) 1.07 (3H, s), 1.24 (3H, dJ=6.4)
1.50-2.50 (many peaks can be seen) 2.14
(3H, s), 2.60 (3H, s), 3.02 (1H, dJ=
5.4), 3.13 (1H, dJ=5.4), 3.46 (3H, s),
3.63 (3H, s), 3.84 (3H, s) 4.50-5.50 (many peaks can be seen), 7.43 (1H, s),
1.43 (1H, s) CMR spectrum (TMS standard in CDCl 3 )
(ppm) 16.9, 20.5, 20.9, 25.7, 36.7 (2 bottles),
50.2, 56.6, 57.0, 62.7, 63.0, 68.0 (2 pieces),
68.9, 69.2, 69.4, 73.3, 74.4, 98.3, 99.0,
100.1, 104.1, 107.4, 114.8, 115.4, 116.7,
126.5, 135.4, 143.0, 144.9, 151.6, 163.0,
170.4, 203.1 Solubility: Soluble in methanol, ethanol, acetone, ethyl acetate, chloroform, slightly soluble in benzene, ether water, insoluble in n-hexane (2) Physical and chemical properties of DC-45-A 2 Melting point: 152- 158℃ (decomposition) Elemental analysis value (%): H: 5.23, C: 57.80 Molecular weight: 518 Molecular formula: C 25 H 26 O 12 Ultraviolet absorption spectrum (in methanol):
Figure 3 Infrared absorption spectrum (KBr tablet method): Figure 4 Optical rotation: [α] 25 D +97.5° (C = 0.5, CHCl 3 ) PMR spectrum (in CDCl 3 , TMS standard)
(ppm) 1.50-2.50 (many peaks can be seen), 2.61 (3H, s), 3.01 (1H, dJ=4.6)
3.13 (1H, dJ=4.6), 3.46 (3H, s), 3.62
(3H, s), 3.92 (3H, s), 4.50-5.50 (many peaks can be seen) 7.43 (1H, s) 14.0
(1H, s) CMR spectrum (in CDCl 3 , TMS reference)
(ppm) 20.5, 37.3, 50.0, 56.6, 57.0, 61.8,
63.1, 67.8, 69.1, 69.4, 73.4, 99.0, 100.0,
104.0, 107.4, 114.3, 115.1, 116.2, 129.3,
135.5, 142.6, 144.3, 151.4, 162.1, 203.6 Solubility: Soluble in methanol, ethanol, acetone, ethyl acetate, chloroform, slightly soluble in benzene, ether, water, insoluble in n-hexane Next DC-45-A 1 The acute toxicity test and antitumor effect of A2 and A2 are described. () Acute toxicity test ddY male mice weighing 19 ± 1 g (5 per group)
Inject 0.5 ml of a serially diluted physiological saline solution of this compound into the peritoneal cavity or tail vein of a rat
Administered twice. After administration, the mice were observed for 14 days to determine their mortality rate, and Behrens-
LD 50 was calculated by the Ko¨ber method. The results are shown in Table 1.
【表】
() 抗腫瘍作用
実験方法
(1) サルコーマ180固形腫瘍に対する効果依殖
後７日目のサルコーマ180腹水担癌マウスか
ら腹水細胞を採取し、滅菌生理食塩水により
５×107個／mlの細胞浮遊液を作成した。こ
の0.1mlを体重19±１ｇのddY雄性マウスの
右腋窩部皮下に移殖した。１回投与は、移殖
後24時間目に、連続投与は、移殖後24時間目
より１日１回６日間、各群５匹ずつのマウス
に薬剤を尾静脈より投与した。薬剤の抗腫瘍
活性の判定は、移殖後７日目に腫瘍の長径ａ
と短径ｂを測定し、腫瘍体積に相当するａ×
b2／２の値を求めた。対照群Ｃに対する薬剤
投与群Ｔの体積の比Ｔ／Ｃを目安に抗腫瘍効
果を表わし、その結果を第１表に示す。
(2) ED50
サルコーマ180固型腫瘍の体積を対照群の
50％に低下させる投与量を、ED50とした。
縦軸にＴ／Ｃ、横軸に対数目盛で投与量を表
したグラフに、投与量とＴ／Ｃの関係をプロ
ツトし、投与量と抗腫瘍活性を最小二乗法で
直線として求め、Ｔ／Ｃが0.5を示す投与量
をED50として計算した。その結果を第２表
に示す。なお、最大耐容量におけるＴ／Ｃが
0.5以下を示さない場合は、ED50を求めなか
つた。[Table] () Antitumor effect Experimental method (1) Effect on Sarcoma 180 solid tumor Ascites cells were collected from Sarcoma 180 ascites tumor-bearing mice on the 7th day after inoculation, and 5 x 10 7 cells/cell were collected with sterile physiological saline. ml of cell suspension was prepared. 0.1 ml of this was subcutaneously transplanted into the right axillary region of a ddY male mouse weighing 19±1 g. The drug was administered via the tail vein to 5 mice in each group for a single administration 24 hours after transplantation, and for continuous administration once a day starting 24 hours after transplantation for 6 days. The antitumor activity of the drug was determined by measuring the long axis a of the tumor on the 7th day after transplantation.
and the short axis b, and a× corresponding to the tumor volume.
The value of b 2 /2 was determined. The antitumor effect is expressed using the volume ratio T/C of drug administration group T to control group C as a guide, and the results are shown in Table 1. (2) ED 50 sarcoma 180 solid tumor volume compared to control group
The dose at which the dose was reduced by 50% was defined as the ED 50 .
Plot the relationship between dose and T/C on a graph with T/C on the vertical axis and dose on a logarithmic scale on the horizontal axis, calculate the dose and antitumor activity as a straight line using the least squares method, and calculate T/C. The dose at which C was 0.5 was calculated as ED50 . The results are shown in Table 2. In addition, T/C at maximum withstand capacity is
If it did not show 0.5 or less, ED 50 was not determined.
【表】【table】
【表】
第２表から判る様にDC−45−A1とDC−45−
A2は、１回投与においても６回連続投与におい
ても抗腫瘍効果を示し、その最大耐容量における
Ｔ／Ｃの値は対照化合物であるDC−45−Ａおよ
びDC−45−B2よりも小さく、Sarcoma180固型
腫瘍に対して腫瘍増殖抑制効果が強い。
DC−45−A1とDC−45−A2を抗腫瘍剤として
用いるに際しては、DC−45−A1では0.001〜0.05
mg／Kg、DC−45−A2では0.02〜1.0mg／Kgの各化
合物を、生理食塩水、ブドウ糖注射液に溶解し
て、静脈内に１日１回投与すればよい。
投与量は、年令や症状により適宜増減できる。
又、投与頻度は、投与量により１回／週〜１回／
月に適宜調整する。
さらにDC−45−A1又はDC−45−A2を粉剤、
錠剤等の形態にして、同様の投与量で経口的に投
与することもできる。
粉剤、錠剤を調整する場合には、例えば、DC
−45−A1又はA2をラクトース、マンニトールな
どの賦形剤、馬れいしよでんぷんなどの崩壊剤、
ステアリン酸ナトリウム、タルクなどの滑沢剤、
ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアル
コールなどの結合剤を混合して調製する。
以下に、実施例および参考例（DC−45−A1お
よびA2の製造例）を示す。
実施例 １
（注射剤）
DC−45−A22.0ｇを蒸留水1000mlに溶解した
後、ミリポアフイルター（pore size：0.22μ）で
加圧ろ過して無菌化を行う。得られた無菌ろ液を
10mlの褐色バイアルに５mlずつ分注し（主薬：10
ml／バイアル）、−50℃で２時間凍結後、棚温−10
℃、真空度0.1mmHgで24時間一次乾燥を行なう。
棚温と品温が一致したのを確認後、棚温40℃、真
空度0.1mmHgで４時間二次乾燥を行ない水分を除
去した後、ゴム栓を施し打栓する。
これを、用時、滅菌生理食塩水５mlを加え、充
分振とう撹拌して溶解し、注射剤を調製する。
参考例 １
種菌としてストレプトマイセス・ボトロペンシ
スDO−45（菌学的性質は特開昭56−61398号公報
に記載されている。）を用いた。該菌株を30容
量のジヤーフアーメンター中の種培地〔KCl4
ｇ／、MgSO4・7H2O0.5ｇ／、KH2PO41.5
ｇ／、硫安5.0ｇ／、シユークロース20ｇ／
、フラクトース10ｇ／、グルコース10ｇ／
、コーンスチープリカー5.0ｇ／、CaCO320
ｇ／PH7.0〕15に植菌し、30℃で48時間振と
う（220r.p.m.）培養した。かくして得られた種
培養液を300容量のフアーメンター中の下記組
成の発酵培地150に５％（容量）の割合で移し、
30℃で通気撹拌方式（回転数180r.p.m.通気量150
／min）により培養を行つた。
発酵培地組成：グルコース30ｇ／、可溶性デン
プン10ｇ／、フアームメデイア（綿実粕、ト
レーダーズ・オイル・ミル社製、U.S.A.）10
ｇ／、K2HPO41ｇ／、MgSO4・7H2O1
ｇ／、NaCl3ｇ／、CuSO4・5H3O70mg／
、FeSO4・7H2O10mg／、MnCl2・4H2O8
mg／、znSO4・7H2O2mg／、CoCl2・
6H2O0.006mg／、PH7.0（殺菌前）にNaOH調
整する。
培養中培地のPHは制御しないで、72時間培養し
た。培養液より菌体および沈殿物を別し、液
130を得た。まず液を10の非イオン性多孔
性樹脂（商品名「ダイヤイオンHP−10」三菱化
成社製）に通塔して活性物質を吸着させ、水約20
で水洗後50％（Ｖ／Ｖ）メタノール約20で洗
い不純物を除去する。次いでメタノールで溶出す
る。メタノール画分約10を濃縮乾固後、0.1M
燐酸緩衝液（PH7.0）に溶解後等量の酢酸エチル
で３回抽出した。酢酸エチル層を濃縮後、セライ
トにまぶして粉末状とした。
一方菌体（湿重量約２Kg）をアセトン約50に
懸濁し、目的物質を抽出する。抽出液を濃縮乾固
後0.1M燐酸緩衝液（PH7.0）に溶解後等量の酢酸
エチルで３回抽出した。酢酸エチル層を濃縮後、
セライトにまぶして粉末状とした。これらの粉末
状のサンプルを予めクロロホルムに懸濁後カラム
に充填したシリカゲル（商品名：ワコーゲルＣ−
200、和光純薬社製）（５）のカラムに静かに乗
せた後、クロロホルム、次いでクロロホルム−メ
タノール（200：1V／Ｖ）を通塔することによつ
て不純物を除去する。次いでクロロホルム−メタ
ノール（150：1V／Ｖ）で溶出するとDC−45−
Ａの画分が溶出されてくる。続いてクロロホルム
−メタノール（100：1V／Ｖ）で溶出するとDC
−45−A1の画分が溶出される。得られたDC−45
−A1を含む画分を濃縮乾固する。DC−45−A1を
含む画分は予めシクロヘキサン−酢酸エチル
（１：１）に懸濁後カラムに充填したシリカゲル
を用いてクロマトグラフイーを行なう。まず、シ
クロヘキサン−酢酸エチル（１：1V／Ｖ）を通
塔して不純物を除き、次いでシクロヘキサン−酢
酸エチル（１：3V／Ｖ）で活性物質を溶出する
とDC−45−A1が不純物と分離されて出てくる。
濃縮後ｎ−ヘキサンを加え、粉末状のDC−45−
A115mgを得た。
参考例 ２
実施例１において、発酵培地組成を次のものに
代えて行なう以外は実施例１と同様に行ない、
DC−45−A24mgを得た。
発酵培地組成：可溶性デンプン40ｇ／、脱脂大
豆粕30ｇ／、コーンスチープリカー５ｇ／
、KCl0.3ｇ／、CaCO33ｇ／PH7.8（殺菌
前）にNaOHで調整する。
参考例 ３
DC−45−A500mgを0.1塩酸−メタノール10ml
に溶かし、室温で４時間放置する。炭酸鉛100mg
を加えて中和後過し、液を濃縮する。これを
予めクロロホルムに懸濁後カラムに充填したシリ
カゲルを用いてクロマトグラフイーを行なう。ク
ロロホルム、次いでクロロホルム−メタノール
（200：1V／Ｖ）を通塔することによつて不純物
を除去する。続いてクロロホルム−メタノール
（120：1V／Ｖ）で溶出する。DC−45−A1を含む
フラクシヨンを集めて濃縮する。これをシクロヘ
キサン−酢酸エチル（１：1V／Ｖ）で予め懸濁
したカラムに充填したシリカゲルを用いてクロマ
トグラフイーを行なう。シクロヘキサン−酢酸エ
チル（１：1V／Ｖ）を通塔して不純物を除き、
次いでシクロヘキサン−酢酸エチル（１：3V／
Ｖ）で溶出するとDC−45−A1が溶出されてく
る。これを集めて濃縮乾固し、ｎ−ヘキサンを加
えて粉末状のDC−45−A1210mgを得た。
参考例 ４
DC−45−A500mgを0.1％塩酸−メタノール10
mlに溶かし、室温で８時間放置する。生じた塩化
鉛および過剰の炭酸鉛を過し、液を濃縮す
る。これを予めクロロホルムに懸濁してカラムに
充填したシリカゲルを用いてクロマトグラフイー
を行なう。クロロホルム、次いでクロロホルム−
メタノール（120：1V／Ｖ）を通塔して、不純物
を除去した後、クロロホルム−メタノール（60：
1V／Ｖ）で溶出する。DC−45−A1を含むフラク
シヨンを集めて濃縮乾固する。これを、予めクロ
ロホルム−酢酸エチル（１：1V／Ｖ）に懸濁し
てカラムに充填したシリカゲルを用いてクロマト
グラフイーを行なう。クロロホルム−酢酸エチル
（１：1V／Ｖ）を通塔して不純物を除いた後、ク
ロロホルム−酢酸エチル（１：5V／Ｖ）で溶出
を行なうとDC−45−A2が出てくる。これを集め
て濃縮し、ｎ−ヘキサンを加え、黄色の粉末120
mgを得た。[Table] As seen from Table 2, DC-45-A 1 and DC-45-
A 2 showed antitumor effects both in a single dose and in 6 consecutive doses, and its T/C value at the maximum tolerated dose was higher than that of control compounds DC-45-A and DC-45-B 2 . It is small and has a strong tumor growth inhibitory effect on Sarcoma180 solid tumors. When using DC-45-A 1 and DC-45-A 2 as antitumor agents, DC-45-A 1 has a concentration of 0.001 to 0.05
mg/Kg, and for DC-45-A 2 , 0.02 to 1.0 mg/Kg of each compound may be dissolved in physiological saline or glucose injection and administered intravenously once a day. The dosage can be increased or decreased as appropriate depending on age and symptoms.
In addition, the administration frequency ranges from once/week to once/week depending on the dose.
Adjust accordingly each month. Furthermore, add DC-45-A 1 or DC-45-A 2 as a powder,
It can also be administered orally in the form of a tablet or the like in similar dosages. When preparing powders and tablets, for example, DC
−45−A 1 or A 2 is lactose, an excipient such as mannitol, a disintegrant such as horse starch,
Lubricants such as sodium stearate and talc,
Prepared by mixing binders such as hydroxypropyl cellulose and polyvinyl alcohol. Examples and reference examples (manufacturing examples of DC-45-A 1 and A 2 ) are shown below. Example 1 (Injection) After dissolving 2.0 g of DC-45-A 2 in 1000 ml of distilled water, it is sterilized by pressure filtration with a Millipore filter (pore size: 0.22 μ). The obtained sterile filtrate
Dispense 5 ml each into 10 ml brown vials (main drug: 10
ml/vial), after freezing at -50℃ for 2 hours, shelf temperature -10
Primary drying is performed for 24 hours at ℃ and vacuum level of 0.1 mmHg.
After confirming that the shelf temperature and product temperature match, perform secondary drying for 4 hours at a shelf temperature of 40°C and a vacuum level of 0.1 mmHg to remove moisture, and then seal with a rubber stopper. Before use, add 5 ml of sterile physiological saline and thoroughly shake and stir to dissolve this to prepare an injection. Reference Example 1 Streptomyces botropensis DO-45 (mycological properties are described in JP-A No. 56-61398) was used as an inoculum. The strain was grown in a seed medium [KCl4] in a 30 volume jar fermenter.
g/, MgSO 4・7H 2 O0.5g/, KH 2 PO 4 1.5
g/, ammonium sulfate 5.0 g/, seuclose 20 g/
, fructose 10g/, glucose 10g/
, corn steep liquor 5.0g/, CaCO 3 20
g/PH7.0]15 and cultured at 30°C for 48 hours with shaking (220 rpm). The seed culture solution thus obtained was transferred to a fermentation medium 150 having the following composition in a 300-volume fermenter at a rate of 5% (volume),
Aeration stirring method at 30℃ (rotation speed 180r.pm aeration rate 150
/min). Fermentation medium composition: glucose 30g/, soluble starch 10g/, farm media (cottonseed meal, Traders Oil Mill, USA) 10
g/, K 2 HPO 4 1g/, MgSO 4・7H 2 O1
g/, NaCl3g/, CuSO 4・5H 3 O70mg/
, FeSO 4・7H 2 O 10mg/, MnCl 2・4H 2 O8
mg/, znSO 4・7H 2 O2 mg/, CoCl 2・
6H 2 O0.006mg/, adjust NaOH to PH7.0 (before sterilization). Culture was carried out for 72 hours without controlling the pH of the culture medium. Separate the bacterial cells and precipitate from the culture solution, and
Got 130. First, the liquid is passed through a column of 10 nonionic porous resin (trade name "Diaion HP-10" manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) to adsorb the active substance, and water
After washing with water, remove impurities by washing with 50% (V/V) methanol at about 20°C. Then elute with methanol. After concentrating about 10 methanol fractions to dryness, 0.1M
After dissolving in phosphate buffer (PH7.0), it was extracted three times with an equal volume of ethyl acetate. After concentrating the ethyl acetate layer, it was sprinkled on Celite to form a powder. On the other hand, the bacterial cells (wet weight approximately 2 kg) are suspended in approximately 50% acetone and the target substance is extracted. The extract was concentrated to dryness, dissolved in 0.1M phosphate buffer (PH7.0), and extracted three times with an equal volume of ethyl acetate. After concentrating the ethyl acetate layer,
It was sprinkled on Celite to form a powder. These powdered samples were suspended in chloroform in advance and filled into a column with silica gel (trade name: Wakogel C-).
200 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (5), and then chloroform and then chloroform-methanol (200:1 V/V) were passed through the column to remove impurities. Then, when eluted with chloroform-methanol (150:1 V/V), DC-45-
Fraction A is eluted. Subsequently, elution with chloroform-methanol (100:1 V/V) resulted in DC
-45-A 1 fraction is eluted. Obtained DC−45
- Concentrate the fraction containing A 1 to dryness. The fraction containing DC-45-A 1 was previously suspended in cyclohexane-ethyl acetate (1:1) and then subjected to chromatography using silica gel packed in a column. First, impurities are removed by passing cyclohexane-ethyl acetate (1:1 V/V) through the column, and then the active substance is eluted with cyclohexane-ethyl acetate (1:3 V/V), and DC-45-A 1 is separated from the impurities. It comes out being done.
After concentration, add n-hexane to obtain powdered DC-45-
15 mg of A1 was obtained. Reference Example 2 The same procedure as in Example 1 was carried out except that the composition of the fermentation medium was changed to the following,
4 mg of DC-45-A 2 was obtained. Fermentation medium composition: soluble starch 40g/, defatted soybean meal 30g/, corn steep liquor 5g/
, KCl 0.3g/, CaCO 3 3g/pH adjusted to 7.8 (before sterilization) with NaOH. Reference example 3 DC-45-A 500mg 0.1 hydrochloric acid - methanol 10ml
Dissolve in and leave at room temperature for 4 hours. Lead carbonate 100mg
After neutralization, filter and concentrate the liquid. This is suspended in chloroform in advance, and then chromatography is performed using silica gel packed in a column. Impurities are removed by passing through chloroform and then chloroform-methanol (200:1 V/V). Subsequently, elution is performed with chloroform-methanol (120:1 V/V). The fractions containing DC-45-A 1 are collected and concentrated. Chromatography is performed using silica gel packed in a column which has been suspended in advance with cyclohexane-ethyl acetate (1:1 V/V). Cyclohexane-ethyl acetate (1:1 V/V) was passed through the column to remove impurities.
Then cyclohexane-ethyl acetate (1:3V/
When eluting with V), DC-45-A 1 is eluted. This was collected and concentrated to dryness, and n-hexane was added to obtain 210 mg of powdered DC-45-A 1 . Reference example 4 DC-45-A500mg 0.1% hydrochloric acid-methanol 10
ml and leave at room temperature for 8 hours. The resulting lead chloride and excess lead carbonate are filtered off and the liquid is concentrated. Chromatography is performed using silica gel, which is suspended in chloroform and filled in a column. Chloroform, then chloroform-
After removing impurities by passing methanol (120:1V/V) through the column, chloroform-methanol (60:1V/V) was passed through the column to remove impurities.
Elute at 1V/V). The fractions containing DC-45-A 1 are collected and concentrated to dryness. Chromatography is performed using silica gel which has been suspended in chloroform-ethyl acetate (1:1 V/V) and filled in a column. After removing impurities by passing chloroform-ethyl acetate (1:1 V/V) through the column, elution is performed with chloroform-ethyl acetate (1:5 V/V), and DC-45-A 2 comes out. This was collected and concentrated, and n-hexane was added to give a yellow powder of 120
I got mg.