JPH02291300A - 高感度特異的核酸の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は特異的核酸の高惑度測定法に ３． ２． 関する． 〔従来の技術〕 感染症、癌および遺伝子病の臨床検査の分野において、
核酸レベルの異常は蛋白質レベルの異常に先行するため
、核酸の測定は病態の把握に、病因の解析に重要な意義
を持っている． 従前、前述のごとき核酸の測定はＤＮＡ（ＲＮＡ）プロ
ープを用いたハイプリダイゼーシテン法によって行われ
ている． まず、フィルター上に検体から抽出した核酸を固定し、
標識プロープをハイプリダイズさせる方法（サザンプロ
ット法、ドット法）がある（第一の技術）．　この例と
しては、リンパ芽球細胞中のＥＩ３ウィルス（Ｅｐｓｔ
ｅｉｎ−Ｂａｒｒ　Ｖｉｒｕｓ）の　測定におけるプラ
ンズマ（Ｊ．Ｂｒａｎｄｓｍａ）らの報告〔プロシーデ
ィングス　オプ　ナショナル　ア力デミイ　オブ　サイ
エンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　
ＵＳＡ）、第７７＠、第６８５１頁（１９８０）　）が
ある．　細胞をニトロセルローズ膜に固定して、ＤＮＡ
を変性させた後、放射性同位元素で標識したＥＢウィル
スのＤＮＡプローブをハイブリダイズさせて定量したも
のである。

また、第一のプローブを固定したフィルターに被検液中
の測定すべき特異的核酸をトラップし、これに標識した
第二のプローブをハイブリダイズさせる方法（サンドイ
ンチ法）がある（第二の技術）。　この例としては、鼻
咽喉分泌物中のアデノウィルスの測定におけるパルバ（
Ａ．Ｐａｌｖａ）らの報告〔フェムス　マイクロバイオ
ロジカルレター（　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌ
ｅｔｔ．）第２３巻、第８３頁（　１９８４）　）があ
る．　メンプレンフィルター上に固定したアデノウィル
ス２型のＤＮＡプロープと放射性同位元素で標識したＤ
ＮＡプローブを用いて、アデノウィルスＤＮＡを定量し
たものである。

第一の技術では！Ｉｌ識ＤＮＡプローブが被検体中に多
量に存在するゲノムＤＮＡと非特異的にハイプリダイズ
することにより、フィルターに吸着するため、測定の特
異性が低くなるとともに、バンクグラウンドが高くなり
、感度が悪くなるという欠点がある． 第二の技術では、２種のブローブを用いるため、ＤＮＡ
を認識する特異性は高くなるが、フィルター上のＤＮＡ
プローブの検体ＤＮＡ｝ラップ能力に限界がある．　も
し担体の能力を大きくすれば、その結果、標識ブローブ
のフィルターへの非特異的吸着によるバンクグラウンド
が大きくなり、いずれにしても高感度化は困難であった
．〔発明の解決しようとする！！ｌ！題〕本発明の目的
は、このような状況下、 標識プローブの非特異的吸着による測定値のバックグラ
ウンドを減少させて高惑度のサンドインチ法による核酸
の測定法を提供することにある． 〔課題を解決するための手段〕 本発明は以下の（Ａ）、（Ｂ）および （Ｃ）工程を包含することを特徴とする高感度特異的核
酸の測定法である。

工程（Ａ）：　被検液中の測定すべき特異的核酸と２種
以上のプローブを反応せしめ担体上にプローブと測定す
べき核酸からなる複合体を結合せしめる工程． 工程（Ｂ）：　担体から前記複合体を含む成分を解離さ
せる工程． 工程（Ｃ）＝　Ｉｇ成分量を測定する工程．以下、本発
明について工程順に従い、説明する．工　（Ａ）につい
て 本工程は被検液中の測定すべき特異的核酸とブローブと
を反応せしめ、担体上に核酸一ブロープ複合体を結合せ
しめる工程である。

被検液としては、たとえば、血清、血漿、髄液、裸等の
体液、測定すべき核酸を含む緩衝液が挙げられる．測定
すべき特異的核酸としては、実質上、従来の核酸ブロー
プ法で測定し得たすべての特異的ＤＮＡ　（ＲＮＡ）が
挙げられる． 例を挙げれば、■血友病Ａ型、血友病Ｂ型、フェニルケ
トン尿症、α．−アンチトリブシン欠損症、鎌型赤血球
症、家族性アミ口イドボリニューロパチー、およびハン
チントン病等の遺伝子疾患のＤＮＡ　　■ＥＢウィルス
、アデノウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、ＨＩＶ、マイコ
プラズマ、レジオネラ、およびクラミジア等のウィルス
・微住物のＤＮＡ　　■神経芽細胞腫のＮ−１１ＶＣ％
パーキットリンパ腫のＣ−ｍｙｃ等の癌疾患のＤＮＡ　
　■心疾患におけるＬＤＬレセプター、アボＡ−１，お
よびアボＣ−１１等のリスクファクターのＤＮＡ等があ
る． ブローブとは、測定すべき特異的核酸と相補的な核酸の
断片である．一般に１〜２　０　ｋｂ（キロ塩基）のも
のが用いられているが、合成オリゴヌクレオチドブロー
ブ（約２０〜５０ヌクレオチド）を用いることもできる
〔高橋、ＤＮＡプローブー技術と応用−、（株）シーエ
ムシー、１９８８年発行〕。これらのブローブは通常（
Ａ）以下の工程において、担体または標識との結合に関
与する官能基を１種または２種以上結合させて用いる。

ここでいう官能基とは、プロープに導入した特異的な結
合性を有する物質であり、抗原（ハプテンを含む）一抗
体、酵素一掃酵素等のアフィニティー結合物質対の一方
を用いる． 官能基としては、例えば、ジニトロフェニル基またはト
リニトロフェニル基等のハブテン、ビオチン、抗原、お
よび抗体等が挙げられる。特に分子量の小さい、ハブテ
ンやビオチン等が好ましい。これらは公知の方法により
、ブローブに導入できる．　ビオチン基に関しては、ラ
ンガー（Ｐ．Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ）　（プロシーディング
ス　オブ　ナシタナル　アカデミイオブ　サイエンス（
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｅａｄ．Ｓｃｉ．ＬＩＳＡ）第
７８巻、第６６３３頁（１９８１））　、フォスター（
＾．Ｃ．Ｆｏｓ　ｔｅｒ）他〔ヌクレイックアシズ　リ
サーチ（Ｎｕｃｌｅｔｃ　Ａｃｔｄａ　Ｒｅｓ．）第１
３巻、第７４５頁（１９８５）〕等、ジニトロフェニル
基に関しては、シュロイヤー（　Ｋ．Ｒ．Ｓｈｒｏｙｅ
ｒ　）　　（ジャーナルオブ　セル　バイオロジー（Ｊ
．Ｃ＠ｌｌ．　Ｂｉｏｌ．）第９７＠、第３７７ａ頁（
１９８３）　）等、参照のこと．また、官能基を結合さ
せる際、官能基とブローブの間に核酸−プローブ複合体
に影響を与えずに切断することができる結合を導入して
もよい．このような例として、−Ｓ−Ｓ−結合、ビオチ
ンーアビジン結合、および抗原（ハブテンを含む）一抗
体結合等が挙げられる． また、これらのプロープの一つは、工程（Ｃ）の測定の
際に利用されるｔｕｉを結合させて用いてもよい．　標
識としては免疫学的測定法において用いられるいずれの
物質でもよく、酵素、放射性物質、発光物質、蛍光物質
、および金属化合物等が挙げられる．　例えば、酵素で
は、ベルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカ
リホスファターゼ、放射性物質としては、りん（”Ｐ）
　、ヨウ素（ｔｇｓＩ）、水素（　”Ｈ）　、蛍光物質
としてはフルオレセインイソチオシアネート、発光物質
としては、アクリジウム塩、金属化合物としては、ユー
ロビウム（Ｅｕ’９等が好適である。　標識を結合させ
る方法としては、従来の核酸プロープ法における技術を
何れでも用いることができる．　酵素標識プローブに関
しては、レンツ（Ｍ．Ｒｅｎｚ）他〔ヌクレイックアン
ズ　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．
）第１２巻、第３４３５頁（１９８４）　）　，ヤブロ
ンスキー（Ｅ．Ｊａｂｌｏｎｓｋｉ）他〔ヌクレイック
アシズ　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅ
ｓ．）第１４巻、第６１１５頁（１９８６）　）　：蛍
光物質標識プロープに関しては、ルース（Ｊ　．　Ｒｕ
　ｔｈ）他（ディーエヌエ−（ＤＮＡ）第３１１，第１
２２頁（１９８４）　）　、ブロバー（Ｊ．　Ｐｒｏｂ
ｅｒ）他〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２３８巻、
第３３６頁（１９Ｂ？）　）等、公知の方法にて作成で
きる． これらの官能基、標識は、（Ａ）から（Ｃ）の工程に影
響を及ぼさないキャリアーを介在させてプロープに結合
させても良い．　キャリアーとしては、蛋白質や鎖状の
有機化合物、ポリヌクレオチド等が挙げられる．例とし
て、アル・ハキムら〔ヌクレイックアシズ　リサーチ（
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．）第１４＠、第
９９６５頁（１９８６）　）による、ＤＮＡプローブに
ヒストンＨ１、チトクロムＣおよびボリエチレンイミン
（分子量６０．０００）を介して、ビオチン分子を結合
させている報告がある．また、検体ＤＮＡとハイプリダ
イズしていない、ＤＮＡブローブの一端と相補的な塩基
配列を有するポリヌクレオチドを介して、ＤＮＡプロー
ブとビオチンを結合させているアーディア他（特開昭６
２−１８８９７０）の技術がある．プロープは少なくと
も２種以上作成し、測定の対象や目的により、最適の組
み合わせを任意に選択するが、代表例として下記のよう
な組み合わせが挙げられる． ■　プローブＡ一官能基 プローブＢ一標識 ■　プロープ八一官能基１ ブローブＢ一官能基２ ■　プロープＡ一官能基１ プローブＢ一官能基２ プロープＣ一標識 ■　ブローブＡ一官能基１、官能基２ １ローブＢ一標識 ■のように＋！識プロープをハイプリダイズさせる時に
用いない場合には、後に官能基の標識化を行う．その方
法については、工程（Ｃ）の項で述べる． 担休としては、従来サンドインチ法測定法において使用
されている物全てを使用しうる．例えば、ボリスチレン
、ポリアクリル、テフロン、紙、ガラス、アガロース等
の他、ニトロセルロース、ナイロンが挙げられる．また
、その形状はどのようなものであっても良い．担体は、
工程（Ａ）で形成される複合体を結合させるため、また
は、担体上で複合体を形成させるために反応基を結合さ
せておく．反応基は、プローブに結合された官能基と特
異的に結合するものならば、どのようなものでも良く、
例えば、官能基がジニトロフェニル基、トリニトロフェ
ニル基等のハプテンのときは、抗ハブテン抗体、　官能
基がビオチンのときは、アビジンまたはストレプトアビ
ジン、　官能基が抗原または抗体のときは、対応する抗
体または抗原が挙げられる。

反応基の担体への結合は、免疫学的測定における担体作
成の公知の方法で行われる。

また、反応基と担体の間に、核酸一プローブ複合体に影
響を与えずに切断することができる結合を導入してもよ
い．　このような例として、−Ｓ−Ｓ−結合、ビオチン
ーアビジン結合、および抗原（ハブテンを含む）一抗体
結合等が挙げられる。

工程（Ａ）は次の手順で行う． まず、被検液に２種以上のプロープを加えて、通常のＤ
ＮＡプローブ法で用いられる条件下、測定すべき核酸と
ブロープから構成される複合体を形成させる。反応は一
般には２０〜７５　’Ｃ，数時間〜数十時間、好ましく
は６５〜７２’Ｃ，１０〜２０時間行う。このようにし
て形成された核酸一プローブ複合体は免疫学的測定に通
常用いられる条件で、担体に結合させる．プローブと測
定すべき核酸を反応させ、核酸−プローブ複合体形成後
、担体と結合させる方法、または、プローブと測定すべ
き核酸と担体とを同時に加えて、核酸一プロープ複合体
形成を担体上で行わせる方法等がある．　後者は工程を
簡略にできるので望ましい． 担体上に複合体を結合させた後、一般には担体の洗浄を
行う．洗浄は免疫学的測定法で用いる公知の方法で行わ
れる． 工　（Ｂ）について 本工程はバックグラウンドの原因となる、担体に非特異
的に結合した標識ブローブ及び非特異的核酸から、核酸
−プロープ複合体を含む成分を選択的に分離する工程で
ある。

複合体の解離は下記のいずれかの結合を切断して行う． ？）官能基と反応基の結合 ２）官能基とプロープの結合 ３｝反応基と担体の結合 核酸−ブローブ複合体に影響を与えずに解離させる好ま
しい方法は、　■上記の結合に関与する結合物質対にお
いて、一方の物質と置換しうる反応部位を有する物質を
加えること、■還元剤または酸化剤を加えること、等で
ある．　具体的には、結合がジニトロフエニル基または
トリニトロフエニル基等のハブテンー抗ハブテン抗体の
ときには、ジニトロフェニルアミノ酸（例：ジニトロフ
エニルリジン）、ビオチン■アビジンまたはストレプト
アビジンのときには、ビオチンを添加する．　結合が−
Ｓ−Ｓ一である場合、一Ｓ−Ｓ−を切断する試薬、例え
ば２−メルカプトエタノール等を用いる。

工王（Ｃ）について 工程（Ｂ）で解離された核酸一ブロープ複合体を含む成
分を定量する工程である。

解離された該成分はそのまま溶液状態で定量しても良く
、また他の担体に結合させ、洗浄後定量しても良い。こ
の他の担体への結合は公知の材料、方法にて行うことが
できる。

そして、免疫学的測定に通常用いられる方法で定量する
。測定法の例として、放射性同位元素、酵素、蛍光物質
等を用いた方法が、臨床病理（（Ｔｈｅ　Ｊａｐａｎｅ
ｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＣＩｉｎｉｃａｌＰａｔ
ｈｏｌｏｇｙ）、臨時増刊特集第５３号、昭和５８年２
月２８日発行〕に総括されている。

解離された核酸−プローブ複合体を含む成分を測定する
には、該成分中の標識を用いる．従って、工程（Ａ）の
項で記載したように、標識プローブを工程（Ａ）のハイ
ブリダイゼーションに用いない場合は、後の工程で反応
基を結合させた標識を加え、核酸−プローブ複合体上の
官能基に結合させて標識化を行う。

ここで用いる反応基と官能基は、工程（Ａ）で担体と核
酸−プローブ複合体との結合に用いる様なアフィニティ
結合物質対であり、強い結合性を有するものが好ましい
。例としてアビジンービオチンが挙げられる。反応基と
結合させた標識は当分野で公知の方法により作成される
。標識と官能基及び反応基の選択は任意であるが、標識
化に用いる反応基一官能基は、担体と核酸−プロープ複
合体の結合に関与している反応基一官能基とは異なるも
のを選ぶ．また、担体との結合に関与しているプロープ
には標識を導入しない。

標識化する時点は任意であるが、溶液状態で定量する場
合は、担体から核酸−プローブ複合体を最終的に解離す
る前に行う。また、他の担体上で定量する場合は最終的
な担体洗浄の前の適切な時点を選んで行う． 例を挙げれば、■工程（Ａ＞の核酸一プローブ複合体形
成後■工程（Ｂ）の複合体解離前■工程（Ｃ）の他の担
体への複合体結合後、等である。

このハイプリダイゼーション終了後に標識を導入する方
法は、特に酵素で標識する場合に好ましい。一般に酵素
の分子量は大きいため、酵素標識ブロープを用いた場合
、各プロープと、測定すべき核酸とのハイプリダゼーシ
ョンが阻害されるかも知れないからである．以上説明し
たように、本発明は従来の核酸サンドイッチ法における
バックグラウンドの原因であった、担体に非特異的に結
合する標識プローブおよび非特異的核酸を除くことによ
り、より高感度に特異的核酸を定量しうる測定法を提供
するものである。

以下、本発明を実施例に即して説明するがもとより、こ
れに限られるものではない．実施例　Ｉ ＤＮＡ　　びプローブ　ＤＮＡの 測定の検体モデル用ＤＮＡ及びそれの一部分と相補的な
配列をもつ二種のブロープ用ＤＮＡは、全自動ＤＮＡ合
成機ＭＯＤ［！Ｌ　３８１Ａ　（アブライド・バイオシ
ステム、カルフォルニア州）を用い、同社の操作手引書
に従い、公知の方法（Ｍ．０．マツーシ（Ｍ．Ｄ．Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｉ）ら、ジャーナルオブ　アメリカン　ケ
ミカル　ソサイエティ（Ｊ．＾ｍ．ｃｈｅｍ．ｓｏｃ．
）第１０３巻．第３１８５頁（１９８１）　）で合成し
た．　合成後、１５０シリーズセパレーシッンシステム
（アプライド・バイオシステム）を用い、逆相の高速液
体クロマトグラフィーにより精製を行った。

上記の方法で調製した各ＤＮＡの塩基配列を以下に示す
． 検体ＤＮＡ（５１塩基） ３′９。−ＡＣＧＴＴＧＣＣＧＣ　　ＣＣＣＧＣＣＧＣ
ＣＧ　ＣＣＴＧＴＣＧＣＴＧ＾ＧＣＴＣＧＧＡＣＣ　Ｔ
ＧＣＴＣＧＧＣＡＣ　Ｇ一。％ＪブローブＤＮＡ−２　
　１０＃ｇ（１．５ｎｍｏｌｅ）に対してＣｒ−”Ｐ）
アデノシン３リン酸（アマシャム・ジャパン、東京）　
２０ｎｍｏｌｅ　（　５μＣｉ／ｎｍｏｌｅ）及びＴ４
ポリヌクレオチド・キナーゼ（東洋紡．大阪）８０単位
を用い、公知方法（Ｃ．Ｃ．リチャードソン（Ｃ．Ｃ．
　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）　、プロシーディングス　オ
ブ　ナショナル　ア力デミイオプ　サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．υ，Ｓ６Ａ．）第５
４巻．第１５８頁（１９６５）　）で、５′末端を３２
ｐ標識した。次いでＰＤ−１０カラム（ファルマシア、
ウプサラ、スウェーデン）を用いて０．１５Ｍ塩化ナト
リウムおよびＩ　ｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡを含む０．　１　Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液でゲルろ過を行った後、７０％
エタノールで沈澱させて、プローブを精製した。

ビオチニルーＤＮＡプロープの プロープＤＮＡ−１　　１０４ｇ　（１．５ｎｍｏｌｅ
）に対して、アデノシン３リン酸（ファルマシア、ウプ
サラ、スウェーデン）　８０ｒｕ＋＋ｏｌｅ及びＴ４ボ
リヌクレオチドキナーゼ８０単位を用い、公知の方法（
Ｃ．Ｃ．リチャードソン（Ｃ．Ｃ．　Ｒｉｃｈａｒｄｓ
ｏｎ）、プロシーデインダス　オプ　ナショナル　ア力
デミイ　オブ　サイエンス（前出）〕で５′末端にリン
酸基を導入した．　次いでリン酸基の先にアミノ基を導
入し、Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルビオチンを結合さ
せる公知の方法［Ｃ．Ｆ．バーバラ（Ｃ．Ｆ．Ｂａｒｂ
ａｒａ）　ら、ディーエヌエ−（ＤＮＡ）　、第４巻、
第３２７頁（１９８５）　）に従ってブローブＤＮＡの
５′末端にビオチン分子を導入した．反応後、前述同様
ＰＤ−１０カラムによるゲルろ過及びエタノール沈澱に
よりプローブの精製を行った。

ｓｚｐの　・活　の測 各ポリスチレンボールに結合した３２Ｐ放射活性の測定
は、ポリスチレンボールをキシレン系液体シンチレータ
ＡＣＳｎ　（アマシャム・ジャパン、東京）５ｌｌｌを
含むミニバイアル中で激しく撹拌した後、液体シンチレ
ーションカウンター（バッカード、旧ＮＡＸＩ　ＴＲＩ
〜ＣＡＲＢ　４０００）を用いて５分間計測で行った。

（１１　　ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アル
プミン）　ＩｇＧ不溶化固相の調製 ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）　
ＩｇＧ（生化学工業、東京）　４．２３ｇを溶解した０
．０１７５　Ｍ　　リン酸ナトリウム緩衝液（ａｌｌ６
．３）に　０．７４７　ｇの硫酸ナトリウムを少しずつ
加え、Ｏ℃　３０分間撹拌した１！ｔ　１０，０００　
ｘ　ｇで１５分間遠心した．沈澱を４．０ｍｌの０．０
１７５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．３）に溶解
し、同緩衝液で透析した後、ＤＥ−５２セルロース（ワ
ソトマン、ケント州、イギリス）カラム（１．６Ｘ８．
ＯＣＩｍｌ）を用いて、塩化ナトリウムの直線濃度勾配
による陰イオン交換クロマトグラフィーを行った．　Ｉ
ｇＧを含む分画を集め、０６１ｈリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ　　７．　０　）で透析した後１ｇＧ濃度を２
８０ｎｍにおける吸光係数１．５ｇ　−　１　，　ｌ　
，　ＣＩ１−　１から求め、０．１ｇ／ｊ！になるよう
に同緩衝液で希釈した。

次いで、この溶液を用いてポリスチレンボール〔直径３
．２ｍ（プレシジョン・プラスチックポール、シカゴ）
〕表面上に公知の方法〔石川ら、スカンジナビアン　ジ
ャーナル　オブ　イムノロジー（Ｓｃａｎｄ．Ｊ．　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．）第８巻（補７）第４３頁（１９７８）
　）で、物理的吸着により不溶化した． （２）　　ジニトロフェニルーアビジンの調製（１）メ
ルカプトサクシニルーアビジンのｊ屑製０．１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐ｝１７．５）に溶解したアビジン
Ｄ（ベクター社）１■にＳ−アセチルメルカブトーサク
シニックーアンハイドライド（ナカライテスク、京都）
を用いて、公知の方法〔石川ら、ジャーナル　オブ　イ
ムノアソセイ　（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）第４巻
、第２０９頁（１９８３）　）に従ってチオール基を導
入した．導入されたチオール基の数はアビジン１分子当
たり１３個であった． （　ｉｉ　）マレイミドージニトロフェニルーＬ−リジ
ンの調製 ５．５ｎｌｌ　　２．　　４−ジニトロフェニルーし−
リジン塩酸塩（東京化成，東京）を含む０．１ＭＩＪン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）　　１．７ｍｌと、
５．５ｍＭＮ−サクシニミジル−６−マレイミドヘキサ
ノエート（同仁化学，熊本）を溶解したＮ．Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド０．１７ｍｌとを３０℃で３０分反応さ
せた。

（　ｉｉｉ　）ジニトロフェニノレーアビジンの８周製
（ｉ）で調製したメルカプトサクシニルーアビジン０．
５４■を溶解した、５ｍＭＥＤＴ＾　（エチレンジアミ
ン四酢酸）を含む、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ６．　０　＞　　１．０ｍｌと（　ｉｉ　）で調製
したマレイミドージニト口フエニルーＬ−リジン溶液０
．４３ｍｌとを３０℃で３０分反応させた後、同緩衝液
に溶解した０．１ＭＮ−エチルマレイミド（ナカライテ
スク，京都）５μｌを加え３０℃で１５分保温した．反
応液をセファデフクスＧ一２５　（ファルマシア、スウ
ェーデン）カラム（１．ＯＸ３０ａｉ）を用い、０．１
Ｍ　リン酸ナトリウム緩衝液でゲルろ過を行った。アビ
ジン１分子当り導入されたジニトロフェニル基の数は７
個であった． （３）ジニトロフェニルーアビジン結合ウサギ（抗ジニ
トロフェニルーウシ血清アルブミン）■ｇＧ不溶化固相
の調製 （１）で調製したウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血
清アルプミン）　ＩｇＧ不溶化ポリスチレンボールを、
（２）で調製したジニトロフェニルアビジンを溶解した
（０．１　ｇ／ｊ！）　、０．１Ｍ塩化ナトリウムおよ
び０．　１％ウシ血清アルプミンを含む０．ＯＩＭリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　７．０）中で、３０℃１０
時間保温して反応させた。

ポリスチレンボールは、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．
１％ウシ血清アルブミンおよび０．１％アジ化ナトリウ
ムを含む０．ＯＩＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）中で保存した。

ビオチニルーウシ血　アルブミン　　　　　の且盟 （１）Ｎ−ビオチニル−２−メルカプトエチルアミンの
調製 Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルービオチン（ピアスケミ
カル．イリノイ州）に２−メルカプトエチルアミンを用
いて公知の方法〔石川ら、バイオケミカル　アンド　バ
イオフィジカルリサーチ　コミュニケーション（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ
．）、第１４７巻、第６４４頁（１９８７）〕でチオー
ル基を導入した。

（２）　　マレイミドーウシ血清アルブミンの調製ウシ
血清アルブミン（ナカライテスク、京都）にＮ−サクシ
ニミジル−６−マイレミドヘキサノエートを用い、公知
の方法〔橋田ら、ジャーナルオプ　アプライド　バイオ
ケミストリ−　（Ｊ．Ａｐｐｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．）
第６巻、第５６頁（１９８４）〕に従って　マレイミド
基を導入した．導入されたマレイミド基の数は、ウシ血
清アルブミン１分子当り１１個　であった。

《３）　　ビオチニルーウシ血清アルプミンの調製（２
）で調製したマレイミドーウシ血清アルプミン１０■を
溶解した５　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む０．　１　Ｍ　ＩＪ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　６．　０）　　２．　０
ａ＋ｌに｛１｝で調製したＮ−ビオチニル−２−メルカ
ブトエチルアミン溶液０．２２ｍｌを加え３０℃、３０
分反応させた。　反応後、Ｏ．ｌ？Ｉ２−メルカプトエ
チルアミンを熔解した５ｍＭ　！！ＤＴＡを含む０．１
Ｍ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐｌ＋　６。Ｏ　）　０
．０５ｍｌを加え、セファデソクスＧ−２５（ファルマ
シア、スウェーデン）カラム（　１．　０　Ｘ３０ＣＩ
Ｉ１）を用い、０．ＩＮリン酸ナトリウム緩衝液（ｐｌ
＋　７．　５　”）でゲルろ過を行った。ウシ血清アル
プミン１分子当りに導入されたビオチン分子は７個であ
った．（４）　　ビオチニルーウシ血清アルプミン不溶
化固相の調製 （３）で調製したビオチニルーウシ血清アルブミン溶液
（０．１ｇ／ｌ）を用いて、ポリスチレンボール〔直径
３．２■■（プレシジョン社、シカゴ）〕表面上に公知
の方法〔石川ら、スカンジナビアンジャーナル　オプ　
イムノロジー（前出）〕で、物理的吸着により不溶化し
た。

挟生旦凡人立皿足 種々の濃度に希釈した検体Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｎ＝６）　、
５ｎｇの３茸Ｐ標識ＤＮＡプローブ、５ｎｇのビオチニ
ルーＤＮＡブロープ、ｌｏＯｎｇのサケ精子の単鎖ＤＮ
Ａ、　０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡお
よび０．１％ウシ血清アルプミンを含む、０．１阿リン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　７．　０　）　０．　１５
ｍｌを６５℃、１６時間保温した。　室温に戻した後、
ジニトロフェニルーアビジン結合ウサギ（抗ジニトロフ
ェニルーウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化ポリスチ
レンポールを１個添加し、３０℃５時間反応させた。　
ボールを０．１５Ｍ塩化ナトリウム、Ｉ　ａ＋Ｍ　ＥＤ
ＴＡ及び０．　１％ウシ血清アルブミンを含む０．１Ｍ
　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）　　２ｍｌで
２回洗浄した後、１　５　０ｎｍｏｌｅのジニトロフヱ
ノールーし−リジン（東京化成工業、東京）を溶解した
、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び
０．１％ウシ血清アルブミンを含む０．１６リン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ　７．０）　０．１５ｍｌ中でビオ
チニルーウシ血清アルプミン不溶化ポリスチレンボール
１個とともに３０℃、２時間反応させた。　ジニトロフ
ェニルーアビジン結合ウサギ（抗ジニトロフェニル〜ウ
シ血清アルプミン）　ＩｇＧ不溶化ポリスチレンボール
を除去した後、さらに３０℃、３時間反応させた．ポリ
スチレンボールを上述と同様に洗浄した後、ポリスチレ
ンボールに結合した３！Ｐの放射活性を測定した。　結
果を第１図に示す。

比較例　１ 検体用およびプローブ用ＤＮＡの調製、固相の調製、お
よび放射活性の測定は実施例１の方法に従った。

穂淋』」シ眞（社）燵定 種々の濃度に希釈した検体Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｎ・６）、５
ｎｇの”ｐｉ！ｌｉＤＮＡプロープ、５ｎｇのビオチニ
ルーＤＮＡプローブ、１００ｎｇのサケ精子の単ｉｌｌ
　Ｄ　Ｎ　Ａ　，　０．１５Ｍ塩化ナトリウム１　ｍＭ
　ＥＤＴＡおよび０．　１％ウシ血清アルブミンを含む
、０。Ｉ台リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　７．　０　
）　０．　１５ｍｌを６５℃、１６時間保温した．　室
温に戻した後、ジニトロフェニルーアビジン結合ウサギ
（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ
不溶化ポリスチレンボールを１個添加し、３０℃で５時
間反応させた。　ポリスチレンボールを０．１５Ｍ塩化
ナトリウム、１　ｍＭ　　ＥＤＴＡ及び０．１％ウシ血
清アルブミンを含む０．　１　Ｍ　リン酸ナトリウム緩
衝液（ａｌｌ　７．０）　　２ｍｌで２回洗浄した後、
ポリスチレンボールに結合した３ｔｐの放射活性を測定
した．　結果を第１図に示す。

本発明による実施例の測定限界は１　０ｐｇ　（０．５
　ｆｍｏｌｅ）であった．　従来法である比較例に比し
て、バックグラウンドが約１／８に減少し、３倍の感度
向上が認められた． 実施例　２ 検体用ＤＮＡ及びプローブ用ＤＮＡの調製、ａｌｐ標識
ＤＮＡプローブの調製、及び　ウサギ（抗ジニトロフェ
ニルーウシ血清アルプミン）ＩｇＧ不溶化固相の調製は
実施例１の方法に従った． ジニトロフエニルーＤ　Ｎ　Ａ　７”ロープの（ｌ）５
゜−アミノヘキシルホスヰールアミデート−ＤＮＡの調
製 ブローブＤＮＡ−１　　１０４ｇ　（１．５ｒ＋ｍｏｌ
ｅ）に対して、アデノシン３リン酸（ファルマシア、ウ
プサラ、スウェーデン）　８０ｎｍｏｌｅ及びＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ８０単位を用い、公知の方法（Ｃ
．Ｃ．リチャードソン（Ｃ．Ｃ．　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏ
ｎ）　、プロシーデインダス　オプ　ナショナル　アカ
デミイ　オブ　サイエンス（前出））で５′末端にリン
酸基を導入した。　次いで、０．１Ｍ　　イミダゾール
ー塩酸緩衝液（ｐＨ　６．０）中で、１−エチル−３．
３−ジメチルアミノブロピルカルボジイミド（ナカライ
テスク、京都）により導入したリン酸基に　イミド基を
結合させた後、１．６−ジアミノヘキサン（ナカライテ
スク）を反応させる公知の方法（Ａ，　コレソト　（Ａ
．Ｃｈｏｌｌｅｔ）ら、ヌクレインクアシズ　リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．）、第１３巻
、第１５２９頁（１９８５）］に従って、５末端にアミ
ノ基を導入した。

（２）　　サクシニミジル−２．４−ジニトロフエニル
−ξ一カプロン酸の合成 ２．４−ジニトロフェニルーξ一カプロン酸（シグマ社
、ミズーリ州）と、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（和光
純薬工業、大阪）をジクロ口力ルポジイミド（和光純薬
工業）により縮合される公知の方法（Ｆ．レビ・シエー
ファ−（Ｆ．ｌｅｖｉ−ｓｃｈａｆｆｅｒ）ら、アメリ
カン　ジャーナルオプ　トロピカル　メディスン　アン
ド　ハイジーン（八ｍ．　Ｊ．　Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈ
ｙｇ．、第３２巻、第３４３頁（１９８３）　）により
サクシニミジル−２４−ジニトロフエニルーξ一カプロ
ン酸ヲ合成した。次いで、シリカゲル（４０ｇ）カラム
を用い、クロロホルム／メタノール（４０／１（Ｖ／Ｖ
）　）の系で精製を行った後、ＮＭＲ　（核磁気共鳴法
）および質量スペクトル法により構造を確認した。

（３）　　ジニトロフエニルーＤＮＡプローブの調製（
１）で調製した５′−アミノへキシルホスホールアミデ
ートーＤ　Ｎ　Ａ　　１５０ｐｍｏｌｅを熔解した０．
０１Ｍ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）５０μｌ
に、（２）で調製したサクシニミジル−２，４−ジニト
ロフェニルーξ一カプロン酸５０ｎｍｏｌｅ　ヲ含むＮ
，Ｎ−ジメチルホルムアミド５０μｌを加え、２０℃、
２０時間反応させた。反応後ＲＰＣ−５カラム（アプラ
イド・バイオシステム　）を用いる公知の方法（Ｒ．Ｌ
．ピアソン（Ｒ．Ｌ．Ｐｅａｓｏｎ）ら、パイオケミカ
ル　エト　バイオフィジカ　アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．
　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ）　、第２２８巻、第７
７０頁（１９７１）　）で高速液体クロマトグラフィー
を行って未反応ＤＮＡを除き、さらにエタノール沈澱に
よりブロープを精製した。

３ｔｐの　・ゞ性の測 反応溶液中に含まれるｓｉｐ放射活性の測定は、反応溶
液全量（１５０μ１）をキシレン系液体シンチレークＡ
ＣＳＨ　（アマシャム・ジャパン、東京）５ｍｌを含む
ミニバイアル中で激しく攪拌した後、液体シンチレーシ
ョンカウンター（バンカード、旧ＮＡＸＩ　ＴＲＩ−Ｃ
ＡＲＢ　４０００）を用いて５分間計測で行った。

枚婆旦凡人二遠足 種々の濃度に希釈した検体Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｎ＝６）　、
２ｎｇの′３２Ｐ標識ＤＮＡプローブ、２ｎｇのジニト
ロフェニルーＤＮＡプローブ、ＩＱＯｎｇのサケ糟子の
単鎖ＤＮＡ，　　０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ　
ＥＤ丁Ａおよび０．１％ウシ血清アルブミンを含む、０
．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　７．　０）　，
０．１５ｍ１を６５℃、１６時間保温した。　室温に戻
した後、ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルプ
ミン）　ＩｇＧ不溶化ポリスチレンボールを１個添加し
、３０℃、５時間反応させた。　ボールを０．　１５Ｍ
塩化ナトリウム、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．１％ウシ
血清アルブミンを含む０．１ｉリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ　７．０）　　２ｍｌで２回洗浄した後、１　５
　０ｒ＋ｍｏｌｅのジニトロフエノールーしリジン（東
京化成工業、東京）を溶解した、０．　１５Ｍ塩化ナト
リウム、１　ｍＭ　ＥＤＴ八及び０．１％ウシ血清アル
プミンを含む０．　１　Ｍ　リン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ　７．　０　）　０．１５ｍｌ中で３０℃、２時間
反応させた。

反応後溶液１５０μｌ全量をとり、標識ＤＮＡプロープ
の３ｚＰ放射活性を測定した。　結果を第２図に示す。

比較例　２ 検体用ＤＮＡ，ジニトロフエニルＤＮＡプロープ、ツ２
Ｐ標１１ＤＮＡプローブおよびウサギ（抗ジニトロフェ
ニルーウシ血清アルブミン）■ｇＧ不溶化固相の調製は
実施例１の方法に従った．３ｔｐ　　・活　の測 各ポリエスチレンボールに結合した３２Ｐ標識ＤＮＡプ
ロープの放射活性の測定は、ポリスチレンボールを液体
シンチレータを含むミニバイアルに入れ、実施例と同様
の条件で計測を行った。

艙淋』ひレ口填乳定 種々の濃度に希釈した検体Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｎ＝６）　、
２ｎｇの０Ｐ標識ＤＮＡブローブ、２ｎｇのジニトロフ
ェニルーＤＮＡプローブ、１００ｎｇのサケ精子の単鎖
ＤＮＡ，０．１５Ｍ塩化ナトリウム−１ｍＭＥＤＴＡお
よび０．１％ウシ血清アルプミンを含む、０．１阿リン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　７．０）　０．１５ｍｌを
６５℃、１６時間保温した．　室温に戻した後、ウサギ
（抗ジニトロフエニルーウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ
不溶化ポリスチレンボールを１個添加し、３０℃で５時
間反応させた．　ポリスチレンボールを０．１５Ｍ塩化
ナトリウム、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ及び０．１％ウシ血清
アルプミンを含む０．１Ｍ　リン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ　７．０）　　２ｍｌで２回洗浄した後、ポリスチ
レンボールに結合した２Ｚｐの放射活性を測定した。　
結果を第２図に示す。

本発明による実施例の測定限界は０．９ｐｇ　（５０ａ
ｍｏｌｅ　＝５　ｘ　１０−１７ａ＋ｏｌｅ）であった
。従来法である比較例に比して、バックグラウンドが約
１／３に減少し、３倍の感度向上が認められた。

〔効果〕

以上、説明したように、本発明は従来サンドインチ法で
測定しえた核酸を、より高感度に測定しうる方法を提供
するものである．

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、本発明の実施例、及び比較例のＤ
ＮＡ測定における検量線である。横軸は、測定対象のＤ
ＮＡ量、縦軸に測定値Ｃ２Ｐ放射活性）を示した。 特許出願人　石川　栄治（ほか１名）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）工程を包含す
   ることを特徴とする特異的核酸の の測定法。 工程（Ａ）：被検液中の測定すべき特異的 核酸と２種以上のプローブを反応せしめ 担体上にプローブと測定すべき核酸から なる複合体を結合せしめる工程。 工程（Ｂ）：担体から前記複合体を含む成 分を解離させる工程。 工程（Ｃ）：該成分量を測定する工程。