JPH01148963A - 抗体のサンドイッチイムノアッセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、コーティング抗原または標識抗原を用いた、
抗体の検出のためのサンドイッチイムノアッセイを行う
ための方法に関する。この場合、″コーティング抗原お
よび標識抗原は遺伝的に関連性を有さない生物（「異種
生物」）から産生されたものである。さらに詳しくは、
本発明は、哺乳動物流体または組織中のある種の抗原（
「Ｘ」）に対する抗体を検出するための固相法および装
置に関するものであり、その際、検出しようとする抗体
は、固相に結合した抗原ｒＸＪと、異種生物に由来し標
識を結合させた抗原ｒＸＪまたはその共通のエピトープ
との間にサンドイッチにはさまれる。本発明の方法およ
び装置は、医師または獣医師が、患者が特定の生物また
は抗原に対し免疫応答を有するか否かを速やかにかつ特
異的に決定することができ、それによってその生物また
は抗原に過去もしくは現在にさらされていることを示す
ことができるので、試験所医学に有用である。とりわけ
本発明の方法および装置は、後天性免疫不全症候群（Ａ
ＩＤＳ）と関連するＨＴＬＶＩＩＩ［に対する免疫応答
、従ってそれへの接触を速やかにかつ特異的に検出する
のに有用である。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）抗体
の検出のためのたいていのイムノアッセイでは、抗原で
コーティングした固相を、該コーティング抗原に特異的
な抗体を捕捉するために用いている。捕捉した抗体は、
ついで酵素や放射性同位体のような検出システムが結合
した抗抗体を用いて定量および／または同定する。

第二のタイプのイムノアッセイもまた抗原でコーティン
グした固相を用い、抗原特異的抗体を捕捉する。しかし
ながら、第一のタイプのイムノアッセイと違って、この
第二のタイプのイムノアッセイは、検出システムとして
働く放射標識や酵素と交差反応する抗原を用いて定量お
よび／または同定を行う。この第二のタイプのイムノア
ッセイにおいて、ビーズにコーティングした抗原と標識
を有する抗原とは共に同一であり、同じ生物（源）に由
来するものであり、同じ汚染物質を含んでいる。

以下の記載において、同じ生物または関連種から得られ
た抗原は「同種」抗原と称することにする。

たとえば、ＨＴＬＶＤＩに対する抗体（抗ＨＴＬＶＩＩ
Ｉ）を検出するために現在行なわれているイムノアッセ
イでは広範囲の試料希釈を必要とし、固相をコーティン
グするためにヒトＨ９細胞株から精製したウィルスを用
い、最後に非特異的プローブを用いる（たとえば抗ヒト
ＩｇＧ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）に結
合）。これらのイムノアッセイにおいては、粉砕ウィル
スでコーティングした固相に未知の試料を接触させて抗
ＨＴＬｖ■の存在に関しスクリーニングする。ＨＴＬＶ
■に対する抗体は、ついでウィルスをコーティングした
固相１こ結合する。粉砕ウィルスは多くの抗原を生じさ
せ、これらが固相上にコーティングされるので、試料中
の抗体のうち粉砕ウィルス調製物中の汚染物質に対して
反応性のものすべてもまたコーティング固相に結合する
であろう。−担抗体が固相に結合すると、プローブとし
て標識抗体（第一のタイプのイムノアッセイ）を用いよ
うが標識同種抗原（第二のタイプのイムノアッセイ）を
用いようが、有為の数の「過誤の陽性」を生じてしまう
であろう。

従って、本発明の目的は、特異性を有する、すなわち上
記「過誤の陽性」の問題を克服した、抗ＨＴＬＶＩＩＩ
Ｉを検出および／または定量するためのイムノアッセイ
法および装置を提供することにある。

イムノアッセイとは違って、特異性の問題の幾つかを克
服する競合結合アッセイが存在する。たとえば、抗ＨＴ
ＬＶＩＩＩＩについての競合タンパク質結合アッセイで
は組換え抗原を用い、ＨＴＬＶＩＩＩＩエンベロープ（
ＥＮＶ）抗原およびＨＴＬ、ＶＩ［Ｉ：Ｉア抗原に対す
る抗体を互いに区別することができる。

しかしながら、この方法は時間がかかり、一般に一晩か
かって行なわれる。しかも、これには２つの固相、すな
わちｐ４１エンベロープ抗ＷＸをコーティングしたビー
ズおよびｐ２４コア抗原をコーティングしたビーズが必
要である。

従って、本発明の目的とするところは、アッセイが速や
かに行なわれるのみならず、２つの固相を必要とするこ
となく競合結合アッセイの特異性をも有する、抗ＨＴＬ
ＶＩＩＩに対するイムノアッセイを提供することである
。

（課題を解決するための手段） 本発明は、試験試料中の特定の抗原に対する抗体を検出
するためのサンドイッチイムノアッセイを行う方法であ
って、検出しようとする抗体に特異的な第一の抗原を固
相上に固定化し、試験試料中の検出しようとする抗体を
該第一の抗原に結合させることによって固定化し、さら
に該固定化された抗体を標識を有する第二の抗原と結合
させる際に、該第一の抗原と該第二の抗原とが同一源に
由来するものである方法において、第二の抗原を第一の
抗原とは異なる由来とすることを特徴とする方法に関す
る。

とりわけ本発明は、試験試料中の抗原特異的抗体の検出
方法であって、 （ａ）検出しようとする抗体に特異的な第一の組換え体
由来抗原を固相上に固定化し、 （ｂ）工程（ａ）で得た固相を、抗原特異的抗体を含ん
でいるかまたは含んでいると思われる水相試験試料と接
触させ、 （ｃ）工程（ｂ）で得た固相を、今度は標識を付着した
第二の組換え体由来抗原番含む水相と接触させ、その際
、第二の組換え体由来抗原は第一の組換え体由来抗原と
は異なる由来とし、 （ｄ）水相を固相から分離させ、ついで（ｅ）固相上ま
たは液相中に存在する標識を測定して試験試料中に存在
する抗体を検出および／または滴定する ことを特徴とする方法に関する。

さらに本発明は、記載した方法および装置の変更にも関
するものであって、コーティング抗原と標識抗原とは異
種源に由来するものであるが、少な（とも１個の抗原決
定基（「エピトープ」）を共通に有している限り必ずし
も同一であることを必要としないものに関する。

（発明の構成および効果） 本発明は、生物学酌流体を含む試験試料中の抗原特異的
抗体を検出するためのイムノアッセイを行う方法に関す
る。

本明細書にいう「イムノアッセイ」とは、最終的に標識
に結合した分析対象物の量を直接測定することにより分
析対象物を検出または定量する方法を意味する。このイ
ムノアッセイは、競合タンパク質アッセイとは区別され
なければならず、後者では、分析対象物の検出または定
量が、生物学的流体からの非標識分析対象物により結合
部位から競合的に置換された標識分析対象物の量に関係
付けられる。

本明細書において「生物学的流体」とは、全血、血清、
血漿、尿、だ液、髄液（Ｃ８Ｆ）、羊水、組織抽出物お
よびそれらの希釈物または濃縮物などのような哺乳動物
に由来する流体をいう。

本発明のイムノアッセイ装置および方法では固相および
標識の両方を用いる。

本明細書において「固相」とは、抗原を共有結合手段ま
たは非共有結合手段により付着させることのできる表面
を有するすべての非溶液相物質をいう。共有結合手段に
よる付着は、一般に、（ｉ）臭化シアンなどのハロゲン
化シアンや（ｉｉ）ゲルタールアルデヒドを用いること
によるような、技術の分野でよく知られた試薬を用いた
付着手段をいう。

非共有結合手段による付着とは、吸収または吸着をいう
。いかなる非共有結合手段で抗原を付着させることも本
発明の範囲に含まれるものであるが、とりわけ本発明の
抗原を本発明の固相に吸着により付着させることが好ま
しい。

本発明に用いることのできる固相の例としては、プラス
チック、ガラスまたはラテックスの微粒子またはビーズ
；プラスチックまたはガラスの試験管；セルロースまた
は修飾セルロース物ｆｆｌ；カラスまたはプラスチック
の繊維状物質などが挙げられる。固相物質として特に適
したプラスチックの例はポリスチレンである。固相は、
試験管、マイクロタイターウェルなどのような反応容器
中に適合するに充分な大きさを有するポリスチレンピー
ズであるのが最も好ましい。

本明細書において「標識」とは、シグナルを生じること
ができるか、または検出可能な分子種を生じるように他
の分子に対し挙動することのできるものであれば、抗原
に結合したいかなる分子または元素同位体をもいうもの
とする。「シグナルを生じることができる」分子とは、
Ｉ！Ｉｌｌなどの放射性同位体、フルオレセイン、フル
オレセイン類似体、フルオレセイン誘導体、フィコビワ
ンタンパク質、ウンベリフェロン、およびウンベリフェ
ロン類似体および誘導体などの蛍光物質をいう。「検出
可能な分子種を生じるように他の分子に対し挙動するこ
とのできる」分子とは、技術の分野で知られた種々の酵
素をいい、基質に直接作用するか、または基質に作用す
る他の酵素と共役して発色団、すなわち器具によりまた
は視覚により検出することができる蛍光分子を生じる。

本明細書において「発色団」とは、電磁スペクトルにお
いて約３４０ｎｍ〜約７２ＯｎＩ１１に吸収ピークを有
する分子をいう。

本明細書において好ましい標識は、放射性同位体および
酵素である。とりわけ放射性同位体の１１１１１を標識
として用いるのが好ましい。

本明細書において「プローブ」とは、抗体が結合するこ
とができ、化学的方法もしくは組換え技術により標識を
共有結合的にイず着させた異種の抗原、エピトープまた
はハブテンをいう。

本発明のイムノアッセイは、２工程手順かまたは１工程
手順で行うことができる。

２工程手順においては、第一の工程は、一つの源に由来
する抗原をコーティングした固相を、該抗原に対する未
知の量の抗体を含有する水相試験試料とともにインキュ
ベートすることからなる。

該抗原に対する抗体は、その２個の結合部位のうちの一
つを介してコーティング抗原に結合し、固相の一部（「
固相抗体」）となる。第二の工程では固相をまず洗浄し
、ついで標識抗原を含有する水相とともにインキュベー
トする。その場合、標識抗原は、固相をコーティングし
ている抗原とは異種の源に由来するものである。インキ
ュベートの間に異種源に由来する標識抗原（プローブ）
は、抗体の第二の抗原結合部位を介して水相から固相に
捕捉される。その後、水相中の未反応試薬と固相とを分
離する。標識の存在は、固相中かまたは液相中かで任意
に測定する。試験試料中に存在する抗体の量は、固相に
結合した標識抗原の量および水相中に残っている標識抗
原の量の両方に数学的に関連付けられる。しかしながら
、試験試料中の抗体の存在または量を決定するのに固相
を利用するのが好ましい。

本明細書において「水相」とは、抗原のビーズへの結合
または抗体の抗原への結合に悪影響を与えない有機液体
とバランスを保ちながら約５０％〜約１００％の水を含
有する液相をいう。そのような有機液体としては、低分
子量アルコール、ポリエチレングリコール、ジメチルホ
ルムアミドなどが挙げられる。

１工程手順は、一つの源に由来する抗原をコーティング
したビーズ、試験試料および異種の源に由来する標識抗
原を同時に加えることからなる。

一定のインキュベーション時間を測定した後、固相と未
反応試薬とを分離し、上記２工程手順で説明したように
して測定を行う。

本発明のアッセイでは、検出しようとする抗体に特異的
な抗原のみが反応して抗原−抗体−抗原サンドイッチを
形成し、そのことにより高度の特異性を有するイムノア
ッセイが可能となる。さらに詳しくは、サンドイッチの
全体は固相−抗原一抗体一異種抗原一標識からなる。本
発明のイムノアッセイ装置および方法は、固相に付着さ
せる抗原とプローブ（標識抗原）とが同一源に由来する
従来のサンドイッチイムノアッセイよりも特異性が優れ
ている。とりわけ、単一の源（生物）から精製した抗原
は該生物からの痕跡量の汚染物質を含んでおり、これが
アッセイ中にイムノアッセイの固相に結合したり組み込
まれたりする。これらの固相汚染物質はさらに、試験試
料中に存在するかもしれない該汚染物質に対する抗体を
結合させることができる。しかしながら、同じ抗原を異
種源（生物）からｉｈ製しプローブとして標識したとき
には、異なる種類の汚染物質が含まれることになる。従
って、異種抗原とその１組の汚染物質を標識したときに
は、固相に結合した第一の汚染物質に対する抗体は標識
汚染物質と結合して過誤の陽性を生じることはないであ
ろう。両方の生物に共通した抗原それ自身のみが、抗原
−抗体−異種抗原サンドイッチを形成することができる
。従って、標識抗原のみが固相抗体に結合することがで
き、真の陽性の結果をもたらす。それゆえ、このことが
本発明のイムノアッセイ法に特異性を付与するのであり
、従来技術によって記載されたようなイムノアッセイ法
によっては達成しえないものである。

本発明の装置および方法幌生物学的流体中のいかなる抗
体をも検出および／または滴定するのに用いることがで
きるものであるが、本発明は、ＨＴＬＶＩＩＩ［のｐ４
１エンベロープ抗原に対する抗体、ＢＬ’肝炎表面抗原
（ＨｂｓＡｇ）に対する抗体、またはＢ型肝炎コア抗原
（ＨｂｃＡｇ）に対する抗体を検出または滴定するのに
用いるのが好ましい。本発明の装置および方法は、ＨＴ
ＬＶＩＩＩＩのｐ４１抗原に対する抗体を検出および／
または滴定するのに用いるのが最も好ましい。これはＨ
ＴＬＶＩＩＩに感染した個体における第一の、そして最
も普遍的な抗体応答であると信じられている。

ｐ４１抗原のような純粋な抗原を調製するために一層好
ましい方法は、組換えＤＮＡ技術によるものである。組
換えＤＮＡ技術における第一の工程は、所望のｐ４１抗
原をフードしている一定の長さのｃＤＮＡを得ることで
ある。このための一つの方法は、ＨＴＬＶＩＩＩ［ウィ
ルスからｍＲＮＡを単離し、インビトロで逆転写酵素を
用いて所望のｐ４１抗原をコードしているｃＤＮＡを得
ることである。

別法として、ＤＮＡを化学的に合成することもできる。

多数のオリゴヌクレオチドを製造することができ、これ
からＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼを用いて
所望のｃＤＮＡを合成的に構成することができる。いず
れの末端を制限エンドヌクレアーゼで消化しても、プラ
スミド中へ挿入するための適当な粘着制限部位を得るこ
とができる。

上記合成りＮＡまたはｃＤＮＡは、制限エンドヌクレア
ーゼにより、またはオリゴｄＣのような適当なヌクレオ
チドおよび末端トランスフェラーゼを用いることにより
、末端にテール（粘着端を備えている）を付すことがで
きる。

いかなるテーリング法をも用いることができ、ついでｐ
Ｕ　Ｃ−９（ファルマシア社、ピスカタウエー、ニニー
ジャージー）のようなプラスミドを採ってきてＰｓｔｌ
（シグマ・ケミカル社、セントルイス、ＭＯ）のような
制限エンドヌクレアーゼにより単一部位で開裂させるこ
とができる。開裂させたｐＵ　Ｃ−９は、所望のペプチ
ドをコードしているＤＮＡのオリゴｄＣテール断片に相
補的なオリゴｄＧのテールを付すことができる。開裂し
たプラスミドと抗原をコードしているＤＮＡとはアニー
ルし結合させることができる。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）
のような宿主細胞は、適当な組換えプラスミドとともに
インキユベートすることによりｐ４１抗原産生細胞に形
質転換することができる。どうして形質転換した大腸菌
宿主細胞は、ついでｐ４１抗原を大量に発現させるため
に適当な条件下で培養する。ｐ４１タンパク質の精製は
、実施例６に記載のようにして行うことができる。核酸
を含む種々の取り扱い方法は、マニアチス（Ｍａｎｉａ
ｔｉｇ）　ラのモレキユラー・クローニング、コールド
・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１３〜１７（１
９８２）に記載されている。

同様に、上記技術を利用して、ｃＤＮＡ断片を得ること
のできる他のあらゆるタンパク質または糖タンパク質を
発現させることができる。しかしながら、本発明の抗原
を提供するタンパク質または糖タンパク質として特に好
ましいのは以下のものである。ＨＴＬＶＩＩＩＩ（ＨＩ
Ｖとしても知られている）のｐ４１エンベロープタンパ
クＬ　ｐ４１コアタンパク質およびｇｐ１２０表面糖タ
ンパク質；表面抗原（ＨｂｓＡｇ）、コア抗原（Ｈｂｃ
Ａｇ）およびｅ抗原（ＨｂｅＡｇ）のようなり型肝炎ウ
ィルスの種々の抗原。これらのタンパク質の精製は、実
施例６に記載の技術を用いて行うことができる。

同様に、上記技術を利用して、ｐ４１のような抗原をコ
ードするＤＮＡを含有している適当な組換えプラスミド
を酵母に供することにより酵母を抗原産生生物に形質転
換することができ、これにより本発明の異種生物が提供
される。

本発明の抗原に適した異種生物の例としては、大腸菌お
よびパシラス・メガテリウムのような細菌、酵母、マウ
ス細胞株、およびＨ９のようなヒト細胞株［メッシング
（Ｍｅｓｓｉｎｇ）らのＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ
、＋　１０１．２０〜７８（１９８３）参照］が挙げら
れる。いかなる２種の生物により産生された抗原からも
本発明において充分な結果が得られるが、プラスチック
ビーズ上にコーティングするためのｐ４１抗原を産生ず
る生物としては酵母が、標識に結合させるためのｐ４１
抗原を産生させるための生物としては大腸菌が特に好ま
しい。

また固相上にコーティングされる抗原と標識に結合され
る抗原とは、両抗原が少なくとも１個の抗原決定基（「
エピトープ」）を共通に有しており、本発明の高度に特
異的な抗原−抗体−抗原サンドイッチを生成させること
ができる限り完全に同一でなくてもよい。

たとえばｐ４１抗原の場合には、ｐ４１の免疫優性ドメ
インおよび疎水性カルボキシル末端ドメインを含むよう
に完全なｐ４１抗原をクローニングし生物中で発現させ
ることができる。疎水性カルボキシル末端ドメインは、
固相に付着するのを能力を助長する。標識に用いるｐ４
１抗原は、ｐ４１抗原のアミノ末端側の半分だけからな
っていてよ（、疎水性の領域を欠いてはいるが免疫優性
ドメインは含んでいるので、抗体は両方のｐ４１抗原と
結合して本発明の高度に特異的な抗原−抗体−抗原サン
ドイッチを生成することができる。

プローブ中の抗原のエピトープ（すなわち標識に結合し
たエピトープ）もまた組換え技術により任意に発現させ
ることができる。同様に、本発明のエピトープを発現さ
せるために組換え技術を用いることができ、その際、エ
ピトープの発現は酵素標識をすでに付したままで行う。

本発明の他の応用例としては、組合わせアッセイを行う
ために同じ構成（ｃｏｎｆ　ｉｇｕｒａｔ　１ｏｎ）を
用いることが挙げられ、これは多数の抗原を同時に検出
するために、２またはそれ以上の抗原を固相上にコーテ
ィングし、異種源に由来する２またはそれ以上の抗原を
プローブとして用いるものである。

さらに本発明は１．高度に変異性のタンパク質の保存（
ｃｏｒ＋＋５ｅｒｖｅｄ）領域に対する抗体を試料が含
んでいるかどうかを決定するのに応用することができる
。たとえばＨＴＬＶＩＩＩからのｇｐ１２０は２つの距
離的に関連するＨＴＬＶＩＩＩ［株から精製することが
でき、一方の株からのｇｐ１２０は固相をコーティング
するのに用い、他方の株からのｇｐ１２０はプローブ、
すなわち標識抗原として用いる。

従って、本発明のイムノアッセイ法および装置は多くの
利点を有する。特に本発明のイムノアッセイは、異種抗
原を用いない従来のイムノアッセイよりも特異性が高い
。さらに本発明に記載したＨＴＬＶＩＩＩＩに対する抗
体を検出するためのイムノアッセイ法および装置は、標
識ヤギ抗ヒトＩｇＧ。

ＩｇＭまたはＩｇＡなどの比較的非特異的なプローブを
用いる従来のヒト抗ＨＴＬＶＩＩＩ［のためのイムノア
ッセイよりも実質的に特異性が高い。加えて本アッセイ
は簡単に行うことができる。さらに本発明の抗ＨＴＬＶ
ＩＩＩ［イムノアッセイでは、従来技術では必要とされ
た試験試料の１：ｌＯＯまたは１：４００倍希釈を必要
としない。

つぎに実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１（抗ｐ４１のための同位体２工程直接イムノア
ツセイ法） 本実施例では、放射性標識を用いた抗ｐ４１の検出のた
めの２工程直接イムノアツセイを行う。

放射性標識抗原を、グリーンウッド（Ｇ　ｒｅｅｎｖｏ
ｏｄ）らのＪ、Ｂｉｏｃｈｅｔ、８９：ｌ　１４〜１２
３（１９６３）に記載の方法１こ従って調製する。

ポリスチレンビーズ（１ｚ４インチ）を、リン酸バッフ
ァー（０，５μｖ／ｚ（１，ｐＨ７，０）中、４５℃で
２時間、酵母に由来し発現されたｐ４１抗原でコーティ
ングする。ついで未知の量の抗ｐ４１を含むヒト血清試
料（２００μのをビーズに加え、４０℃で２時間、水平
面でインキュベートする。

ビーズを脱イオン化水＜４１１０”）で３回洗浄する。

洗浄したビーズについでＩＩＪで標識した酵母由来ノｐ
４１抗原（２００μ（りを加え、４０℃で１時間インキ
１ベートす′る。ビーズを脱イオン化水（５ｚ（りで３
回洗浄し、ついで試験管に移してアボット・ラボラトリ
ーズ（ノース・シカゴ、イリノイ）により製作されたＡ
ＮＳＲガンマカウンターのようなガンマシンチレーショ
ンカウンター上で放射能をカウントする。血清試料中に
存在する抗ｐ４１の量が多ければ多いほど、検出される
放射性は太き（なる。

この同じイムノアッセイはまた、大腸菌に由来するｐ４
１でコーティングしたポリスチレンビーズを用いても行
うことができる。この方法を用いる場合、１′■で標識
した酵母由来ｐ４１を用いる。

両アッセイとも抗ｐ４１の検出のためにうまく機能する
。

実施例２（抗ｐ４１のための酵素２工程直接イムノアツ
セイ法） 本実施例では、酵素を用いた抗ｐ４１のための・　２工
程直接イムノアツセイを行う。西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ（ＨＲＰＯ）標識抗原を、ナカネ（Ｎａｋａｎｅ）
らのＪ　、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃ’ｈｅｍ
、　＋　２２　：　１０８４〜１０９１（１９７４）に
記載の方法に従って調製するか、またはｐ４１をビオチ
ン化し［ホフマン（Ｈｏｆｍａｎｎ、　Ｋ）らのＢ　ｉ
ｏｃｈｅｍ、　（１９８２）参照］、ＨＲＰＯで標識し
たウサギ抗ビオチンと反応させる。

ポリスチレンビーズを実施例１に記載したようにしてｐ
４１抗原（酵母由来）でコーティングする。

このビーズにヒト血清試料（２ｏＯμｇ）を加え、結合
させた固相および水相を４０℃で２時間、水平面でイン
キユベートする。ついでビーズを脱イオン化水（５ｘｆ
ｆ）”’：３回洗浄する。つぎに、直接またはビオチン
／抗ビオチンシステムを用いて西洋ワサビペルオキシダ
ーゼで標識したｐ４１抗原（大腸菌由来）（２００μの
をビーズに加え、ビーズを約４０℃で１時間インキュベ
ートする。ビーズを脱イオン化水（５酎）で３回洗浄し
、試験管に移して発色させる。試験管中のビーズには。

−フユニレンジアミン（ＯＰＤ）基質溶液［０−）ユニ
レンジアミン・８０１錠（１２，８ｙ）を含有、０．０
２％過酸化水素を含有する０、１Ｍクエン酸−リン酸バ
ッファー（ｐＨ５，５〜６．０Ｘ５ｘ（２）で希釈コ（
３００μのを加え、室温で３０分間インキュベートする
。その後、ＩＮ硫酸（１、０ＲＱ”）を試験管に加える
。生じた色を分光光度計上で読み取り、約４９２ｎｍ波
長での吸光度を測定する。試料中の抗ｐ４１の量が多く
なればなるほど、測定される吸光度は高（なる。

実施例１の同位体イムノアッセイでも指摘したように、
ｐ４１の一方が他方に対して異種の源である限り、本実
施例においてビーズのために選択されるｐ４１の源は、
標識のために選択されるｐ４１の源と逆にすることがで
きる。

実施例３（抗ｐ４１のための１工程アツセイ）本実施例
では、放射標識または酵素標識を用いた１工程アツセイ
を行う。

ポリスチレンビーズを実施例１記載のｐ４１（酵母由来
）でコーティングする。反応容器中のビーズにヒト血清
試料（１００μＱ）およびｔ＊ｓ■かまたは西洋ワサビ
ペルオキシダーゼで標識したｐ４１（大腸菌由来）（１
００μに）を加え、４０℃で約２時間インキニベーショ
ンを続ける。ついでビーズを脱イオン化水（５ｘＱ＞で
３回洗浄し、放射能をカウントするか（実施例１のごと
く）または発色させて４９２μｍでの吸光度を測定する
（実施例２のごとく）ために試験管に移す。

実施例４（抗ＨＢｓＡｇのための２工程直接イムノア・
ｙセイ法） 本実施例では、Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体のための
２工程直接イムノアツセイ法を詳述する。

本実施例では、ナカネ（Ｎａｋａｎｅ）らのＪ　、　Ｈ
ｉｓｔｏｃｈｅｍ、ｃｙｔｏｃｈｅａ、、２２：１０８
４〜１０９１（１９７４）に記載の方法により西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）を調製した。別法とし
てＨＢｓＡｇをヌゴー（Ｎｇｏ）らの方法によりビオチ
ン化し、ＨＲＰＯで標識した抗ビオチン（マウスモノク
ローナルまたはウサギポリクローナル）かまたはアビジ
ンと反応させることができる［ヌゴーらのＪ、Ａｐｐｌ
、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ　１ｏｔｅｃｈ、　＋　７
．４４３〜４５４（１９８２）参照］。ＨＲＰＯ標識ア
ビジンは、シグマ・ケミカル社（セントルイス、ＭＯ）
から市販されている。

本実施例は、ヒト血漿由来のＨＢｓＡｇをビーズをコー
ティングするのに用い、形質転換マウスＬ細胞からの組
換え由来ＨＢｓＡｇをたとえばＨＲＰＯ標識に結合させ
てプローブとして用いた他は実施例２の手順に従って行
った。

下記に示した反応曲線が、本実施例により典型的な結果
として得られた。

抗ＨＢａＡｇ濃度　　　４９２μｍでの吸光度陰性対照
　　　　　　　０．０２２ 陽性対照　　　　　　　１．５３６ １５０ｍ１　Ｕ／ｘ（２１，５８８ ７５ｍＩ　Ｕ／ｘ（ｌ　　　　　０．８３２４０ｍ１Ｕ
／ｍｅ　　　　　０．５９９１５＋ｎｌ　Ｕ／＊（２０
，２２０ ８ｍ１　Ｕ／＊Ｑ　　　　　０．１４１４ｏ＋ＩＵ／Ｉ
Ｑ　　　　０．０８２ 実施例５（抗ｐ４１のための定１１３工程イムノアッセ
イ法） 本実施例は抗ｐ４１のための３工程直接イムノアツセイ
法であり、バシラス・メガテリウムで発現し由来する組
換えｐ４１をコーティングした微粒子をフィルター上に
沈積させ固相として用いた（フィルター上に沈積させた
コーティング微粒子からなる固相について記載した米国
特許束４．６３２゜９０１号明細書参照）。

本実施例では、試験試料（３００μｇ）を試料希釈液（
２００μｇ）に加え、吸収パッドの上に位置するフィル
ターの上に注ぎ、３分間インキエベートする。希釈試料
を流し微粒子を含有するフィルターを、ついでヌゴーら
のＪ　、　Ａ　Ｐｐｔ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ、、ヱ、４４３〜４５４（１９８２）に記載の
方法で調製したビオチン化ｐ４１と３分間反応させた。

その後、アルカリホスファターゼ標識抗ビオチン抗体か
またはアルカリホスファターゼ標識アビジンを含有する
溶液をフィルターに加える。

３分間インキュベートした後、フィルターをバッフ１−
塩溶液（ｐＨ６，５〜９．５．０゜９％ＮａＣ１）で充
分に洗浄する。ついで基質溶液をフィルターに加えると
、固定化されたアルカリホスファターゼと反応して色原
体を生じ、ｐ４１に対する抗体の存在、従って）ＩＴＬ
ＶＩＩＩウィルスに接触があったことを示す。

基質としてはアルカリホスファターゼによる加水分解で
色原体を生じ得る有機ホスフェート化合物が適している
が、好ましい基質は、置換フェニル、ナフチルおよびイ
ンドールホスフェートである。アルカリホスファターゼ
標識に対する基質として特に好ましいのは、５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、３−イン
ドリルホスフェートおよび類似体またはその誘導体であ
る。

実施例６（ＨＴＬ、ＶＩ［のｐ４１およびｐ２４抗原の
精製および特徴付け） 大腸菌で産生されたＨＴＬＶＩＩＩ［９４１組換えタン
パク質をアフィニテイカラムおよびイオン交換クロマト
グラフィーを用いて精製する。細菌溶解物の上澄み液を
、モノクローナル抗ＨＴＬＶＩＩＩｐ４１を結合させた
セファロース４Ｂビーズからな′るアフィニティカラム
上に通した。カラムを０゜５％トリトンＸ−１００のバ
ッファーで洗浄し、結合したＨＴＬＶＩＩＩ［ｐ４１を
５Ｍ　　ＮａＩを含有する同じバッファーで溶出した。

溶出したタンパク質溶液を充分に透析してＮａｌを除き
、０．１％ツイーン２０および７Ｍ尿素を含有するエタ
ノールアミンバッファー（バッファーＡ）とｌ：ｌで混
合し、ＤＥＡＥ陰イオン交換カラムに加えた。カラムを
バッファーＡ中で充分に洗浄し、ついで結合したタンパ
ク質をバッファーＡ中の１００〜５００ｍＭ　　ＮａＣ
１勾配を用いて溶出した。ｐ４１活性のピーフッラフシ
ランをプールし透析して尿素を除いた。

同様に大腸菌で産生された組換えｐ２４を、モノクロー
ナル抗ＨＴＬＶＩＩＩＩｐ２４を結合させたセファロー
ス４Ｂビーズからなるアフィニティカラム上に溶菌上澄
みを流すことにより精製する。

カラムを０．１％トリトンＸ−１００を含有するバッフ
ァーで洗浄し、結合したｐ２４を４Ｍ塩酸グアニジン（
ＧｕＨＣｌ）を含有する同じバッファーで溶出する。溶
出したタンパク質溶液を充分に透析し、ついで第二のア
フィニティカラムに再び加えて上記のようにして溶出す
る。ｐ２４のビークフラクションをプールし透析してＧ
ｕＨＣｌを除く。

組換えタンパク質をさらに特徴付けるために、精製ｐ２
４コアまたはｐ４１エンベロープ抗原をドデシル硫酸ナ
トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳＰＡ
ＧＥ）およびシャブバ−７／＼（Ｓｃｈｕｐｂａｃｈ）
らの５ｃｉｅｎｃｅｓ　２２土、５０３〜５０５（１９
８４）記載の方法によるウェスタンプロ・ノテイング分
析に供する。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）試験試料中の特定の抗原に対する抗体を検出する
   ためのサンドイッチイムノアッセイを行う方法であって
   、検出しようとする抗体に特異的な第一の抗原を固相上
   に固定化し、試験試料中の検出しようとする抗体を該第
   一の抗原に結合させることによって固定化し、さらに該
   固定化された抗体を標識を有する第二の抗原と結合させ
   る際に、該第一の抗原と該第二の抗原とが同一源に由来
   するものである方法において、第二の抗原を第一の抗原
   とは異なる由来とすることを特徴とする方法。
2. （２）試験試料中の抗原特異的抗体の検出方法であって
   、 （ａ）検出しようとする抗体に特異的な第一の組換え体
   由来抗原を固相上に固定化し、 （ｂ）工程（ａ）で得た固相を、抗原特異的抗体を含ん
   でいるかまたは含んでいると思われる水相試験試料と接
   触させ、 （ｃ）工程（ｂ）で得た固相を、今度は標識を付着した
   第二の組換え体由来抗原を含む水相と接触させ、その際
   、第二の組換え体由来抗原は第一の組換え体由来抗原と
   は異なる由来とし、 （ｄ）水相を固相から分離させ、ついで （ｅ）固相上または液相中に存在する標識を測定して試
   験試料中に存在する抗体を検出および／または滴定する ことを特徴とする方法。
3. （３）標識が酵素または放射性同位体である特許請求の
   範囲第（２）項記載の方法。
4. （４）第一および第二の組換え体由来抗原が、試験試料
   中の抗原特異的抗体により交差反応を起こすに充分な抗
   原決定基を有している限り、第一および第二の組換え体
   由来抗原が共にＨＴＬＶIIIのｐ２４抗原、ＨＴＬＶII
   Iのｐ４１抗原、ＨＴＬＶIIIのｇｐ１２０抗原、ＨＢｓ
   Ａｇ、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｅＡｇ、およびそれらの抗原性
   断片すなわちエピトープよりなる群から選ばれたもので
   ある特許請求の範囲第（２）項記載の方法。
5. （５）工程（ａ）および工程（ｂ）を同時に行う特許請
   求の範囲第（２）項記載の方法。
6. （６）固相がポリスチレンビーズである特許請求の範囲
   第（２）項記載の方法。
7. （７）ヒト血清中のｐ４１に対する抗体の検出方法であ
   って、 （ａ）ポリスチレンビーズを酵母由来の精製ｐ４１抗原
   でコーティングし、 （ｂ）ヒト血清試料を該コーティングビーズに加え、（
   ｃ）約４０℃で約２時間インキュベートし、（ｄ）該ビ
   ーズを脱イオン化水で洗浄し、 （ｅ）該ビーズに精製および標識したｐ４１抗原または
   精製および標識したその断片すなわちエピトープを加え
   、その際、ｐ４１抗原またはその断片すなわちエピトー
   プは、ビーズ上のｐ４１抗原を産生させるのに用いたの
   とは異なる生物に由来するようにし、また該断片すなわ
   ちエピトープは、ヒト血清中のｐ４１に対する抗体と交
   差反応ができるように、工程（ａ）の抗原と共通する充
   分な抗原決定基を有しているようにする、 （ｆ）約４０℃で約１時間インキュベートし、（ｇ）該
   ビーズを脱イオン化水で洗浄し、 （ｈ）未反応の試薬をビーズから分離し、ついで（ｉ）
   ビーズ上に存在するマーカーを測定することを特徴とす
   る方法。
8. （８）工程（ａ）のｐ４１抗原が酵母中で産生されたも
   のであり、工程（ｅ）の標識ｐ４１抗原が大腸菌中で産
   生されたものである特許請求の範囲第（７）項記載の方
   法。
9. （９）工程（ｅ）のｐ４１抗原がマウス細胞中で産生さ
   れたものである特許請求の範囲第（７）項記載の方法。
10. （１０）マーカーが＾１＾２＾５ I である特許請求の
    範囲第（７）項記載の方法。