JPH022937A - 酵素標識抗体の分離精製方法 - Google Patents
酵素標識抗体の分離精製方法Info
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- JPH022937A JPH022937A JP63150889A JP15088988A JPH022937A JP H022937 A JPH022937 A JP H022937A JP 63150889 A JP63150889 A JP 63150889A JP 15088988 A JP15088988 A JP 15088988A JP H022937 A JPH022937 A JP H022937A
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、ヒドロキシアパタイトカラムを用いた酵素標
識抗体の精製法に関するものであり、さらに詳しくは、
酵素標識抗体を未標識抗体および酵素から分離する際に
、ヒドロキシアパタイトカラムを用いる方法に関するも
のである。
識抗体の精製法に関するものであり、さらに詳しくは、
酵素標識抗体を未標識抗体および酵素から分離する際に
、ヒドロキシアパタイトカラムを用いる方法に関するも
のである。
（従来の技術）
酵素免疫測定（ＥＩＡ）法は、医学、薬学の分野を中心
に種々の物質の特異的かつ高感度な定量分析手段として
広く活用されている。このＥＩＡ法による測定において
は、抗原を酵素標識して用いる場合もあるが、−ａ的に
は抗体を酵素で標識化して用いられる場合が多い。また
、免疫組織化学の分野においても、−酵素標識抗体は広
範囲に利用されている。
に種々の物質の特異的かつ高感度な定量分析手段として
広く活用されている。このＥＩＡ法による測定において
は、抗原を酵素標識して用いる場合もあるが、−ａ的に
は抗体を酵素で標識化して用いられる場合が多い。また
、免疫組織化学の分野においても、−酵素標識抗体は広
範囲に利用されている。
（発明が解決しようとする課題）
抗体を酵素標識する方法としては、グルタルアルデヒド
を用いる方法、過ヨウ素酸法、マレイミド法など多くの
方法が試みられているが、いずれの場合も反応効率１０
０％にはならないため、標識反応後のサンプルは標識抗
体と未標識抗体および酵素の混合物となる。測定の感度
を上げ、また非特異的な発色をできるだけ低くおさえる
ためには、この混合物から８８抗体だけを精製して用い
る必要が生じる。
を用いる方法、過ヨウ素酸法、マレイミド法など多くの
方法が試みられているが、いずれの場合も反応効率１０
０％にはならないため、標識反応後のサンプルは標識抗
体と未標識抗体および酵素の混合物となる。測定の感度
を上げ、また非特異的な発色をできるだけ低くおさえる
ためには、この混合物から８８抗体だけを精製して用い
る必要が生じる。
抗体としてＦａｂ−化したＩ（ＩＧを用いる場合には、
ゲル濾過法により標識抗体と未標識抗体の分離を行なう
ことも可能であるが、その他の場合には簡便で有効な分
離手段はほとんど知られていない。
ゲル濾過法により標識抗体と未標識抗体の分離を行なう
ことも可能であるが、その他の場合には簡便で有効な分
離手段はほとんど知られていない。
本発明の目的は、酵素標識抗体を未標識抗体および酵素
から簡便に精製する方法を提供することにある。
から簡便に精製する方法を提供することにある。
（課題を解決するための手段）
上記目的は、酵素標識抗体を分離精製する際に、ヒドロ
キシアパタイトカラムを用いることを特徴とする酵素標
識抗体の分離精製方法により達成される。
キシアパタイトカラムを用いることを特徴とする酵素標
識抗体の分離精製方法により達成される。
本発明の方法を用いて分離するサンプルとしては、マウ
ス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの動物を免疫し
て得られるポリクローナル抗体および細胞融合技術など
を利用して得られるマウス、ラット、ヒトなどに由来す
るモノクローナル抗体のいずれもが対象となり得るが、
より完全な分離を得るためには分子として均一であるモ
ノクローナル抗体がより好ましい。
ス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの動物を免疫し
て得られるポリクローナル抗体および細胞融合技術など
を利用して得られるマウス、ラット、ヒトなどに由来す
るモノクローナル抗体のいずれもが対象となり得るが、
より完全な分離を得るためには分子として均一であるモ
ノクローナル抗体がより好ましい。
また本発明の方法は、特にクラスがＩｇＧである抗体、
Ｆａｂ−化されていない抗体を用いる際に有効に用いる
ことができる。
Ｆａｂ−化されていない抗体を用いる際に有効に用いる
ことができる。
抗体を得るために免疫する抗原としては、ヒトおよび各
種動物由来の細胞、タンパクおよび核酸などの高分子化
合物、ホルモンその他の低分子化合物など、一般に抗原
として使われる全ての物置を用いることができる。低分
子化合物を用いる場合には、抗原性を高めるためにウシ
血清アルブミンなどのタンパク質に結合させた状態で免
疫することが望ましい。
種動物由来の細胞、タンパクおよび核酸などの高分子化
合物、ホルモンその他の低分子化合物など、一般に抗原
として使われる全ての物置を用いることができる。低分
子化合物を用いる場合には、抗原性を高めるためにウシ
血清アルブミンなどのタンパク質に結合させた状態で免
疫することが望ましい。
また、抗体に結合させる酵素としては、西洋ワサビペル
オキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクト
シダーゼなど酵素免疫測定に一般に用いられる多くの酵
素が対象となるが、特に西洋ワサビペルオキシダーゼが
好ましく用いられる。
オキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクト
シダーゼなど酵素免疫測定に一般に用いられる多くの酵
素が対象となるが、特に西洋ワサビペルオキシダーゼが
好ましく用いられる。
これらの酵素を抗体に結合させる方法としては、グルタ
ルアルデヒドを用いる方法、過ヨウ素酸法、マレイミド
法などこれまでに知られている全て方法が可能である。
ルアルデヒドを用いる方法、過ヨウ素酸法、マレイミド
法などこれまでに知られている全て方法が可能である。
結合する酵素の数を一定−にするためにはマレイミド・
ヒンジ法［Ｙｏｓｈｉｔａｋｅら、 Ｊ、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、 ９２１４１３（１９８２） ］が優れており、
特に酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる場
合には、この方法が適している。
ヒンジ法［Ｙｏｓｈｉｔａｋｅら、 Ｊ、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、 ９２１４１３（１９８２） ］が優れており、
特に酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる場
合には、この方法が適している。
本発明で用いられるヒドロキシアパタイトカラムは、一
般のカラムクロマトグラフィー用および高速液体カラム
クロマトグラフィー用のいずれもが使用できる。一般力
ラムクロマトグラフィー用の充填剤としてはＢ１ｏ−Ｇ
ｅ１ ＨＴ ”および”８ｉｏ−Ｇｅｌ ＨＴＰ “
（バイオ・ラッド社製）など、また高速液体クロマトグ
ラフィー用のカラムとしては、“ＨＣ＾−Ｃｏ ｌ ｕ
ｍｎ“（三井東圧化学（株）製）など多くの市販品が入
手可能である。
般のカラムクロマトグラフィー用および高速液体カラム
クロマトグラフィー用のいずれもが使用できる。一般力
ラムクロマトグラフィー用の充填剤としてはＢ１ｏ−Ｇ
ｅ１ ＨＴ ”および”８ｉｏ−Ｇｅｌ ＨＴＰ “
（バイオ・ラッド社製）など、また高速液体クロマトグ
ラフィー用のカラムとしては、“ＨＣ＾−Ｃｏ ｌ ｕ
ｍｎ“（三井東圧化学（株）製）など多くの市販品が入
手可能である。
分離時間を短くするためには、１ｍｌ／ｍｉｎ程度の高
淳速が可能な高速液体クロマトグラフィーを用いること
が好ましい。
淳速が可能な高速液体クロマトグラフィーを用いること
が好ましい。
サンプルの溶出のための溶離液としては、リン酸ナトリ
ウムＭ街液、リン酸カリウム緩衝液など一般にヒドロキ
シアパタイトカラムクロマトで用いられる溶離液が使用
できる。サンプルの溶出は直線濃度勾配、段階的濃度勾
配のいずれもが用いられる。いずれの場合にも低イオン
強度から高イオン強度への濃度勾配が一般的に用いられ
るが、ＰＨ勾配による溶出も可能であり、両者を組み合
わせて用いることがさらに好ましい。また、サンプルに
よっては、低能度のカルシウムイオン、マグネシウムイ
オンなどで効果的な分離が得られることもある。
ウムＭ街液、リン酸カリウム緩衝液など一般にヒドロキ
シアパタイトカラムクロマトで用いられる溶離液が使用
できる。サンプルの溶出は直線濃度勾配、段階的濃度勾
配のいずれもが用いられる。いずれの場合にも低イオン
強度から高イオン強度への濃度勾配が一般的に用いられ
るが、ＰＨ勾配による溶出も可能であり、両者を組み合
わせて用いることがさらに好ましい。また、サンプルに
よっては、低能度のカルシウムイオン、マグネシウムイ
オンなどで効果的な分離が得られることもある。
（実施例）
以下本発明を実施例により詳細に説明する。
実施例１
ヒト結腸癌細胞を免疫して得られたマウスモノクローナ
ル抗体、抗ＣＡ １９−９抗体（ｃｌａｓｓ ＩＩＪ
Ｇ１ ） ［Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉら、Ｓｏｍａｔｉｃ
Ｃｅ１ｌ ＧｅｎｅｔｉｃＳ、５ ９５７ （１９７９
） ］ ５５ｍ］と西洋ワサビペルオキシダーゼ９．２
ｍｇとの結合反応をマレイミド・ヒンジ法により行ない
、１１１１１の反応液を得た。
ル抗体、抗ＣＡ １９−９抗体（ｃｌａｓｓ ＩＩＪ
Ｇ１ ） ［Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉら、Ｓｏｍａｔｉｃ
Ｃｅ１ｌ ＧｅｎｅｔｉｃＳ、５ ９５７ （１９７９
） ］ ５５ｍ］と西洋ワサビペルオキシダーゼ９．２
ｍｇとの結合反応をマレイミド・ヒンジ法により行ない
、１１１１１の反応液を得た。
このうちの１９０μｍをヒドロキシアパタイトカラム（
三井東圧化学（株）製、ＨＣＡカラムＡ−７６１０にア
プライし、高速液体クロマトグラフィー（ファルマシア
（株）製、ファルマシアＦＰＬＣ）を用いて１ ｍｌ／
ｍｉｎの流速で１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ＰＨ５
，８（Ａ液）から５００ｍＭリン酸ナトリウムＭ’Ｓ液
ＰＨ６゜８（Ｂ液）への濃度勾配で溶出させた。充分な
分離を得るために、標識抗体の溶出する１００ｍＭ付近
では濃度勾配をゆるやかにして溶出を行なった。ピーク
の検出は、２８０ｎｍの紫外吸収およびペルオキシダー
ゼに由来する４０３ｎｍの可視吸収を同時にモニターし
て行なった。
三井東圧化学（株）製、ＨＣＡカラムＡ−７６１０にア
プライし、高速液体クロマトグラフィー（ファルマシア
（株）製、ファルマシアＦＰＬＣ）を用いて１ ｍｌ／
ｍｉｎの流速で１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ＰＨ５
，８（Ａ液）から５００ｍＭリン酸ナトリウムＭ’Ｓ液
ＰＨ６゜８（Ｂ液）への濃度勾配で溶出させた。充分な
分離を得るために、標識抗体の溶出する１００ｍＭ付近
では濃度勾配をゆるやかにして溶出を行なった。ピーク
の検出は、２８０ｎｍの紫外吸収およびペルオキシダー
ゼに由来する４０３ｎｍの可視吸収を同時にモニターし
て行なった。
溶出パターンは第１図に示す。実線は各々の波長の吸光
度を、点線はグラジェントを表わす。
度を、点線はグラジェントを表わす。
３個の主要ピークを分収後標識抗体としての活性を測定
した結果、−一一 で示す２番目のピークが目的の標識
抗体であり、１番目のビクは未反応のペルオキシダーゼ
、３番目のとりは未反応の抗体であることが明らかにさ
れた。
した結果、−一一 で示す２番目のピークが目的の標識
抗体であり、１番目のビクは未反応のペルオキシダーゼ
、３番目のとりは未反応の抗体であることが明らかにさ
れた。
実施例２
ヒト乳癌肝転移細胞の膜フラクションを免疫して得られ
たマウスモノクローナル抗体ＤＦ３（Ｃ１ａｓｓ Ｉ
ｇＧ１ ） ［Ｋｕｆｃら、ＨｙｂｒｉｄＯｍａ 、
３２２３ （１９８４）］ １０ｍｇと西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ９．２ｍ（］との結合反応をマレイミド
・ヒンジ法により行ない、２ｍｌの反応液を得た。
たマウスモノクローナル抗体ＤＦ３（Ｃ１ａｓｓ Ｉ
ｇＧ１ ） ［Ｋｕｆｃら、ＨｙｂｒｉｄＯｍａ 、
３２２３ （１９８４）］ １０ｍｇと西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ９．２ｍ（］との結合反応をマレイミド
・ヒンジ法により行ない、２ｍｌの反応液を得た。
このうちの５０μｌをヒドロキシアパタイトカラム（三
井東圧化学（株）製、ＨＣＡカラムＡ−７６１０＞にア
プライし、実施例１と同じ条件で溶出を行なった。２８
０ｎｍの紫外吸収でモニターした溶出パターンを第２図
に示す。各ピークを分収後、各々の４０３ｎｍの吸収お
よび標識抗体としての活性を測定した結果、１番目のピ
ークは未反応のペルオキシダーゼ、２番目のピークが標
識抗体、３番目のピークは未反応の抗体であることが明
らかにされた。
井東圧化学（株）製、ＨＣＡカラムＡ−７６１０＞にア
プライし、実施例１と同じ条件で溶出を行なった。２８
０ｎｍの紫外吸収でモニターした溶出パターンを第２図
に示す。各ピークを分収後、各々の４０３ｎｍの吸収お
よび標識抗体としての活性を測定した結果、１番目のピ
ークは未反応のペルオキシダーゼ、２番目のピークが標
識抗体、３番目のピークは未反応の抗体であることが明
らかにされた。
（発明の効果）
本発明は酵素標識抗体を簡便かつ短時間に精製する方法
であり、１段階の精製で標識抗体を未標識抗体および酵
素から特異的に単離することができ、酵素免疫測定を用
いた各種疾患の診断、微量物質の定景をはじめとする多
くの分野で極めて有効に活用できる。
であり、１段階の精製で標識抗体を未標識抗体および酵
素から特異的に単離することができ、酵素免疫測定を用
いた各種疾患の診断、微量物質の定景をはじめとする多
くの分野で極めて有効に活用できる。
第１図は実施例１における抗ＣＡ１９−９抗体と西洋ワ
サビペルオキシダーゼの結合反応後の溶液の分離パター
ンである。第２図は、実施例２におけるＤＦ３抗体と西
洋ワサビペルオキシダーゼの結合反応後の溶液の分離パ
ターンである。 特許出願人 東 し 株 式 会 社 吸光度 ｌｊ０３ｎｍ Ｑ、１ ２８０ｎｍ Ｑ、１ ％（Ｄ；ｌ支）
サビペルオキシダーゼの結合反応後の溶液の分離パター
ンである。第２図は、実施例２におけるＤＦ３抗体と西
洋ワサビペルオキシダーゼの結合反応後の溶液の分離パ
ターンである。 特許出願人 東 し 株 式 会 社 吸光度 ｌｊ０３ｎｍ Ｑ、１ ２８０ｎｍ Ｑ、１ ％（Ｄ；ｌ支）
Claims (1)
- （１）酵素標識抗体を分離精製する際に、ヒドロキシア
パタイトカラムを用いることを特徴とする酵素標識抗体
の分離精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63150889A JPH022937A (ja) | 1988-06-17 | 1988-06-17 | 酵素標識抗体の分離精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63150889A JPH022937A (ja) | 1988-06-17 | 1988-06-17 | 酵素標識抗体の分離精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH022937A true JPH022937A (ja) | 1990-01-08 |
Family
ID=15506599
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63150889A Pending JPH022937A (ja) | 1988-06-17 | 1988-06-17 | 酵素標識抗体の分離精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH022937A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7122641B2 (en) | 2001-12-21 | 2006-10-17 | Immunex Corporation | Methods for purifying protein |
| WO2011037094A1 (ja) * | 2009-09-25 | 2011-03-31 | Hoya株式会社 | 分離方法 |
| US8993715B2 (en) | 2009-07-06 | 2015-03-31 | Canon Kabushiki Kaisha | Labeled protein and method for obtaining the same |
-
1988
- 1988-06-17 JP JP63150889A patent/JPH022937A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7122641B2 (en) | 2001-12-21 | 2006-10-17 | Immunex Corporation | Methods for purifying protein |
| US7476722B2 (en) | 2001-12-21 | 2009-01-13 | Immunex Corporation | Methods for purifying protein |
| US8993715B2 (en) | 2009-07-06 | 2015-03-31 | Canon Kabushiki Kaisha | Labeled protein and method for obtaining the same |
| WO2011037094A1 (ja) * | 2009-09-25 | 2011-03-31 | Hoya株式会社 | 分離方法 |
| JP2011068785A (ja) * | 2009-09-25 | 2011-04-07 | Hoya Corp | 分離方法 |
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