JPS6113156A - ヒトインタ−フエロン−αの定量用試薬及び定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、血清もしくは培養液等液体中のヒトインター
フェロン−αを定量するための試薬およびその試薬を用
いた定量法に関するものである。

従来、゛液体中のヒトインターフェロン−αの定量は、
バイオアッセイで行なわれ、最小検出感度はＩ　１．Ｕ
、　／ｌｕｔとされているが、操作が繁雑で、測定値の
変動が大きかった。最近、抗原抗体反応を利用したラジ
オ゛イムノアッセ４九　、 イあるいはエンザイムノアッセイでの定量が行なわれる
ようになったが、いずれも、モノクローナル抗体をラジ
オアイソトープまたは酵素で標識したものであり、ヒト
インターフイオアッセイに及ばなイ（Ｊ、ｇｅｎ、Ｖｉ
ｒｏｌ。

６２．１８１−１８５（１９８２）ｉ医学のあゆみｖｏ
ｌ、　１２９　　黒８　１８１−１８６（１９８４））
。

本発明者らは、高感度のエンザイムイムノアッセイを鋭
意検討した結果、ポリクローナル抗ヒトインターフェロ
ン−α抗体ヲβ−Ｄ−ガラクトシダーゼで標識した酵素
標識抗体を用いて、ヒトインターフェロン−αをサンド
イツチ法で定量することにより、バイオアッセイに匹敵
する感度を有する定量法をみいだした。

スナわち、抗ヒトインターフェロン−α抗体もしくはそ
のペプシン分解物であるＦ（ａｂ’）を還元し、ジマレ
イミド化合物を介してβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを結合
せしめた酵素標識抗体を製造し、この酵素標識抗体を用
いてヒトインターフェロン−αをサンドイツチ法で定量
することにより、バイオアッセイと同様１）、Ｕ、／、
ｌのヒトインターフェロン−α全定量することが可能と
なりだ。

インターフェロンは、ウィルス感染を受けた動物が生産
、分泌する分子量約２万の糖タンパク質で、あるウィル
スの感染が他のウィルス感染を阻害する現象、いわゆる
ウィルス干渉の主要因となっている物質であり、その抗
原性の違いによりα型、β型、β型に大別され、それぞ
れインターフェロン−α、インターフェロン−β、イン
ターフェロン−γと分類とされている。

また、インターフェロンを産生じた動物細胞の動物種を
示すためヒトインターフェロン、マウスインターフェロ
ンなどのように表現さ２　　れる。ヒトインターフェロ
ン−αとはヒトの細胞が産生ずるα型インターフェロン
である。

なお、最近ではヒトインターフェロン−α遺伝子の塩基
配列およびヒトインターフェロン−αのアミノ酸配列な
どから、ヒトインターフェロン−αには１０種類以上の
サブタイプが存在することが明らかにされている （Ｎａｔｕｒｅｖｏｌ、２８６．＆１０，１）０，１９
８０）。

、ヒトインターフェロン−α（以後ＨｕＩＦＮ−αさせ
精製する方法、ヒＩ−ＩＪンバ芽球細胞であル− るナマルバ細胞をセンダイライヘス処理し、ＨｕＩＦＮ
−αを誘発させ精製する方法、遺伝子工学ｌこより大腸
菌にＨｕＩＦＮ−α遺伝子を組み込み、大腸菌を大量培
養し、ＨｕＩＦＮ−αをつくらせ、精製する方法等が知
られている。望ましくは、種々のサブタイプが共存し、
製造の容易な、ナマルバ細胞をセンダイウィルス処理し
た方法である。

抗ＨｕＩＦＮ−α抗体は公知の方法で得ることができる
（免疫学実験入門第■、［Ｉ章ｐ、３５〜ｐ、６９−学
会出版センター）。すなわち、家兎、モル５．、Ｉニッ
ト、ラット、マウス、ヤギ等の哺乳動物の皮下、皮肉、
筋肉内等にＨｕＩＦＮ−αを投与すること馨こよって抗
血清を得ることができ、抗血清に硫酸ナトリウムを加え
て塩析し、生じた沈澱をリン酸緩衝液に溶解し、ＤＥＡ
Ｅ＋ルロースーイオン交換り・ロマトグラフィー］こよ
ってＩｇＧ画分を分取することにより、抗ＨｕＩＦＮ−
α抗体を得る。

抗ＨｕＩＦＮ−α抗体のペプシン分解物であるＦ　（ａ
　ｂ’　）２の公゛知の方法によりたとえは次の様にし
て得ることができる。抗ＨｕＩＦＮ−α抗体（５〜２０
〜／肩ｌの酢酸緩衝液（ｐＨ４〜５）溶液）に、抗体に
対し１〜５重量％のペプシンを加えて、４〜４０℃で２
時間〜４日間反応せしめ、その後、ｐＨを７〜８に調製
した後、セファデックス　Ｇ−１５０（ファルマシア社
製）でゲル沖過を行ない、分子量約１０万の両分を分取
することにより、抗ＨｕＩＦＮ−α抗体のペプシン分解
物であるＦ（ａｂ’）２を得る。

なお、抗ＨｕＩＦＮ−α抗体またはそのペプシン分解物
であルＦ（ａｂ’）＊は、ＨｕＩＦＮ−ａをＣＮＢ　ｒ
−セファロース■４Ｂ（７丁）レマシ泰社製）に結合せ
しめたＨｕ、ＩＦＮ−αカラムを用いて、アフィニティ
−精製することが望マシく、最も望ましいのは、アフィ
ニティー精製したＦ（ａｂ’）２を用いることである。

抗ＨｕＩＦＮ−α抗体またはそのペプシン分解物である
Ｆ（ａｂ’）２とβ−り一がラクトシダーゼとの結合′
は、抗ＨｕＩＦＮ−α抗体またはそのペプシン分解物で
あるＦ　（ａ　ｂ’　）２を還元し、ジマレイミド化合
物を介して結合する。結合方法 法は酵素免疫測定ｆ！（−第２版−６−α、ｐ。

９２−　ｐ、ｌ　０５　、医学書院）に記載の方法によ
る。以下にその方法を記す。

β−り一がラクトシダーゼとの結合に用いるジマレイミ
ド化合物としては、Ｎ、Ｎ’−０−７エニレンジマレイ
ミド１．Ｎ、Ｎ／−ｐ−フェニレンジマレイミド、Ｎ、
Ｎ’−オキシジメチレンジマレイミド等である。好まし
くは、Ｎ、Ｎ’−ｏ−７二二レンジマレイミドである。

結合方法としては抗ＨｕＩＦＮ−α抗体またはそのペプ
シン分解物であるＦ（ａｂ／）２を還元してチオール基
を生成せしめ、このチオール基またはβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼのチオール基の一方に対し、大過剰のジマレイ
ミド化合物を反応せしめた後、未反応のジマレイミド化
合物を除去し、他方のチオール基と反応させることによ
って抗体と酵素を結合させ、る。

上記結合方法の例としては、抗ＨｕＩＦＮ−α抗体のペ
プシン分解物であるＦ（ａｂ’）２溶液（５〜２０ｒＱ
／Ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ５，５〜６．５）溶液）に
、最終濃度が０．００５〜０．１モルになる様にメルカ
プトエチルアミンヲ添加することにより還元した後、４
〜４０℃で５分〜１日反応させ、その後ｐＨ４，５〜６
．０のリン酸緩衝液で平衡化したセファデックス■Ｇ−
２５（７アルマシア社製）にて、ゲル沖過を行ない、低
分子成分であるメルカプトエチルアミンを除去し、溶出
してくるタンパク両分ニＮ　、　Ｎ　’　−ｏ−７エニ
レンジマレイミドの酢酸緩衝液（ｐＨ４，５〜６．０）
に対する飽和溶液を、Ｎ、Ｎ’　−ｏ−７エニレンジマ
レイミドがペプシン分解物であるＦ（ａｂ′）２の２θ
〜ＩＯθ倍のモル数になる様加え、４〜４０℃で５分間
〜２４時間反応せしめた後上記と同様にゲル沖過によっ
て低分子成分である未反応のＮ、Ｎ’　−ｏ−フェニレ
ンジマレイミドを除去し、得られたタンパク画分を１．
０〜ｌＯ■／　ｍｌのタンパク濃度になる様濃縮した後
、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ溶液（１，０〜１０ｍｖ／
ｍｅのリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，０〜７．０　）溶液）
を、ペプシン分解物Ｆ（ａｂ’）２の還元産物Ｆａｂ’
のマレイミド化物の１０〜５０モル％量加え、ｐ　Ｈｅ
、、　ｏ〜７．０に調製後、４℃で１０時間〜ｌＯ日間
反応せしめる。その後、セファ。−ス■ＣＬ−６Ｂ（フ
ァル、シア社製）でβ−り一がラクトシダーゼの溶出画
分を分取する。

抗ＨｕＩＦＮ−α抗体を用いる時、あるいは他のジマレ
イミド化合物を用いる時、または、β−り一がラクトシ
ダーゼのチオール基とジマレイミド化合物を先に反応せ
しめる時も、同様の方法で行なうことができる。

上記の方法で抗Ｈｕ　Ｉ　ＦＮ−α抗体またはそのペプ
シン分、解物であるＦ　（ａ　ｂ’　）２とβ−Ｄ−が
う゛クトーシダーゼが結合したことを確認するためには
、抗ＨｕＩＦＮ−α抗体に、フルオレッセイン標識Ｉｇ
Ｇ　を少量加えておけばよい。

即ち、分取したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ画分にフルオ
レッセインの蛍光が認められることから、抗ＨｕＩＦＮ
−α抗体またはそのペプシン分解物であるＦ（ａｂ’）
２とβ−Ｄ−ガラクトシダーゼが結合した事が確認でき
る。各両分のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性、全溶出画
分のフルオレッセイン蛍光強度、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ酵素活性゛が認められる両分のフルオレッセイン蛍
光強度からβ−Ｄ−がラクトシダー４１分子に結合した
抗ＨｕＩＦＮ−α抗体またはそのペプシン分解物Ｆ（ａ
ｂ′）２の還元産物Ｆａｂ’の平均分子数を知ることが
できる。

本発明の目的のためには、β−Ｄ−がラクトシダー４１
分子あたり、抗ＨｕｌＦＮ−α　抗体またはペプシン分
解物Ｆ（ａｂ′）２の還元産物Ｆａｂ’が１．０〜５．
０分子結合することが好ましい。より好ましくは１．０
〜３．０分子である。

最も好ましいのは、β−り一がラクトシダーゼ１分゛子
あたりアフィニティー精製したペプシン分解物Ｆ（ａｂ
’）２　　の還元産物Ｆａｂ　’が１．５〜２．５分子
結合することである。　　。

”　この様にして得られた抗ＨｕＩＦＮ−α抗体または
ペプシン分解物であるＦ（ａｂ′）２　　とβ−り一が
ラクトシダーゼの結合体（以下標識抗体という）を用い
ての、血清あるいは培養液等の液体中のＨｕＩＦＮ−α
の定量は公知のサンドイツチ法で行なう。

サンドイツチ法とは、例えばポリスチレン、ナイロン、
ガラス等のボール、チューブあるいはシリコンの丸紐、
あるいはポリスチレン、ポリ塩化ビニル等のマイクロプ
レートに物理的吸着あるいは化学結合に°よりて抗Ｈｕ
　Ｉ　ＦＮ−α抗体を結合して得た固相化抗体（以下面
相という）と測定すべき液体とを反応せしめた後、固相
の洗浄を行なう。この後、同相、に標識抗体を加えて反
応を行ない、同相の洗浄を行なう。次いで固相上の酵素
活性を測定する。

酵素活性の測定は、β−Ｄ−ガラクトシダーゼによって
蛍光、可視光、紫外線を発する化合物を基質として用い
る。例えば基質としてはＯ−ニトロフェニル−β−り一
がラクトピラノシド、４−メチルウンベリフェリル−β
−Ｄ−がラクトピラノシド等がある。望ましくは、蛍光
を発する４−メチルウンベリフェリル−β−り一がラク
トピラノシドを用いる。具体的な測定は例えは以下の方
法で行なう。即ち、４−メチルウンベリフェリル−β−
り一がラクトピラノシド溶液（終濃度０．５〜１０　Ｘ
　１０−４　Ｍ　）　１００〜２００μｌと固相を２５
〜４０℃でｌθ〜６０分間反応させた後、０．０１−Ｉ
Ｍのグリシン緩衝液（ｐＨ９，５〜１）．０）、１〜’
３　ｍｌを加えて酵素反応を停止させ、生じた４−メチ
ルウンベリフェロンの蛍光強度を励起波長８６５ｎｍ、
蛍光波長４４８　ｎｍにて測定する。

定量を行なうには、ＨｕＩＦＮ−αの既知濃度の標準溶
液を測定して検量線を作成し、測定すべき液体の酵素活
性からそのＨｕ　Ｉ　ＦＮ−α濃度を知ることができる
。かくして得られた方法によれば２０〜１００μｅ　の
試料量でＩＩ。

Ｕ　、／　ｍｌのＨｕＩＦＮ−α　濃度を測定すること
かり能でありバイオアッセイとの相関も良好であった。

以下、本発明を実施例で詳述する。

実施例Ｉ　　ＨｕＩＦＮ−ａ　ｏ）調製および抗ＨｕＩ
ＦＮ−α抗体、酵素標識抗体の作製 （１）ｎｕ　ＩＦＮ−ａ　（７）　７５　製出いたＨｕ
ＩＦＮ−αは、培養したリンパ芽球細胞であるナマルバ
細飽をセンダイウィルスにて処理し、ヒトインターフェ
ロンを誘発させ、培養液から公知の方法で精製した（　
Ｎａｔｕｒｅ　ｖｏｌ　、２８７，４０８−４１）　＋
１９８０）。即ち、培養液からヒトインターフェロンを
トリクロロ酢酸で沈澱させ、酸性エタノール抽出、ポリ
クローナル抗ＨｕＩＦＮ−α抗体カラムによるアフィニ
ティー精製を行ない、さらに抗ウシ血清抗体カラムによ
り、培養液中の異種タンパクを除き、最終的に力価がｌ
Ｏ，７Ｘ１０６ＩＩＪ、ないし２０Ｘ１０６１．Ｕ／＋
ＪのＨｕＩＦＮ−α溶液（０，ｌ　５ＭＮａＣ５を含む
０．０１　Ｍ　）リス−グリシン緩衝液（ｐ　＊　７．
２　）溶液）を得た。

（２）抗体作製法 ｎｕ　Ｉ　ＦＮ−α溶液を等量の７０インドコンプリー
トアジユバントと混合し、エマルジョンを作製し、家兎
に投与した。投与１回あたり、２　Ｘ　１０６１．Ｕ、
ないし１０　Ｘ　１０’　１．Ｕ、　（Ｄ　Ｈｕ　Ｉ　
ＦＮ−ｔｘを用イ、投与部位は足踵、皮下、筋肉内とし
、投与間隔を２ないし４週間として計１８回の投与を行
なった。最終投与からＩＯ日幀 後に骨動脈から採血した。得られた血液は、室温にて６
時間放置後、ａ　ｏ　ｏ　ｏ　ｒ。

ｐ　、ｍ、で遠心分離を行ない、抗血清を採取した。抗
血清８５ｇ＋／に対し６．８２の硫酸ナトリウムを加え
て塩析し、生じた沈澱をリン酸ナトリウに緩衝液（０，
０１７，５Ｍ、ｐＨ５，３、以後緩衝液■と略称する）
に溶解させ、同じ緩衝液に対して透析しにより除き、上
清をＤＥ−５２［相］（ワットマン社製）カラム（Ｉ　
Ｘ　４０　ｃｍ、緩衝液のにて平衡化）によるイオン交
換クロマトグラフを行ない波長２８０ｎｍの光を吸収す
る画分を集め、抗ＨｕＩＦＮ−αＩｇＧ画分とした。得
られた両分はダイア７０−メンブレン■（アミコン社製
）による限外濾過を行なって濃縮し、ＩｇＧ濃度２０”
９／ｍｌの液１２．８　ｍｌを得た。抗ＨｕＩＦＮ−ａ
ＩｇＧ液を０、ＩＭ酢酸ナトリウム緩衝取（１）Ｈ４，
５）に対し透析後、７．７〜のペプシンを加士、３７℃
、２５時間保温した。ＩＮ水酸化ナトリウム溶液を用い
、ペプシン処理したＩｇＧ溶液のｐＨを７，９とした後
、セファデックス■Ｇ−１５０（ファルマシア社製）カ
ラム（１，５Ｘ４０ｃｎＩ）に″てゲル濾過（カラムの
平衡化及び溶出には０．１　Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液
（１）Ｈ８，０）を用いる）し、分子量約ｉ。

万 今の両分を分取し、抗Ｈｕ　Ｉ　ＦＮ−ａ　Ｆ　（ａ　
ｂ’）２１５０■を得た。得られた抗ＨｕＩＦＮ−αＦ
（ａｂ’）２を０，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７，０）に対し透析し、ＨｕＩＦＮ−αをＣＮＢ　ｒ−
セファロース■４Ｂ（ファ アミコン社製）に結合させたＨｕＩＦＮ−αカラムでア
フィニティー精製を行なった。カラムに吸着した抗Ｈｕ
ＩＦＮ−αＦ（ａｂ’）２（７）溶出には０．２　Ｍグ
リシン−ＨＯ２［ｒ液（ｐＨ２，３）を用い、溶出して
きたＦ　（ａ　ｂ’）２は０．　Ｉ　Ｎ水酸化ナトリφ
ム溶液にて直ちにｐＨを７．０とした。・０．１Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）に対し透析後、ダイ
ア７０−メンブレン［相］（アミコン社製）を用いた限
外濾過による濃縮を行ないアフィニティー精製抗Ｈｕ　
ＩＦＮ−ａＦ　（ａｂ’）２５．　ｌ　ｍｙを得た（８
１ｙＩ素標識抗体合成法 アフィニティー精製抗Ｈｕ　Ｉ　ＦＮ−ａＦ（ａｂ’４
■を１ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含むＯ，ｌ　Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６，０（以後緩衝液■と略称
する）に対し透析した後、このアフィニティー精製抗Ｈ
’ｕＩＦＮ−ａ　Ｆ（ａｂ’　）２４　”！／４８０　
ｕｌｌｌｌ緩衝液圧常ウサギＩｇＧ　　（カペルラボラ
トリー社製）より得たフルオレッセイン標識Ｆ（ａｂ′
）ｚ　０．　Ｉ　Ｑ　／　１００１ｔ（ｌ緩衝液■、０
．１Ｍメルカプトエチルアミン／１００μｅ緩衝液■、
緩衝液０３２０μｅを混合後、８７℃で９０分間保温し
て Ｆ（ａｂ’）２の還元を行なった。緩衝液■にて平衡化
したセファデックス■Ｇ−２５（ファルマシア社製）カ
ラム（ｌ×３０ｃｒｎ）によりゲル濾過を行ない最初に
溶出するタンパク質画分約８．８７ＩＱ、　８．１　ｒ
ｘｌをＮ、Ｎ’−ｏ−フェニレンジ孟レイミド飽和の、
１ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む０．１　Ｍ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５，０）２．６ｇＪに直接導き入
れ３０℃、２０分間保温した。０．０２ＭＩＩＩｌ’酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０）にて平衡化したセファ
デックス■Ｇ−２５（ファルマシア社製）カラム（ｌ　
Ｘ　４０　ａｎ　）にてゲル濾過を行ない、最初に溶出
してくる、波長 ２８０ｎｍに吸収を持つ画分を集め、ダイアフローメン
ブレンの（アミコン社製）を用いた限外濾過により濃縮
し、１分子のＦａｂ’に０．５２分子のマレイミド基が
導入されたＦａｂ’　２．４　’Ｆ／　１．２８　ｗｌ
を得た。なお、Ｆａｂ’　中のマレイミド基の定緻は公
知の方法で行ならた（免疫実験操作法Ｘ１．３４９７〜
８５２０．１９８２）。

β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（以後、β−Ｄ−Ｇａｌと略
称する）を８．７５ｍｇ／Ｉ／となるよう（こ０．１　
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，５）に溶解し、Ｆ
ａｂ’＋ｚ対し、β−Ｄ−Ｇａｌがモル比＋ｆｆｌテ４
０／１９２゜賃 ２８／１９２　、１４／１９２．７／１９２となるよう
に、Ｆａｂ／−マレイミド溶液とβ−Ｄ−Ｇａｌ溶液の
混合液を４種類作製した。ただし、混合液のｐＨはＯ，
Ｉ　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５７によりＩ
）　Ｈ６，５に調整した。４℃にて９０時間から １４０時間反応させた後、反応液をｏ、ＩＮ　１”Ｊａ
Ｃｌ　、　１　ｍＭＭｇ　Ｃ１，、０，１％ＢｓＡおよ
び０．１％ＮａＮ、を含む０．０１ＭＩＪｙ酸ナトリウ
ム緩衝液ｐＨ７，０（以後、緩衝液■と略称する）にて
平衡化したセファロース■ＣＬ−６Ｂ　（７７，、ｖ、
＋社製）カラム（１，５Ｘ　４０　ｃｍ　）にてゲル沖
１した。溶出液には緩衝液■を用い、分画は１．８コと
した。各面分のフルオレツセインの蛍光強度β−Ｄ−Ｇ
ａｌの酵素活性を測定した。フルオレッセインの蛍光は
励起波長４９９ｎｍ、’蛍光波長５１０ｎｍで測定した
。β−Ｄ−Ｇａｌ１分子中に結合したＦａｂ’の数は以
下の式より算出した。

ここで、Ａは、β−Ｄ−Ｇａｌの酵素活性が認められる
両分のフルオレッセイン蛍光強度、Ｂは全溶出画分のフ
ルオレッセイン蛍光強度、αは使用したｌ’ａｂ’に対
するβ−Ｄ−’Ｇａｌのモル比である。

αが、４０／１９２．２８／１９２．１４／１９２゜７
／１９２とした混合液から、それぞれβ−Ｄ−Ｇａｌ１
分子に対し、Ｆａｂ’が２．２゜２．５　、−８．９　
、’８．８分子結合した酵素標識抗体を得た。

実施例２　　ＨｕＩＦＮ−αの定量方法および検量線 実施例１で得られた本発明のＨｕ　Ｉ　ＦＮ−α定量用
試薬を次の様に用いて検量線を作成し、定量可能域につ
いて検討した。即ち、試験管（１０ｗ　Ｘ　７２　＋ｕ
　）に緩衝液■１００μｅ　と、国立予防衛生研究所で
行なわれているＣＰＥ細胞変性阻止色素取り込み法（蛋
白質、核酸、酵゛素、別冊第・２５号、ｐ。

８５９〜ｐ、８６２．１９’８１　、共立出版）に準じ
て行なったバイオアッセイにて力価を測定し緩衝液■に
て希釈した標準Ｈｕ　Ｉ　ＦＮ−α５０μｅ　とを入れ
混合した後、Ｏ，ｌ　ｆ／’１濃度の抗Ｈｕ　Ｉ　ＦＮ
−ａ　Ｉ　ｇＧの０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ７，５）溶液に径８．２關のポリスチレンボールを
入れて４℃で１週間静置してＩｇＧを物理的にポリスチ
レンボールに吸着させて得た固相化抗ＨｕＩＦＮ−αＩ
ｇＧ　（以後固相と略称する）を入れ、８７℃で６時間
振盪しながらインキュベートした後、４℃にて一夜静置
した（第１反応）。

反応液をアスピレーターで吸引除去後、固相を緩衝液■
１　ｍｌにて２回洗浄した。洗浄後の緩衝液はアスピレ
ータ−にて吸引除去し、試験管に緩衝液■１００μ＃、
２０００μ単位の酵素活性を有する実施例１にて作製し
た４種の標識抗体５０μｅおよび固相を入れ、８７℃、
５時間振盪しながらインキュベートした（第２反応）。

反応液をアスピレータ−で吸引除去し、固相を緩衝液０
１　ｍｌにて２回洗浄した。洗浄後の緩衝液はアスピレ
ータ−にて吸引除去した。新しい試験管に固相を移し替
え、緩衝液■１００μｅを入れ、３７℃で５分間インキ
ュベートした。０．８　ｍＭ　　４−メチルウンベリフ
ェリル−β−Ｄ−がラクトピラノシド５０μｅを加え、
３７℃７１０分間酵素反応を行なわせた後、２．５ｇ＋
／の０．　Ｉ　Ｍメリシン緩衝液（ＯＨ１０，４）を加
え酵素反応を停止した。

励起波長８ｆｉ５ｎｍ、蛍光波長４．４８ｎｍにて反応
生成物４−メチルウンベリフェロンの蛍光強度を測定し
た。蛍光強度の標準として０．１　Ｍグリシン緩衝液に
溶解させたｌＸｌ０−７Ｍ４−メチルウンベリフェロン
の蛍光強度を１００とした。横軸にＨｕＩＦＮ−α濃度
、縦軸に蛍光強度をとり検量線を作成した。β−Ｄ　−
Ｇａｌ　１分子に対し、Ｆａｂ’がそれぞれ２．２　、
２．５　、８．８　、８．９分子結合した酵素標識抗体
の検量線において、ＨｕＩＦＮ−α濃度がＯｌ、Ｕ、／
ｇｌのときの蛍光強度の２倍の値となる蛍光強度を示す
ＨｕＩＦＮ−α濃度は、それぞれ１）．Ｕ、／ｍｌ　。

２１、　Ｕ、Ａｌ、　４．１．Ｕ７祇４１．Ｕ肩であつ
た。また、いずれの酵素標識抗体の場合でも、Ｈｕ　Ｉ
　ＦＮ−α濃度が２５６０１．Ｕ、／ｙまで検量線は右
上りの曲線となった。β−Ｄ−Ｇａｅ１分子に対し、Ｆ
ａｂ’が２．２分子結合した酵素標識抗体を用いた時の
検量線を第１図に示した。なお、第１図においてＨｕＩ
ＦＮ−α濃度が４０１．Ｕ、／ｄ以下の部分を拡大して
第２図に示した。

実施例３　バイオアラ苺イ測定値との相関実施例１の（
１）の様にして得たＨｕＩＦＮ−α溶液にさらに安定剤
としてヒト血漿アルブミンを加えたＨｕ　ＩＦＮ−α最
終製品１６０ツトについて、バイオアッセイによるＨｕ
ＩＦＮ−α定量値と本発明によるＨｕＩＦＮ−α定量用
試薬を用いたＨｕＩＦＮ−α定量値を比較した。バイオ
アッセイは実施例２に記載した方法で行なつた。本発明
によるＨｕＩＦＮ−α定量用試薬を用いた定量は実施例
２に準じて行なった。即ち、第１反応において検量線作
成用には緩衝液■にて・希釈した標準Ｈｕ　Ｉ　ＦＮ−
α５０μｅ１試料として緩衝液■にて希釈したＨｕＩＦ
Ｎ−α最終製品５０μ４を用いた。第１反応以後の操作
は実施例２と同様１ｉ−ｖた。試料の蛍光強度から標準
ＨｕＩＦＮ−αの濃度を横軸に、蛍光強度を縦軸にとっ
て作成した検量線を用いて試料中のＨｕＩＦＮ−α濃度
を求めさらにその値に希釈倍率を乗じてＨｕＩＦＮ−α
最終製品中のＨｕＩＦＮ−α濃度とした。バイオアッセ
イと本発明によるＨｕＩＦＮ−α定量用試薬を用いたＨ
ｕ　Ｉ　ＦＮ−α最終製品中のＨｕ　Ｉ　ＦＮ−α濃度
測定値゛の関係を第９図に示した。回帰式はｙ＝１．０
７ｘ−０，１）６、相関係数は０．９３、検体数は１６
であり良好な相関関係が認められた。

実施例４　　ＨｕＩＦＮ−α投与黛者血清中のＨｕＩＦ
Ｎ−α定量 実施例１の（１）の様にして得たＨｕＩＦＮ−α溶液に
さらに安定剤としてヒト血漿アルブミンを加えたＨｕＩ
ＦＮ−α最終製品を投与した患者から経時的に採取した
血清を試料として、血清中のＨｕＩＦＮ−α濃度をバイ
オアッセイおよび本発明によるＨｕｌＦＮ−α定量用試
薬を用いて定置した。バイオアッセイによる血清中のＨ
ｕＩＦＮ−α濃度は、実施例２に記載した方法で定量し
た。本発明にょるＨｕＩＦＮ−α定量用試薬を用いた血
清中のＨｕＩＦＮ−αの定量は実施例２に準じて行なっ
た。ただし、本発明のＨｕＩＦＮ−α定量性時 への血清の非侍異的影響を避けるために第％ｇｅｌａｔ
ｉｎ　　を含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
７，０（以後、緩衝液■と略称する）とし、標準ＩＦＮ
−α　には非動化ウサギ血清を添加してＨｕＩＦＮ−α
を定量した。

即ち、Ｈｕ　Ｉ　ＦＮ−α検量線作成のために、緩衝液
■にて希釈した標準Ｈｕ　Ｉ　ＦＮ−α゛５０μ４゜非
動化ウキギ血清５０μｅ１緩衝液■５０μｅおよび固相
を用いて第１反応を行ない、また、試料中ＨｕＩＦＮ−
α定量のために、試料血清５０μ４、緩衝液■１００μ
ｌ　および固相を用いて第１反応を行なまた。第１反応
以後の操作は実施例２と同様になった。

本発明によるＨｕＩＦＮ−α定量用試薬を用いて定量し
た血清中ＨｕＩＦＮ−α定量値とバイーオアッセイ定量
値との比較を行なった。相関係数は０．９６（検体数２
４）で良好な相関関係が認められた。なお、Ｈｕ　Ｉ　
ＦＮ−α投与後経時的に採取した血清中のパイオアッセ
イニよルＨｕＩＦＮ−ａ定量値が１０１．Ｕ、７ｍｌ以
下とされた検体を、本発明によるＨｕ　Ｉ　ＦＮ−α定
量用試薬を用いて定量した結果を第４図に示した。Ｈｕ
ＩＦＮ−α投与後６時間にピークを持つ明瞭なＨｕＩＦ
Ｎ−α濃度の推移が認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｎ、Ｎ／−０−フェニレンジマレイミドを化
学結合剤としたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗ＨｕＩ
ＦＮ−αＦａｂ’　を用いた場合の１ＨｕＩＦＮ−αの
検量線を表わす。横軸はＨｕＩＦＮ−α濃度（１，Ｕ、
／　ｄ　）を、縦軸はｌｏ−７Ｍ　４−メチルウンベリ
フェロンの蛍光強度を１００としたときの蛍光強度を表
わす。 第２図は、第１図のＨｕ　Ｉ　ＦＮ−α濃度が０〜４０
１、　Ｕ、　／　ｍｌの部分を拡大したものであり、横
軸、縦軸は第１図と同様である。 第３図は、Ｈｕ　Ｉ　ＦＮＮ二段最終製品中のＨｕＩＦ
Ｎ−α定量における、バイオアッセイによる定量値と本
発明によるＨｕＩＦＮ−α定量用試薬を用いた定量値の
関係を示す。横軸はバイオアッセイによる定量値（Ｉ　
Ｘ　１０６Ｉ、Ｕ、　／ｚｌ　）を、縦軸は本発明によ
るＨｕ　Ｉ　ＦＮ−α定量用試薬を用いた定量値を表わ
す。 第４図は、ＨｕＩＦＮ−α投与後の血清中ＨｕＩＦＮ−
α濃度の経時的変化を表わす。横軸はＨｕＩＦＮ−α投
与後時間（時間）を縦軸はＨｕＩＦＮ−α濃度（１，Ｕ
、／＃Ｉｌ　）を表わす。 ・　４０　８０　１６０　　　６４０　　　２５６０（
１，Ｕ、／屑ｌ）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗ヒトインターフェロン−α抗体またはそのペプ
   シン分解物Ｆ（ａｂ′）＿２を還元せしめた後該還元体
   をジマレイミド化合物を介してβ−Ｄ−ガラクトシダー
   ゼと結合せしめたことを特徴とするヒトインターフェロ
   ン−α定量用試薬。
2. （２）ジマレイミド化合物がＮ，Ｎ′−ｏ−フェニレン
   ジマレイミドである特許請求の範囲第１項記載の試薬。
3. （３）抗ヒトインターフェロン−α抗体またはそのペプ
   シン分解物Ｆ（ａｂ′）＿２が、アフィニティー精製し
   た抗ヒトインターフェロン−α抗体またはそのペプシン
   分解物Ｆ（ａｂ′）＿２である特許請求の範囲第１項記
   載の試薬。
4. （４）抗ヒトインターフェロン−α抗体またはそのペプ
   シン分解物Ｆ（ａｂ′）＿２を還元せしめた後、該還元
   体をジマレイミド化合物を介してβ−Ｄ−ガラクトシダ
   ーゼと結合せしめたヒトインターフェロン−α定量用試
   薬を用いて、サンドイッチ法により検体のヒトインター
   フェロン−α濃度を測定する方法。