JPH02294308A - アズラクトン官能基含有支持体及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の分野 本発明は、ポリマービーズ、膜、フィルムおよび被覆を
含むアズラクトン官能基含有支持体に関する。アズラク
トン官能バ含Ｇ支持体は、官能性物質を結合させて新規
の付加物支持体をｉＩ７るのに白゜用である。付加物支
持体は、錯化剤、触媒、および高分子試薬、酵素または
他の蛋白質含Ｈ支持体として、またはクロマトグラフィ
ー支持体として有用である。追加態様として、前記の支
持体の製造方法も開示されている。

本発明の背景 触媒、試薬、キレート化または錯化剤および蛋白質のよ
うな有用物質を不溶性支持体へ付着させることは周知で
ある。一般的化学工程および診断監視方法の両者におけ
る連続流れ系統の増加する利用度と相俟って、簡単な濾
過、再生（必要な場合）および再循環によるような系か
らの除去および回収の容易さの付随する利点を有するた
め、支持物質は現在の技術の至る所で使用されている。

この指標の一つは１９８２年に始められたＣｈｅｍｉｃ
ａｌ＾ｂｓｔｒａｃｔｓのＧｅｎｅｒａｌ　Ｓｕｂｊｅ
ｃｔ　ＩＩｎｄｅｘ中における別個の見出しとしてｒＰ
ｏｌｙｇｅｒ−ＳｕｐｐｏｒＬｅｄ　ＲｅａｇｅｎＬＳ
Ｊのリストである◎不溶性支持体物質に関しては、無機
ポリマー（顕著なのはシリカゲルおよびアルミナ）およ
び有機ポリマーが使用されている。しかし、反応速度に
直接影響を及ぼす、良好な多孔性による増加された能力
（特に、幾分膨潤し、かつ、溶剤および溶質が支持体内
の結合官能性に比較的自由に近づくことができるいわゆ
る、「ゲル型ポリマーの場合）、および支持体の極性の
比較的良好な制御（適切なコモノマーの選択によって）
のような因子のため有機ポリマー支持体の方が一般的に
好ましい。ボリスチレンが最も広く利用されている固体
支持体である。

最もしばしば使用されているボリスチレン支１：ｉ体に
付着させる官能性は、クロロメチル基である。

これらの反応性、固体支持体は、これらおよび他の業績
によって１９８４年に化学分野でノーベル賞を受賞した
Ｒ．Ｂ．　Ｍｅｒｒｌｒｌｅｌｄによって命名された（
Ｊ．＾ｔａ．　Ｃｈｅａｐ．　Ｓｏｃ．　８５．　２１
４９（１９６３））いわゆるｒＭｅｒｒｌ『ｌｅｌｄ　
　樹脂」である。Ｍｅｒｒｌｌ’ｌｌｄ樹脂は、固柑ペ
ブチド合成を行うためには極めて有用であるが、これら
の反応性、固体支持体としての広範囲の利用は、疎水性
ボリスチレン主鎖の相対的な非極性、クロライドイオン
の求核性置換を含むしばしば起こる予想できない付着反
応、およびポリマー１ｇ当りの反応性クロロメチルフエ
ニル基の比較的低い１七力のために限定される。クロロ
メチルフエニルおよび他の反応性官能性に関しては、Ｎ
．）［．ＭａＬｌ＋ｕｎ、Ｃ．Ｋ．Ｎａｒａｎｇおよび
Ｒ．ＰＪＩＩｌ！ａ＋ｍｓによってｒＰｏｌｙｍｅｒ　
ａｓ　Ａｉｄｓ　Ｉｎ　ＯｒｇａｎｌｃＣＩ＋ｅｓｉｓ
Ｌｒｙ　Ｊ第２章、＾Ｃａｄｅｓｌｃ　Ｐｒｅｓｓ：Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ（＋９８０）に論議されている。

反応性、不溶性支持体の現在の状態は、一つの支持体で
固体支持物質の多数の用途に広く適しているものはない
と記述することによって要約できる。要求される性質の
籟囲は、有機合成変換の媒介、海水からの貴金属の取出
し、または産業排出物からの重金属汚染物の除去、有機
反応または重合を行うための触媒としての支持金属の利
用、光学的異性体の分割、生物高分子の分離および生物
高分子の付むなどのような種々の用途を含む最終用途に
よってｉＬ＜＆化する。

アズラクトンは、不溶性支持体上の付芒基として以前に
は使用されなかった。しかし、アズラクトンは２例にお
いて有用であることが提案されている。

Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎｏ．４，０７０，３４８には、０．２〜
５モル％の架橋用モノマーおよび少なくとも１０モル％
の水溶性コモノマーが配合されている水膨潤性、架橋ビ
ーズコポリマーの製法が教示されている。このコポリマ
ーは、特許請求されている唯一の反応性基であるオキシ
ラン基を含めることによって主として蛋白質と反応性で
ある。しかし、２ーアルケニル　アズラクトン、２−イ
ソブロペニル−４．４−ジメチルーオキサゾロン−５　
（Ｃｏｔ．５；２〜３行）を含む数扛の［活性化力ルボ
キシル基Ｊ　　（Ｃｏｌ．４　；　４　２行）が挙げら
れ、がっ、この化合物と蛋白質の第一アミノ基との反応
が略図的に描写されている（Ｃｏｌ．５　：　６〜１４
行）。アズラクトンを親水性、架橋ビーズポリマー中へ
の組込みまたはアズラクトンー官能基含有不溶性支持体
と蛋白質または任意の他の官能性物質との反応に関して
の追加情報または可能にする開示は示されテイない。Ｕ
．Ｓ．Ｐ．Ｎｏ．４，０７０，３４８の架橋、ビーズコ
ポリマーは、すべて木質的に無水条件、すなわち、水を
排除するように注意して製造されている。

Ｌ．Ｄ．Ｔａｙｌｏｒ等は、Ｍａｋｒｏｍｏｌ　Ｃｈｅ
ｗ　Ｒａｐｌｄ　Ｃｏｍｍｕｎ，３．　７７９（１９ｇ
２）に、アズラクトンはポリマー支持体上の反応性基と
して有用なことを提案している。

２−ビニル−４．４−ジメチルアズラクトンを塊状重合
させてポリマー「ブラグＪ　　（ｐｌｕｇ）を形成する
ことのみが記載されている。架橋およびポリマービーズ
の生成に関しては言及されていない。

さらに、ある程度の長さに、ポリ（アズラクトン）の加
水分解の受け易さ、すなわち、水による開環反応［式（
ｌ）］が記述されている。加水分解は次のようにホモポ
リマー川の有機溶剤中にしばしば存在する痕跡の湿分に
よってすら起こる非常に起こり易いと考えられている： 雪 ＮＨ 署 この加水分解を受け易い傾向のために、アズラクトン官
能基含有支持体を水性媒質中において官能性物質と選択
的に反応させることができるとは仝く予想できない。

本発明の要約 要約すれば、本発明によって５モル部までの架橋剤を有
するポリマービーズを含む親水性アズラクトン官能基含
有支持体が提供される：また本発明によってＯ〜９９モ
ル部の範囲内の架橋用モノマーが配合されている基村上
の膜、フィルムおよび彼覆も提供される。

他の態様において、本発明によって、本発明のアズラク
トン官能基含有支持、体と官能性物質との間の開環反応
によって製造される新規の付加物支持体が提供される・
。付加物支持体は、錯化剤、触媒、試薬、吸着剤、クロ
マトグラフ支持体として、または生物学的活性支持体と
して有用である。

本発明によって、本発明の支持体製造の４ＦＩｉ類の方
法が提共される。アズラクトン官能基含有支持体の製造
には数種の方法が利用できる。方法の一つは、支持体に
アルケニルアズラクトンを加え（所望により、他のコモ
ノマーと共に）そして例えば光重合（適切な光開始剤を
利用して）によってその場所でモノマーを重合させる方
法である。

方法Ｉにおいては： （１）　　所望により、少なくとも１種の遊離基により
付加重合性の、水溶性モノマー （１１）少なくともＩ　ＰＩの、Ｎ−（メト）アクリロ
イルアミノ酸の水溶性塩、および （Ｉｌｌ）　　少なくとも１種の架橋用モノマの逆川懸
濁重合生成物によってアズラクトン官能基含ａポリマー
支持体の中間体としてカルボキシレート官能話含有ポリ
マー支持体を製造する。

環化剤と上記のカルボキシレート官能基含ａ支持体との
反応によって、アズラクトン官能基含有ポリマー支持体
が得られる。

本発明の方法■において、アズラクトン官能基含有支持
体は、 （１）　　所望により、少なくとも１種の、１！！離基
により付加重合性の、水溶性モノマー （Ｉ　Ｉ）　　少なくとも１社のアルケニルアズラクト
ン、および （Ｉｉ１）　　少なくとも１種の架橋用モノマーの逆相
懸濁重合生成物によって製造できる。

本発明の方法■においては、アズラクトン官能基含Ｈ支
持体は、 （１）　　所望により、少なくともＩＦＩの、ｉｔ！離
基により付加重合性のモノマー （１１）　　少なくともＩＦＩｉのアルケニルアズラク
トン、および （０１）　　所望により、少なくともＩ　ＦＮの架橋用
モノマー の分散重合反応生成物によって製造できる。

本発明の方法■においては、アズラクトン官能基含有支
持体は、一因体支持体上にアズラクトン官能基含有ポリ
マーを披罠することによって製造できる。

本発明のアズラクトン官能基含有支持体とアズラクトン
環と反応し得る官能性物質との反応（すなわち、開環反
応）によって本発明の付加物支持体が得られる。発明者
等は、この付加物形成反応は、水溶液中の溶解求核剤、
特に求核剤が第一アミン官能性であるときに高度に起こ
ることを見出した。例えば蛋白質官能性物質上のアミン
求核剤の濃度は、水溶媒中における濃度より最もしばし
ば実質的に低いことを考えたとき、この反応の選択性は
さらに驚ろくべきことである。本発明の以前には、アズ
ラクトン乱は、溶解求核剤と反応するより主として水と
反応する、すなわち、加水分解すると考えられていた。

支持体の親水性または疎水性は、その利用価値を決定す
る上で極めて重要である。親水性支持体の明白な利点は
、支持物質の操作の多くが水性媒質中で行えることであ
る。水は貴金属または有害金属イオン除去を行う場合、
生物学的流体およびバイオシステムの成分の診察上の監
視用並びに多数の化学反応において実質上独占的溶剤で
あり、水中で膨潤するポリマー支持体を利用することが
しばしば有利である。水溶媒は、溶質および親水性支持
体内並びに支持体一水界面での反応性基との追加の遭遇
および相互作用を容易にする。

親水性ポリマー支持体物質は、非水性系においても同様
な用途があり、かつ、有利である。親水性を付与する官
能基は、高度に極性であり、溶剤の影響に敏感な支持体
物質機能は、ポリマー主鎖の極性により、特に速度の点
で著しく影響されるであろう。支持物質の局部環境を決
定する上でのポリマー主鎖の重要性は、Ｈ．Ｍｏｒａｖ
ｃｔｚ．　Ｊ．Ｍａｃｒｏｓｏｌ．　Ｓｃｌ．　−−　
ＣＩｕｅｓ．、Ａ−１３．　３１１（１９７９）に記述
されている。

前記したように、υ，！ｌｉ．Ｐ．ｌｌｈ４，０７０，
３４８には０．２〜５モル％の架橋用モノマーおよび少
なくとも１０モル％の水溶性モノマーが配合されている
コポリマーを基剤とする水膨潤性、架橋ビーズが開示さ
れている。特許権所ａ者は、Ｃｏｌ．６、６６〜６７行
に開示されているように高度の水中での膨潤、すなわち
５〜１００倍を有するビーズを希望している。この高度
の膨潤は、蛋白質との高い結合能力を得るために重要で
あると考えられている。υ．ｓ．ｐ．嵐４，０７０，３
４８のＣｏｌ．９、３０〜３２行において、「生物学的
活性物質の殆んど大部分は膨潤粒子内の広いメッシュの
“中間間隙”　　（ｈｏｌｌｏｗ　ｓｐａｃｅ）中に見
出される」と述べている。

しかし、多数の用途、特にクロマトグラフ用途では水性
媒質中において高度の膨潤性を示す支持体物質を便利に
使用することができない。

驚ろくべきことに、発明者等は官能性物質と顕著に高い
結合能力を有するアズラクトン支持体が水中で３倍以下
のような非常に緩和に膨潤する高度に架橋した支持体で
得られることを見出した。

所望の場合には、高度の架橋は５〜９９モル部（モル％
）の架橋川モノマー、好ましくは７〜９９モル部、さら
に好ましくは１０〜９９モル部、最も好ましくは３０〜
９９モル部の少なくとも１種の架橋川七ノマーをアズラ
クトン官能基含有支持体に配合することによって得られ
る。

本出願において： 「アズラクトン官能基含有支持体」は、アズラクトン官
能基含有ポリマーまたは基材の少なくとも一表面上に被
覆したアズラクトン官能ｕａＲポリマーを含む物品の意
味である； 「アクロイル」はメタクリロイル化反応によつて得られ
る１−オキソー２−ブロベニルのみならず１−オキソー
２−メチループロペニルも表わす；「アルキル」は１〜
１４個の炭素原子を有する飽和線状または分枝状鎖炭化
水素から水素原子を除去した後の一価残基の意味である
； 「アリール」はＳＳＮおよび非過酸化物Ｏから選ばれる
３個までのへテロ原子を含むことができる５〜１２個に
環原子を有する１個の環または２個の溶融もしくは鎖状
に連結する環から成る芳香族またはへテロ芳香族化合物
から１個の水素原子を除去した後のーＩ残基の意味であ
る。炭素原子は３個までのハロゲン原子、０１〜Ｃ４ア
ルキル、ｃ　　−ｃ　　アルコキシ、Ｎ，　Ｎ−ジ（Ｃ
１〜Ｃ４アルキル）アミノ、ニトロ、シアノおよびＣｌ
〜Ｃ４アルキルカルボン酸エステルによって置換できる
。

「アーレニル」は６〜２６個までの炭素およびヘテロ原
子（この場合のへテロ原子は３個までのＳ，Ｎおよび非
過酸化物Ｏである）を有するアルキルおよびアリール基
の両者を含有する炭化水素のアルキル部分から１個の水
素原子を除去した後に残留する一価残基の意味である。

「アズラク１・ン」は式Ｉの２−オキサゾリン５−オン
基および式■の２−オキサゾリン−６＝オン基の意味で
ある Ｉ ■ 「部」は別記しない限り重量部の意味である。

「カルボキシレート」は一ＣＯＭ”（式中、Ｍは水素、
アンモニウムまたはＬｉ，ＮａまたはＫのようなアルカ
リ金属である）を意味する。

［マクロボーラスＪ　　（Ｉｌａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ　
）は１ポリマー、溶剤またはｐｏｒｏｇｅｎ使用を必要
としないで架橋剤または二官能性七ノマーの量が２０部
以Ｌである架橋ポリマーを言う。

「生物学的活性」とは、抗体、抗原物質酵素、補因子、
酵素阻害物質、レクチン、ホルモン、レセブター、凝折
囚子、アミノ酸、ヒストン、ビタミン、薬剤、細胞表面
マーカーおよびこれらと柑交作用をする物質のような生
化学的、免疫化学的、生理学的、薬理学的活性である物
質を言う：「ゲルー型」とは、架矯剤または二官能性モ
ノマーの量が、２０部未満である架橋ポリマーを言う。

括弧間に示した構造および式は、ポリマーの部分的構造
である。

本発明の詳細な説゜明 本発明によって、それらの表面の少なくとも一つに式Ｖ
： （式中、ＲｌはＨまたはＣＨ　　であり、Ｒ２およびＲ
３は独立に、１〜１４個の炭素原子を有するアルキル基
、３〜１４個の炭素原子を有するシクロアルキル基、５
〜１２個の環原子を有するアリール基、６〜２６個の炭
素およびＯ〜３個のＳ，Ｎおよび非過酸化物０ヘテロ原
子を有するアレニル基であるか、またはＲ２およびＲ３
はこれらが結合している炭素原子と共に４〜１２個の環
原子を含何する炭素環式環を形成することができ、そし
て ｎは整数０または１である）の単位をＨするアズラクト
ン官能基ａＨ支持体が提洪される。

これらの支持体は、架橋アズラクトン官能基含有ポリマ
ービーズでもよくまたはこれらは少な《ともその一表面
上にアズラクトン官能基含有ポリマーの被覆を有する固
体基材でもよい。この層はｌｎｍ〜５ｍｓの範囲内の厚
さを有することができる。

有用な固体基材には、ガラス、セラミックス、火で処理
されていない金属および非金属酸化物、クレー、ゼオラ
イトのような無機物固体および有機ポリマーが含まれる
。

本発明によって、式二 方法Ｉ： ２工程逆相懸濁重合 本発明の方法Ｉのポリマーおよび付加物支持体は、下記
の化学方程式に示す方法によって得られる。

■ ［式中、 Ｒｌ，Ｒ２、Ｒ３およびｎは前記の定義と同じであり はアリールである）であり、そして Ｇは、付加物ビーズの吸告、錯化、触媒、分離または薬
剤機能を行うＨＸＧの残 基である〕を有する付加物支持体も提 洪される。

ＨＸＧは、生物学的活性物質、染料、触媒、試薬などで
ある。

本発明のアズラクトン官能基含有支持体数種の方法の一
によって提供される。

＋ 式Ｖの架橋親水性、アズラクトン官能基含ａポリマー支
持体は、新規の２−工程方法によって製造される。第１
工程において、次の群のモノマーを遊Ｒ　ＩＩ．ｍ合反
応に処する： （１）０〜８９モル部の、少なくともＩＦＩの水溶性モ
ノマー； （ＩＩ）．　　１〜９９．９モル部の、少なくとも１種
のＮ−（メト）アクリロイルアミノ酸の水溶性塩；およ
び （ｉｌｌ）　　０．　　１〜９９モル部、好ましくは７
〜９９、さらに好ましくは１０〜９９、最も好ましくは
３０〜９９モル部の、少なくともＩ　Ｐｉの架橋川モノ
マー 上記の重合反応の生成物は、弐■の架橋、親水性、カル
ボキシレート官能基含有支持体である。

方法の第２工程には該カルボキシレート官能基含ｔｆ支
持体を環化剤で処理して本発明のアズラクトン官能基含
有支持体の形成が含まれる。

ポリマー支持体の親水性の程度は、使用する水溶性モノ
マーの量によって殆んど決定されるが、若干の親水性は
架橋剤および生成された官能入（、すなわち、アミドー
アミド、アミドーエステル、またはアミン、アルコール
またはチオール求核剤（上記に定義したＨＸＧ）を伴う
アミドーチオエステルによって、開環、アズラクトン／
求核剤反応（化学方程式！の工程３）によって付与され
る。

従って、本発明の最も厳密な意味においては、水溶性モ
ノマーを含めることは任意的である。好適な水溶性モノ
マーは、１００部の水中において少なくとも３部の溶解
度を示す。好ましいモノマーには、ビニル基含有並びに
アクリロイル基含有化合物が含まれる。一かような七ノ
マーの代表的例には、アクリルアミド、メタクリルアミ
ド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ジアセトンアク
リルアミド、Ｎ−ビニルビロリドン、ヒドロキシエチル
メタクリレート、２−アクリルアミドー２−メチルブロ
バンスルホン酸およびその塩、Ｎ−　（３−メタクリル
アミドブ口ビル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−１リメチルアンモニウ
ム塩、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、
アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸およびこれらの
組合せが含まれる。好ましい水溶性モノマーは、Ｎ，Ｎ
−ジメチルアクリルアミドおよびＮ−ビニルビロリドン
である。

Ｎ−アクリロイルアミノ酸塩七ノマーには、式■のＮ−
アクリロイルアミノ酸のアンモニウム、ナ１・リウム、
カリウムおよびリチウム塩であり、例えば水酸化アンモ
ニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは水酸
化リチウムの水性溶液と式■の化合物との等モル量を混
合（く３０℃で）することによって製造される。

■ （式中、Ｒｌ　，Ｒ２　　Ｒ３およびｎは上記の定義と
同じである）。

Ｎ−アクリロイルアミノ酸化合物は周知であり、かつ、
容晶に合成できる。ｎ−０であり、適当なアミノ酸のナ
トリウム塩である式■の化合物は、例えばκ．Ｉｌｕｅ
ｂｎｅｒ等Ｍａｋｒｏｍｏｌ．　ＣＩ＋ｅａ＋．．　　
１１、１０９（１９７０）によってアクリロイル化する
ことができる、またはさらに効率的には、ケトンのＮ−
アクリロイルアミノ酸へのｏｎｅ−ｐｏｔ転位を含むＵ
．Ｓ．Ｐ．Ｎａ４，６９４．１０３に記載の方法によっ
て製造できる。

ｎ−１である式■の化合物の有用な製法は、Ｄ．１，Ｈ
ｏｋｃ等エし堕追見．Ｓｅｉ．：　　Ｐｏｌｙｍ．肋μ
１以Ｌ，リ、３３１１（１９７２）によって開示されて
いるような３，３−ジ置換アクリル酸の転位である。

不溶化は系から支持体（ビーズのような）の除去を容昌
にするたーめの必要条件である。これは複数の重合性基
を含有し、それの重合反応への関与の結果ポリマー主鎖
の物理的結合、すなわち架橋が得られるモノマーを含ま
せることによって達成できる。架橋は、機械的安定性が
実質的に増進し、かつ、ある程度のビーズ寸法の制御が
架橋の程度の操作によって行うことができる、すなわち
、股に一定の重合条件では架橋剤の二が多ければビーズ
寸法は小さくなるから、特にビーズのようなポリマー支
持物質において望ましいことである。

架橋度は、主として支持体物質の意図する用途によって
決まる。すべての例において、ポリマーはすべての溶剤
に不溶性であり、かつ、本質的に不定の分子量を有する
。相当高い能力を必要とし、かつ、膨潤ポリマー支持体
中へ拡散し得る比較的小さい溶質反応パートナーを含む
多くの用途に対しては、低〜中程度の架橋度が望ましい
。Ｄ．Ｃ．Ｓｈｃｒｒｌｎｇｔｏｎ　、Ｂｒ．　Ｐｏｌ
ｓ．　Ｊ．、１８Ｓｌ（１４（１９８４）によれば、こ
れらの架橋、膨潤性支持体（「ゲルー型」ポリマーと呼
ばれる）は、１〜２０部の多官能性モノマーを含めるこ
とによって得られる。膨潤による物理的膨張の低い度合
が要求され、比較的低い能力が許容されるある種の用途
に対しては（クロマトグラフ力ラムまたはカラム反応器
のような限定された流れ系統内で行なわれるある種の操
作におけるような）、２０部以上の多官能性モノマーの
共重合によって得られる高度に架橋した疎水性系が利用
される。これらは、一般に非膨潤性と考えられ、そして
溶質／支持体反応は主として溶媒／支持体界面で起こる
と考えられているいわゆる「マクロボーラス」ポリマー
である。これらの支持体の用途には、これらの大きい寸
法のためポリマー網状構造中に拡散することができない
生体高分子のような大きい溶質が含まれる。

要約すれば、先行技術では疎水系においては２０部以上
の架橋剤では非膨潤系が得られると教示している。

しかし、発明者等は本発明の親水性支Ｉ！ｊ体に関して
、水性媒質中において低い膨潤度を得るためには、上記
のようないわゆる非膨潤、疎水性、マクロボーラス樹脂
・において一般に使用されている２０部より実質的に高
い濃度の多官能性七ノマーが必要であることを見出した
。これは水中におけるこれらの親水性支持体を利用した
結果であり、そして、高度の親水性は多官能性モノマー
が大部分高度に極性官能基から成るからこれら自体によ
って付与されたものである。

先行技術では、一般に、架橋ポリマービーズを得るため
には、ポリマー支持体（ビーズ）は疎水性コモノマーと
疎水性架橋川モノマーから成ると教示されていた。これ
らは１〜２０部の架橋剤が存在するときは膨潤すること
は公知であった。２０部以上の二官能性モノマー（架橋
剤）では、本質的に非膨潤性ビーズが得られた。υ．Ｓ
．Ｐ．ｋ４．０７０，３４８には、Ｏ　−　２　〜５　
ｍｏｆｆ％の架橋用モノマーでは、水に高度に膨潤性の
ビーズが得られることが教示されている。特許権所有者
は、この低い度合の架橋および随伴する高度の膨潤が高
い結合能力を得るために必要であると考えている。

本発明においては、親水性コモノマーおよび親水性架橋
剤を使用している。かように製造された支持体の膨潤は
、存在する多官能性架橋剤の量に反比例して変化する。

低い膨潤度（非膨潤容積の３倍未満）を有するポリマー
支持体（一緒に充填されたビーズのような）は、一般に
２０部より実質的に多い二官能性架橋剤を必要とする。

驚ろくべきことに、５モル％以上の架橋剤を使Ｉ１１シ
て（親水性系において）も水中のポリマー支持体の低い
膨潤度および高い結合能力が得られる。

かような支持体は、錯化剤、触媒、ポリマー試薬、クロ
マトグラフ支持体および酵素一、他の蛋白質−および他
の生体高分子一ＩＵｌ体として有用である。

低い膨測度であり、しかも高い結合能力を維持するポリ
マー支持体を得るためには、親水系においては実質的に
高い量の架橋剤が必要である。かようなポリマー支持体
は、クロマトグラフ用途およびカラム反応器において特
に有用である。

好適な多官能性、架橋用モノマーには、エチレンジアク
リレート、エチレンジメタクリレート、トリメチロール
プロパントリアクリレートおよびトリメタクリレートの
ようなエチレン状不飽和（α，β一不飽和）エステルお
よびメチレンビス（アクリルアミド）、メチレンビスメ
タクリルアミド）　、Ｎ，Ｎ’−ジアクリロイル−１．
２−ジアミノエタン、Ｎ，Ｎ’　−ジメタクリロイル−
１．２−ジアミノエタンのようなα．β一不飽和アミド
および２−アルケニルアズラクトンと式■および■； ｕ−ＣＪ ｏ＝０ 工 ｕ−ＣＪ−Ｌ） 工 ｏ＝Ｑ によって表わされるような短鎖ジアミンとの反応生成物
が含まれる。

架橋用モノマーは水には少なくとも少し可溶性である必
要はあるが、水溶性モノマー成分に対して定義したほど
水溶性である必要はない。ゲルー型ポリマーの場合には
比較的大量の水溶媒と共に比較的少割合の架橋用モノマ
ーおよびしばしば水溶性モノマー成分が使用され、特に
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドおよびＮ−ビニルピロ
リドンは架橋用モノマーの溶解を容易にするため、この
ことは一般に問題ではない。しかし、架橋川七ノマーの
濃度が２０部以上であるマクロポーラスポリマーの場合
には、架橋用モノマーの溶解を容晶にする補助溶剤の添
加が必要であろう。好適な補助溶剤には、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド、ＮＮ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−
メチルビロリドンおよびジメチルスルホキシドが含まれ
る。

本発明の方法Ｉにおいて使用する重合方法は、しばしば
「逆相」または「逆」懸濁重合と呼ばれ、この方法の全
般的論議は、Ｃ．Ｃ．Ｓｃｈｌ　ｌｄｋｎｅｃｌ＋ｔお
よびＩ．Ｓｋｅ１ｓｔ編集のｒＰｏｌｙｍｃｒ１ｚａｔ
１ｏｎ　ＰｒｏｃｃｓｓＪＶｌｌｃｙ−Ｉｎｔｃｒｓｃ
１ｃｎｃｃ，　ＮｃＷ　ＹｏｒｋＳ１２３　〜１２４頁
（１９７７）のｒｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　Ｐｏｌｙｍｅ
ｒｌｚａｔｌｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｎｏｎ−Ａｑｕｅｏｕｓ
　ＭｃｄｌａＪにＭ．Ｍｕｎｚｃｒ等によって発表され
ている。本発明の七ノマーは水溶性であり、従って水に
不混和性懸濁媒質を必要とするため、通常の懸濁重合法
（水が通常の懸濁用媒質である）の逆が必要である。

懸濁用媒質の主な［！的は、重合川の分散のための不活
性媒質としての機能の他に、重合反応によって生成され
る熱を消散させることである。懸濁用媒質の重要なｃ１
−ｔ！４ｌ：の一つはその密度である。均一寸法の球状
ポリマービーズを得るためには、ビーズは一たん形成さ
れたら懸濁媒質中において収縮または浮揚してはならな
い。従って、懸濁用媒質および水性相は、ほぼ同じ密度
を有しなければならない。

実際の重合は、溶解されたモノマーおよび開始剤を含有
する水の個々の小滴中で起こる。はげしいかく拌によっ
て小滴が形成され懸濁用媒質中に維持され、得られるビ
ーズ寸法および別個性（すなわち、凝集しない）は、−
１ａに輝水性および親水性の両部分をＨする界面活性分
子である各種の懸濁用薬剤の添加によって制御される。

重合工程（王程１）それ自体は本発明における新規の態
様ではない。当業者には明らかであるように、懸濁用媒
質の性質、使用する水の量、開始系、架■エ剤の量、か
く拌速度、および懸濁剤は本質的にすべて独立であり、
しかも、ポリマービーズの寸法および形状を決定する重
要な変数である。

如何なる重合条件の特定の型に拘束されたくないが、発
明者等はＧ．ｌ，．ＳＬａｌ＋ｌ等、Ｊ．　Ｏｒｇ．　
Ｃｈｃｍ、ｕ２３４２４（１９７９）に記載されている
逆｝■懸濁重合法が極めて有用であることを見出した。

この方法においては、ヘブタンと四塩化炭素との混合物
を懸濁用媒質として使用し：開始系は過硫酸アンモニウ
ム／Ｎ，Ｎ，Ｎ′１Ｎ′−テトラメチル−１．２一ジア
ミノエタンレドックスカップルであり、かく拌速度は３
　０　０　ｒｐｍであり；そして懸濁剤はソルビタンセ
スキオレエートである。匹敵する物質による各種成分の
置換はもちろん可能であり、かつ、かような置換は本発
明の範囲外とはならない。例えば、ソルビタンセスキオ
レエートの代りにコポリ（インオクチルアクリレート／
アクリル酸）またはコボリ（ヘキサアクリレート／ナト
リウムアクリレート）のようなポリマー安定剤の使用に
よって比較的一貫して非凝集ビーズ生成物が得られるこ
とが見出された。

本発明の方法ｌの工程２は、カルボキシレート官能基含
Ｈ支持体のアズラクトン官能基含Ｈ支持体への転化から
成る。これは環化剤（ＣＡ）の使用によって行われ・る
。環化剤は、カルボキシレート官能基ＳＨ支持体と反応
してアミドカルボニル話による分子内反応を受２ク易く
、下記の化学方程式ＩＡに記載のアズラクトンを形成す
る中間体付加物を形成する。この感受性はカルボニルに
よる求咳性反応のための良好な離脱基［下記の０　（Ｃ
Ａ））の形成を伴う。

化学方程式ＩＡ （式中、Ｒｌ　．　Ｒ２　．Ｒ３およびｎは前記の定義
と同じである）。

（括弧間に示した構造および式は環化反応に活溌に関与
する側鎖を示したポリマーの部分構造である。括弧の使
用は通常の意味の化学中間体または活性化された錯体で
ある。点線は部分結合であり、δは部分的イオン電荷で
ある。） カルボキシレート官能基含有支持体の転換用の有用な環
化剤には、例として、無水酢酸、無水トリフルオ口酢酸
、およびメチル、エチルおよびイソプロビルクロロホル
メートのようなアルキルホルメートが含まれる。Ｎ，Ｎ
’　−ジシクロへキシルカルボジイミドのようなカルボ
ジイミドも有効に使用できるが、カルボキシレート官能
基含Ｈ支持体を酸性化して、次にカルボジイミド試薬を
使用してカルボキシレー１・官能基含有支持体をアズラ
クトン官能基含ａ支持体に環化できるようにする追加工
程を必要とする。本発明の環化工程の理解を容昌にする
ために、前記の環化剤の使用によって得られる中間体を
下記に順に示す。

環化反応の過程は、ポリマー支持体の赤外スペクトルの
検査によって容易に監視できる。約１８２０ｃｍ−１で
のカルボニル伸縮吸収の出現は、アズラクトン基の証拠
である。実際に、ポリマーに対する共有結合用の連鎖と
してアズラクトン基が有用な理由の一つは、アズラクト
ン官能基含有支持体の合成におけるこの赤外吸収の出現
または他の官能性物質とのその後の反応におけるこの吸
収の消失のいずれかでこの赤外吸収を観測することによ
って反応を監視できることである。この吸収は強力であ
り、アズラクトンの極めて特徴的のものであり、他の共
通の吸収が存在しない赤外スペクトル領域に存在する。

このことは、それらの赤外スペクトルにこれらの独特の
特徴を有しないクロロメチルフエニルおよびオキシラン
のような他の結合用官能基にまさる決定的利点である。

現実に、これらの後者の基の結合反応を監視するための
便利な分析方法は存在しない。

低価格、入手性および環化温度での液体状態のため、無
水酢酸が好ましい環化剤である。典型的には、カルボキ
シレート官能基含有支持体を、無水酢酸によって覆い、
４０〜１００℃、好ましくは８０〜１００℃の温度で２
〜２４時間加温する。

環化反応後に、ポリマー支持体をａ遇する。無水酢酸が
特に好ましい理由は、環化反応の副生物であるアルカリ
金属酢酸塩が無水酢酸に非常に溶解性であり、従って、
アズラクトン官能基含有支持体から容易に除去できるこ
とである。次いで支持体を直接乾燥または乾燥前にアセ
トン、トルエン、エチルアセテート、ヘブタンおよびク
ロロホルムのような非反応性有機溶剤を使用して一連の
洗浄操作もしばしば行゛なわれる。

方法■： １工程逆相懸濁重合 本発明の方法■のポリマー支持体は、下記の化学方程式
Ｈに示した方法によって得られる。

この方法は、方法Ｉにおいて使用したのとおなじ亜合方
法によって行い、かつ、同じ水溶性モノマーおよび架橋
剤を使用する。主な相異は、Ｎ一アクリ口イルアミノ酸
塩、■の代リアルケニルアズラクトンモノ＊＋、Ｘを使
用することである。

Ｎ−（メト）アクリロイルアミノ酸の塩をアズラクトン
に代えたのを除いては方法Ｉと同じ反応体量である。こ
の方法では、方法Ｉの２−工程法とは人なり、１−工程
でアズラクトン官能基含有支持体が都合良く得られる。

この方法の幾つかの特徴は、先行技術に鑑みて驚異的で
ある。第１に、アルケニルアズラ“タトン、Ｘは懸濁用
媒質に非常に良く溶解し、しかも重合工程に不利な影響
を及ぼすことなくポリマー支持体（ビーズのような）中
に容品に配合されることである。［このことはｕ．ｓ．
ｐ．胤４．０７０．３４８　（下記の実施例４７および
４８を参照）の教示を使用して観察された事項と鮮明な
相違である。］第２に、アズラクトン環は、この重合工
程の間水性相中における水によって加水分解されない。

このことも、上記のＵ．Ｓ．Ｐ．ＮｃＬ４，０７０，３
４８およびＴａｙｌｏｒの教示を考察すると注目すべき
ことである。重合工程の後に、ビーズは例えば濾過によ
って単離し、所望ならば、一連の洗浄工程に処し、そし
て、乾燥させることができる。

有用なアズラクトンモノマーおよびそれらの合成は、Ｕ
．Ｓ．Ｐ．Ｎｌ４．　３７８，　４　１　１およびＲｎ
ｃｙｃｒｏｐｅｄｌａ　ｏｒ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ　ａｎｄｈｇｌｎｅｅｒｌｎｇ　ｓ　Ｖｏｌ．
１１、第２版、Ｖｌｌｅｙ　，　Ｎ．Ｙ．１９８８、５
５８　〜６７１頁のｒＰｏｌｙ　ａｚｌａｅｔｏｎｅｓ
　Ｊに記載されており、（なお、両引例は本明細書の参
考になる）、かつ、 ２−ビニル−４．４−ジメチル−２−オキサゾリンー５
−オン、 ２−イソブロペニル−４．４−ジメチル−２−オキサゾ
リンー５−オン、 ２−ビニル−４．４−ジェチル−２−オキサゾリンー５
−オン、 ２−ビニル−４−エチル−４−メチル−２−オキサゾリ
ン−５−オン、 ２−ビニル−４−ドデシル−４−メチル−２−オキサゾ
リン−５−オン、 ２−ビニル−４．４−ペンタメチレン−２−オキサゾリ
ン−５−オン、 ２−ビニル−４−メチル−４−フエニル−２ーオキサゾ
リンー５−オン、 ２−イソブロベニル−４−ベンジルー４−メチル−２−
オキサゾリン−５−オンおよび２−ビニル−４．４−ジ
メチル−１．３−オキサジンー６−オンが含まれる。

好ましいアズラクトンモノマーは、２−ビニル−４．４
−ジメチノレ−２−オキサゾリンー５−オン（これはＳ
ＮＰＥ，　Ｉｎｃ．、ＰｒＩｎｃｅｔｏｎ　ＳＮＪから
商用として入手できる）、２−インプロペニル−４．４
−ジメチル−２−オキサゾリンー５−オンおよび２−ビ
ニル−４．４−ジメチル−１．３−オキサジン−６−オ
ンである。

方法■： 分散重合 本発明の方法■のポリマー支持体は、［分散重合」と呼
ばれる重合方法、特に有機媒質中における分散重合によ
って得られる。方法■と幾分類似のこの方法においては
、七ノマーおよび溶媒は最初に均質である。重合開始後
間もなく、ポリマーは粒子として分離し、次いで重合は
不均質方法で続けられる。重合工程の間、ポリマー粒子
の凝集を防止するためにポリマー「分散剤」または「安
定剤」が典型的に使用される。非水性媒質中における分
散重合の方法は、当業界において周知であり、かつ、例
えばＥ．Ｊ．ＢａｒｒｅｔｔによりｒＤｉｓｐｅｒｓｌ
ｏｎ　Ｐｏｌｙｍｅｒ１ｚａｔｌｏｎ　Ｉｎ　Ｏｒｇａ
ｎ１ｅＭｅｄ１ａ　Ｊ　、Ｖ１１ｅｙ　，　Ｎ．Ｙ．　
１９７５に詳述されている。

本発明の方法ｍのアズラクトン官能基含有支持体の製造
用として有利なことが証明されてい、る分散重合法は、
Ｙ．Ａｌｓｏｇ等によってＢｒｌｔ．　Ｐｏｌｙ．　Ｊ
．、ｌ９８２、１８１に記載されている方法である。

式Ｖのアズラクトン官能基含有ポリマー支持体は、一般
に次の群のモノマー電 （ｌ）１〜１００モル部の、少なくとも１種の式Ｘのア
ルケニルアズラクトン； （Ｉｉ）　　０〜９９モル部の、少なくとも１種の架橋
用モノマー；および （１ｍ　　Ｏ〜９９モル部の、少なくとも１種のコモノ
マー を遊離基重合反応に処することによって方法■によって
製造される。

この重合方法において使用するのに好適な架橋用モノマ
ーには、方法！および■用として有用な架橋用七ノマー
が含まれる。しかし、分散重合法では水溶解度は判定基
準ではなく、むしろ分散媒への溶解度が判定基準となる
から、例えばジビニルベンゼンのよう“なジビニル化合
物のような他の架橋剤が使用できる。

方法■による支持体の製造用として有用なコモノマーに
は、方法ＩおよびＨにおいて有用な水溶性コモノマーが
含まれるが、この場合にも水溶性でない追加のコモノマ
ーも含まれる。分散媒中ヘの初期溶解度を有することを
条件として、任意の遊離基によウて重合性のモノマーも
コモノマーとして使用できる。

これらの例には、スチレン、α−メチルスチレン、２−
および４−ビニルビリジンのようなビニル芳香族モノマ
ー；アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン
酸、フマル酸およびクロトン酸のようなα，β一不飽和
カルボン酸；メチルメタクリレート、プチルメタクリレ
ート、２−エチルへキシルメタクリレート、エチルアク
リレート、プチルアクリレート、イソーオクチルアクリ
レート、オクタデシルアクリルレート、シクロヘキシル
アクリルレート、テトラヒド口フルフリルメタクリレー
ト、フエニルアクリレート、フエネチルアクリレート、
ペンジルメタクリレート、αーシアノエチルアクリレー
ト、無水マレイン酸、ジエチルイタコネート、アクリル
アミド、メタクリ口ニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリ
ルアミド、およびＮ−ブチルアクリルアミドのようなα
，β一不飽和カルボン酸誘導体；ビニルアセテートおよ
びビニル２−エチルヘキサノエートのようなカルボン酸
のビニルエステル；ビニルクロライドおよびビニリデン
クロライドのようなビニルハライド：メチルビニルエー
テル、２−エチルヘキシルビニルエーテルおよびプチル
ビニルエーテルのようなビニルアルキルエーテル；エチ
レンのようなオレフィン；Ｎ−ビニルビロリドンおよび
Ｎ−ビニル力ルバゾールのようなＮ−ビニル化合物；メ
チルビニルケトンのようなビニルケトンおよびアク口レ
イン並びにメタクロレインのようなビニルアルデヒドが
含まれる。

分散重合技術の熟練者には周知のように、不活性稀釈剤
または分散媒は、モノマーまたは七ノマー混合物を溶解
させなければならないが、ポリマーの形成されるに゛伴
いこれを沈殿させるものを選ばなければならない。この
ことは架橋ポリマーは全溶剤に不溶性であるから該ポリ
マーの製造の場合に特に重要である。従って、分散媒は
架橋体の形成の場合より重合工程の間離散粒子の分離に
好都合であるように選択しなければならない。分散媒の
決定または特定の媒質中１こおいて分散重合できる適切
な七ノマーを選択する場合の助けとなる考えの一つは、
溶解バラメーターの概念である。

この概念および分散重合との関係は、前記の１３ａｒｒ
ｃｔｔ　　（第４章）に詳細に論議されている。多数の
溶剤および若干のポリマーの溶解バラメーター値の表並
びにポリマーおよびコポリマーの溶解パラメーター値の
評価方法は、Ｐｏｌｙｍｅｒ　ｔｌａｎｄｌ＋ｏｏｋ，
Ｊ．ＢｒａｎｄｒｕｐおよびＥ．ｌＬ　ｌｍｍｅｒｇｕ
ｔ編集、第２版、Ｖｌｌｅｙ　．　Ｎｅｗ　ＹｏｒｋＳ
１９７５、ＩＶ−３８７　〜３３８に見出すことができ
る。一般に、分散重合を成功させるためには、分散媒お
よび形成するポリマーの溶解パラメーターは、少なくと
も約１〜１．５、好ましくは１．５〜２またはそれ以上
の溶解パラメーター単位の差がなければならない。従っ
て、大部分のモノマー混合物に対して分散媒として有用
な溶剤には、ペンタン、ヘキサン、石油エーテル、シク
ロヘキサンおよびトルエンのような非極性炭化水素およ
びメタノール、エタノール、イソブロパノールおよびｔ
−ブタノールのようなアルコールである極性ヒドロキシ
溶剤が含まれる。

本発明の方法■において有用な開始剤には、分散媒に可
溶性であるすべての有利基開始剤が含まれる。当業界に
おいて周知であるように、開始剤の選択は、重合を行う
温度に依存する。５０℃以上のような高められた温度で
有用な開始剤には、アゾビスイソブチロニトリルのよう
なアゾ化合物、ペンゾイルパーオキサイド、ジーｔ−プ
チルパーオキサイド、ｔ−プチルハイドロパーオキサイ
ドおよびクメンハイドロバーオキサイドのような過酸化
物またはハイドロパーオキサイドが含まれる。

室温のような比較的低温度用としては、例えばｔ一アミ
ンと組合せた過酸化物またはハイドロバーオキサイドの
ようなレドックス開始剤が使用できる。かようなレド゜
シクス系の１種は、ペンゾイルパーオキサイド／Ｎ，Ｎ
−ジメチルアリンである。

開始剤はモノマー組成物の０．１〜１０重量％、好まし
くは０．５〜２．０重量％の範囲内の量で存在できる。

前記したように、Ａｌｓｏｇ等の分散重合法が方法■に
よるアズラクトン官能基含有支持体の製造に有効に使用
されている。この方法では分散媒としてアルコールを、
そして開始剤としてアゾビスイソブチロニトリルを使用
している。補助界面活性剤としてのＡｌ１ｑｕａｔ　３
３６　　（Ｈｅｎｋｅｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と
共に、ポリビニルピロリドン、ポリ（ビニルメチルエー
テル）、ポリアクリル酸またはボリエチレンイミンのよ
うなポリマー安定剤が使用される。

この場合も驚ろくべき、かつ、予想外のこの方法の結果
は、架橋および非架橋のアズラクトン官能基含有支持体
がアルコール溶媒とアズラクトンとの反応なしにこのヒ
ドロキシル性媒質中において１工程で製造できることで
ある。単離は簡単な濾過で行うことができ、所望ならば
洗浄、そして乾燥を行う。

上記した３種の方法によって製造したビーズは、それら
の表面上でアズラクトン官能性をすべて示すが、これら
の物理的性質はそれらの製造に使用した方法によって大
幅に変化する。逆相懸濁重合法によって製造されたビー
ズは、一般に高度に多孔性（すなわち、１０〜９０、好
ましくは２０〜７５容量％の空隙）であり、比較的大き
い表面積および細孔容積並びに高密度の反応基を有する
。

これらのビーズは、結合能力が反応動力学より比較的重
要である用途に有用である。これに反して、分散重合に
よって製造されたビーズは、一般に前記のものより小・
さい寸法であり、かつ、はるかに多孔度が少なく、若干
の例においては実質的に非孔質である。これらのビーズ
を使用すると、比較的高い処理量が要求されるようなあ
る種の用途において特に有用な特徴である反応動力学が
非常に速い。

方法■ （非架橋アズラクトンポリマーを 使用する固体支持体の被！１） 前記のように本発明のポリマー支持体は、ビーズの形態
であることができる。これは支持体が特にクロマトグラ
フ力ラム充填用のような用途には非常に利用ｆａＳｉｌ
を有する物理的形態である。しかし、新規の物質はビー
ズの物理的形態には拘束されない。発明者等は、ある種
の可溶性アズラクトンポリマー（非架橋）も多数の基村
上に被覆でき、かつ、これらがこれらの形態においてビ
ーズと同様な反応性アズラクトン官能性を示すことも見
出した。従って、これらの基材は官能性物質との反応用
として使用できる。例えば、被覆すべき物体をアズラク
トンポリマーの溶液中に浸漬し、浸漬物体を乾燥させる
ことによってナイロン濾過膜およびガラス繊維を本発明
のアズラクトンポリマーで被覆できる。同様に、セラミ
ックス（例えば、酸化ジルコニウム）のような粒状物質
またはポリエチレン粒子のような非反応性ポリマーをア
ズラクトン官能基含有ポリマーで被覆することができる
。例えば吹付彼覆およびナイフコーティングのような当
業界で周知の溶液被覆方法も、基材の物理的形態によっ
て使用できる。

本発明のアズラクトン官能基含有ポリマーを被覆したシ
リカビーズを基材として使用したとき同様な結果が得ら
れた。この種のビーズはクロマトグラフ力ラムにおける
充填剤として一般的に使用される。同様に、この場合に
も普通のカラム充填媒質である制御された寸法のガラス
ビーズを使用して、アズラクトン官能基含有被覆を使用
したとき、著しく改良された蛋白質結合力および共有結
合が得られることが見出された。方法■のアズラクトン
官能基含有支持体の特別の利点は、これらの非圧縮性で
あり−、かつ、膨潤性が殆ど完全に無い点である。

固体基村上に被覆を行うために有用なアズラクトン官能
基含有ポリマーは、当業界で周知であるか、または当業
界において周知の方法によって製造できる。これらのポ
リマーは、一般に１種以上のアルケニルアズラクトン、
所望により１種以上の遊離基重合性、エチレン状不飽和
コモノマーと共に当業界において普通の重合方法を使用
して遊離基重合によって製造できる。好適なアズラクト
ン含有ポリマーおよびコポリマーは、例えばＲ．ｉｕｅ
ｂｎｅｒ等による、Ａｎｇｅｖ．　Ｍａｋｒｏａｏｌ．
　Ｃｈｅｓ．ｌ９７０、１１．　１０９頁およびＬＩ．
Ｓ．Ｐ．Ｎａ４，　３　７　８，　４　１　１に記載さ
れている。固体支持体上に被覆を生成させるのに特に好
適なアズラクトン官能基含有ポリマーは、上記のアズラ
クトン官能基含有ホモポリマーまたはコポリマーのアズ
ラクトン基の一部を低級アルキルアミンまたはアルコー
ルと反応させることによって得られる。

アズラクトン官能基含有支持体の製造に他の方法も利用
できる。方法の一つは、支持体にアルケニルアズラクト
ンモノマーを適用し（所望により他のコモノマーと共に
）、その場所でモノマーを重合させる方法である。重合
方法には、当業界において周知のような光重合（適切な
光開始剤を使用する）法が含まれる。

本発明のアズラクトン官能基含有支持体は、上記のよう
に製造され、官能性物質と反応にいつでも使用できる。

初期に示したように、官能性物質は、従来アズラクトン
と反応性であると考えられてきた水のような溶媒中にお
いて本発明のアズラクトン官能基含有支持体にしばしば
結合させることができるという驚ろくべき発見であった
。本明細書において使用する「物質」とは、特定の目的
を遂行するためポリマー支持体に付着させることを希望
する主要化学的実体の意味である。換言すれば、「物質
」とは、実際に吸収、錯化、触媒または試薬の最終用途
を行う「官能性物質」の部分または残基の意味である。

本発明の目的のための「官能性」とは、アズラクトンと
反応し得る基を含有する「官能性物質」の部分の意味で
ある。本発明において有用な「官能性」基には、ヒドロ
キシ、第一アミン、第ニアミンおよびチオールが含まれ
る。これらの基は、好適な触媒の存在または不存在下で
、下記の方程式（２）に示すように求核性付加によって
アズラクトンと反応する。

（式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，ｎ，Ｘ，およびＧは前記の
定義と同じである）。

官能性物質中に存在する官能基によって、有効な結合反
応速度を得るためには触媒を必要とする。

第一アミン官能基は触媒を必要としない。トリフルオ口
酢酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸などのよ
うな酸触媒は、ヒドロキシおよび第二アミン官能基の場
合には有効である。トリエチルアミン、１．８−ジアザ
ビシク口［５．４．０］ウンデセ−７−エン（Ｄ　Ｂ　
Ｕ）および１．　５−ジアザビシク口［４．３．０１ノ
ン−５−エン（ＤＢＮ）、（両者共にＡｌｄｒ１ｃｈ　
Ｃｈｅｓｌｃａｌ　Ｃｏ．Ｍ１１ｗａｕｋｅｅ．　Ｍｌ
から入手できる）のようなアミン塩基は、ヒドロキシお
よびチオール官能基に対して同様に有効である。使用す
る触媒の量は、一般に、１００部のアズラクトンに基づ
いて１〜１０部、好ましくは１〜５部である。

当業者には明らかなことであるが、溶剤、温度、触媒量
などのような特定の反応条件は、結合させるべき官能性
物質に依存して著しく変化する。ポリマー支持体に結合
させたまたは結合できるであろう官能性物質は無数ある
ため、式（２）および化学方程式Ｉの総称ＨＸＧを超え
る官能性物質のすべてを例挙することは、不可能であり
、かつ、本発明の発明の観点が官能性物質にはないので
不必要である。新規であることは、これらの官能性物質
がアズラクトン官能基含有支持体に共有結合によって結
合し得ることである。

総括的に本発明を説明してきたが、次の実施例によって
本発明の目的および利点をさらに特定的に説明する。実
施例において引用した特別の物質およびその量並びに他
の条件および詳細は、本発明を不当に拘束するものと解
釈すべきではない。

下記の実施例にお０て（　）内の数は重量％であり、［
　］はモル％である。

実施例１ この実施例では、方法ｌによるアズラクトン官能基含有
支持体の製造を教示する。

工程１：コボリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（Ｄ
ＭＡ）：Ｎ−アクリロイルメチルアラニンＮａ塩（Ｎａ
ＡＭＡ）：メチレンビスアクリルアミ　ド　（ＭＢＡ）
　　）　　　（４４．　　６　　：　　５０．　　４　
　：　　７．　　８）の製造：機械か《拌機（約３　０
　Ｏ　ｒｐｍのかく拌速度）、窒素入口、温度計および
コンデンサーを備た２１，クリーズド（ＣｒｅａＳｅｄ
　）丸底フラスコに、ヘプタン（１０４３ｍｌ）および
四塩化炭素（５６５ｍｌ）を装入した。この溶液をかく
拌し、窒素を１５分間吹込んだ。水酸化ナトリウム溶液
（６．　６ｇ　Ｈ　８５ｍｌの水に０．１６５モルを溶
解させた）、Ｎ−アクリロイルメチルアラニン（ＡＭＡ
）（２５．９８ｇ　；０．１６５モル）、ＤＭＡ　（２
３ｇ　；０．２３２モル）　、ＭＢＡ　（４ｇ：０．０
２６モル）および過硫酸アンモニウム（１ｇ；０．００
４モル）から成る別の溶液を調製し、そして、有機懸濁
用媒質に添加した。ソルビタンセスキオレエ−　｝　（
　Ａｒｌａｃｅｌ”　８３．　ＩｃＩＡｍｅｒ１ｃａｓ
　Ｉｎｃ．．　Ｖｉｌｓｉｎｇｔｏｎ，　ＤＢ　）　　
（２ｍｌ）を添加七、混合物をかく拌し、窒素を１５分
間吹込んだ。Ｎ，Ｎ，Ｎ’　，Ｎ’−テトラメチル−１
．２−ジアミノエタン（２ｍｌ）を添加し、そして、反
応温度は相当速かに２１℃から３３℃に上昇した。

混合物を室温で３時間かく拌した。混合物を、ｒＤＪ　
　（２１μ一以上）焼結ガラス漏斗で効率的に濾過し、
そして、フィルターケーキをアセトンで完全、かつ、繰
返し洗浄した。６０℃およびＩＴｏｒｒ未満で１２時間
乾燥後、乾燥固体（５２ｇ）を篩にかけ４部分：３８μ
一未満のビーズ、１２．３２ｇ；３８〜６３μ量の間の
ビーズ、１９．８３ｇ；６３〜９０μ一の間のビーズ、
４．５６ｔ：および９０μ一以上のビーズ、１３．９５
ｇに分離した。Ｎｌｋｏｎ　Ｎｏｍａｒｓｋｉ　Ｄｉｆ
ｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ＣｏｎｔｒａｓｔＭｉｃｒｏｓｃ
ｏｐｅ．　Ｄａｇｅ　Ｎｅｖｖｉｃｏｎビデオカメラ、
Ｓｏｎｙ３／４′ビデオレコーダーおよびソフトウェア
ーが付属するＰｅｒｃｅｐｔｌｖｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ．
　Ｉｎｃ．のデジタルイメージプロセッサーから成る光
学顕微鏡集成装置を使用して、水中において直径が３５
〜５０％の増加を伴って水に膨潤する完全球状ビーズ（
平均アスペクト比−０．８７）から成る３８〜６３μ■
の試料を測定した。

工程２：コボリ（ＤＭＡ：　２−ビニル−４．４−ジメ
チルアズラク｝：／　（ＶＤＭ）：ＭＢＡ）（４６：４
６：８）の環化：工程１において調製した３８〜６３μ
−ビーズ、１５．１ｇに無水酢酸（１００ｍｌ）を添加
した。この混合物を１００℃で２時間加熱した。冷却そ
して濾過後に、ビーズをソックスレー注出器中に入れ、
エチルアセテートで１６時間抽出した。６０℃およびＩ
Ｔｏｒｒ未満で乾燥後、ビーズは１２．６ｇの重量であ
った。

実施例２ この実施例では、アズラクトンの官能基含有ポリマーと
蛋白質官能性物質との反応を説明する。

放射性同位体で標識を付した蛋白質Ａの製造蛋白質Ａ　
（２．　５ｇ）　　（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｅｕｓａ
ｕｒｅｕｓから）　　（Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｒｐ．　
Ｂｏｓｔｏｎ．　ＨＡ）を、１０ｓＭの燐酸カリ．ウム
緩衝液（ｐｌｌ７．　　０　．　０．　　６ｍｌ）中に
溶解させ、２個のＩｏｄ．ｏ−ｂｅａｄｓ”　（クロラ
ミンＴの不溶形態；　Ｐ１ｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｌｃａｌ
　Ｃｏ．．Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ　）を添加しチロシ
ン残基への沃素の付加の触媒作用をさせた。反応は０，
１ミリＣｕｒｉｅｓ　（ｍｃｉ　）のＮａｌ（無担体ｌ
２５１　，　ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　
Ｃｏ．．　Ｎ．　Ｂｌｌｌｅｒｌｃａ，　Ｍ＾）の添加
によって開始させた。反応物を５分間隔で手ではげしく
振りまぜながら、２０℃で３０分間温置した。蛋白質Ａ
（沃素化および未変性の両者）を同じ燐酸塩緩衝液中に
おいてＰｈａｒｍａｃ１ａ　ＰＤ−ｔｏサイズ排除力ラ
ムを通して溶離させることによってＮａｌから分離した
。蛋白質を含有する部分を一緒にし、小部分に分け使用
するまで−１５℃で冷凍させた。特定の放射能は、０日
で１５４．０００カウント／分（ｃｐｓ　／μｇ）であ
った。その後のすべての計算は６０日の１２５！の放射
能半減期に対して補正した。放射能蛋白質Ａは沃素化後
６週間を超えては使用しなかった。

使用したアズラクトン官能基含有ポリマーは、ＤＭＡ：
ＶＤＭ：ＭＢＡ　（６２．２；　３４．４　：３．３モ
ル％）を使用して実施例１のように製造した。ポリマー
ビーズ（０．　　０　１　０　ｇ）を遠心分離管に入れ
、上記の標識蛋白製剤（１００μｇ）および４００μｇ
の燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．　　５）から成る溶液で覆っ
た。混合物を室温で緩和に９０分間振りまぜた。管を遠
心分離に処し、元の上層液および５回の逐次洗浄（　１
　ｍｌのｐＨ７．５緩衝液）液を集め、そして、それら
の１２５Ｉ含量をＰａｃｋａｒｄ　　Ａｕｔｏ−Ｇａｍ
ＩＩａ　ＳｃｌｎｔｉｌｌａｔｌｏｎＳｐｅｃｔｒｏｍ
ｅｔｅｒ　Ｍｏｄｅｌ　５２３０を使用して測定した。

元の上層液は４２，４１５ｃｐｍ　　（バックグラウン
ド以上）；第１洗浄液：　６７２２　；第２洗浄液二８
３６；第３洗浄液：　２０２　．第４洗浄液：４８；お
よび第５洗浄液：１８ｃｐｒＡを示した。エタノルアミ
ン（ａｌｌ７．　　５の燐酸塩緩衝液中０．５Ｍの４０
０μｇ）を添加し、ビーズと共に９０分間振りまぜ、残
留するすべてのアズラクトン残基を反応させた。最後に
緩衝溶液による追加の４回目の洗浄後に、ビーズおよび
反応容器を計数し、それぞれ、７００２および１８６５
ｅｐｍｌ示しｔ二。これは１０＋ｎｇのビーズ当り２，
５４μｇの量に相当する。

蛋白質Ａとエタノールアミンの添加順序を逆にしたのを
除いて同様な方法によって対照実験を行った。対照では
１０ｍｇのビーズ当り０．１４μｇの蛋白質Ａの量が示
された。

同様な方法によって、ＤＢＵ　（２５μ１１）を最初の
蛋白質Ａ緩衝溶液に添加して触媒ＤＢＵの効果を検討し
た。この結果は、１　０　ｍｇのビーズ当り３．９０μ
ｇの蛋白質Ａの量であった。

実施例３ この実施例では、先駆物質の代りに単量体の２−ビニル
−４，４エジメチルアズラクトンを使用して逆相懸濁重
合法（方法■）による本発明の高度架橋ビーズの製造を
説明する。

機械かく拌機（かく拌速度３０Ｏｒｐｍ）、窒素入口お
よびコンデンサーを備えた３ｇのクリーズド、丸底フラ
スコに、ヘブタン（１０４３ｍｌ）および四塩化炭素（
５６５ｍｌ）を装入した。この溶液をかく拌し、窒素を
１５分間吹込んだ。別の溶液を次のように調製した：メ
チレンビスアクリルアミドＣ２９ｇ，０．１８８モル）
をジメチルホルムアミド（１６０ｍｌ）中に溶解させ；
溶液が得られた後、水（１６０ｍｌ）を添加し、得られ
た溶液に窒素を１５分間吹込んだ。ソルビタンセスキオ
レエート（　３　ｍｌ　）を添加し、窒素の吹込みをさ
らに５分間続けた。この時点で、過硫酸アンモニウム（
１ｇ）を添加し、窒素吹込みをさらに１分間続けた。こ
の溶液を次いで迅速に有機懸濁用媒質に添加した。この
添加の直後に、ＶＤＭ（２１ｇ１０．１５１モル）を添
加し、全混合物をさらに５分間、窒素を吹込んだ。Ｎ，
　Ｎ，　Ｎ’　，　Ｎ’一テトラメチル−１．２−ジア
ミノエタン（　２　ｍｌ　）を添加し、そして、反応温
度は相当迅速に２２℃から２９℃に上昇した。ジアミン
添加から合計４時間反応混合物をかく拌し、次いでｒＤ
Ｊ　　（２１μ１以上）焼結ガラス漏斗を使用して濾過
した。

フィルター上でフィルターケーキをアセトン（２Ｘ５０
０ｍｌ）で洗浄し、次いで６０℃、ＩＴｏｒｒ未満で２
４時間乾燥させた。ＩＲ分折では、アズラクトン力ルボ
ニルの強い吸収が示された。

実施例４Ａ ソルビタンセスキオレエートの代りにポリマー安定剤を
使用したのを除いて、実施例３と同様な方法によって逆
相懸濁重合（方法■）を行った。

ポリマー安定剤は次のように調製した：コボリ（イソオ
クチルアクリレート：ＶＤＭ）（９５：５）（エチルア
セテート中における３８、７％固形分溶液、３１．６８
ｇ）をアセトン （２０．５４ｇ）で稀釈した。この溶液にコリンサリチ
レート（１．０６ｇ，０．００４４モル）および１．８
−ジアザビシク口［５．４．０１ウンデセ−７−エン（
ＤＢｔＪ）　　（０、Ｉｇ）を添加し、得られた混合物
を５５℃で１５時間加熱した。

ＩＲ分折によって所望反応生成物の形成が立証された。

ビーズポリマーの配合物に、６．０．の上記のポリマー
安定剤溶液を使用した。実施例３に記載のように重合を
行い、ビーズポリマーを単離および乾燥後に、ＩＲ分折
によってアズラクトン基が全部加水分解されたことが確
認された。実施例１の工程２と同様に無水酢酸を使用し
て環化を行った。次いでビーズを濾過し、エチルアセテ
ート（２Ｘ５００ｍｌ）、ジエチルエーテル（ＩＸ５０
０ｍｌ）で洗浄し、次いでボンブ真空（　＜　Ｉ　Ｔｏ
ｒｒ）、６５℃で２４時間乾燥させた。

実施例４Ｂ 使用したポリマー安定剤が、コボリ（イソオクチルアク
リレート：Ｎ−アクリロイルメチルアラニン、Ｎａ塩）
（９０．５：９．５）であったのを除いて実施例４Ａと
同様な方法によって逆相懸濁重合を行った。得られたビ
ーズのＩＲ分析によって重合の間、アズラクトン環の加
水分解が起らないことが立証された。

実施例４Ｃ，４Ｄ，および４Ｅ ポリマー安定剤が、（４Ｃ）（９０：１０）コボリ（イ
ソオクチルアクリレート：アクリル酸、Ｎａ塩）、（４
Ｄ）（９０：１０）コボリ（イソオクチルアクリレート
：アクリル酸）および（４Ｅ）（９１．８：８．２）コ
ボリ（イソオクチルアクリレート：Ｎ−アクリロイルー
α−アミノイソブチルアミド）であったのを除いて、実
施例４Ａの方法によって逆相懸濁重合を行った。全例の
場合において、得られたビーズのＩＲ分析では重合の間
、アズラクトン環の加水分解が起らなかったことが立証
された。

実施例５Ａ 次の実施例では、アルコール媒質中における分散重合（
方法■）によるアズラクトン官能基含有ビーズポリマー
の製造を説明する。

実施例３のように装備された１ｇ１クリーズド、丸底フ
ラスコに、ｔ−ブチルアルコール（４００ｍｌ）、ポリ
ビニルビロリドン（７．　　０ｓｒ）およびＡｌｉｑｕ
ａｔ”３３６　（２．　Ｏｇ）　　（ｌｌｅｎｋｅｌ　
Ｃｏｒｐ．．κａｎｋａｋｅｅ，比から入手できる）を
装入した。ＶＤＭ（２１ｇ）、エチレングリコールジメ
タクリレ−｝　（ＥＧＤＭＡ，２９ｇ）およびアゾビス
（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）（０．５ｇ）を混
合し、得られた溶液を反応容器に添加した。かく拌反応
混合物中に１０分間窒素を気泡として通し、次いでフラ
スコを７０℃に予め平衡させた油浴中に浸漬した。かく
拌および加熱を２．５時間続け、次いで冷却させ、濾過
した。フィルターケーキをアセトンで２回洗浄し、循還
空気炉中、５０℃で乾燥させて無色のポリマービーズ、
４３ｇを得た。！Ｒ分析ではアズラクトン環はそのまま
であり、アルコール溶媒との顕著な反応がなかったこと
が示された。

異種の分散媒、異なる七ノマー比または．異なるコモノ
マーを使用したのを除いて、本実施例に記載の方法によ
ってポリマービーズの追加例を製造した。ビーズは分散
媒としてイソブロパノール、エタノールおよびメタノー
ルを使用し、モノマーとしてメタクリレート、ヒドロキ
シエチルメタクリレートおよび２−イソブロペニルー４
，４−ジメチルアズラクトンを使用してビーズを別個に
製造した。

全例の場合において、ＩＲ分折によって生成物ビーズ中
におけるアズラクトン環はそのままであった。第Ｉ表に
は、この方法によって製造した各種の配合物を示す。

第 ■ 表 モノマー　組　成　（νｔ％） ＶＤＭ　　　ＥＧＤＭＡ　　その他 １００（ＩＤＭ）ｃ 溶媒 ｔ−ブタノール ｌ−プロバノール １−プロパノール ｌ−プロパノール １−プロバノール ープロバノール ープロバノール ープロバノール ３１１（ＭＭ＾）ａ　　Ｉ−プロパノール１０（ＩＩＥ
ＭＡ）ｂ　ｉ−プロパノーループロパノール ｂ 一メチルメタクリレート 一２−ヒドロキシエチルメタクリレート−２−イソブロ
ペニルー４．４−ジメチルアズラクトン 実施例６ 前記の配合物からのポリマービーズの蛋白質Ａに対する
結合能力を標詭蛋白質を使用して評価した。放射性沃素
化した蛋白質Ａ（実施例２）を非標識蛋白質で稀釈して
、最終蛋白質濃度２５０μｇ／ｍｌを有し、燐酸塩緩衝
生理的食塩水（ＰＢＳ）２５ｓＭ燐酸ナトリウム、１５
１）＋Ｍ　　ＮａＣＪ緩衝液、ｐＨ７．　　５中に溶解
させた標的放射能２ｏ００ｃｐｍ／μｇの蛋白質を得た
。蛋白質Ａ溶液の３組の試料２００μｐを１０ｍｇのビ
ーズに添加し、室温で１時間反応させた。蛋白質の除去
および未反応アズラクトン部位の消止（ｑｕｅｎｃｈｉ
ｎｇ　）用として５００μｇの３．０Ｍのエタノールア
ミン、ｐｌｌ９．　　０を添加することによって反応を
停止させた。３０分後に、ビーズを５００μｇのＰＢＳ
で３回洗浄し、きれいな試験管に移し、そして、実施例
２と同様に結合放射性蛋白質を検査した。翌日、ビーズ
をＰＢＳ中の５００μｇの１％ｓＤｓ（ドデシル硫酸ナ
トリウム）と共に３７℃で４時間温置し、非共有結合蛋
白質を除去した。温置後、ビーズを５００μｇのＳＤＳ
で３回すすぎ洗いし、残留放射能を測定した。これらの
実験のデータを下記の第■表に示す。

第■表 アズラクトンポリマービーズの性質 ビーズ　　　蛋白質Ａの結合　耐ＳＤＳ性（実施例＃）
　　　　（ｍｇ／ｓｒ）　　　　　（％）３　　　　　
　　３．２　　　　　　８１４　Ａ　　　　　　　２．
８　　　　　　９０５Ａ　　　　　　　Ｉ．１　　　　
　　９６５Ｅ　　　　　　　４．１　　　　　　９６第
■表のデータは、方法■および■によって製造したビー
ズは方法Ｉによって製造したビーズと同様な高い蛋白質
結合能力を有することを示している。

実施例７ 実施例３および５Ａの方法によって製造したアズラクト
ンポリマービーズの表面積および細孔寸法を、それぞれ
、ＢＥＴ法（等温窒素吸着）および水銀気孔率測定の標
準法によって測定した。反応性基は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．ｋ４
，７３７，５６０の実施ｆｌＪ３の方法を、標準酸溶液
で滴定する前にビーズをＯ，ＬＭ　　ＮａＯＨと反応さ
せるように変更することによって測定した。第■表に示
す結果では、実施例３によって製造したビーズはＥｕｐ
ｅｒｇ１ｔ−Ｃ　（Ｖｅｎｄｅｒ情報からの値）より有
意に気孔率の高い物質が得られたが、実施例５Ａの方法
によって製造されたビーズはほとんど非孔質であること
を示す。

一節　ｍ表 ポリマービーズの性質 表面積　平均細孔 ビーズ（耐／ｇ）寸法（Ａ） Ｅｘ．３　　　２００　　　　６５０ ＥＸ．５＾　　２．８５　　　２５０００（２．５μ一
） 反応性基　反応密度 （ｍｅｑ／ｇ）　（μｃｑ／ｎｆ） ２．７９　　　　１４ ０．１９　　　　８１ Ｅｕｐｅｒ− ｇｌｔ−Ｃ ０．８−１．０ ５．５ 実施例３の多孔質アズラクトンビーズの測定した平均細
孔寸法は、Ｅｕｐｅｒｇｌｔ　−　Ｃより幾分大きかっ
た。実施例５Ａのアズラクトンビーズの大きいΔ？１定
細孔寸法（２．５μ鐙）は、ビーズ間の隙間容積を表わ
すものと考えられ、多孔質構造に欠けていることを示し
ている。多孔質アズラクトンビーズ上の利用できる反応
性基は、クロマドグラフ目的用に使用するとき非常に使
用効果があるＥｔ＋ｐＯｒｇ１ｔ　−　ｃで得られる数
よりはるかに高い。単位面積当りの反応性基として比較
したとき、非孔質アズラクトンビーズおよび多孔質ビー
ズは、Ｅｕｐｃｒｇ１ｔ　−　Ｃより明らかにすぐれて
いる。

実施例８ この実施例では、無機並びに有機基材に対する被覆性を
増進させたアズラクトン官能基含有ポリマーの製造を説
明する。

２，２′−アゾピスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を
メチルエチルケトン（ＭＥＫ）中の３０％固形分で開始
剤として使用してモノマーの遊離基重合によってＶＤＭ
のホモポリマーを製造した。

このポリマーの試料を、触媒としてＤＢＵ　（装入メタ
ノールに基づいて２〜５モル％）を使用してメタノール
と反応させた。使用したメタノールの量は、ポリマーの
アズラクトン環のある部分をそのまま残すように選んだ
。ホモポリマーおよび１００、８０、６０、４０、２０
、および０％残留する５種の改質ポリマーを製造した。

これらを、逐次試料においてそれぞれＶＤＭ−１００、
ＶＤＭ−８０、ＶＤＭ−６０、ＶＤＭ−４０、ＶＤＭ−
２０およびＶＤＭ−０と称した。

同様にエチルアミンをホモポリマー溶液の一部分と反応
させて、６０％エチルアミド／４０％アズラクトンポリ
マー（ＶＤＭ−６０Ｎ）を製造した。

実施例９ この実施例では、改質ボリＶＤＭのすぐれた被覆性を示
す（方法■）。

ガラス顕微鏡スライド（２．．　５Ｘ７．　　６ｃｍ）
　　：（Ｓｕｒｇｉ　ＰａｔｈＴＭ）を、エチルアセテ
ート中のＶＤＭ−６０またはＶＤＭ−１００　（実施例
８）ノ１０％溶液中に３回浸漬し、室温で１時間風乾さ
せて（方法■）。次いで、このスライドを蒸留水中に５
〜１５分間浸漬し、そして残留するＶＤＭ被覆を観察し
た。すすぎ洗い後に、ＶＤＭ−６０ポリマーを被覆した
スライドはかすかな乳白先の光沢の外観によって妨害さ
れなかったＶＤＭポリマー被田の証拠を示した。ポリマ
ーフィルムはＶＤＭ−１００で被覆されたこれらのスラ
イドの表面に浮き上がっていることが観察された。この
ことは、部分的にメタノールと反応したアズラクトンが
未反応ポリマーよりガラス表面に実質的に良好に接着す
ることを示している。同様に、ガラススライドをＶＤＭ
−１００およびＶＤＭ−６０Ｎの１０％溶岐中で浸漬被
覆し、かつ、風乾させた。

一対のスライドをＯ，ＩＭ　　ＨＣＮ溶液中に１０およ
び４０分間浸漬した。ＶＤＭ−１００の被覆は気泡を生
じ各々の場合浮き上って来たが、ＶＤＭ−６０Ｎ被覆は
この処理によって付着して残り、変化がなかった。

これらの定性的観察を確認するために、普通のガラスマ
イクロへマトクリット毛細管（ＡｍｅｒｉｃａｎＳｃ１
ｅｎｔ１ｆ’ｌｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，　ＭｃＧａｖ．
比）の切片をＶＤＭ−６０　（実施例８）で被覆し、そ
して、風乾させた（内径１．２ｍｍ．長さ６市；１検定
当り２個の切片、全面積０’．　　９　０ｃｍ２）　、
これらの試料（３回の実験の）を前記のように（実施例
６）、放射性沃素化蛋白質入と共に温置した。この結果
（下記の第■表参照）では、ガラスのアズラクトン官能
基含有ポリマー披覆は、共有結合によって結合する蛋白
質の量（未処理ガラスの１７倍大きい）および耐ＳＤＳ
％（４．５倍の増加）の両者を増加させることを示して
いる。これに加えて、水性ＰＢＳ溶液中、室温で１６時
間の温置では、結合蛋白質の有意の損失もないことは、
この長い時間にわたる水性溶液によるアズラクトン官能
括含有ポリマー被覆の溶解は最小であることを示してい
る。

第■表 ＶＤＭ−６０被覆ガラスに対する蛋白質Ａの結合共有結
合蛋白質　　耐ＳＤＳ性 処　　　理　　　　　（ｎｇ／　ｃＪ）　　　　　　　
（９６）なし　　　　　　１１　　　　　　　　１６溶
剤　　　　　　２６２３ ＶＤＭ−００　　　　　　１９４　　　　　　　　７２
実施例１０ この実施例では、アズラクトン官能基含有ポリマーによ
るシリカゲルの被覆および被覆生成物の共有結合による
蛋白質との結合能力を説明する（方法■）。

クロマトグラフ等級シリカビーズ（Ｓｔ　Ｉ　ｔｅａｒ
ＣＣ−４ＴＭ，　Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ　Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ．　ＳＬ．Ｌｏｕｉｓ．　ＭＯ）を、炉中で１３
５℃、＜ＩＴｏｒｒで２４間乾燥させた。このシリカゲ
ルの試料（９．８１ｇ）を、ＭＥＫ中の実施例８のＶＤ
Ｍ−１００ポリマーの３０％固形分溶液（１．６３ｇ）
と混合した。この混合物を追加のＭＥＫ（５０ｍｌ）で
覆い、ときどき渦巻まかせて室温に３時間置いた。次い
で溶剤を減圧下で除去し、５重量％のアズラクトンポリ
マーを含有する被覆シリカゲルを＜　Ｉ　Ｔｏｒｒｓ室
温で一晩乾燥させた。同様に、ＶＤＭ−８０、ＶＤＭ−
６０、ＶＤＭ−４０、ＶＤＭ−２０およびＶＤＭ−０を
シリカゲル上に被覆した。各被覆シリカゲルおよび非被
覆シリカゲルの約１０ｍｇを、標識蛋白質Ａにさらし、
実施例６のように蛋白質結合度を評価した。

蛋白質処理ビーズの放射能検査およびその後のＳＤＳ処
理の結果を下記の第Ｖ表に示す。

第ｖ表 アズラクトン官能基含有ポリマー被覆 シリカビーズに対する蛋白質Ａの結合 結合蛋白質Ａ　　　ｉＪｓＤｓ性 （ｍｇ／ｇ）　　　　　　（％） ビーズの種類 未処理シリカ　　　　０．１５　　　　　　　４２ＶＤ
Ｍ−０　　　　　　　０．１４　　　　　　　４１ＶＤ
Ｍ−２（１　　　　　　　１　．　９７　　　　　　　
９４ＶＤＭ−４０　　　　　　　２．４４　　　　　　
　９７ＶＤＭ−６０　　　　　　　２．６０　　　　　
　　９８ＶＤＭ−８０　　　　　　　２．８４　　　　
　　　９８ＶＤＭ−１００　　　　　　２．５０　　　
　　　　９７第Ｖ表のデータは、２０％残留アズラクト
ンを含有するポリマー（ＶＤＭ−２０）が蛋白質結合量
が１４倍の増加を示し、耐ＳＤＳ性は２倍になった。４
０％以上のアズラクトン官能性を含有するポリマーの溶
液は、非被覆シリカより蛋白質の結合が１７倍増加した
。耐ＳＤＳ性は、この無機支持物質へのアズラクトン官
能基含有ポリマー被覆の結果として９８％増加した。

実施例１１ この実施例では、酸化ジルコニウムセラミックビーズを
被覆する部分反応アズラクトンポリマーの能力を説明す
る（方法■）。

Ｍ．　Ｐ．　Ｒｌｇｎｅｙ．　Ｐｈ．Ｄ．論文、［Ｔｂ
ｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｏｒｏｕｓ　Ｚｌ
ｒｃｏｎｌａ　ａｓ　ａ　Ｓｕｐｐｏｒｔｆｏｒ　Ｒｅ
ｖｅｒｓｅ　Ｐｈａｓｅ　ｌｌｌｇｈ　Ｐｅｒｌ’ｏｒ
ｍａｎｃｅ　ＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｓａｒｏｇｒａｐｈ
ｙＪ　，　Ｕｎｌｖｅｒｓｌｔｙ　ｏｌ’　Ｍｌｎｎｅ
ａｐｏｌｌｓ．ＭＮ　（１９８８）に記載のように製造
した酸化ジルコニウムセラミックビーズ（１２．６５ｇ
）を、実施例１０のようにＶＤＭ−６０で最終５重量％
に被覆した。被覆および非被覆ビーズを放射性沃素化蛋
白質Ａを使用して蛋白質結合性に関し評価した。

各ビーズ種類の約２０ｍｇ（３回実験）を、４００μｇ
の標識蛋白質Ａの稀釈溶液（２０００ｅｐｉ／μｇの特
定放射能；２５０μｇ蛋白質／　ｍｌ　）と共に１時間
温置し、この時点で８００μｇの３．０Ｍのエタノール
アミン、ｐＨ９．０を反応混合物に添加した。遠心分離
および上層液除去後に、追加の消止用アミン８００μｇ
をビーズと共に３０分間温置した。この消止後、ＰＢＳ
の３×８００μｇですすぎ洗いした。次いで、ビーズの
放射能を検査（試験管当り１０分間）、そして、翌日１
％ＳＤＳ処理に処した（実施例６参照）。

ビーズのアズラクトン官能基含有ポリマー被覆によって
、セラミック物質に対して２４倍の蛋白質結合が増加し
た、すなわち、非被覆ビーズでは１■当り０．０３μｇ
であるのに対し、１ｆｌｌｇのビーズ当りＯ．’７２μ
ｇであった。これに加えて、結合蛋白質はＳＤＳ処理に
対して９９％以上の耐性を示した、このことは蛋白質の
アズラクトン官能基含有酸化ジルコニウム支持体に対す
る蛋白質の共有結合による結合を証明している。

実施例１２ この実施例では、ポリアズラクトンで被覆したナイロン
膜およびこれに対する蛋白質の結合性を説明する（方法
■）。

ナイロン濾過膜（Ｆ１１Ｌｅｒ−　ＰｕｒｅＴＭＮｙｌ
ｏｎ　６Ｂ．０．２　ｐｍ　．　Ｐｉｅｒｃｅ．　Ｒｏ
ｃｋｒｏｒｄ．　ＩＬ）の小さいデイスクを切断（直径
１／４’：全表面積０．６１０Ｉｌ２／ディスク）シ、
エチルアセテート中のＶＤＭ−６０（実施例８）の１％
溶液中に室温で１時間浸漬し、次いで風乾させた。蛋白
質結合性は、膜を完全に濡すため真空下で最初３０分間
温置し、ポリアズラクトン被覆ディスクおよび未処理デ
ィスクを２５０μｇの標識蛋白質Ａで処理し、次いで室
温で１時間反応させた（３回の実験で）のを除いて、実
施例６の方法によって評価した。反応は蛋白質溶液の除
去および前記のように未反応アズラクトン部位を消止さ
せるため５００μｇの３．０Ｍのエタノールアミン、ｐ
Ｈ９．０の添加して停止させた。

ＶＤＭ−６０処理ナイロン膜ディスクは未処理ディスク
より共有結合蛋白質の６０％の増加（７５７ｎｇ蛋白質
／ｃｍ２：　４　７　２ｎｇ／ｃｍ２）を示し、耐ＳＤ
Ｓ性は６倍の有意の増加（１１％に比較して７１％）を
示した。これらの結果は、この膜に対する蛋白質の結合
性は、アズラクトン官能基含有ポリマーによる簡単な処
理によって増加することを立証している。

実施例１３ この実施例では、部分反応させたアズラクトンポリマー
によるポリエチレン粒子の被覆およびこの被覆有機粒子
の蛋白質を結合する能力を説明する（方法■）。

高密度多孔質ポリエチレン粒子（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎａ４’
．５３９．２５６の開示のように製造した）を、オース
トラリア特許ｋ５５１，４４６に開示の方法によって極
低温で磨砕し、次いで、実施例１０と同じ方法によって
ＶＤＭ−６０の５％塗布量で被覆した。未処理並びにＶ
ＤＭ−６０処理粒子の蛋白質Ａへの結合性を、１０ｍｇ
の粒子／試験管、２００μｇの蛋白質Ａ溶液および５０
０μｇの消＋Ｌ剤、ＰＢＳおよびＳＤＳ溶液を使用して
前記（実施例６）のように評価した。

放射能測定では、未処理ポリエチレンに比較してＶＤＭ
−６０処理粒子では共有結合蛋白質の６５％の増加を示
した。耐ＳＤＳ性は２４％から６５％に増加したことは
、共有結合蛋白質の結合性の相対二において２〜３倍の
増加となる。

実施例１４ この実施例では、ＶＤＭとボリスチレンとのグラフトポ
リマーが、ガラスビーズ（ＣｏｒｎｌｎｇＧｌａｓｓ　
Ｗｏｒｋｓ．　Ｃｏｒｎｌｎｇ，　ＮＹ）の被覆に使用
できることを説明する（方法■）。

制御された細孔のガラス（ＣＰＧ）ビーズを、蒸発後Ｃ
ＰＧの１％塗布量になるのに十分なＶＤＭグラフトポリ
スチレン（２％ＶＤＭ）の１％トルエン溶液で実施例１
０と同様に処理した。対照としてグラフトさせないポリ
スチレンも同様な方法によってＣＰＧ上に被覆した。次
いで被覆ＣＰＧを、試験管１個当り１０ｍｇの支持体物
質を使用し、実施例６に前記したように、蛋白質結合性
を未処理ガラス物質と比較して試験した。

共有結合放射性蛋白質の測定では、非被覆ビーズよりボ
リスチレン被覆ビーズの全蛋白質結合性は９倍増加し、
ＶＤＭグラフトボリスチレン被覆物質ではこれに加えて
３倍増加した。未処理ボリスチレン被覆ビーズに比較し
てＶＤＭグラフトボリスチレン上の結合蛋白質のＳＤＳ
結果耐性％は２倍を示した。これらのデータはガラスビ
ーズ上へのＶＤＭ−グラフトポリマーの直接の結果とし
て、共有結合蛋白質の結合性の有意の増加を証明してい
る。

？施例１５ ＶＤＭコポリマービーズの誘導体化および疎水的相互作
用特性の例示 １７，　Ｓ．Ｐ．　Ｎへ４．８７１■８２４の実施例１
８からのＶＤＭコポリマービーズを、室温で９６時間２
５ｍＭの燐酸塩緩衝液、ｐｌ１７．　　５中の０、５Ｍ
フエネチルアミン（Ａｔｄｒｌｃｈ　Ｃｈｅｗ．　Ｃｏ
．．８１１νａｕｋｅｅ．　Ｖｌ　）で誘導体化した。

ビーズを燐酸塩緩衝液で徹底的に洗浄し、０．　　３５
ｍｌ　　Ｏａ＋ｎｉＴＭガラスカラム（　３　ｍＩＩＸ
　５　ｃｍ，　Ｒａｉｎｉｎ　ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＧ
ｏ．　Ｖｏｂｕｒｎ．　ＨＡ）中に手で充填した。カラ
ムを５０ｓＭ燐酸塩緩衝液、ｐｌｌ６．　８中の１．７
Ｍ硫酸アンモニウムでＥＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ　Ｉｎｃ．，Ｐ１ｓｃａｔａｖａｙ．　ＮＪ）上
で平衡させた。硫酸アンモニウム緩衝液に溶解されたオ
ヴアルブミン（５ｍｇ／ｍｌ　；ＳＩｇ＋ｇａ　Ｃｈｅ
ｔ　Ｇｏ．　Ｓｔ．Ｌｏｕ１ｓ．　Ｎｏ）をカラムに負
荷した。１．０ｍｌ／分の流速、１５ｍｌのグラジエン
ト（ｇｒａｄｉｅｎｔ）を使用し、疎水的相互作用によ
り蛋白の溶離を評価した。この実施例において０．５３
■ｇの蛋白質が１０．４．５ｍｌの溶離容積でのグラジ
エントの終りで溶離し、残留蛋白質は空隙容積において
回収された。この結果は同一の溶剤系を使用したが燐酸
塩緩衝液中において加水分解させたＶＤＭビーズを充填
した対照力ラムとは対照的であった。対照は、オヴアル
ブミンとの相互作用を示さない、すなわち、全蛋白質は
遅滞なく加水分解コボリャー力ラムの空隙を通過した。

硫酸アンモニウム緩衝液中のウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ　；Ｓ１ｇｍａ　）を２５ｍｇ／ｍｌでカラム上に注
入し、上記と同じグラジエントで溶離させた。

この高濃度（５＋ａｇ注入）の蛋白質で全蛋白質の３２
％が１０．５３ｍｌ　（１．１７Ｍ塩）で溶離し、残余
は空隙容積中で回収された。再注入後、空隙容積からの
非結合蛋白質部分がカラムに結合し、１０．４９ｍｌで
溶離されたことは、最初の注入間がカラムに対して過負
荷であったことを示唆する。

これらのデータは、濃度の減少に伴い、マトリックスか
らの蛋白質溶離はそれらの疎水性に基づくことを示唆す
る。この例示は疎水的相互作用クロマトグラフィーにお
けるＶＤＭコポリマーの潜在的用途を示している。

実施例１６ イオン交換特性の例示 実施例１５からのＶＤＭコポリマービーズを、２５−Ｈ
の燐酸塩緩衝液、ｐｌ＋７．　　５中の０．７Ｍのタウ
リン（Ａｌｄｒｌｃｈ　ＣｈｅＩ１．．　Ｍｌｌｖａｕ
ｋｅｅ，　Ｖｌ）で室温で７２時間誘導体化した。過剰
の試薬をビーズからすすぎ洗いした後、０．　　３５ｍ
Ｉ　ＯｓｕｎｊＴＭガラス力ラム（３ｍ重Ｘ５ｃｍ）中
に充填した。カラムを５０１％（７）酢酸、ｐｌ＋５．
　０テ平衡させた。ＢＳＡを平衡緩衝液中に溶解させ、
０．８ｍｇをカラムに注入した。５ｍｌの平衡緩衝液中
の蛋白質を０．５ｍｌ／分の流量で装入後に、イオン交
換溶離のため０〜２Ｍ　ＮａＣＩの２５ｍ１塩（５０ａ
Ｍのアセテート中のｐｌｌ５．　　Ｏ）グラジエントを
適用した。２８ＯｎｅでのＵＶ吸収の読みによって検出
されるように、０．５４ａ＋ｇのＢＳＡが８．８ｍｌの
溶離容積でカラムから溶離した。残余の蛋白質は空隙容
積から回収された。

２種の蛋白質藺の溶離の相異を評価するために、実験用
蛋白質としてウシ抗体１　ｇ　Ｇ　（８１ｇｓａ　）を
使用して上記の実験を行った。０．６８ｉｍｇのＩｇＧ
の装入後、約０．５２ｍｇ（６４％）が８．４ｍｌで溶
離し、残余のＩｇＧは空隙容積から回収された。これら
の結果は、商業用イオン交換マトリックスを使用した以
前の実験と一致する、この実験では！ＩｇＧはＭｏｎｏ
　Ｓ力ラム（ＰｈａｒｍａｃｉａＣｏ．．　Ｐｌｓｃａ
ｔａｖａｙ．　ＮＪ　）上のＢＳＡの前にわずかに溶離
した。上記の２種の蛋白質混合物を、カラム上に注入し
、次の多重グラジエント：０〜０．３０Ｍ　　ＮａＣｊ
）の３０ｍｌグラジエント、次に、１．ＯＭ　　ＮａＣ
Ｊの１５ｍ１グラジエントそして２Ｍ　　ＮａＣ＃で結
合蛋白質の最終洗浄によって０．　　２ｍｌ／分で溶離
させたとき上記の２種の蛋白質混合物はタウリンーアズ
ラクトン力ラム上で分割された。蛋白質は、１　７．　
８ｍｌ　（０．　　１　３Ｍ　　ＮａＣＮ）および２１
．５ｍｌ　（０．　　１６ＭＮａＣ１）の２つの主ピー
クで溶離された。これらの溶離容積は、流量の変化によ
り前記の例とは変化している。

実施例１７ アズラクトンビーズのア二オン交換 特性の例示 実施例１５からＶＤＭポリマービーズを、アセトン中の
過剰の４−ジメチルアミノー１−プチルアミンと還流で
１２時間反応させた。濾過およびアセトン洗浄により未
反応アミンを除去後に、ビーズを真空下６０℃で乾燥さ
せた。次いで、ビーズを２．０ｍｌガラス力ラム、５ｍ
ｍＸ１０ｃａ＋（Ｐ）１ａｒｓａｃ１ａ　　Ｐｉｎｅ　
　Ｃｌｔｅｍｌｃａｌｓ．　　Ｕｐｐｓａｌｌａ．　　
Ｓｗｅｄｅｎ）中に充填し、２０ｍＭのトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノエタン（Ｔｒｌｓ）　、ｐＨ８．　
　０で平衡させた。

ＢＳＡおよびウシＩｇＧをカラム上に注入し、そしてＯ
　〜２Ｍ　　ＮａＣ，９の２０ｍｌグラジエント、２　
０ｓＭ　Ｔｒ１ｓ　Ｓｐｌｌ８．　　０で溶離させた。

蛋白質の滞留容積は、それぞれ１７，０および２１．７
であり、空隙容積は４６　１ｍｌであった。この実験は
、アニオン交換分離用としてのＶＤＭポリマービーズの
カチオン誘導体の使用の例証である。

実施例１８ サイズ排除特性の例示 実施例１５からのＶＤＭポリマービーズを、１０ｍＭ燐
酸塩緩衝液、ｐＨ７．　　５中において室温で〉７２時
間加水分解させた。ビーズを２ｍｌのガラス力ラム、５
龍Ｘ１０ｃｍ中に充填し、燐酸塩緩衝液（１０量り、ｐ
Ｈ７．２中の５０−Ｍ硫酸ナトリウム中で平寵させた。

′下紀の第■表に示した物質を水に溶解させ、そして濾
過後（０．２μｍ）、カラムに注入した： 第■表 多孔質ポリマービーズを使用したサイズ排除による生物
学的分子の分離 ＭＷ　　　　　溶離容積 物　　質　　　　　　　（Ｄａｌｔｏｎｓ）　　　　　
　（ｍＬ）ｂｌｕｅ　ｄｅｘＬｒａｎＴＭ２．ＯＯＯ．
００Ｇ　　　　１．４５チログロブリン　　　　　ｌｉ
７０．ｏ００　　　　１．５３カタラーゼ　　　　　　
　２４７．００Ｇ　　　　１．８３ウシ血清アルブミン
　　　６９．０００　　　．１．８０ミオグロビン　　
　　　　　１７．０００　　　　　１．９８ビタミンＢ
−１２　　　　　　　　１．３５５　　　　　２．２５
０Ｍ　　硫酸ナトリウム　　　　　１４２　　　　２．
８０各物質（１００μＩ）をカラム上に装入し、Ｑ．　
２ｍｌ／分の流量で流れる緩衝液中で溶離させた。溶離
容積の検出は、２８０ｎｍでのＵＶ吸収によウた。６Ｍ
の硫酸ナトリウムは塩濃度の増加によって生ずる屈折率
の変化によって吸光度の振れを起こし、かつ、非常に低
分子量非蛋白質標識を付与した。

グラフ化した結果では、分子ｍの対数と溶離容積間の線
状関係を示した。これらのデータは、加水分解ＶＤＭポ
リマーの広い範囲のサイズ排除特性の証拠である。この
標準曲線に基づいて、アズラクトンコポリマービーズの
この特別の配合物は、４１０ｇ単位（１００〜１，００
０，０００）の分子量範囲にわたってサイズ排除クロマ
トグラフィに使用できる。

実施例１９ 誘導体化ＶＤＭのサイズ排除特性 実施例１５からのＶＤＭコポリマーを、サイズ排除研究
に使用す゛るために２種の短鎖長アミン試薬で誘導体化
した。ビーズを燐酸塩緩衝液（２５ＩＩＭ、ｐＨ７．　
　５）中の２Ｍのエチルアミンまたは０．５Ｍのブチル
アミン（同じ緩衝系中における）のいずれかに室温で少
なくとも７２時間暴露させた。緩衝液中において洗浄す
ることによって過剰のアミンを除去し、個々の５ｍｍＸ
１０ｃｍカラムを調製したｏ　Ｂｌｕｅ　ｄｅｘｔｒａ
ｎ．チログロプリン、カタラーゼ、およびウシ血清アル
ブミンをカラム上に装入し、そして、実施例１８のよう
に溶離させた。

この結果でも分子二のｌｏｇと溶離容積間の直線関係が
証明されている。

実施例２０ 逆相クロマトグラフィーの例示 実施例１５からのアズラクトンポリマービーズを、燐酸
塩緩衝液（２　５＋ｎＭ）　、ｐＨ７．　　２中のＩＭ
オクチルアミンにより室温で７２時間銹導体化した。ビ
ーズを緩衝液で過剰のアルキルアミンが無くなるまで洗
浄し、そして、ｏｓｎｌ　　：３＋ｍＸ５ｃｍガラスク
口マトグラフ力ラムに充填した。０、３５ｍｌのカラム
を１．７Ｍの硫酸アンモニウム（ｐ１｝７，０）で平衡
させた。平衡化緩衝液中にミオグロプリンを溶解させ、
１．２５ｍｇをカラム上に装入した。実施例１５のよう
に硫酸アンモニウムの減少する塩グラジエントでの溶離
では、蛋白質は何等回収されなかった。典型的な蛋白質
逆相溶離条件の使用では、水中の１％のトリフルオ口酢
酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）〜７０％メタノール中の１％ＴＦＡの
３０ｍｌグラジエントでは蛋白質が回収された。この方
法を０．５Ｍのメチルアミン（ＣＩ）、２Ｍのエチルア
ミン（Ｃ２）および０．５Ｍのブチルアミンと反応させ
たポリマービーズを使用して繰返し、同様な結果を得た
。

０８基が結合しているビーズを使用し、ミオグロビン、
ＢＳＡ，およびリゾチームを注入し、水中の１％ＴＦＡ
〜７０％メタノール中の１％ＴＦＡの３０ｍｌグラジエ
ントで０．１ｍｌ／分の流量で溶離させた。溶離分布を
第■表に要約する。

第■表 オクチルアミンー誘導体化コポリマービーズを使用した
蛋白質の逆相分離 ビーク溶離　　　積算面積 蛋白質　　　（ａＬ）　　　　（％合計）ミオグロビン
　　　　０．６１　　　　１８（空隙容積）Ｇ．１　　
　　　　　２ｇ ３８Ｊ　　　　　　　５０ Ｂ　Ｓ　Ａ　　　　　　　　０．６７　　　　　８（空
隙容積）２６．８　　　　　　　１８ ３１．８　　　　　　　３０ ３８．２　　　　　　　４３ リゾチーム　　　　　０．７２　　　　　９（空隙容積
）３３．８　　　　　　　８８ これらの溶離分布の相違は、これらの蛋白質の寸法並び
に疎水的性質の相違の証拠であり、かつ、逆相クロマト
グラフィーにおける０１〜０８群で誘導体化されたＶＤ
Ｍビーズの使用を立証している。

実施例２１ 低分子量物質の逆相クロマトグラフィー実施例１５のＶ
ＤＭビーズを、ジエチルエーテル中の過剰のｎ−ヘキサ
デシルアミン（Ｃ　１　６）と１時間反応させた。未反
応アミンを濾過により除去し、ジエチルエーテルで洗浄
した。銹導体化ビーズを、次いでメタノール中に分散さ
せ、そして４．６Ｘ１００ＩＩＩｌステンレス鋼ＨＰＩ
，Ｃカラムに充填した。４５／　５５メタノール／水中
において平衡させた後、小分子有機物を注入し、２８０
ｎ一でＵｖ検出を行い０．２５ｍｌ／分で溶離させた。

第■表には保持時間を要約し、さらに逆相クロマトグラ
フィー支持体としてのアルキルアミン誘導体化ＶＤＭポ
リマービーズの使用を例示する。

第■表 低分子皿物質の逆柑分離 保　　　持 化　合　物　　　（容積／空隙容積） ウラシル　　　　　　　　Ｌ．ロ ペンゾフエノン　　　　　１．５７ ニトロベンゼン　　　　　２．１５ 実施例２２ ポリスチレンウエル（Ｗｅｌｌ）上へのアズラクトンモ
ノマーの被覆 ２−ビニル−４．４−ジメチルアズラクトンモノマ−（
ＶＤＭ）に、０．２５ｇ重量の先開始剤、（ＩＲＣＡＣ
ＵＲＥＴＭ６　５　１　（ＣＩｂａ　Ｇｅｌｇｙ）　）
を配合し、次いでボリスチレンマイクロタイターウエル
ス（Ｍｌｃｒｏｔｌｔｅｒ　Ｖｅｉｌｓ）　（　１＋ｕ
ｕｌｏｎＴＭＩＩ，　Ｄｙｎａｔｅｃｈ．Ｓｐｒ１ｎｇ
ｒｌｅｌｄ．　ＶＡ　）の表面上に塗布した。次いでウ
エルを窒素雰囲気下で４個の蛍光ブラックライトチュー
ブ（ＧＴＥ　Ｓｙｌｖａｎｌａ．　Ｉｎｃ．．）の列を
使用し、３０分間照射した。これによってアズラクトン
モノマーはウエルの表面上で重合した。４一イソプロペ
ニルー４．４−ジメチルアズラクトン（ＩＤＭ）のよう
な他のモノマーも同様に被覆できる。

実施例２３ ポリスチレンウエル上へのアズラクトンー官能基含有コ
ポリマーの被覆 標準の遊離基溶液重合方法によってＶＤＭとメチルメタ
クリレート（ＭＭＡ）とのコポリマーを製造した。８５
：１５、７０　：　３０および５０：５０のＶＤＭ／Ｍ
ＭＡ比（モル／モル）を含有するコポリマーの試料を各
々エチルアセテートで１０％固形分に稀釈した。ポリマ
ー溶液の３滴を使い捨てピペットを使用して各ウエル中
に入れ、次いで循還空気炉中、６０℃で３０分間蒸発さ
せた。

あるいはまた、コポリマー溶液をウエル上に塗布し、そ
して溶剤を蒸発させてもよい。

実施例２４ 改良された免疫検定法用としてポリスチレンウエルの使
用 実施例２２のウエルの改良された表面の評価を、４８個
のウエルにマウスｌｇ　Ｇ　（ＳｌｇｍａＣｈｅｆｆｉ
ｌＣａｌ）　％または抗山羊（ａｎｔｉ−ｇｏａｔ　）
　　Ｉ　ｇ　Ｇ（Ｃｏｏｐｅｒ−Ｂｌｏ　Ｍｅｄｉｃａ
ｌ，　Ｍａｌｖｅｒｎ．　ＰＡ　）の水性溶液をＰＢＳ
中の５０μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．　　０で添加し、これら
を室温で２時間温置することによって行った。溶液を吸
引し、Ｐ　Ｓ　Ａ　（２．　　５ｍｇ／ｍｌ）およびＰ
ＢＳ中のスクロース（５％）の固定溶液を３０分間温置
した。次いで被覆ウエルを吸引し、乾燥させた。同様な
数の未改質ウエルをこの方法によって被覆した。

結合蛋白質の量は、マウスＩｇＧおよび抗山羊ＩｇＧ処
理ウエルにそれぞれ、酵素標識試薬、抗マウスＩｇＧ−
アルカリ性ホスファターゼおよび山羊１ｇＧ−セイヨウ
ワサビバーオキシダーゼを添加して１時間温置し、そし
てウエルをｐｌ１７．　　５に緩衝した非イオン界面活
性剤で３回洗浄した。

適切な酵素基質を添加した後、結合酵素標識試薬によっ
て生成した色を測定した。これらのウエルからのデータ
を下記の第■表に要約する。

第■表 アズラクトンコポリマー被ｍＭＩｃｒｏｔ１ｔｃｒｗ０
１！に対する抗体の結合 抗１ｇＧ 対照（無処理）　　　０．０７８　　０．０２９　　　
３７アズラクトン 処理　　　　　　０．０９５　　０．０２３　　　２５
１ｇＧ 対照　　　　　　　０．６６４　　０．（１８２　　　
１２アズラクトン 処理　　　　　　　１．１Ｂ１　　０．１１５　　　　
９＊　ＳＤ一標準偏差 村　ＣＶ一変動係数（ＳＤ／平均） マウスＩｇＧで処理したウェルは、ほぼ７５％多い信号
であったが、抗山羊１ｇＧウェルでは結合信号において
２０％を超える増加が得られた。

改良ウェルの変動係数は、未処理ウェルの値の約１７３
未満であった。

第■表のデータは結合蛋白質の量および処理の再現性の
両者共に通常の受信（ｐａｓｓｉｖｅ　）収着方法以上
に増加することを示している。

実施例２５ 被覆ポリスチレンウエルに対するアレルギー誘発性蛋白
質の改良された結合 ベレニアルライグラス（Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ　ｒｙｅｇ
ｒａｓｓ）（ＰＲＧ）抽出物およびキモバパイン（Ｃ　
Ｐ）（３Ｍ　　ＤＩａｇｏｎｉｓＬＩｃ　　Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ．　　Ｓａｎｔａ　　ｃｌａｒａ，　　ＣＡ）を、
Ｉ−１　２５により同位元素によって標識を付し、そし
て実施例２３と同様に調製した対照（未処理）およびＶ
ＤＭ／ＭＭＡ処理ボリスチレンマイクロタイターウエル
中に周囲温度で温置し、吸引によって放射性溶液を除去
し、表面上の未反応／未結合部位を血清アルブミンと１
時間温置することによって封鎖した。乾燥ウエルの残留
放射能を測定し、相当する量の結合蛋白質の量を下記の
第Ｘ表に示すように計算した。

第Ｘ表 被覆および対照ポリスチレンウエルに対するアレルギー
誘発性蛋白質の結合 結合蛋白質　　　　　　ＣＶ 試　　料　　　　　（ｎｇ）　　　　　　ＳＤ　　　　
（％）ＰＲＧ 対照　　　　　６６　　　　　２．２　　　３．４ＶＤ
Ｍ　　　　　７９　　　　　３．８　　　４．８ＣＰ 対照　　　　　４５　　　　　２．２　　　４．８ＶＤ
Ｍ　　　　　５１ｉ　　　　　２．８　　　４．７第Ｘ
表のデータは、ＶＤＭ被覆ポリスチレンウエルは、対照
より同じ精度でアレルゲン蛋白質を２０〜２５％多く結
合させることを示す。

実施例２６ 被覆ポリスチレンウエルに対するアレルゲン蛋白質の不
可逆的結合の増加 １−１２５標識アレルゲンを彼覆したマイクロタイター
試験ウエルを０、１％ＳＤＳと共に３７℃でまたは燐酸
塩緩衝液中、周囲温度で温置した。

４時間後に吸引によって溶液を除去し、脱イオン水で２
回すすぎ洗いし、そして残留する結合！＝１２５を脱イ
オン水で２回すすぎ洗いした。残留する蛋白質％を下′
記の第Ｘ１表に示す。

第ＸＩ表 変性剤による溶解化に対するアズラクトン結合蛋白質の
増加された耐性 残留蛋白質　％ ＰＲＧ”　　　　　　　　　　ＣＰ＊ネ緩衝剤　ＳＤＳ
　　緩衝剤　ＳＤＳ ８５　　　　Ｂ４　　　　８５　　　　７３零　ＰＲＧ
−ベレニアノレライグラス ネ＊　ＣＰ−キモババイン 試　　料 対照 ５０／５０　ＶＤＭ／ＭＭ＾ ７０／３０　ＶＤＭ／ＭＭＡ ８５／１５　ＶＤＭ／ＭＭＡ ＩＤＭ ＰＲＧのイソブロベニル誘導体を除外すれば、第ＸＩ表
のデータは対照よりアズラクトン処理ウエルの著しく高
い残留結合力はアレルゲン蛋白質の共有結合の証拠であ
る。

比較例２７ 次の例は、Ｕ．　Ｓ．　Ｐ．　４，　０７０，　３４８
の実施例３と同様な方法によってアズラクトン官能基含
有ビーズ製造の試みである。

ヘブタン（４２ｇ）、パークロロエチレン（８４ｇ）、
およびペンゾイルパーオキサイド（０．５ｇ）を５００
ｍｌ丸底フラスコに入れた。

アクリルアミド（ｒ５ｇ）　、ＶＤＭ　（１５ｇ）、エ
チレングリコールジメタクリレート（０．　　７６ｇ）
およびポリマー安定剤（０．　　０　２　５　ｒ）をＤ
ＭＦ　（２０ｇ）中に溶解させ、次いでこの溶液を室温
で反応フラスコに添加した。使用したポリマー安定剤は
、イソブチルアクリレート／ｎ−ブチル７クＩＪレ−｝
／ＶＤＭ　（４５：４５：１０）　コポリマーであり、
これは実施例４Ａと同様な方法によってコリンサリチレ
ートと反応させたものである。３　５　０　ｒｐｍでの
かく拌によって、モノマー相を有機相中に分布させ、そ
して、Ｎ２で４５分間パージした。外部冷却を行って、
ジメチルアニリン（０．　　２　５　ｇ）の添加によっ
て重合を開始させた。３分以内に゛、七ノマー混合物は
大きい架橋塊としてかく拌機軸の周囲に析出した。ビー
ズのないことは明らかであった。

実施例２８（比較） 次は、Ｕ．　　Ｓ．　　Ｐ．魔４，０７０，３４８の教
示によってアズラクトン官能基含有ビーズを製造する試
みである。反応はＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎａ４，０７０，３４８
の実施例２５に特定されているのと同じ成分および量を
使用して実施した、但し、グリシジルアクリレートの代
りにＶＤＭを使用した。

この場合にも反応開始２分以内に架橋ポリマー塊が分離
した。ビーズのないことは明らかであった。

当業者には本発明の範囲および精神から逸脱することな
く本発明の種々の改良および変更態様が明らかになるで
あろう、かつ、本発明は本明細書に示した説明的態様に
よって不当に拘束されないことを理解すべきである。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＾１はＨまたはＣＨ＿３あり、 Ｒ＾２およびＲ＾３は独立に、１〜１４個の炭素原子を
   有するアルキル基、３〜１４個の炭素原子を有するシク
   ロアルキル基、５〜１２個の環原子を有するアリール基
   、６〜２６個の炭素および０〜３個のＳ、Ｎおよび非過
   酸化物Ｏヘテロ原子を有するアレニル基であり、または
   Ｒ＾２およびＲ＾３はそれらが結合している炭素と共に
   ４〜１２個の環原子を含有する炭素環式環を形成するこ
   とができ、そして ｎは０または１の整数である）の単位を含むアズラクト
   ン官能基含有支持体であって、該支持体が９９モル部ま
   での架橋用モノマーをさらに含むときは、該支持体は基
   材上の膜、フィルムもしくは被覆であり、または、該支
   持体が５モル部までの架橋用モノマーをさらに含むとき
   は該支持体はビーズであることを特徴とする前記の支持
   体。
2. （２）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３およびｎは上記の定義
   と同じであり、 ｎは０または１であり、 Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−または Ｒ＾４がアルキルまたアリールである▲数式、化学式、
   表等があります▼であり、そして Ｇは付加物支持体の吸収、錯化、触媒作用、分離または
   試薬機能を行うＨＸＧの残基である）の単位を有する付
   加物支持体であって、該支持体が９９モル部までの架橋
   用モノマーをさらに含むときは、該支持体は基材上の膜
   、フィルムもしくは被覆であり、または該支持体が５モ
   ル部までの架橋用モノマーをさらに含むときは、該支持
   体はビーズであることを特徴とする前記の支持体。
3. （３）アズラクトン−官能基含有支持体の製造方法であ
   って、 ￥方法 I ￥ （ａ）（ｉ）０〜８９モル部の、少なくとも１種の遊離
   基により付加重合性の、水溶性モノマー、 （ｉｉ）１〜９９．９モル部の、少なくとも１種のＮ−
   （メト）アクリロイルアミノ酸の水溶性塩、および （ｉｉｉ）カルボキシレート官能基含有ポリマービーズ
   を得るための０．１〜９９モル部の範囲内の少なくとも
   １種の架橋用モノマー を一緒に重合させ、 （ｂ）該カルボキシレート官能基含有ビースを環化剤と
   反応させ、そして （ｃ）得られた請求項１に記載のアズラクトン官能基含
   有ポリマー支持体を単離する； その際、該支持体が９９モル部までの架橋用モノマーを
   さらに含むときは、該支持体は基材上の膜、フィルムも
   しくは被覆であり、または該支持体が５モル部までの架
   橋用モノマーをさらに含むときは、該支持体はビーズで
   あるる。 ￥方法II￥ （ａ）（ｉ）０〜８９部の、少なくとも１種の遊離基に
   より付加重合性の、水溶性モノマー、 （ｉｉ）１〜９９．９モル部の、少なくとも１種のアル
   ケニルアズラクトン、および （ｉｉｉ）０．１〜９９モル部の、少なくとも１種の架
   橋用モノマー を一緒に重合させ、そして （ｂ）得られた請求項１に記載のアズラクトン官能基含
   有ポリマー支持体を単離する； 該支持体は基材上のビーズ、膜、フィルムまたは被覆で
   ある； ￥方法III￥ （ａ）（ｉ）１〜１００モル部の、少なくとも１種のア
   ルケニルアズラクトン、 （ｉｉ）０〜９９モル部の、少なくとも１種の架橋用モ
   ノマー、および （ｉｉｉ）０〜９９モル部の、少なくとも１種の遊離基
   により付加重合性の、水溶性モノマーを一緒に重合させ
   、そして （ｂ）得られた請求項１に記載のアズラクトン官能基含
   有ポリマーを単離する； 該支持体は基材上のビーズ、膜、フィルムまたは被覆で
   ある； ￥方法IV￥ （ａ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３およびｎは、請求項１
   における定義と同じである）の単位を有するアズラクト
   ン官能基含有ポリマーを用意し、 （ｂ）該アズラクトン官能基含有ポリマーを固体基材上
   に被覆し、請求項１に記載のアズラクトン官能基含有ポ
   リマー支持体を得る の方法 I 、II、IIIまたはIVの１種の工程から成ること
   を。特徴とする前記の製造方法。
4. （４）（ｄ）前記のアズラクトン官能基含有ポリマー支
   持体を、開環反応において該アズラクトンと反応するこ
   とができる官能性物質と反応させ、そして （ｃ）得られた請求項２に記載の付加物支持体を単離す
   る 工程をさらに含む請求項３に記載の方法。