JPH02295486A - 胎盤タンパク質９をコ−ドするｃＤＮＡ、その単離および使用 - Google Patents
胎盤タンパク質９をコ−ドするｃＤＮＡ、その単離および使用Info
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- JPH02295486A JPH02295486A JP2059800A JP5980090A JPH02295486A JP H02295486 A JPH02295486 A JP H02295486A JP 2059800 A JP2059800 A JP 2059800A JP 5980090 A JP5980090 A JP 5980090A JP H02295486 A JPH02295486 A JP H02295486A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
庄盃豆１
本発明は、胎盤特異性タンパク質９ （ＰＰ９）をコー
ドするｃＤＮＡ、その単離、およびＰＰ９の遺伝子工学
的調製のためのその使用、に関する。
ドするｃＤＮＡ、その単離、およびＰＰ９の遺伝子工学
的調製のためのその使用、に関する。
１ｌ肢歪
ＥＰ−Ｂｌ第０ ０３７ ９６３号明細書の記載によれ
ば、ＰＰ９は、次のような性質を有する。
ば、ＰＰ９は、次のような性質を有する。
ａ）炭水化物含有量：５．５７±１．３５％（ヘキソー
ス４．９±１．０％、ヘキソースアミン０．１±０．１
％、フコース０．０７±０．０５％、およびノイラミン
酸０．５±０．２％を含む） Ｃ）分子量（超遠心分離によって決定）：３５，１００
±３ ，８ ０ ０ ｄ）分子量（ドデシル硫酸ナトリウム＜ＳＯＳ）を含む
ポリアクリルアミドゲルにおいて決定）：４ ０ ，０
０ ０±４，０００ ｅ）吸光係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃ
ｉｅｎｔ） ：Ｅ 已（２８０ｎｍ）＝： １ ４ ．
６±１．０ｆ）電気泳動移動度：β１〜グロプリン領域
ｇ）等電点：ｐＨ５−０〜６．８の領域Ｕ 目
、二Ｂ 上記の特許明＊Ｖに記載ざれているＰＰ９の従来の単離
は、非常に複雑である。したがって、本発明の目的は、
ＰＰ９の遺伝子工学的調製を可能にするために、ＰＰ９
をコードする遺伝子を単離することであった。
ス４．９±１．０％、ヘキソースアミン０．１±０．１
％、フコース０．０７±０．０５％、およびノイラミン
酸０．５±０．２％を含む） Ｃ）分子量（超遠心分離によって決定）：３５，１００
±３ ，８ ０ ０ ｄ）分子量（ドデシル硫酸ナトリウム＜ＳＯＳ）を含む
ポリアクリルアミドゲルにおいて決定）：４ ０ ，０
０ ０±４，０００ ｅ）吸光係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃ
ｉｅｎｔ） ：Ｅ 已（２８０ｎｍ）＝： １ ４ ．
６±１．０ｆ）電気泳動移動度：β１〜グロプリン領域
ｇ）等電点：ｐＨ５−０〜６．８の領域Ｕ 目
、二Ｂ 上記の特許明＊Ｖに記載ざれているＰＰ９の従来の単離
は、非常に複雑である。したがって、本発明の目的は、
ＰＰ９の遺伝子工学的調製を可能にするために、ＰＰ９
をコードする遺伝子を単離することであった。
驚いたことに、ＰＰ９と頚似していることが知らていな
い異なる胎盤タンパク質Ｐ Ｐ ５ （８ｏｈｎおよび
Ｗｉｎｋｌｅｒ： Ａｒｃｌ＋． Ｇｙｎａｅｋ． ２
２３、１７９−１８６、１９７７）に対する抗体を用い
て発現遺伝子バンクをスクリーニングしたときに、５個
の個々のクローンが得られた（ＰＰ９−１０、ＰＰ９−
３５３、ＰＰ９−３５７、ＰＰ９−３６１およびＰＰ９
−３６２）。これらのクローンは、全ｃＤＮＡまたはそ
の部分を含む．ＰＰ９−１０の配列決定において、ＰＰ
９をコードする配列（しかし、全く完全ではないが）の
中問に約ｅｏｏｂｐの大きさのイントロンが有りかつ３
′末端にポリ（Ａ）配列が存在しないことから、ｃＤＮ
Ａは不完全にプロセスざれた外主の（ ｈｅｔｅｒｏｇ
ｅｎｏｕｓ）核ＲＮＡ（ＨｎＲＮＡ）に由来するようで
あることが見出ざれた。他の四つのクローンは全てイン
トロンを欠いているが、それらはポリ（Ａ）配列を有し
ている。上記の工程によってＰＰ５のｃＤＮＡを単離す
ることは可能ではなかった。
い異なる胎盤タンパク質Ｐ Ｐ ５ （８ｏｈｎおよび
Ｗｉｎｋｌｅｒ： Ａｒｃｌ＋． Ｇｙｎａｅｋ． ２
２３、１７９−１８６、１９７７）に対する抗体を用い
て発現遺伝子バンクをスクリーニングしたときに、５個
の個々のクローンが得られた（ＰＰ９−１０、ＰＰ９−
３５３、ＰＰ９−３５７、ＰＰ９−３６１およびＰＰ９
−３６２）。これらのクローンは、全ｃＤＮＡまたはそ
の部分を含む．ＰＰ９−１０の配列決定において、ＰＰ
９をコードする配列（しかし、全く完全ではないが）の
中問に約ｅｏｏｂｐの大きさのイントロンが有りかつ３
′末端にポリ（Ａ）配列が存在しないことから、ｃＤＮ
Ａは不完全にプロセスざれた外主の（ ｈｅｔｅｒｏｇ
ｅｎｏｕｓ）核ＲＮＡ（ＨｎＲＮＡ）に由来するようで
あることが見出ざれた。他の四つのクローンは全てイン
トロンを欠いているが、それらはポリ（Ａ）配列を有し
ている。上記の工程によってＰＰ５のｃＤＮＡを単離す
ることは可能ではなかった。
配列決定データによって、ＰＰ９のプロセスされた完全
なｃＤＮＡは１３９４個の塩基対（ｈｐ）の長さであっ
て３１６個のアミノ酸のタンパク質をコードするという
結果が得られる（表１）。
なｃＤＮＡは１３９４個の塩基対（ｈｐ）の長さであっ
て３１６個のアミノ酸のタンパク質をコードするという
結果が得られる（表１）。
３５８５３ｄの分子量およびアミノ酸組成は、上記に記
載の特許明！ＩＩＩＭ中に含まれるデータに大変よく一
致する（表２を参照されたい）。
載の特許明！ＩＩＩＭ中に含まれるデータに大変よく一
致する（表２を参照されたい）。
六九
く０ く口
α Ｃ
ト
べ山ＩＪＱ閤１１Ｌｌ（ｊ工Ｈ×一Σ
図は、入ｇｔｌ！−１０の位置を、入ｇｔ １１３６２
との関係において図式的に示すものである．二つのクロ
ーンが塩基交換を示す。すなわち、ＰＰ９−３６１の位
直２５５（Ｇの代わりにＣ、アミノＭＥの代わりにＱ）
、および ＰＰ９−３６２の位置９２５（Ａの代わりにＧ１アミノ
陵Ｋの代わりにＲ）。
との関係において図式的に示すものである．二つのクロ
ーンが塩基交換を示す。すなわち、ＰＰ９−３６１の位
直２５５（Ｇの代わりにＣ、アミノＭＥの代わりにＱ）
、および ＰＰ９−３６２の位置９２５（Ａの代わりにＧ１アミノ
陵Ｋの代わりにＲ）。
このようにしてＰＰ９のｃＤＮＡ配列を有することによ
って、他の既知の核酸配列との比較が可能になった。ラ
ットのアルドースレダクターゼのＤＮＡ配列（ Ｃａｒ
ｐｅｒら： ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２０、２０
９−２１３、１９８７）ならびにロークリスタリン（ｒ
ｈｏ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ）およびアルデヒドレダク
ターゼの遺伝子との相同性（ ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ）
があることが見出された。これらのタンパク質がアルデ
ヒドレダクターゼとして同一の上科（ｓｕｐｅｒｆａＩ
Ｗｉｌｙ）に属することが可能であり、ＰＰ９がヒ１・
アルドースレダクターゼと同一である可能性が非常に高
い。
って、他の既知の核酸配列との比較が可能になった。ラ
ットのアルドースレダクターゼのＤＮＡ配列（ Ｃａｒ
ｐｅｒら： ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２０、２０
９−２１３、１９８７）ならびにロークリスタリン（ｒ
ｈｏ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ）およびアルデヒドレダク
ターゼの遺伝子との相同性（ ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ）
があることが見出された。これらのタンパク質がアルデ
ヒドレダクターゼとして同一の上科（ｓｕｐｅｒｆａＩ
Ｗｉｌｙ）に属することが可能であり、ＰＰ９がヒ１・
アルドースレダクターゼと同一である可能性が非常に高
い。
本発明によれば、適当な発現系を利用して、コードｃＤ
ＮＡを用いてＰＰ９を発現させることが可能である。さ
らに、宿主の選択によって、ＰＰ９の修飾型に影響を及
ぼすことができろ。例えば、纏苗中ではグリコシル化（
ｇ１ｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は起きないが、一方、酵
母細胞で起きるグリコシル化は高等真核纏胞におけるも
のとは異なる。
ＮＡを用いてＰＰ９を発現させることが可能である。さ
らに、宿主の選択によって、ＰＰ９の修飾型に影響を及
ぼすことができろ。例えば、纏苗中ではグリコシル化（
ｇ１ｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は起きないが、一方、酵
母細胞で起きるグリコシル化は高等真核纏胞におけるも
のとは異なる。
ＰＰ９は、発現ベクターｐＴｒｃ９９ＣまたはｐＴａｃ
Ｔ７Ｌを用いて大腸菌中でとくに有利に発現ざれる（諸
例を参照されたい）。
Ｔ７Ｌを用いて大腸菌中でとくに有利に発現ざれる（諸
例を参照されたい）。
ＰＰ９のアミノ酸配列が解ると、ポリクローナルまたは
モノクローナル抗体の製造のための抗原として用いられ
るアミノ酸部分配列物 （ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を従来法または遺伝子工学的
手法によって調製することができる。そのような抗体は
、診断的用途だけでなく、抗体力ラムの調製にも用いら
れ得る。そのようなカラムによって、ＰＰ９を他のタン
パク質とともに含む溶液からＰＰ９を分離することが可
能である。また、ＰＰ９をコードし、真核細胞中での発
現を促進し、さらには診断的情報をも得ることができる
ようなゲノムクローンを、ｃＤＮＡまたはその部分を用
いてゲノムバンクから簡単な方法で！ｉｉｍすることも
可能である。
モノクローナル抗体の製造のための抗原として用いられ
るアミノ酸部分配列物 （ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を従来法または遺伝子工学的
手法によって調製することができる。そのような抗体は
、診断的用途だけでなく、抗体力ラムの調製にも用いら
れ得る。そのようなカラムによって、ＰＰ９を他のタン
パク質とともに含む溶液からＰＰ９を分離することが可
能である。また、ＰＰ９をコードし、真核細胞中での発
現を促進し、さらには診断的情報をも得ることができる
ようなゲノムクローンを、ｃＤＮＡまたはその部分を用
いてゲノムバンクから簡単な方法で！ｉｉｍすることも
可能である。
アルドースレダクターゼ（． Ｅ Ｃ ｌ．１．１．２
１）は、ＮＡＤＰＨ一依存性酵素で、糖アルコールへの
アノレドースの還元を触媒する。糖尿病およびガラクト
ース血症（ ｇａｌａｃｔｏｓｅｍｉａ）の病理的な状
態ξこおＩ，）で、多くの組織におけるアルドースレダ
クターゼ活性の上昇の結果、ソルビトールおよびガラク
チトール（ｇａｌａｃｔｉｔｏｌ）が高レベルになる。
１）は、ＮＡＤＰＨ一依存性酵素で、糖アルコールへの
アノレドースの還元を触媒する。糖尿病およびガラクト
ース血症（ ｇａｌａｃｔｏｓｅｍｉａ）の病理的な状
態ξこおＩ，）で、多くの組織におけるアルドースレダ
クターゼ活性の上昇の結果、ソルビトールおよびガラク
チトール（ｇａｌａｃｔｉｔｏｌ）が高レベルになる。
これζこよって、例えば、水晶体の白内障および網膜の
網細膜（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｍｅｍｂｒａｎｅ）の肥
厚化（ ｔｈ ｉ ｃｋｅｎ ｉ ｎ３）などが起きる
かも知れな０。さらに、アルドースレダクターゼレベル
の上昇心よ、神経または腎臓などの糖尿病合併症の原因
とみなされる。これらの理由で、最近アルドース阻害剤
の開発のための仕事がさかんである。これまで、この目
的のために、動物のＭｉ織や器官からアノレドースレダ
クターゼを苦心して単離することが必要であり、これに
よって、さらに収率が非常ζこ低くなる結果になってい
た。アルドースレダクターゼの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における発現の可能性は、今や細
菌抽出物を用いて分析システムを作ること、その結果、
動物の器官や組織への依存に取って代わること、を可能
にする。分析方法は、全体としてかなり単純化される。
網細膜（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｍｅｍｂｒａｎｅ）の肥
厚化（ ｔｈ ｉ ｃｋｅｎ ｉ ｎ３）などが起きる
かも知れな０。さらに、アルドースレダクターゼレベル
の上昇心よ、神経または腎臓などの糖尿病合併症の原因
とみなされる。これらの理由で、最近アルドース阻害剤
の開発のための仕事がさかんである。これまで、この目
的のために、動物のＭｉ織や器官からアノレドースレダ
クターゼを苦心して単離することが必要であり、これに
よって、さらに収率が非常ζこ低くなる結果になってい
た。アルドースレダクターゼの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における発現の可能性は、今や細
菌抽出物を用いて分析システムを作ること、その結果、
動物の器官や組織への依存に取って代わること、を可能
にする。分析方法は、全体としてかなり単純化される。
本発明は、特許請求の範囲にさらに定義され、以下の諸
例に詳細にさらに説明される通りである。
例に詳細にさらに説明される通りである。
上記で説明したものの他に、次の略語を用いる。
ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸ナトリウムＳＤＳ＝
ドデシル硫酸ナトリウム ＤＴＴ＝ジチオスレイトール ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン ＩＰＴＧ＝イソブロビルチオガラクトシド例≦２ ｌ．抗−ＰＰ５抗体を用いる、ヒト胎盤からの発現ｃＤ
ＮＡバンクのスクリーニング Ｇｅｎｏｆｉｔ Ｇｎ＋ｂＨ （Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ
）からのファージλｇｔｌｌ中の発現ｃＤＮＡバンクを
、寒天プレート（直径１３．５ｃｍ）当り約３０，ＯＯ
ＯＰＦＵの濃度で塗布した。このために、大腸菌ｙｌ０
９０株（ＡＴＣＣ ３ ７ １ ９ ７） （Ｒ．Ａ
． ＹｏｕｎｇおよびＲ．Ｗ． Ｄａｖｉｓ： Ｓｃｉ
＝ｎｃｅ Ｖｏｌ． ２２２、７７８−７８２、１９８
３）のコンビテントな細胞に３７℃で３０分間ファージ
を感染させて、次いでＬブロスプレート上の上層寒天に
塗布した。プレートを４２℃で４時間インキユベートし
て、次いで各々を乾燥したニトロセルロースフィルター
（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｂ
Ａ ８５、Ｒｅｆ． Ｎｏ． ４０１１２４）でカバー
した。フィルターは１０ｍＭＩＰＴＧ水溶液によって予
め飽和させておいた。フィルターでカバーしたプレート
を再び３７℃で４時間インキユベートした。次いで、フ
ィルターを再び除去する前に、フィルターおよびプレー
トをカーボンブラックに漬けた針でともに印付した。フ
ィルターをＴＢＳＴ（１０ｍＭ｝リスーＨＣＩ、ｐＨ８
．０、１ ５０ｍＭ ＮａＣ ｌ，０．０５％ツィーン
２０および５％脱脂粉乳）中で４℃で一晩インキユベー
トした。次に、フィルターをＴＢＳＴ中で室温で１０分
間３回洗浄して、次いで、フィルター当り１５ｍｌのＴ
ＢＳＴに溶解した抗−ＰＰ５ウサギ抗体とともに室温で
１時問イシキュベートした。（抗体溶液は予め１：２０
０に希釈して、非組換え入ｇｔ １ １溶解大腸菌細胞
とともにニトロセルロースフィルター上で１時間飽和さ
せておいた。）一次抗体とともにインキユベートした後
、フィルターをＴＢＳＴで４×１０分問洗浄した。次い
て、フィルターをアルカリフオスファターゼ（米国ブロ
メガ社製、ハイデルベルグのアトランタ社販売）と抱合
させて予めＴＢＳＴで１：５０００に希釈しておいた二
次の抗−ウサギ抗体とともに１時間賑盪しながらインキ
ユベートした。次いで、フィルターをＴＢＳＴで４×１
０分間再び洗浄した。
ドデシル硫酸ナトリウム ＤＴＴ＝ジチオスレイトール ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン ＩＰＴＧ＝イソブロビルチオガラクトシド例≦２ ｌ．抗−ＰＰ５抗体を用いる、ヒト胎盤からの発現ｃＤ
ＮＡバンクのスクリーニング Ｇｅｎｏｆｉｔ Ｇｎ＋ｂＨ （Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ
）からのファージλｇｔｌｌ中の発現ｃＤＮＡバンクを
、寒天プレート（直径１３．５ｃｍ）当り約３０，ＯＯ
ＯＰＦＵの濃度で塗布した。このために、大腸菌ｙｌ０
９０株（ＡＴＣＣ ３ ７ １ ９ ７） （Ｒ．Ａ
． ＹｏｕｎｇおよびＲ．Ｗ． Ｄａｖｉｓ： Ｓｃｉ
＝ｎｃｅ Ｖｏｌ． ２２２、７７８−７８２、１９８
３）のコンビテントな細胞に３７℃で３０分間ファージ
を感染させて、次いでＬブロスプレート上の上層寒天に
塗布した。プレートを４２℃で４時間インキユベートし
て、次いで各々を乾燥したニトロセルロースフィルター
（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｂ
Ａ ８５、Ｒｅｆ． Ｎｏ． ４０１１２４）でカバー
した。フィルターは１０ｍＭＩＰＴＧ水溶液によって予
め飽和させておいた。フィルターでカバーしたプレート
を再び３７℃で４時間インキユベートした。次いで、フ
ィルターを再び除去する前に、フィルターおよびプレー
トをカーボンブラックに漬けた針でともに印付した。フ
ィルターをＴＢＳＴ（１０ｍＭ｝リスーＨＣＩ、ｐＨ８
．０、１ ５０ｍＭ ＮａＣ ｌ，０．０５％ツィーン
２０および５％脱脂粉乳）中で４℃で一晩インキユベー
トした。次に、フィルターをＴＢＳＴ中で室温で１０分
間３回洗浄して、次いで、フィルター当り１５ｍｌのＴ
ＢＳＴに溶解した抗−ＰＰ５ウサギ抗体とともに室温で
１時問イシキュベートした。（抗体溶液は予め１：２０
０に希釈して、非組換え入ｇｔ １ １溶解大腸菌細胞
とともにニトロセルロースフィルター上で１時間飽和さ
せておいた。）一次抗体とともにインキユベートした後
、フィルターをＴＢＳＴで４×１０分問洗浄した。次い
て、フィルターをアルカリフオスファターゼ（米国ブロ
メガ社製、ハイデルベルグのアトランタ社販売）と抱合
させて予めＴＢＳＴで１：５０００に希釈しておいた二
次の抗−ウサギ抗体とともに１時間賑盪しながらインキ
ユベートした。次いで、フィルターをＴＢＳＴで４×１
０分間再び洗浄した。
最後に、一次および二次抗体が結合しているＰＰ９−ｉ
性のクローンを可視化するために、アルカリフォスファ
ターゼと発色剤（プロトジエン社からのブロトプロット
（ ＰｒｏｔｏＢＩｏｔ）システム）との反応によって
発色反応を行わせた。各々の発色反応のために、９９μ
１のＮＢＴ （ニトロブルーテトラゾリウム）基質（５
０ｍｇ／１、７０％ジメチルホルムアミド溶冫夜）およ
び４９．５μ１のＢＣｒＰ（５−ブロモー４−クロロ−
３−インドリルフォスフェート）基質（ ５ ０ Ｂ／
ｍｌ、７０％ジメチルホルムアミド溶液）を二口トセル
ロースフィルターのための１５ｍｌのＡＰ緩衝液（１０
０ｍＭ｝リスーＨＣＩ、１）Ｈ９．５、１ ００ｍＭ
ＮａＣ １，５ｎ＋ＭＭｇＣｌ２）に加えた。陽性ブラ
ークが十分な青色を呈するまで、フィルターを発色溶液
中で暗所で約２０分閏から１時閏回すように揺り動かし
た。発色反応を、停止溶液（２０ｍＭ｝リスーＨＣＩ％
ｐＨ８．０、および５ｍＭＥＤＴＡ）中にフィルターを
浸漬して停止させた。
性のクローンを可視化するために、アルカリフォスファ
ターゼと発色剤（プロトジエン社からのブロトプロット
（ ＰｒｏｔｏＢＩｏｔ）システム）との反応によって
発色反応を行わせた。各々の発色反応のために、９９μ
１のＮＢＴ （ニトロブルーテトラゾリウム）基質（５
０ｍｇ／１、７０％ジメチルホルムアミド溶冫夜）およ
び４９．５μ１のＢＣｒＰ（５−ブロモー４−クロロ−
３−インドリルフォスフェート）基質（ ５ ０ Ｂ／
ｍｌ、７０％ジメチルホルムアミド溶液）を二口トセル
ロースフィルターのための１５ｍｌのＡＰ緩衝液（１０
０ｍＭ｝リスーＨＣＩ、１）Ｈ９．５、１ ００ｍＭ
ＮａＣ １，５ｎ＋ＭＭｇＣｌ２）に加えた。陽性ブラ
ークが十分な青色を呈するまで、フィルターを発色溶液
中で暗所で約２０分閏から１時閏回すように揺り動かし
た。発色反応を、停止溶液（２０ｍＭ｝リスーＨＣＩ％
ｐＨ８．０、および５ｍＭＥＤＴＡ）中にフィルターを
浸漬して停止させた。
陽性シグナルを、対応する寒天プレート上のブラークと
照合した。ブラークをパスツールピペットで切り出して
、ｌｍｌのＳＭ！ｌ衝液（１０ｍＭ｝リスーＨＣＩ，ｐ
Ｈ７．５、１ ０ｍＭ ＭｇＣ Ｉ ２ ）に再懸濁さ
せて、単一の陽性ブラークを単離して取り出した。その
結果、陽性反応を呈するクローン、ＰＰ９−１０、ＰＰ
９−３５３、ＰＰ９−３５７、ＰＰ９−３６１およびＰ
Ｐ ９ −３ ６ ２が得られた。
照合した。ブラークをパスツールピペットで切り出して
、ｌｍｌのＳＭ！ｌ衝液（１０ｍＭ｝リスーＨＣＩ，ｐ
Ｈ７．５、１ ０ｍＭ ＭｇＣ Ｉ ２ ）に再懸濁さ
せて、単一の陽性ブラークを単離して取り出した。その
結果、陽性反応を呈するクローン、ＰＰ９−１０、ＰＰ
９−３５３、ＰＰ９−３５７、ＰＰ９−３６１およびＰ
Ｐ ９ −３ ６ ２が得られた。
２．ＤＮＡの配列分析
上記のファージクローンを増やして、それぞれのＤＮＡ
を抽出した。特定のＥｃｏＲＩ断片を単離して、ブルー
スクリプトＭ１３ベクター（ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、
サンジエゴ、ＣＡ，米国）のＥｃｏＲＩ部位に連結させ
た。配列分析をＳａｎｇｅｒらの酵素的ジデオキシ法（
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ
７４、５４６３−５４６７、１９７７）を用いて行った
。
を抽出した。特定のＥｃｏＲＩ断片を単離して、ブルー
スクリプトＭ１３ベクター（ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、
サンジエゴ、ＣＡ，米国）のＥｃｏＲＩ部位に連結させ
た。配列分析をＳａｎｇｅｒらの酵素的ジデオキシ法（
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ
７４、５４６３−５４６７、１９７７）を用いて行った
。
配列は、転写解読枠を示し、最大３１６個のアミノ酸を
有するタンパク質をコードする。
有するタンパク質をコードする。
３．ＰＰ１１ｉ！ｋ合タンパク質の発現ｐ Ｔ ｒ ｃ
９ ９Ｃ （Ｅ． Ａ＋ｍａｎｎら： Ｇｅｎｅ ６
９、３ｏ１〜３１５、１９８Ｂ）をＥｃｏＲＩによって
消化した．クローン入ｇｔｌｌ−３６１をＥｃｏＲＩで
消化して、１３８７ｂｐの大きさのＥｃｏＲＩ挿入物を
、上記のｐＴｒｃ９９ｃベクター断片に連結させた。結
果として得られたブラスミドｐＴｒｃ９９Ｃ−ＰＰ９は
、約３６ｋＤのタンパク質の大腸菌細胞中での合成を誘
導することができる。このタンパク質を、ヒト胎盤から
単離されたＰＰ９による免疫によって産生される単一特
異性（ｎ＋ｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）ウサギ抗一ＰＰ９
抗血清を用いて特異的に免疫沈降させることができる。
９ ９Ｃ （Ｅ． Ａ＋ｍａｎｎら： Ｇｅｎｅ ６
９、３ｏ１〜３１５、１９８Ｂ）をＥｃｏＲＩによって
消化した．クローン入ｇｔｌｌ−３６１をＥｃｏＲＩで
消化して、１３８７ｂｐの大きさのＥｃｏＲＩ挿入物を
、上記のｐＴｒｃ９９ｃベクター断片に連結させた。結
果として得られたブラスミドｐＴｒｃ９９Ｃ−ＰＰ９は
、約３６ｋＤのタンパク質の大腸菌細胞中での合成を誘
導することができる。このタンパク質を、ヒト胎盤から
単離されたＰＰ９による免疫によって産生される単一特
異性（ｎ＋ｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）ウサギ抗一ＰＰ９
抗血清を用いて特異的に免疫沈降させることができる。
大腸菌細胞におけるＰＰ９の発現は、ざらに上記の血清
を用いるウエスタンプロット分析によって示された。こ
の実験において、ｐＴｒｃ９９Ｃ−ＰＰ９プラスミドを
含む［ＰＴＣ；一誘導細胞からの抽出物のみとの反応が
あり、約３６ｋＤのタンパク質バンドが再び特異的に可
視化された。
を用いるウエスタンプロット分析によって示された。こ
の実験において、ｐＴｒｃ９９Ｃ−ＰＰ９プラスミドを
含む［ＰＴＣ；一誘導細胞からの抽出物のみとの反応が
あり、約３６ｋＤのタンパク質バンドが再び特異的に可
視化された。
ブラスミドを有しない大腸菌対照抽出物、およびｐＴ
ｒ ｃ ９９Ｃ−ＰＰ９を含むがｒｐ’ｒｃで誘導ざれ
ていなかった抽出物は、と記の抗−ＰＰ９抗血清と反応
しなかった。前記のようにして産生されたプラスミド構
造物によって生産されたＰＰ９融合タンパク質は、以下
のヌクレオチド配列で定義される次のようなＮ一末端ア
ミノ酸配列を有した。
ｒ ｃ ９９Ｃ−ＰＰ９を含むがｒｐ’ｒｃで誘導ざれ
ていなかった抽出物は、と記の抗−ＰＰ９抗血清と反応
しなかった。前記のようにして産生されたプラスミド構
造物によって生産されたＰＰ９融合タンパク質は、以下
のヌクレオチド配列で定義される次のようなＮ一末端ア
ミノ酸配列を有した。
ベクター／リンカー／
５′π領域
ＰＰ９
Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｉｒ妃．ａ Ａｌａ Ｍｅ
ｔ Ａｌａ Ｓｅｒ．．． ＡＴＧＧＧＧＡＡＴ この構造によって定義されるＰＰ９融合タンパク質は、
ＰＰ９ ｃＤＮＡによってコードされる完全なＰＰ９
アミノ酸配列に加えて、Ｎ一末端の前に６個のアミノ酸
を有している。４個のアミノ酸はベクターによってコー
ドざれるアミノ酸であり、２個はＰＰ９ｃ ＤＮＡに
ある５′非翻訳領域によって特定ざれるアミノ酸である
。確認のために、前記に示された構築を、発現ベクター
ｐＴｒｃ９９Ａおよびｐ Ｔ ｒ ｃ ９ ９ Ｂ （
Ａｍａｎｎら：前出）を用いて同様に行った。これらの
ベクターは、２ｂｐ（ｐＴｒｃ９９Ａの場合）およびｌ
ｂｐ（ｐＴｒｃ９９Ｂの場合）のみがｐＴｒｃ９９Ｃと
異なっており、これによってＵ訳解読枠においてシフト
が起きる。予想されたように、ｐＴｒｃ９９Ａ−ＰＰ９
およびｐＴｒｃ９９Ｂ−ＰＰ９のいずれも、抗−ＰＰ９
抗血清と反応するＰＰ９タンパク質の合成を誘導するこ
とができなかった。
ｔ Ａｌａ Ｓｅｒ．．． ＡＴＧＧＧＧＡＡＴ この構造によって定義されるＰＰ９融合タンパク質は、
ＰＰ９ ｃＤＮＡによってコードされる完全なＰＰ９
アミノ酸配列に加えて、Ｎ一末端の前に６個のアミノ酸
を有している。４個のアミノ酸はベクターによってコー
ドざれるアミノ酸であり、２個はＰＰ９ｃ ＤＮＡに
ある５′非翻訳領域によって特定ざれるアミノ酸である
。確認のために、前記に示された構築を、発現ベクター
ｐＴｒｃ９９Ａおよびｐ Ｔ ｒ ｃ ９ ９ Ｂ （
Ａｍａｎｎら：前出）を用いて同様に行った。これらの
ベクターは、２ｂｐ（ｐＴｒｃ９９Ａの場合）およびｌ
ｂｐ（ｐＴｒｃ９９Ｂの場合）のみがｐＴｒｃ９９Ｃと
異なっており、これによってＵ訳解読枠においてシフト
が起きる。予想されたように、ｐＴｒｃ９９Ａ−ＰＰ９
およびｐＴｒｃ９９Ｂ−ＰＰ９のいずれも、抗−ＰＰ９
抗血清と反応するＰＰ９タンパク質の合成を誘導するこ
とができなかった。
４．成熟非融合ＰＰ９タンパク質の発現ＰＰ９ ｃＤ
ＮＡは、開始コードンにおけるＮｅｏ Ｉ部位（ ５
’ ＣＣＡＴＧＧ３ ’ ）の他にも、構造遺伝子中に
別のＮｃｏＩ部位を有する。ＰＰ９タンパク質の成熟発
現を達成するために、先ず、１３８７ｂｐの大きさ（上
記を参照されたい）のＥｃｏＲＩ断片を、ベクターｐＭ
ａ５−８（ Ｓｔａｎｓｓｅｎｓら： １９８９）に連
結させた。その中にＥｃｏＲＩ断片が所望の位置方向（
５′末端、左手にＰＰ９ ＡＴＧ開始コードンが位置
している）に存在しているブラスミド（ｐＭａ５−８−
ＰＰ９）を得て、増殖させた。ブラスミドＤＮＡを、Ｈ
ｉｎｄｍによって完全に、Ｎｃｏｌによって部分的に、
消化した。１４１５ｂｐの大きさのＮｃｏＩ−Ｈｉｎｄ
ｌＩＩ断片を単離して、同じ制限酵素で切断しておいた
発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ中の対応する部位の閏に連
結させた。その結果得られるブラスミドｐＴ ｒ ｃ
９９Ａ−ＰＰ９Ｍ （ ｒＭＪは「成熟Ｊ （＋ａａｔ
ｕｒｅ）を意味する）は、５５３５ｂｐからなり、ｉｐ
’ｒｃ誘導の後、成熟非融合ＰＰ９タンパク質を発現す
る。このＰＰ９タンパク質のＮ一末端アミノ敢配列は、
以下のヌクレオチド配列によって定債ざれる。
ＮＡは、開始コードンにおけるＮｅｏ Ｉ部位（ ５
’ ＣＣＡＴＧＧ３ ’ ）の他にも、構造遺伝子中に
別のＮｃｏＩ部位を有する。ＰＰ９タンパク質の成熟発
現を達成するために、先ず、１３８７ｂｐの大きさ（上
記を参照されたい）のＥｃｏＲＩ断片を、ベクターｐＭ
ａ５−８（ Ｓｔａｎｓｓｅｎｓら： １９８９）に連
結させた。その中にＥｃｏＲＩ断片が所望の位置方向（
５′末端、左手にＰＰ９ ＡＴＧ開始コードンが位置
している）に存在しているブラスミド（ｐＭａ５−８−
ＰＰ９）を得て、増殖させた。ブラスミドＤＮＡを、Ｈ
ｉｎｄｍによって完全に、Ｎｃｏｌによって部分的に、
消化した。１４１５ｂｐの大きさのＮｃｏＩ−Ｈｉｎｄ
ｌＩＩ断片を単離して、同じ制限酵素で切断しておいた
発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ中の対応する部位の閏に連
結させた。その結果得られるブラスミドｐＴ ｒ ｃ
９９Ａ−ＰＰ９Ｍ （ ｒＭＪは「成熟Ｊ （＋ａａｔ
ｕｒｅ）を意味する）は、５５３５ｂｐからなり、ｉｐ
’ｒｃ誘導の後、成熟非融合ＰＰ９タンパク質を発現す
る。このＰＰ９タンパク質のＮ一末端アミノ敢配列は、
以下のヌクレオチド配列によって定債ざれる。
Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓａｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ．．．ＡＧＧ
ＡＡＡＣＡＧＡＣＣ ＡＴＧ ＧＣＡ ＡＧＣ ＣＧＴ
ＣＴＣ ．．．このようにして発現されたタンパク質
は、ウエスタンプロットおよび免疫沈降において抗−Ｐ
Ｐ９抗血清と反応し、約３６ｋＯの大きさのタンパク質
を検出することが可能である。今や、この成熟ＰＰ９タ
ンパク質が大腸菌細胞のべリブラズム（ ｐｅｒｉｐｌ
ａｓｍ）中に軸送されることおよびそこでその酵素（ア
ルドースレダクターゼ）活性を示すことが見出されてい
る。
ＡＡＡＣＡＧＡＣＣ ＡＴＧ ＧＣＡ ＡＧＣ ＣＧＴ
ＣＴＣ ．．．このようにして発現されたタンパク質
は、ウエスタンプロットおよび免疫沈降において抗−Ｐ
Ｐ９抗血清と反応し、約３６ｋＯの大きさのタンパク質
を検出することが可能である。今や、この成熟ＰＰ９タ
ンパク質が大腸菌細胞のべリブラズム（ ｐｅｒｉｐｌ
ａｓｍ）中に軸送されることおよびそこでその酵素（ア
ルドースレダクターゼ）活性を示すことが見出されてい
る。
さらに、大腸菌におけるアルドースレダクターゼの発現
率を上げるために、改良された発現ベクター（ｐＴａｃ
Ｔ７Ｌ）を構築した。これには、Ｔ７ファージの遺伝子
１０のリポソーム結合部位が利用される。異種の（ ｈ
ｅｔｅｒｏ ｌｏｇｏｕｓ）遺伝子の直前のこの配列は
、より効果的なリポソーム結合によってその発現率を上
げることができることが知られている（Ｏｌｉｎｓら：
Ｇｅｎｅ ７３、２２７−２３５、１９８８） ．
ｐ Ｔ ａ ｃ Ｔ ？ Ｌは本質的には既知のべク
ターｐ Ｋ Ｋ ２ ２ ３ −３ （Ｂｒｏｓｉｕｓ
および｝ｌｏｌｙ：Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ
． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１、６９２９−６９３３、１
９８４）を基礎としたものであるが、後者と対照的に、
クローニングリンカーの直前に上記のＴ７配列を有して
いる。上記の１４１５ｂｐの長さのＰＰ９をコードする
ＮｃｏＩ−Ｈｉｎｄ［ＩＩ断片を、同じ制限酵素で切断
したｐＴａｃＴ７Ｌベクターに連結させた。その結果と
して得られるプラスミドｐＴａｃＴ７Ｌ−ＰＰ９は、同
様に、非融合ＰＰ９タンパク質の発現を仲介するが、Ｐ
Ｐ９の収率は、ｐＴｒ ｃ ９９Ａ−ＰＰ９Ｍで得られ
るものの約２０倍である。
率を上げるために、改良された発現ベクター（ｐＴａｃ
Ｔ７Ｌ）を構築した。これには、Ｔ７ファージの遺伝子
１０のリポソーム結合部位が利用される。異種の（ ｈ
ｅｔｅｒｏ ｌｏｇｏｕｓ）遺伝子の直前のこの配列は
、より効果的なリポソーム結合によってその発現率を上
げることができることが知られている（Ｏｌｉｎｓら：
Ｇｅｎｅ ７３、２２７−２３５、１９８８） ．
ｐ Ｔ ａ ｃ Ｔ ？ Ｌは本質的には既知のべク
ターｐ Ｋ Ｋ ２ ２ ３ −３ （Ｂｒｏｓｉｕｓ
および｝ｌｏｌｙ：Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ
． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１、６９２９−６９３３、１
９８４）を基礎としたものであるが、後者と対照的に、
クローニングリンカーの直前に上記のＴ７配列を有して
いる。上記の１４１５ｂｐの長さのＰＰ９をコードする
ＮｃｏＩ−Ｈｉｎｄ［ＩＩ断片を、同じ制限酵素で切断
したｐＴａｃＴ７Ｌベクターに連結させた。その結果と
して得られるプラスミドｐＴａｃＴ７Ｌ−ＰＰ９は、同
様に、非融合ＰＰ９タンパク質の発現を仲介するが、Ｐ
Ｐ９の収率は、ｐＴｒ ｃ ９９Ａ−ＰＰ９Ｍで得られ
るものの約２０倍である。
５．大腸菌における発現の後のタンパク質ＰＰ９のアル
ド ース レダクターゼ活性 ＰＰ９ ｃＤＮＡ配列の相同性の比較によって、コン
ピューター分析において９４％の相同性（８５％の同一
性）がラットのアルドースレダクターゼ（ Ｃａｒｐｅ
ｒら： ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２２０、２０９−２１
３、１９８７）との間に認められた。ざらに、カエルの
目のローグリスタリンおよびラット水晶体のアルデヒド
レダクターゼとの相同性が発見された。この知見によっ
て、ＰＰ９は、比較的大きなタンパク質群（ｆａｍｉｌ
！／）のあるものであって、ヒトアルドースレダクター
ゼである可能性がきわめて強い。
ド ース レダクターゼ活性 ＰＰ９ ｃＤＮＡ配列の相同性の比較によって、コン
ピューター分析において９４％の相同性（８５％の同一
性）がラットのアルドースレダクターゼ（ Ｃａｒｐｅ
ｒら： ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２２０、２０９−２１
３、１９８７）との間に認められた。ざらに、カエルの
目のローグリスタリンおよびラット水晶体のアルデヒド
レダクターゼとの相同性が発見された。この知見によっ
て、ＰＰ９は、比較的大きなタンパク質群（ｆａｍｉｌ
！／）のあるものであって、ヒトアルドースレダクター
ゼである可能性がきわめて強い。
ベリブラズムの画分を、大腸菌Ｋ１２
Ｗ３１ １０ １ａｃ ＩＱ （ｐＴａｃＴ７Ｌ−ＰＰ
９）からＨｓｉｕｎｇら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ ４、９９１〜９９５、１９８６）の方法によって調
製した。これらの抽出物は、対応する対照抽出物には存
在しないアルドースレダクターゼ活性を有している。ア
ルドースレダクターゼ活性は、分析混合物中のＨＡＤＰ
Ｈの酸化による３ ４ ０ ｒ＋ｍにおける吸収の減少
に基づく既知の分析法（例えば、Ｋａｗａｓａｋ ｉら
： Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９
９６、３０−３６、１９８９）を用いて検出した。
９）からＨｓｉｕｎｇら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ ４、９９１〜９９５、１９８６）の方法によって調
製した。これらの抽出物は、対応する対照抽出物には存
在しないアルドースレダクターゼ活性を有している。ア
ルドースレダクターゼ活性は、分析混合物中のＨＡＤＰ
Ｈの酸化による３ ４ ０ ｒ＋ｍにおける吸収の減少
に基づく既知の分析法（例えば、Ｋａｗａｓａｋ ｉら
： Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９
９６、３０−３６、１９８９）を用いて検出した。
図は、入ｇｔｌｌ−１０の位置を入ｇｔｌ１３６２との
閏係において示す、説明図である。
閏係において示す、説明図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、表１に示されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配
列物、その対立形質および変異体。 ２、表１に示されたコード鎖を含む、胎盤特異性タンパ
ク質ＰＰ９をコードするＤＮＡ配列物。 ３、請求項１に記載のＤＮＡと緊縮条件 （ｓｔｒｉｎｇｅｎｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下でハイ
ブリダイズする、ＤＮＡまたはＲＮＡ。 ４、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡまたは
ＲＮＡを含む、遺伝子構造物。 ５、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡまたは
ＲＮＡを含む、ベクター。 ６、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡまたは
ＲＮＡを含む、形質転換細胞。 ７、請求項２に記載のＤＮＡ配列の大腸菌、酵母または
動物細胞における発現によって遺伝子工学的に得られる
、ＰＰ９。 ８、請求項１〜４のいずれか１項に記載のｃＤＮＡまた
はＲＮＡを発現系へ導入してそこで発現させることから
なる、ＰＰ９の製造法。 ９、遺伝子工学によって製造されるＰＰ９で免疫化を行
うことによって得られる、ＰＰ９に特異的なポリクロー
ナルまたはモノクローナル抗体、または抗原活性を有す
るその部分。 １０、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡまた
はＲＮＡの全部または部分を含んでなる、診断補助物。 １１、請求項９に記載の抗体を含んでなる、診断補助物
。 １２、体液、組織またはそれらから分離した核酸を請求
項１０または１１に記載の診断補助物と接触させること
を含む、診断法。 １３、医薬物としてのＰＰ９。 １４、ＰＰ９を含んでなる、医薬物。 １５、請求項７に記載のＰＰ９を用いることを含む、ア
ルドースレダクターゼ阻害因子の検出またはスクリーニ
ング法。 １６、アルドースレダクターゼ阻害因子のスクリーニン
グまたは検出のための、請求項７に記載のＰＰ９の使用
。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3907744.6 | 1989-03-10 | ||
| DE3907744A DE3907744A1 (de) | 1989-03-10 | 1989-03-10 | Fuer das plazentaprotein 9 (pp9) kodierende cdna, ihre isolierung und verwendung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02295486A true JPH02295486A (ja) | 1990-12-06 |
Family
ID=6375984
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2059800A Pending JPH02295486A (ja) | 1989-03-10 | 1990-03-09 | 胎盤タンパク質９をコ−ドするｃＤＮＡ、その単離および使用 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0386733B1 (ja) |
| JP (1) | JPH02295486A (ja) |
| KR (1) | KR900014595A (ja) |
| AT (1) | ATE124722T1 (ja) |
| AU (1) | AU625082B2 (ja) |
| CA (1) | CA2011877A1 (ja) |
| DE (2) | DE3907744A1 (ja) |
| DK (1) | DK0386733T3 (ja) |
| ES (1) | ES2076238T3 (ja) |
| IE (1) | IE67797B1 (ja) |
| PT (1) | PT93381B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05317083A (ja) * | 1992-02-12 | 1993-12-03 | Mitsubishi Gas Chem Co Inc | 人アルドース還元酵素に結合する抗体およびその使用法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3013724A1 (de) * | 1980-04-10 | 1981-10-15 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Neues protein pp (pfeil abwaerts)9(pfeil abwaerts), verfahren zu seiner anreicherung und gewinnung sowieseine verwendung |
-
1989
- 1989-03-10 DE DE3907744A patent/DE3907744A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-03-07 DK DK90104352.1T patent/DK0386733T3/da active
- 1990-03-07 DE DE59009360T patent/DE59009360D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-03-07 ES ES90104352T patent/ES2076238T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-07 AT AT90104352T patent/ATE124722T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-03-07 EP EP90104352A patent/EP0386733B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-08 AU AU51103/90A patent/AU625082B2/en not_active Ceased
- 1990-03-09 PT PT93381A patent/PT93381B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-03-09 KR KR1019900003102A patent/KR900014595A/ko not_active Ceased
- 1990-03-09 JP JP2059800A patent/JPH02295486A/ja active Pending
- 1990-03-09 CA CA002011877A patent/CA2011877A1/en not_active Abandoned
- 1990-03-09 IE IE85390A patent/IE67797B1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05317083A (ja) * | 1992-02-12 | 1993-12-03 | Mitsubishi Gas Chem Co Inc | 人アルドース還元酵素に結合する抗体およびその使用法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT93381B (pt) | 1996-02-29 |
| EP0386733B1 (de) | 1995-07-05 |
| PT93381A (pt) | 1990-11-07 |
| CA2011877A1 (en) | 1990-09-10 |
| ES2076238T3 (es) | 1995-11-01 |
| KR900014595A (ko) | 1990-10-24 |
| ATE124722T1 (de) | 1995-07-15 |
| IE900853L (en) | 1990-09-10 |
| DE59009360D1 (de) | 1995-08-10 |
| IE67797B1 (en) | 1996-05-01 |
| EP0386733A1 (de) | 1990-09-12 |
| DK0386733T3 (da) | 1995-11-20 |
| DE3907744A1 (de) | 1990-09-20 |
| AU5110390A (en) | 1990-09-13 |
| AU625082B2 (en) | 1992-07-02 |
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