JPH06510904A - 少なくとも遊離のチオールとして存在するシステインを有する抗体フラグメントの大腸菌での発現、２官能性Ｆ（ａｂ’）↓２抗体の産生のための使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 少なくとも遊離のチオールとして存在するシスティンを有する抗体フラグメント の大腸菌での発現、２官能性Ｆ　（ａｂ’）　！抗体の産生のための使用 発明の分野 この発明は、微生物宿主中での機能性抗体フラグメントの産生に関する。

発明の背景 天然に存在する抗体（免疫グロブリン）は、ジスルフィド結合で連結された２本 のＨ鎖および２本のし鎖からなり、各り鎖はこれらＨ鎖の一方とジスルフィド結 合により連結されている。各鎖はＮ末端側の可変ドメイン（Ｖ、またはＶＬ）お よびＣ末端側の定常ドメインを有する：Ｌ鎖の定常ドメインはＨ鎖の第一定常ド メインと並んでジスルフィド結合しており、Ｌ鎖可変ドメインはＨ鎖の可変ドメ インと並んでいる。Ｈ鎖定常領域は、（Ｎ末端側からＣ末端側の方向に）ＣＨＩ 領域およびヒンジ領域を含む。Ｌ鎖もまたヒンジドメインを含む。特定のアミノ 酸残基がＬ鎖およびＨ鎖可変ドメインの間の界面を形成し、ジスルフィド結合さ セテイルモノと思われる（たとえば、コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）ら、Ｊ　、　Ｍ ｏ１．　Ｂ　ｉｏｌ、　１８６　：　６５１−６６３　（１９８５）：ノポト＝ 　−（Ｎｏｖｏｔｎｙ）および／＼−／（−（ｌ（ａｂｅｒ）　、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ８２　：　４５９２−４５９６　（１，９ ８５）、パドラン（Ｐ　ａｄｌａｎ）ら、Ｍｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、２３　（ ９）　：　９５１〜９６０　（１９８６）、およびミラー（Ｓ、Ｍｉｌｌｅｒ） 　、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、２１６　：９６５−９７３（１，９９０）参照）。

定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接関与していなし）が、抗体依存性細胞 障害や補体依存性細胞障害への参画などの種々のエフェクター機１！１こ関与し てＬする。Ｌ鎖およびＨ鎖の各ペアの可変ドメインは、抗体の抗原への結合重こ 直接関与している。天然のＬ鎖およびＨ鎖のドメインは同じ一般的構造を有しく ＬＮわゆる免疫グロブリン折り畳み（ｆｏｌｄ）　）　、各ドメインは４つのフ レームワーク（ＦＲ）領域からなり、これらフレームワーク領域の配列はある程 度保存されており、３つの超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）によって連結 されてＬする（カッく・ノド（Ｋａｂａｔ、　Ｅ、　Ａ、　）ら、免疫学的に重 要なタンパク質の配列、国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、（１９８ ７）参照）。これら４つのフレームワーク領域は、大部分、β−シートコンホメ ーションをとり、ＣＤＲは該β−シート構造を連結し、ある場合には該構造の一 部を形成するループを形成する。各鎖中のＣＤＲはフレームワーク領域によって 極めて近接して保持され、他の鎖からのＣＤＲとともに抗原結合部位の形成に寄 与している。

抗体は、種々の抗原結合フラグメントに分類することができる。Ｆｖフラグメン トは、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変ドメインのみからなるヘテロダイマーである。Ｆａ ｂフラグメントは、Ｌ鎖の定常ドメインおよびＨ鎖の第一定常ドメイン（ＣＨｌ ）をも有している。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１または２ 以上のシスティンを含む、Ｈ鎖ＣＭ１ドメインのカルボキシ末端側に幾つかの残 基が付加していることがＦａｂフラグメントと異なっている。Ｆａｂ’−３Ｈは 、定常ドメインのシスティン残基が遊離のチオール基を有するＦａｂ’を表すた めに本明細書において用いる表示である。Ｆ（ａｂ’）を抗体フラグメントは、 元来、ヒンジシスティンの間でＦａｂ’フラグメントのベアとして生成される。

抗体および抗体フラグメントの組換え製造により、抗原結合親和性の増大した抗 体、免疫原性の修飾された抗体並びに二官能性の抗体を設計することが容易にな る。機能性の抗体を得ることができると報告された最初の発現系は、哺乳動物細 胞に対するものであった。たとえば、キャビンー（Ｃａｂｉｌｌｙ）らの米国特 許（米国特許第４．８１６．５６７号）は、Ｌ鎖およびＨ鎖の少なくとも可変領 域配列を宿主細胞中で共発現する方法を教示している。当該技術分野における他 の研究者は、バキュロウィルス発現系（ハーゼマン（Ｈａｓｅｍａｎ）ら、Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ８７　：　３９４２−３９４６　（１９９０））　、酵母系（ホ ーウイッツ（Ｈｏｒｗｉｔｚ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ ＳＡ８５　：　８６７８−８６８２　（１９８８）Ｌファージラムダにおける組 み合わせライブラリー（ヒユーズ（Ｈｕｓｅ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ２４６　：　 １２７５〜１２８１　（１９８９））　、および繊維状ファージを用いた仕事（ マソカファーティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３４８　：　５５ ２〜５５４　（１９９０））を報告している。

細菌系、とりわけ大腸菌発現系における抗体および抗体フラグメントの産生が当 該技術分野の研究者によって行われている。大腸菌発現系には、構築物の容易な 作成および直接的な発現を可能とする充分研究され便利な遺伝子技術、および大 腸菌の増殖が速いことおよびその発酵が比較的簡単であることによって可能とな る生成物の比較的便利で経済的に大スケールの産生を含む幾つかの利点がある。

大腸菌における機能性抗体フラグメントの大スケールの産生は、研究並びに商業 的な応用において重要である。

抗体遺伝子の細菌中での発現はキャビンーら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ８１　：　３２７３〜３２７７　（１９８４））　、ボス（Ｂｏ ｓｓ）ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１２　：　３７９１−３８０ ６　（１９８４））によって報告されている。これら報告は細胞質発現を示して おり、収率がかなり変動することが報告されている。ゼメルードリーゼン（Ｚｅ ｍｅｌ−Ｄｒｅａｓｅｎ）ら（Ｇｅｎｅ３１５〜３２２　（１９８４））は、大 腸菌における免疫グロブリンＩ７鎖の分泌およびプロセシングを報告している。

ブリュソクツン（Ｐ　１ｕｃｋｔｈｕｎ）ら（定量的生物学に関するコールドス プリングハーバーンンポジウム、ＬＩＴ巻、１０５〜１１２頁（１９８７、コー ルド・スブリンルハーバー・ラボラトリ−））は、細胞質ノ１イブ１ルソドタン ノくり質の発現、潜在的に移動可能なノーイブリツドタンノ＜り質、およびアル カリホスファターゼもしくはβ−ラクタマーゼシグナル配列との融合物としての 看、鎖、Ｖ　＋＋鎖、■ＬＣＬ鎖、および■。Ｃ１１鎖の発現およびペリプラズ ム移動を開示して（する。スケラ（Ｓ　ｋｅｒｒａ）およびプリュツクツン（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ２４０　：　１０３８〜１０４１（１９８８））は、抗体の可変ド メインの大腸菌ペリプラズムへのベリブラスム分泌およびインビボでの正確な畳 み込みを報告している；マウスＦａｂフラグメントの発現についても同様の方法 および結果がベラター（７３６ｔｔｅｒ）らによって報告されている（Ｓｃｉｅ ｎｃｅ２４０　：１０４１−１０４３　（１９８８））。

バード（Ｂｉｒｄ）ら（Ｎａｔｕｒｅ３３２　：　３２３−３２７　（１９８８ ））は、アミノ酸配列を介したＦｖ領領域Ｌ鎖およびＨ鎖フラグメントの連結、 および単一のポリペプチドとしての該複合体の大腸菌での産生を報告している（ ラドナーら、米国特許第４．９４６．７７８号をも参照）。ノ１ストン（Ｈｕｓ ｔｏｎ）ら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ８５　：５８７９ −５８８３　（１９８８））も同様の仕事を報告している。ウォード（Ｗａｒｄ ）ら（Ｎａｔｕｒｅ３４１　：　５４４〜５４６　（１９８９））は、「単一ド メイン」抗体（単離したＨ鎖可変ドメイン）の大腸菌中での産生および大腸菌か らの分泌を報告している。コンドラ（Ｃｏｎｄｒａ）ら（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　ｏ ｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６５　（４）：　２２９２ −２２９５　（１９９０））は、抗体り鎖およびＨ鎖をコードするｃＤＮＡの大 腸菌中での発現およびＦａｂフラグメントへの再現を開示している。ベラターお よびホーウィッツ（Ｍｅｔｈ。

ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１７８　：　４７６−４９６　（１９８９ ）　）は、大腸菌およびサツカロミセス・セレビシェからの機能性Ｆａｂフラグ メントの発現および分泌を記載している。

プリュックツンおよびスケラは、機能性抗体ＦｖおよびＦａｂフラグメントの大 腸菌中での発現技術を記載している（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ ｇｙ　１７８　：　４９７〜５１５　（１９８９））。彼らの方法によると、細 胞質において、それぞれ細菌のシグナル配列に融合したＶｔおよびＶ□の前駆体 タンパク質が還元形にて合成される。内膜を通ってペリプラズム中に移動した後 、シグナル配列が開裂し、各ドメインが折り畳まれて集合し、ジスルフィド結合 が形成される。彼らは、彼らの方法によるＦａｂフラグメントの発現も同様であ ることを教示している。同様の発現法は、文献のいたるところに見いだされる。

抗体フラグメントの大腸菌発現の概略ニツイテは、ブリュソクツン、Ｂｉｏｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ、　９　：　５４５−５５１　（１９９１）をも参照。

キャビン−（Ｇ　ｅｎｅ、８５　：　５５３−５５７　［１９８９］　）は、低 い温度（３７℃ではなく２１℃〜３００Ｃ）で増殖する大腸菌細胞においては、 に鎖および末端の切れたＨ鎖（Ｆｄフラグメント）をコードする単一発現プラス ミドが高収量の機能性Ｆａｂフラグメントを与えることを教示している。キャビ ンーは、Ｆａｂフラグメントは大腸菌細胞實中では非共有結合により連結したダ イマーとして存在するように思われるが、大腸菌から単離した可溶性のＦａｂフ ラグメントは細胞破砕後の空気酸化によって生成される共有結合ダイマーとして 現れることを議論している。

ンステアミンなどの穏やかな還元剤の低濃度の存在下では、２価Ｆ（ａｂ’）ｚ 抗体フラグメントが２つのＦａｂ’フラグメントに解離することが文献で知られ ている。この解離は、穏やかな酸化によって逆行する。ＦａｂおよびＦ（ａ　ｂ ’）、抗体フラグメントの生成はまた、完全な抗体の部分的還元および制限され たタンパク質加水分解によっても示されている（たとえば、バーハム（Ｐａｒｈ ａｍ）　、Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　（ウェア（Ｅ　、　Ｍ 、　Ｗｅｉｒ）編、ブラックウェル・サイエンティフィック、カリフォルニア州 ）第４版、１巻、１４章（１９８３）参照）。しかしながら、これらの方法を用 いた場合、回収した抗体フラグメントの正確な性質および比率を制御するのが困 難である。２側坑体とは、少なくとも２つのエピトープ結合部位（該部位は同じ かまたは異なる抗原上に存在していてよい）を有する抗体をいう。

２特異的抗体とは、単一の抗原によって共有されていない２つのエピトープに結 合し得る２側坑体をいう。腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原と免疫エフェクター細胞の 表面マーカーとに対して二重の特異性を有する２特異的モノクローナル抗体（Ｂ ｓＭＡｂｓ）が記載されている（たとえば、リウ（Ｌ　ｉｕ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ８２　：　８６４８　（１９８５）；ペレツ （Ｐ　ｅｒｅｚ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３１６　：　３５４　（１９８５）を参照） 。これらＢｓＭＡｂｓは、腫瘍細胞標的を殺すようにエフェクター細胞に指令お よび誘発するのに有効であることが示されている（ファンガ−（Ｆ　ａｎｇｅｒ ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｔｏｄａｙ　１２　：　５１　（１９９１）　）。

ＢｓＭａｂｓを産生させる一つの方法は、２つのモノクローナル抗体産生ハイブ リドーマを融合させて、親のモノクローナル抗体を含む所望でない鎖の組み合わ せに加えてＢｓＭａｂを分泌するクアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａｓ）　（ハイ ブリッドハイブリドーマ）を生成することである（ミルンユテインおよびフェロ （Ｃｕｅｌｌｏ。

Ａ、Ｃ，）　、Ｎａｔｕｒｅ３０５　：　５３７　［１９８３］　）、しかしな がら、２特異的なヒト化抗体および抗体フラグメントを産生するには、他の方法 が好ましい。

ニソノフ（Ｎ　１ｓｏｎｏｆｆ）およびマンディ（Ｍａｎｄｙ）　（Ｎａｔｕｒ ｅ４８２６　：　３５５〜３５９　（１，９６２））は、ウサギ抗体を消化し、 その後に抗体フラグメントを再結合することを記載している。彼らは、異なる特 異性のペブンン処理抗体の１価フラグメントを組み合わせることにより二重特異 性の抗体分子が得られることを開示している。ハンマーリング（Ｈａｍｍｅｒｌ ｉｎｇ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎ ｅ　１２８：　１４６１〜１４６９　（１９６８）；バーハム、Ｈｕｍａｎ　１ 關ｕｎｏｌｏｇｙ　１２　：　２１３〜３３１　（１９８５）　；ラソ（Ｒａｓ ｏ）およびグリフィ：／　（Ｇｒｉｆｆｉｎ）　、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ　４１　：　２０７３〜２０７６　（１９８１）　；およびポーラス（Ｐａ ｕｌｕｓ）　（米国特許第４．４４４，８７８号）をも参照。

他の方法では、２つの異なるモノクローナル抗体からの２特異的なＦａｂ’フラ グメントを部位指定（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）化学カップリングを利用して、所望の 特異性を有するＢｓＭＡｂ（この場合はＦ（ａｂ’）ｘ）を組み立てる（たとえ ば、フラン（Ｎｏ１ａｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉ ｃａ　Ａｃｔａ　１０４０　：　１　（１９９０）を参照）。Ｆａｂ’フラグメ ントのジチオニトロベンゾエート誘導体の有方向カップリングの化学については 、モーラ−（Ｒ，Ａ、　Ｍａｕｒｅｒ）の博士論文、バーバード大学（１９７８ ）、およびブレナン（Ｂ　ｒｅｎｎａｎ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ２２９　：　８１ 〜８３　（１９８５）をも参照。ブレナンらはまた、２つの近接するシスティン を架橋するためのヒ酸ソーダの使用をも教示しているが、この反応では非常に毒 性の化合物を使用する。ブレニー（Ｇｌｅｎｎｉｅ）ら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｌｌ、、　１４１　（１０）３６６２〜３６７０　［１９８５］およびＪ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３９：２３６７〜２３７５　［１９７５］　）は、チオ エーテル結合を有する２特異的Ｆ（ａｂ’）ｚ抗体フラグメントの調製を教示し ている。これら化学はまた、同一のＦａｂ’フラグメントのカップリングにも応 用することができる。

リオンズ（Ｌ　ｙｏｎｓ）ら（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　３　 （８）　７０３〜７０８　（１９９０））は、抗体中へのシスティンの導入（Ｈ 鎖のＣ，１ドメインへ）および該導入されたシスティンによるエフェクターまた はレポーター分子の部位特異的結合を教示している。

文献に示された機能性抗体フラグメントの大腸菌発現における進歩にもがかわら ず、２側坑体、とりわけＦ（ａ　ｂ’）２分子の製造のための効率的で経済的な 方法、および２価および２特異的Ｆ（ａ　ｂ’）２分子の修飾を可能とする方法 に対する必要性が存在する。インビトロで都合よ（カップリングさせて２価Ｆｖ またはＦ（ａｂｏ）２分子を形成する安定なＦａｂ’−３Ｈポリペプチドを製造 するのが望ましい。

それゆえ、Ｆｖドメイン、とりわけＦａｂ’、Ｆａｂ’−３ＨおよびＦ（ａｂ’ ）ｚ抗体フラグメントからなるポリペプチドを細菌細胞培養液中または細菌細胞 培養液から高収率で製造する方法を提供することがこの発明の目的である。

この発明の他の目的は、均一な２価および２特異的なＦ（ａ　ｂ’）ｚ抗体フラ グメントの効率的な製造方法を提供することである。

この発明の他の目的は、遊離のチオールとして存在する少な（とも一つのヒンジ 領域システィンを有するＦａｂ’抗体フラグメント（Ｆａｂ’−８Ｈ）を提供す ることである。完全な抗体からＦａｂ’−９Ｈを生成するうえで内在する問題・ タンパク質加水分解の受けやすさの違いおよび非特異的な開裂、低収率、並びに ヒンジジスルフィド結合に対して完全には選択的でない部分的還元を回避するこ とが関連する目的である。本発明の他の目的は、近接するチオールをキレート化 するための極めて毒性の強い亜ヒ酸塩の使用、または他の非効率的で望ましくな い方法に仰ることなく、ヒンジ内ジスルフィド結合の生成を防ぐことである。

−盟の！泊 この発明の主要な態様は、組換え微生物ペリプラズム抗体フラグメントのＬ鎮− １１鎖界面の外側に位置するシスティン残基におけるシスティン遊離チオールの 驚くべき同定、および単一のシスティン残基のみを遊離チオールの形態で含有す るＦｖ変種を製造することができるという驚くべき知見に基づいている。このこ とにより、均一な組換えＦ（ａ　ｂ“）２および他のＦｖ含有２価ポリペプチド の製造が容易になる。従って、一つの態様において、この発明は、免疫グロブリ ンＨ鎖Ｆｖｆｉｉ域および免疫グロブリンＩＪＪＩＦｖ領域を含有するＦｖポリ ペプチド（該り鎖またはＩ］鎖はまた遊離のチオールとしての不対システィン残 基をも含有する）を、絹換え微生物細胞培養物のペリプラズム中に発現および分 泌し、つＬｌで該システィン残基を遊離のチオールとして実質的に維持する条件 下で該ポリペプチドを回収することからなる。

ＦｖＬ鎖またはＩ（鎖のいずれも、１または２以上のシスティン残基を含有する ポリペプチド配列と任意に融合させることができるが、ただし、Ｌ鎖またはＨ鎖 Ｆｖのいずれかに対してＣ末端側のドメイン中に位置するそのようなシスティン 残基の少な（とも一つはべりブラズム中で遊離のチオールとして存在することを 条件とすることが理解されるであろう。適当なポリペプチド配列としては、免疫 グロブリン、担体タンパク質、レセプター、成長因子、栄養物質、細胞付着分子 、組織特異的付着因子、酵素、毒素などに由来する配列が挙げられるが、これら に限られるものではない。一般に、不対システィン残基は、Ｌ鎖またはＩ］鎖Ｆ ＶドメインのいずれかのＣ末端側にて、またはＬ鎖またはＨ鎖ＣＨＩドメインの Ｃ末端側にて置換される。融合ポリペプチド配列はシスティン残基のみからなっ ていてもよいし、または（１）Ｆｖドメインの一つのＣ末端側、（２）Ｌ鎖定常 領域のＣ末端側もしくは（３）Ｈ鎖のＣＨＩドメインのＣ末端側に融合したポリ ペプチド中にシスティン残基が存在していてもよい。後者の場合、単一の遊離チ オールシスティン残基を有するヒンジ領域、好ましくはシスティン残基を１つだ け含有するヒンジ領域アミノ酸配列変種にＦｖ−ＣＨＩドメインを融合させる。

しかしながら、免疫グロブリンヒンジ領域の代わりに、単一の遊離チオールシス ティン残基を含有する他のいかなる配列も有用である。

他の態様において、２以上、一般に２または３の遊離チオール残基を有するヒン ジ領域、好ましくは２または３のシスティン残基を含有するヒンジ領域アミノ酸 配列変種にＦｖ−ＣＨＩドメインを融合させる。たとえば、３つのシスティン残 基を含有するように修飾したＦａｂ’−８Ｈアミノ酸配列変種を適当な宿主細胞 、たとえばＣＨＯ細胞や大腸菌中で組換えにより製造し、インビボで宿主細胞に より首尾よくカップリングして３つのジスルフィド結合がＨ鎖を連結したＦ（ａ ｂｏ）２を形成させることができる。

さらに詳しくは、この発明の目的は、工程ａ、Ｆａｂ’を含む免疫グロブリンプ レ配列（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）をコードする核酸（微生物宿主細胞によって 認識される制御配列に機能的に連結されている）を含むベクターで形質転換した 該宿主細胞中で、宿主細胞のペリプラズム腔へのＦａｂ′の分泌およびＦａｂ’ −８Ｈの生成に適した条件下にて該核酸を発現させ、ついて ｂ、該宿主細胞からＦａｂ’　−（ＳＨ）、（式中、ｎは１または２以上）を回 収する ことからなる、遊離のチオールとして存在する少な（とも一つのヒンジ領域シス ティンを有するＦａｂ’抗体ポリペプチド（Ｆａｂ’−８Ｈ）の製造法によって 達成される。

この発明の方法の別の態様は、ヒンジシスティンチオールをプロトン化形態で維 持するのに適した条件下でＦａｂ’−８Ｈをその後に回収する（精製を含む）こ とからなる。ある種の態様において、形質転換細胞の培養の間またはＦａｂ’− Ｓ　Ｈの回収に際して金属イオンキレート試薬および／またはプロテアーゼイン ヒビターを存在させる。

場合により、宿主細胞を凍結−解凍し、浸透ショックに供し、細胞ペーストを調 製し、ついで該細胞ペーストからＦａｂ’−３Ｈを精製することにより該宿主細 胞からＦａｂ’−８Ｈを放出させる。場合により、たとえばリゾチームを用いた 該宿主細胞の酵素的消化により、または物理的破砕、たとえば超音波処理または フレンチプレスの使用により該細胞からのＦａｂ’−３Ｈの放出を容易にできる 。

ある種の態様において、ＦｖまたはＦｖに融合したポリペプチド（一般にヒンジ 配列）を、ペリプラズム中で遊離のチオールを示すただ−っのシスティン残基が 存在するように修飾させる。それゆえ、たとえば、最初のシスティンに対してＣ 末端側にあるすべてのヒンジ配列ノスティン残基を欠失または置換することによ りＦａｌ）アミノ酸配列を修飾させる。同様に、たとえば、３つのシスティン残 基が遊離のチオールの形態で存在する態様を得るため、第三のシスティンのＣ末 端側にあるすべてのヒンン配列ンスティン残基を欠失または置換により修飾させ る。

この発明はまた、Ｌ鎖と１１鎖との間にジスルフィド結合を有しないＦｖＳＦａ ｂｏ、Ｆａｌ）’　−８ＨおよびＦ（ａ　ｂ“）２ポリペプチドをも提供する。

これらポリペプチドは、本明細書において１非連結（ｌｉｎｋｌｅｓｓ）　Ｊと 称する。たとえば、鏡開（＋−（−Ｌ　）ジスルフィド結合を形成する２つの７ ステインのうちの一方または好ましくは両方を置換または欠失させることにより 該ポリペプチドのアミノ酸配列を修飾させる。一般に、これらシスティンをセリ ンで置換するが、ジスルフィド結合を形成できないようにシスティン側鎖の一方 または両方を共有結合的に修飾することも本発明の範囲に包含される。ある種の 態様において、Ｌ鎖とＨ鎖との間には非常に強力な相互反応が存在するので、鏡 開ジスルフィドを除いてもし鎖とＨ鎖との間で望ましくないレベルの解離とはな らない。非連結Ｆａｂ’　−３Ｈポリペプチドによって、有利にも、化学カップ リングによって均一なＦ（ａ　ｂ’）ｘを調製することが可能となる。

他の観点において、Ｆ（ａｂ’）ｚを含むポリペプチドの製造法は、工程。

ａ、第−Ｆａｂ’を含む免疫グロブリンプレ配列をコードする核酸（微生物宿主 細胞によって認識される制御配列に機能的に連結されている）を含むベクターで 形質転換した該宿主細胞中で、宿主細胞のペリプラズム腔への該第−Ｆａｂ’の 分泌およびＦａｂ’−８Ｈの生成に適した条件下にて該核酸を発現させ（該第− Ｆａｂ’は第一のエピトープに結合し得る）。

ｂ　第二Ｆａｂ’を含む免疫グロブリンプレ配列をコードする核酸（微生物宿主 細胞によって認識される制御配列に機能的に連結されている）を含むベクターで 形質転換した該宿主細胞中で、宿主細胞のペリプラズム腔への該第二Ｆａｂ’の 分泌およびＦａｂ’−８Ｈの生成に適した条件下にて該核酸を発現させ（該第二 Ｆａｂ’は第二のエピトープに結合し得る）：Ｃ１該第−Ｆａｂ’−３Ｈおよび 第二Ｆａｂ’　−８Ｈを該宿主細胞から回収し。

ついで ｄ　該第−Ｆａｂ’−８Ｈおよび第二Ｆａｂ’−３Ｈの遊離のヂオールンステイ ン残基間で共有結合を形成して２価Ｆ（ａｂ’）２を形成させることからなる。

本発明の態様において、当該技術分野で知られた部位指定共有結合カップリング 法を利用して、効率的な部位指定ジスルフィド結合形成がインビトロで生じ、そ れによって２特異的な２側坑体が生成する。特に好ましい態様において、第−Ｆ ａｂ’−３Ｈと第二Ｆａｂ’−３Ｈとの間のジスルフィド結合形成は、下記工程 ：ａ　該第−Ｆａｂ’−８Ｈを（ｉ）５．５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香 酸）（ＤＴＮＢ）と反応させてチオニトロベンゾエート誘導体Ｆａｂ’−ＴＮＢ を生成させるかまたは（ｉｆ）　２官能性マレイミドと反応させ：ｂ、該第−Ｆ ａｂ’−ＴＮＢまたはマレイミド化Ｆａｂ’を該第二Ｆａｂ’−８Ｈと直接カッ プリングしてＦ（ａｂ’）ｔを生成させ；ついでＣ該Ｆ（ａｂ’）２を回収する ことからなる。

この発明の方法により、新規なＦ（ａｂ’）ｚ組成物が提供される。そのような 組成物は、 ａ　天然のＦｖ領域中に認められる天然のジスルフィド結合を例外として、誘導 体化スルフヒドリル基を有するシスティン残基を含有するＦ（ａｂ’）ｚＦｖ領 域を本質的に含まず、 ｂ　ヒンジ領域の鎖内ジスルフィド結合を有するＦ（ａｂ’）２を全く含まず、 Ｃ混入する亜ヒ酸塩を全く含まず、 ｄ、Ｈ鎖Ｃ末端アミノ酸残基に関して全く均一である。

他の態様において、誘導プロモーター／オペレーター系の転写制御下で免疫グロ ブリンポリペプチドをコードする核酸で形質転換した宿主細胞を培養し、それに よって誘導後の細胞培養液中のポリペプチドレベルが細胞培養液１リツトル当た り約１ｇ以りのポリペプチドとするに充分なように誘導前にポリペプチドの発現 が抑制されることからなる方法により、組換え微生物中での免疫グロブリンまた はそのフラグメントの高レベル発現が達成される。一般に、このことは、低コピ ー数ベクター中またはすべてのｐｈｏＡオペレータ一部位を完全に占め該オペロ ンを完全に抑制するに充分なレベルのリプレッサーを発現すべく修飾した宿主中 でｐｈｏＡなどの強力なプロモーターを使用することにより達成される。

図面の簡単な記載 図１は、大腸菌からｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８にＬ鎮およびＨ鎖Ｆｄ’フラグメント を共分泌するのに使用するプラスミドｐＡ１９を示す。Ｆａｂ”発現単位は、リ ン酸飢餓により誘導されるＰｈｏＡプロモーター（チャンク（Ｃ，Ｎ、　Ｃｈａ ｎｇ）ら、Ｇｅｎｅ　４４　：１２１　（１９８６））の転写制御下にある側鎖 について２シストロン（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）である。ヒト化可変ドメイン （ｈｕＶｔおよびｈｕＶＭ、カーター（Ｐ、　Ｃａｒｔｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８９　（１０）　＋４２８５〜 ９　（１９９２）　）が、その５′末端にて熱安定エンテロトキシンＩＩ（ｓｔ ｎ）シグナル配列をコードする遺伝子切片（ピッケン（Ｒ，Ｎ、　Ｐｉｃｋｅｎ ）ら、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｗｕｎ、４２　：　２６９　（１９８３））に正確に融 合しており、その３′部位にてそれぞれ、ヒトに＋（ＣＬ、パーム（Ｗ、　Ｐａ １ｍ）およびヒルシュマン（Ｎ。

Ｈｉｌｓｃｈｍａｎｎ）　、Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、３５６　：１６７ 　（１９７５）　）およびＩｇＧ１　（Ｃ，１、エリマン（Ｊ、Ｗ、　Ｅｌｌｉ ｓｏｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　ｌ　Ｑ　：　４０７１　 （１９８２））定常ドメインに正確に融合している。これらコード領域は８３塩 基対によって隔てられており、翻訳の効率的な開始が可能となるようにそれぞれ リポソーム結合部位（ピッケンら、上記）によって先行されている。このＦａｂ ’発現単位を、テトラサイクリン耐性遺伝子産物のアミノ酸配列を変化させるこ となく５ａｉｌおよび５ｐｈＴ部位を除去することによって前辺て修飾したｐＢ Ｒ３２２（ポリバー（Ｆ、　Ｂｏｌｉｖａｒ）ら、Ｇｅｎｅ　２　：　９５　（ １９７７））のＥｃｏＲ１部位中に部位−ニングした。ＣＨ１遺伝子の末端およ びバクテリオファーンλ１．転写ターミネータ−の直前に唯一の５ａｌＩおよび ｓｐｈ　１部位を設けることにより、種々のＦａｂ’変種の構築を容易にした（ ショルティセック（Ｓ　ｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、　１５　：　３１８５　（１９８７）　）。

図２は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８のＦａｂＳＦａｂ’およびＦ　（ａ　ｂ’）ｚ　 （Ｃｙｓ　Ａ１ａＡ］ａ変種）フラグメントの精製を示す。クーマーンーブリリ アントブルー（Ｒ２５０）を用いた非還元条件下、４〜２０％ゲル上の５ＤＳ− ＰＡＧＥによりタンパク質を分析した。示した試料は、タンパク質分子量マーカ ー（レーン１）、Ｆａｂ　（レーン２）、模擬（ｍｏｃｋ）カップリング反応前 （レーン３）および反応後（レーン４）のＦａｂ’−３Ｈ；模擬カップリング反 応前（レーン５）および反応後（レーン６）のＦａｂ’−ＴＮＢ；Ｆａｂ’　− ＴＮＢとカップリングしたＦａｂ’−８Ｈ（レーン７）、ゲル濾過により精製し たＦ（ａ　ｂ’）２（レーン８）および哺乳動物細胞中で発現させた完全長のｈ ｕＭＡｂ４Ｄ５−８　（カーターら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ　（１９９２）上記）の制限ペプシン消化（ラモイ（Ｅ、　Ｌａ ｍｏｙｉ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１２１　＋　６５２　（１９ ８６）　）により得たＦ（ａ　ｂ’）ｚ　（レーン９）である。電気泳動前に抗 体フラグメント（試料当たり２μｇ）を４ｍＭヨードアセトアミドと反応させた 。遠心分離して細胞破砕物　。

を除去し、ＤＥＡＥセファロースイオン交換クロマトグラフィーにかけ、ついで タンパク質ＡＣＬ４Ｂまたはタンパク質Ｇセファロースを用いてアフィニティー 精製することにより、発酵上澄み液からｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８　Ｆａｂフラグメ ントを精製した。ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８　Ｆａｂ’−８Ｈの精製は、２１ｍ１の １００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３，５）　、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ 　ＰＭＳＦ、５μＭペプスタチン、５μＭロイペプチン、２．４ｍＭベンズアミ ジンの存在下で１５ｇの細胞ペーストを解凍することにより行った。細胞破砕物 を遠心分離により除去した（４０．０００ｇ、１０分、４℃）。得られた上澄み 液（ｐＨ５０）をＤＥＡＥセファロースを通過させ、２ｍｌのタンパク質Ｇセフ ァロースカラム上に負荷した。タンパク質は１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３ ，５）で溶出し、１０ｍＭ　ＥＤＴＡを１．５Ｍ　（ＮＨ４）２ＳＯ４の存在下 でｐＨ４，０に調節し、２ｍｌのフェニルトヨパールカラム上に負荷した。Ｆａ ｂ’−８Ｈは２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，０）　、０．８Ｍ　（ＮＨ４） ｔｓｏ＜、１０ｍＭＥＤＴＡて溶出し、限外濾過（セントリプレブー１０、アミ コン）により容量を減少させ、緩衝液を０２５ゲル濾過により１０ｍＭ酢酸ナト リウム（ｐＨ５，０）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡに交換した。Ｆａｂチオニトロベン ゾエート誘導体の調製も、ＤＥＡＥフロースルーを５ｍＭＤＴＮＢおよびｐＨ７ ，５に調節する他は同様にして行った。ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８　ＦａｂおよびＦ ａｂ’変種の全濃度を、２８０ｎｍにおいて測定した吸光度およびアミノ酸組成 分析により決定した吸光係数（εｏ、ｔ％＝　１．５６）から決定した。ｈｕＭ Ａｂ４Ｄ５　８　Ｆａｂ’　−３Ｈの遊離チオール含量の決定は記載（クレイト ン（Ｔ、　Ｅ、　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）　、タンパク質構造、実際的アプローチ （ＩＲＬプレス、オックスフォード、英国、１９９０）、１５７頁）に従ってＤ ＴＮＢを用いて分析することにより行ない、一方、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８　Ｆａ ｂ’　−ＴＮＢのＴＮＢ含量の決定はジチオトレイトールで還元した際の収量に より行なった。等モル量のｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８　Ｆａｂ’−ＴＮＢ　（ＴＮＢ 含量ｌニー、にり）　およびＦａｂ”−３Ｈ（−８Ｈ含量ニよす）を、１゜０ｍ Ｍトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）および１０ｍＭ　ＥＤＴＡの存在下、合計濃 度≧１．４ｍｇ／ｍｌにて３７℃で１時間カップリングさせた。リン酸緩衝食塩 水の存在下での５１００−ＨＲゲル濾過（ファルマシア）により、カップリング 反応液からｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８　Ｆ（ａｂ’）ｘを単離した。このＦ（ａｂ’ ）ｘ試料を滅菌した０、２μｍフィルターに通し、４℃で貯蔵するかまたは液体 窒素中でフラッシュ凍結しくｆｌａｓｈ　ｆｒｏｚｅｎ）　−７０℃で貯蔵した 。

一般に、下記語句を本記載、実施例および請求の範囲に使用する場合には所定の 定義を有する・ Ｆｖなる語は、定常ドメインを含有しない、共有結合によりまたは非共有結合に より会合したＨ鎖およびＬ鎖ヘテロダイマーとして定義される。

本明細書においてＦａｂ’なる語は、抗体Ｈ鎖の可変ドメインおよび第一定常ド メイン、抗体り鎖の可変ドメインおよび定常ドメイン、およびＨｆ１Ｃ□１ドメ インのカルボキシ末端側の１または２以上のシスティン残基を含む少なくとも１ つの別のアミノ酸残基のヘテロダイマーからなるポリペプチドとして定義される 。

Ｆ（ａｂ’）ｚ抗体フラグメントは、一対のＦａｂ’抗体フラグメントが共有結 合により連結されたものである。

Ｆａｂ’Ｈ鎖にはヒンジ領域が含まれていてよい。これは、いかなる所望のヒン ジアミノ酸配列であってもよい。別の態様として、ヒンジは、１または２以上の システィン残基に有利なように完全に省かれていてもよいし、または好ましくは 短い（約１〜１０残基）システィン含有ポリペプチドであってよい。ある種の応 用においては、天然に存在する一般的な抗体ヒンジ配列（システィンのつぎに２ つのプロリン、ついで他のシスティン）を用いる。この配列は、ヒトＩ　ｇＧ。

分子のヒンジ中に認められる（カバソトら、免疫学的に重要なタンパク質の配列 、第３版（国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、１９８７））。他の態 様において、ヒンジ領域は他の所望の抗体クラスまたはアイソタイプから選択さ れる。この発明のある種の好ましい態様において、Ｆａｂ’の０□１のＣ末端を 配列ＣｙｓＸＸに融合させる。ＸはＡｌａが好ましいが、ＡｒｇＳＡｓｐ、また はＰｒｏなどの他の残基であってもよい。Ｘアミノ酸残基の一方または両方を欠 失させることができる。

「ヒンジ領域」とは、天然免疫グロブリンのＣ，１とＣｕ　２との間に位置する アミノ酸配列またはその配列変種である。以下に記載するヒト化４Ｄ５抗体の場 合には、ヒンジ領域は残基２２４　（、、Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ、、中のＡｓ ｐ）と２３３　（、、Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ、、中のＰｒｏ）との間に位置す る。他の免疫グロブリンの類似領域を用いることができるが、ヒンジ領域のサイ ズおよび配列は太き（変化してよいことが理解されるであろう。たとえば、ヒト ＩｇＧ１のヒンジ領域はわずかに約１０の残基であるが、ヒトＩｇＧ３のヒンジ 領域は約６０残基である。

本明細書においてＦｖ−３ＨまたはＦａｂ’−３Ｈなる語は、少なくとも一つの システィンの遊離チオールを有するＦｖまたはＦａｂ’ポリペプチドとして定義 される。この遊離のチオールはヒンジ領域に存在し、通常鏡開結合に関与するＬ 鎖およびＨ鎖の７ステイン残基は天然の形態で存在するのが好ましい。この発明 の最も好ましい態様において、Ｆａｂ’　−８Ｈポリペプチド組成物には異種の タンパク質加水分解フラグメントが含まれない。ある種の態様において、Ｆａｂ ’−３Ｈポリペブヂ）・はまた、Ｈ鎖およびＬ鎖がたとえば異常なジスルフィド やスルフヒドリル付加生成物の生成によって、天然の状態では存在しないように 還元されているかまたは他の仕方で誘導体化されているＦａｂ’フラグメントを 実質的に（約９０モル％以上）含まない。別の態様において、Ｆａｂ“−３Ｈは 、共有結合により力・ノブリングされていない■］鎖およびＩ、鎖を有する。

本発明の目的のためのヒ；・化抗体は、前以て決定された抗原に結合することの できる免疫グロブリンアミノ酸ｙ列変種またはそのフラグメントであって、実質 的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するＦＲ領領域実質的に非ヒト免疫 グロブリンのアミノ酸配列を有するＣ　Ｉ）　Ｒまたは前以て選択した抗原に結 合するよう修飾した配列とからなるものである。

「制御配列」なる語は、機能的に連結したコード配列を特定の宿主生物中で発現 するのに必要なりＮＡ配列をいう。原核生物に適した制御配列としては、たとえ ば、プロモーター、場合によりオペレーター配列、リポソーム結合部位、および 転写ターミネータ−が挙げられる。特に好ましいのは、細胞培養物が増殖および 成熟している間、たとえば対数増殖期の間に増殖−阻害量販下のレベルでＦａｂ ゛ポリペプチドの合成を抑制する高度に制御された誘導性プロモーターである。

核酸は、それが他の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合に「機能的に連 結している」。たとえば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチ ドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されるなら、該ポリペプチドのＤ ＮＡと機能的に連結している：プロモーターまたはエンハンサ−は、コード配列 の転写に影響を及ぼすなら該配列に機能的に連結している：リポソーム結合部位 は、翻訳を容易にするように位置しているならコード配列に機能的に連結してい る。一般に、「機能的に連結している」とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接して いること、および分泌リーダーの場合には隣接して同じリーディングフレームに あることを意味する。しかしながら、エンハンサ−は隣接している必要はない。

連結は都合のよい制限部位でライゲーションすることにより行うことができる。

そのような部位が存在しない場合には、常法に従って合成オリゴヌクレオチドア ダプターまたはリンカ−を用いる。

本明細書において「外来」要素とは、細胞にとって外来のものであるか、または 該宿主細胞のものと相同ではあるが該要素が通常は認められない該細胞核酸内の 位置に認められるものをいう。

本明細書において「細胞」および「細胞培養物」なる表現は同じ意味で用いられ 、そのような表示はすべて子孫を含む。それゆえ、「形質転換体」および「形質 転換細胞」なる語は、継代の数のいかんにかかわらず、初代目的細胞およびそれ に由来する培養物を包含する。また、時間をかけたまたは偶然の突然変異により 、すべての子孫の１）ＮＡ含量が正確に同一である必要はないことも理解される であろう。最初の形質転換細胞でスクリーニングしたのと同じ機能または生物学 的活性を有する変異子孫も包含される。異なる表示は、前後関係の文脈から明ら かとなるであろう。

「プラスミド」は、小文字のｐと、それに先立つおよび／またはそれに続く大文 字および／または数字によって表示される。本明細書において出発プラスミドは 市販されており、制限されることなく公的に利用でき、またはそのような利用可 能なプラスミドから刊行された手順に従って構築することができる。加えて、当 該技術分野で知られた他の等価なプラスミドは当業者にとって明らかであろう。

ＤＮＡの所定断片の制限消化物からの「回収」または「単離」とは、ポリアクリ ルアミドまたはアガロースゲル上での電気泳動による該消化物の分離、目的断片 の移動度を分子量が知られたマーカーＤＮＡ断片の移動度と比較することによる 該断片の同定、該所望の断片を含有するゲル切片の除去、および該ゲルのＤＮＡ からの分離を意味する。この手順は一般に知られている。たとえば、ローン（Ｌ 参照。

細胞からのＤＮＡの「調製」とは、宿主細胞の培養物からのプラスミドＤＮＡの 単離を意味する。一般に使用されているＤＮＡの調製法は、サンプルツク（Ｓａ ｍｂｒ○ｏｋ）らのモレキュラー・クローラ？！・ア・ラボラトリ−・マニュア ルニューヨーク　コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−プレス、１９８９の 第１゜２５〜１３３節に記載されている大スケールおよび小スケールのプラスミ ド調製法である。ＤＮＡ調製物の精製は、当該技術分野でよく知られた方法によ り行った（上記づンブルンクらの第１４０節を参照）。

本発明を実施するための適当な方法 一般に、培養微生物宿主細胞を、形質転換しｊ−該宿主細胞によって認識される 制御配列に機能的に連結したＦａｂ’コード核酸（すなわち、Ｈ鎖Ｆｄフラグメ ントおよびＩ７鎖をコー１−する核酸）を含むベクターで形質転換する（以下、 「Ｆａｂｌを特別の粋様として言及するが、ペリプラズムで遊離チオールを生成 することのできるノステイン残基がＦｖ領領域たはそれに融合した配列中に存在 する限りにおいて、Ｆｖを含有するいかなる抗体フラグメントまたはその融合／ 配列誘導体をも使用することができることが理解されるであろう）。細胞の培養 は、宿主細胞のペリプラズム腔中へのＦａｂ’の分泌および遊離チオールの形成 に適した条件下で行う。一般に、対応り鎖およびＨＩＩフラグメントの共発現を 指令するため２シストロンオペロンを用いる。別法として、同じまたは異なるプ ラスミドで別々の鎖を別々のプロモーターから発現させる。第二に、ペリプラズ ム腔中への分泌を指令するためシグナル配列をＦａｂ鎖に先行させるが、該腔で は、酸化還元環境は、Ｌ鎖フラグメントとＨ鎖フラグメントとを会合させるため のジスルフィド結合の形成には有利であるが、ヒンジのシスティン残基間でのジ スルフィド結合形成には有利ではないと思われる。特に好ましい態様において、 発現制御配列はリン酸飢餓によって誘導される大腸菌ｐｈｏＡプロモーター（チ ャンクら、Ｇｅｎｅ４４・１２１　（１９８６））であり、シグナル配列は熱安 定エンテロトキシン■シグナル配列（ピッケンら、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ 、４２　：　２６９　（１９８３）　）である。

現在のところ、発酵槽中で高細胞密度で増殖している細菌細胞で抗体フラグメン トを発現させるのが好ましい。適当な発酵条件は、下記実施例に記載されている 。

遊離チオールを含むポリペプチドを発酵培地から回収しおよび／または凍結−解 凍細胞から（一般に浸透ショックにより）回収し、ついで精製する。回収（精製 を含む）は、Ｆａｂ’−８Ｈがプロトン化形態で維持されている場合に最もうま く行える。プロトン化形態を維持するための他の条件としては、有機溶媒または −ＳＨの解＠ｐＫａをシフトさせるための他の試薬の使用が挙げられる。このこ とは、酸性のｐＨ１すなわちヒンジまたは不対システィンチオールのｐＫａより も好ましくは２またはそれ以上のｐＨ単位小さいｐＨにて達成される。別法とし て、その後の反応に適した均一な状態にＦａｂ’を維持するため、Ｆａｂ’−８ ＨをＴＮＢまたはｐ−メトキンベンジルなどの保護基と反応させる。さらに別の 態様として、ピリジンジスルフィドをＦａｂ’−３Ｈに加えて混合ジスルフィド を形成さぜる。このことにより、カンプリングまたは他のプロセシングのために 脱保護するまで遊離のスルフヒドリルを安定にする。さらに別の態様において、 遊離のスルフヒドリルを保護せず、カップリングまたはさらにプロセシングする 前に還元する。当該技術分野で知られた適当な保護基は、グロス（Ｅ、　Ｇ　ｒ ｏｓｓ）およびマイエムホーファー（Ｊ、　Ｍｅｉｅｍｈｏｆｅｒ）　、ペプチ ド：分析、構造、生物学Ｖｏｌ　３　：ペプチド合成における官能基の保護（ア カデミ・ツクブレス、ニューヨーク、１９８１）に記載されている。

酸性ｐＨ（一般に約ｐ　Ｈ４〜ｐＨ６、好ましくは約ｐＨ５，０）でのストレプ トコッカスタンパク質Ｇセファロースまたはスタフイロコソカスタンノくり質Ａ 上などでのアフィニティー精製が好ましい。別法として、２相液体抽出を用いる ことができる。少量の混入したタンパク質分解断片は、たとえばシリカゲルおよ び／またはアルキルもしくはアリール置換クロマトグラフィー樹脂（フェニルト ヨパールなど）を用いた疎水性相互反応クロマトグラフィーにより容易に除くこ とができる。宿主プロテアーゼを不活化または阻害するためのプロテアーゼイン ヒビターのカクテル（フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）　、 ロイペプチン、ペプスタチンおよび／またはベンズアミジンなど）を使用するこ と、および培養および回収手順にＥＤＴＡなとの金属イオンキレート試薬を用０ ることが好ましい。キレート試薬を選択し、ンスルフイド結合形成の金属イオン 触媒反応を防ぐ量で用いる。

ある種の箒様において、Ｆ　ａ　ｂ’　−（Ｓ　Ｈ）、（式中、ｎは１またはそ れ以上）（ヨ組換え手順の間にインビボでＦ（ａｂ’）２を生成する。これら態 様婆こお（飄て、好ましくは２以上のンステイン残基を含有するようにＦａｂ’ −（ＳＨ）アミノ酸配夕１１を修飾しておいた。たとえば、大腸菌中でのＦａｂ ’−８Ｈ３の培養後、Ｈ鎖の間に３つのジスルフィド結合を有するＦ（ａｂ’） ｔを大腸菌細胞ペースト力）ら直接回収する。

他の態様において、架橋剤または溶解酸素などの不定の酸化剤を用ＬＳｆこイン ビトロ化学カップ１ルグにより精製Ｆ　ａ　ｂ’　−（Ｓ　Ｈ）、　（式中、ｎ は１また（まそれ以上）からＦ（ａｂ’：ｈを調製する。後者の場合、精製Ｆａ ｂ’は単に空気酸化暑こよってＦ（ａｂ’）２を生成するであろう。加えて、別 個のＦａｂ’の力・ノブ１ノングを指令し２価の１特異的Ｆ（ａ　ｂ’）ｚの形 成を回避させるＦａｂ’−３Ｈ誘導体の使用により２特異的Ｆ（ａｂ’）ｔが製 造される。１特異的または２特異的なＦ（ａｂ’）＊のための一つの適当な化学 は、上記ブレナンらによって記載された方法である。

凍結−解凍細胞から浸透ショックによって放出されたＦａｂ’−３Ｈを過剰のＤ ＴＮＢの存在下で約ｐＨ７，５に調節する他はＦａｂ’−８Ｈと同様の方法によ りＦ　ａ　ｂ’−ＴＮＢ誘導体を調製する。等モル量のＦａｂ’−８ＨとＦ　ａ 　ｂ’　−ＴＮＢとをＥＤＴＡの存在下でのジスルフィド交換反応により効率的 にカップリングさせてＦ（ａｂ’）ｚフラグメントを形成させる。

この発明の非連結Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’　−３ＨおよびＦ（ａｂ’）ｚポリ ペプチドは、Ｌ鎖とＨ鎖との間にジスルフィド結合を有しない。一般に、ポリペ プチドの修飾は、修飾したポリペプチドの直接発現の結果として、または化学的 手段または酵素手段により行う。該ポリペプチドの典型的なアミノ酸配列修飾は 、鎖体（Ｈ−Ｌ）ジスルフィド結合を形成する２つのシスティンの一方または好 ましくは両方を置換もしくは欠失させることである。一般に、これらシスティン はセリンと置換させるが、ジスルフィド結合を形成することができないように該 システィン側鎖の一方または両方を共有結合的に修飾することも本発明の範囲に 包含される。

上記システィンの一方または両方は、脂肪酸または他の化学基を用いて修飾し、 種々の公知法によりジスルフィド結合を形成できないようにすることができる。

そのような公知法としては、下記方法＋　（１）　Ｎ、Ｎ’−ジシクロへキシル カルボンイミド（Ｄ　ＣＣ）やエトキシ−エトキシカルボニル−ジヒドロキノリ ン（ＥＥＤＱ）などの脱水剤または活性化剤を用いた共有結合修飾；　（２）ケ テン、無水物、イソチオシアネート、またはβ−ラクトンを用いたアシル化：　 （３）シアネートを用いたカルバモイル化；　（４）アルデヒドおよびある種の ケト酸を用いたヘミメルカプクールまたはヘミメルカプドール生成：　（５）活 性二重結合への付加（Ｎ−エチルマレイミドを使用）による、キノンとの反応に よる、ノ入ロ酸およびそのアミドとの反応（ヨード酢酸、またはα−ブロモヘキ サデカン酸を使用）による、メチル化反応（ジメチノはルフエートを用いたもの など）による、スルホアルキル化による、アリール化（ニトロベンゼン化合物を 使用）による、またはジアゾ化合物との反応による、アルキル化およびアリール 化：　（６）銀や有機水銀化合物（塩化第二水銀など）などの金属イオンとの反 応；　（７）亜ヒ酸化合物との反応：　（８）亜硫酸塩との反応：　（９）酸化 反応：および（１０）ハロゲン化スルフェニルとの反応による混合ジスルフィド の生成が挙げられるが、これらに限られるものではない ポリペプチドの修飾は、宿主細胞内で行うか、または組換えにより生成したポリ ペプチドに翻訳後修飾を行ってもよい。現在のところ、翻訳後修飾は、宿主細胞 または微生物から回収してから２４時間以内、好ましくは数時間以内に起こるの が好ましい。

この発明のポリペプチドのンステインに対する修飾の存在の検出法としては、ポ リペプチド試料の質量分析など一般に知られている。別法としては、薄層クロマ トグラフィー（ＴＬＣ）を試料に対して行う。このペプチド分析法は当該技術分 野で一般的であるが、たとえばスチュアート（Ｓｔｕａｒｔ）およびヤング（Ｙ ｏｕｎｇ）、固相ペプチド合成、１０３〜１０７、および１１８〜１２２頁（ピ アス・ケミカル（Ｐ　１ｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏ、　）　、第２版、１９８ ４）を参照。

ある種の態様において、Ｌ鎖と■］鎖との間には非常に強い相互作用が存在する ので、鏡開ジスルフィドを除去したためにＬ鎖とＨ鎖との間での解離は望ましく ないレベルのものにはならない。非連結Ｆａｂ’−８Ｈポリペプチドは、有利に も、化学カップリングによって均一なＦ（ａｂ’）２を調製することを可能にす る。

この発明のＦａｂは、抗体の通常の入手源から得ることができる。抗原に対する ポリクローナル抗体は、一般に、該抗原およびアジュバントを動物に複数回、皮 下（ＳＣ）または腹腔内（１ｐ）注射することによって産生される。抗原または 標的抗原アミノ酸配列を有する断片を、免疫しようとする種において免疫原であ るタンパク質（たとえばキーホールリンベットヘモシアニン、血清アルブミン、 ウノチログロブリン、またはダイズトリブシンインヒビター）に、２官能性また は誘導体化試薬、たとえば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステ ル（／スティン残基によるコンジュゲート）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ リジン残基による）、ゲルタールアルデヒド、無水コハク酸、５ＯＣ１，、また はＲＩＮ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基）を用いてコンジ ュゲートするのが有用である。

動物の免疫の経路および手順または該動物からの培養抗体−産生細胞は、一般に 抗体刺激および産生のための確立された通常法に準じて行う。試験モデルとして はマウスがしばしば用いられるが、あらゆる哺乳動物またはそれから得られた抗 体産生細胞を使用可能であることが考えられる。

免疫後、免疫した動物から免疫リンパ球細胞（一般に膵臓細胞またはリンパ節組 織からのリンパ球）を回収し、通常の方法、たとえばミエローマ細胞との融合ま たはエプスタイン−バー（ＥＢ）−ウィルス形質転換により該細胞を不死化し、 ついで所望の抗体を発現するクローンをスクリーニングすることによりモノクロ ーナル抗体を調製する。ケーラーとミルシュティンによって最初に記載されたハ イブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ　２５６：５２−５３　（１９７５））は、多く の特定抗原に対して高レベルのモノクローナル抗体を分泌するハイブリッド細胞 株を作成するために広く用いられている。所望の抗体を分泌するハイブリドーマ の同定は、常法による。ついで、通常の方法を用いて、選択した抗体のＨ鎖およ びＬ鎖をコードするＤＮＡをハイブリドーマから得る。別法として、免疫した動 物のＢ細胞から抗体特異的な伝令ＲＮＡを抽出し、これを相補ＤＮＡ　（ｃＤＮ Ａ）に逆転写し、ついで該ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅するかまたは細菌発現系 中にクローニングする。Ｈ鎖およびＬＭ配列ソースを得るのに適した他の方法で は、バクテリオファージスベクター系（発現されたＦａｂタンパク質をペリプラ ズム腔内に分泌するリーダー配列を含む）を用い、所望の活性を示すものについ ての多数の機能性抗体フラグメントの生成およびスクリーニングを行う。この系 は市販されている。

アミノ酸配列変種 この発明はまた、天然のＦａｂポリペプチド配列のアミノ酸配列変種をも包含す る。これら変種は、ＦａｂをコードするＤＮＡ中に適当なヌクレオチド変化を導 入するか、または所望のＦａｂのインビトロ合成により調製する。そのような変 種には、たとえば、非ヒト抗体のヒト化変種、並びに特定のアミノ酸配列内の残 基の欠失、挿入または置換が含まれる。最終生成物が所望の特性を有することを 条件として、欠失、挿入および置換のあらゆる組み合わせを用いて最終構築物を 得ることができる。これらアミノ酸変化はまた、グリコシレージョン部位の数お よび位置の変化、定常ドメイン中への膜固着配列の導入または天然Ｆａｂのリー ダー配列の修飾などの、標的ポリペプチドの翻訳後プロセシングをも変えるかも しれない。

標的ポリペプチドのアミノ酸配列変種を設計するに際して、変異部位の位置およ び変異の性質は、修飾しようとする標的ポリペプチドの特性に依存するであろう 。変異部位の修飾は、たとえば、（１）得られる結果に依存して、まず保存アミ ノ酸の選択で、ついで一層過激な選択での置換、（２）標的残基の欠失、または （３）位置する部位に隣接して同じかまたは異なるクラスの残基を挿入すること 、または（１）〜（３）の組み合わせによって、個々にまたは連続して行うこと ができる。

突然変異誘発にとって好ましい位置である標的ポリペプチドの残基または領域を 同定するのに有用な方法は、カニンガム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）およびウェル ズ（Ｗｅｌｌｓ）　（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４　：１０８１−１０８５　［１９ ８９］　）　、およびダンカン（Ｄｕｎｃａｎ、　Ａ、　Ｒ，）およびウィンタ ー（Ｗｉｎｔｅｒ、　Ｇ、）　（Ｎａｔｕｒｅ、　３２２　：　７３８〜７４０ 　［１９８８］　）によって記載されているように、［アラニンスキャニング突 然変異誘発（ａｌａｎｉｎｅ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）　 Ｊと称される□本発明では、残基または標的残基のグループを同定しくたとえば 、ａｒｇ、ａｓｐＳｈｉｓ、Ｉｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）、これらア ミノ酸の細胞内または細胞外の周囲の水性環境との相互反応に影響を与えるため 中性または陰性に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニ ン）で置換する。それゆえ、アミノ酸配列変化を導入する部位は前以て決定する が、変異それ自体の性質は前以て決定する必要はない。たとえば、所定部位での 突然変異を最適にするため、Ａ　Ｉ　ａスキャニングまたはランダム突然変異誘 発を標的コドンまたは領域で行い、発現された標的ポリペプチド変種を所望の活 性の最適な組み合わせについてスクリーニングする。

アミノ酸配列変種の構築には２つの主要な変数、すなわち変異部位の位置および 変異の性質が存在する。一般に、選択した変異の位置および性質は、修飾しよう とする標的ポリペプチドの特性に依存するであろう。

アミノ酸配列挿入としては、長さが１残基から１００またはそれ以上の残基を含 有するポリペプチドまでのアミノ−および／またはカルボキシル−末端融合、並 びに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。配列内挿入（す なわち、標的ポリペプチド配列内の挿入）は、一般に、約１〜１０残基、一層好 ましくは１〜５残基、最も好ましくは１〜３残基の範囲であってよい。末端挿入 の例としては、組換え宿主細胞からの成熟Ｆｖポリペプチドの分泌を容易にする ためのＦｖポリペプチドのＮ末端への異種Ｎ末端シグナル配列の融合が挙げられ る。そのようなシグナル配列は、一般に、目的宿主細胞種から得られるため、該 細胞種と同種であろう。大腸菌に適した配列としては、５ＴＩＩまたはＩＩ）り が挙げられる。

標的ポリペプチドの他の挿入変種としては、該標的ポリペプチドのＮ末端または Ｃ末端への免疫原性ポリペプチド、たとえばβ−ラクタマーゼや大腸菌ｔｒｐ遺 伝子座によってコードされる酵素などの細菌ポリペプチドまたは酵母タンパク質 の融合、および免疫グロブリン定常領域（または他の免疫グロブリン領域）、ア ルブミン、またはフェリチンなどの長い半減期を有するタンパク質とのＣ未融合 が挙げられる（Ｗｏ　８９１０２９２２　（１９８９年４月６日発行）に記載） 。

他の適当なポリペプチド配列としては、免疫グロブリン、担体タンパク質、レセ プター、成長因子、栄養物質、細胞付着分子、組織特異的付着因子、酵素、毒素 などに由来する配列が挙げられるが、これらに限られるものではない。これらの 例示は、遊離のチオール／スティンを与えるヒンジ領域などのシスティンまたは ンステイン含有ポリペプチドの挿入とは別のものであろう。

他のグループの変種は、アミノ酸置換変種である。これら変種は、免疫グロブリ ンポリペプチド中の少なくとも一つのアミノ酸残基が除去され、その位置に異な る残基が挿入されている。置換突然変異誘発のために最も重要な部位は、ＣＤＲ ，ＦＲおよびヒンジ領域である。これには、システィンの他の残基への置換、お よび側鎖のかさばり、電荷、および／または疎水性において実質的に異なる挿入 が含まれる。置換のための他の部位については、置換による特定標的抗体の抗原 結合、親和性および他の特性に対する影響を考慮して以下に記載する。

Ｆａｂ自体、Ｈ鎖のＣ□１から下流の定常ドメインが欠失した完全免疫グロブリ ンの欠失変種である。さらに、好ましい態様において、このＣｌ１１ドメインの Ｃ末端側にＣｙｓ　Ａｈａ　Ａｌａなどのシスティン含有配列または２以上のＣ ｙＳを有する配列が続いている。

Ｆａｂアミノ酸配列配列変種−ドするＤＮＡは、当該技術分野で公知の種々の方 法により調製することができる。これら方法としては、天然採取源からの単離（ 天然に存在するアミノ酸配列変種の場合）、またはオリゴヌクレオチド媒体（ま たは部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、および標的ポリペプチド の前もって調製した変種または非変種型のカセット式突然変異誘発によるまたは 全遺伝子合成による調製が挙げられるが、これらに限られるものではない。これ ら方法では、標的ポリペプチドの核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）　、または標的ポ リペプチドの核酸に相補的な核酸を用いることができる。オリゴヌクレオチド媒 体突然変異誘発法 するのに好ましい方法である。

ＰＣＲ突然変異誘発もまた、Ｆａｂポリペプチドのアミノ酸変種を調製するのに 適している。以下ではＤＮＡについて記載するが、該技術をＲＮＡにも応用でき ることは理解されるであろう。ＰＣＲ法とは、一般に以下の手順をさす（工−リ ソヒ、上記、ヒグチ（Ｒ，Ｈｉｇｕｃｈｉ）による章、６１〜７０頁参照）：Ｐ ＣＲにおいて少量の鋳型ＤＮＡを出発物質として用いる場合、鋳型ＤＮＡ中の対 応領域とはわずかに配列が異なるプライマーを用い、該プライマーが該鋳型と異 なる部位でのみ配列が異なる特定ＤＮＡ断片を比較的大量に生成させることがで きる。

プラスミドＤＮＡ中に変異を導入するには、該変異の位置と重複するように、ま た該変異を有するようにプライマーの一方を設計する。他方のプライマーは該プ ラスミドの他方の鎖の配列と同一でなければならないが、この配列はプラスミド ＤＮＡのいずれの位置にあってもよい。しかしながら、これらプライマーによっ て結合された全増幅領域のＤＮＡを最終的に容品にシーフェンシングできるよう に、第二のプライマーは第一のプライマーから２００ヌクレオチド内に位置して いるのが好ましい。記載された通りのプライマーベアを用いたＰＣＲ増幅の結果 、該プライマーによって特定された変異の部位、およびおそらく他の位置でも異 なる（鋳型コピーは若干エラーを起こしやすいので）ＤＮＡ断片の集団が得られ る。

生成物に対する鋳型の比率が極めて低いならば、生成物ＤＮＡ断片の大部分は所 望の変異を導入している。この生成物は、標準ＤＮＡ法を用い、ＰＣＨの鋳型と して機能したプラスミド中の対応領域を置換するのに用いる。別々の位置におけ る変異の同時導入は、変異第ニプライマーを用いるが、または異なる変異プライ マーを用いて第二のＰＣＲを行い、得られた２つのＰＣＲ断片を３（またはそれ 以上）部ライゲーションにおいてベクター断片中に同時にライゲートすることに より、行なうことができる。

変種を調製するための他の方法（カセット式突然変異誘発）は、ウェルズらによ って記載された方法（９９思、３４　：　３１５　［１９８５］　）に基づいて いる。

出発物質は、変異しようとするＦａｂＤＮＡを含有するプラスミド（または他の ベクター）である。変異しようとするＦａｂポリペプチドＤＮＡ中のコドンを同 定する。同定した変異部位の各部位に唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在 していなければならない。そのような制限部位が存在しない場合には、上記オリ ゴヌクレオチド媒体突然変異誘発法を用いてＦａｂポリペプチドＤＮＡ中の適当 な位置に導入することにより該部位を生成させる。これら制限部位をプラスミド 中に導入した後、これら部位にてプラスミドを切断して線状にする。これら制限 部位の間のＤＮＡ配列をコードしているが所望の変異を有する二本鎖オリゴヌク レオチドを標準法を用いて合成する。２本の鎖を別々に合成し、ついで標準法を 用いてハイブリダイズさせる。この二本鎖オリゴヌクレオチドはカセットと呼ば れる。このカセットは、該プラスミド中に直接ライゲートできるように、線状化 プラスミドの末端と適合した３“および５′末端を有するように設計しである。

このプラスミドは、こうして、変異したＦａｂポリペプチドＤＮＡ配列を含有し ている。

ベクター中へのＤＮＡの挿入 ＦａｂポリペプチドをコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを、さらにクロー ニングするため（該ＤＮＡの増幅）または発現させるために複製可能なベクター 中に挿入する。多くのベクターを利用でき、適当なベクターの選択は、（１）Ｄ ＮＡ増幅のために用いるのかコードタンパク質の発現のために用いるのが、（２ ）ベクター中に挿入するＤＮＡのサイズ、および（３）該ベクターで形質転換し ようとする宿主細胞に依存するであろう。各ベクターは、その機能（ＤＮＡの増 幅またはＤＮＡの発現）およびそれが適合する宿主細胞に依存して種々の成員を 含有する。ベクター成員としては、一般に、以下の１または２以上が挙げられる が、これらに限られるものではない・シグナル配列、複製起点、１または２以上 のマーカー遺伝子、プロモーター、および転写停止配列。

（ａ）シグナル配列成員 一般に、シグナル配列はベクターの成員であるか、またはベクター中に挿入する 標的ポリペプチドＤＮＡの一部である。本発明に包含されるのは、天然のシグナ ル配列が欠失され、異種シグナル配列で置換されたＦａｂポリペプチドである。

選択する異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識されプロセシングを受ける （すなわち、シグナルペプチダーゼで開裂される）ものでなければならない。天 体のＦａｂポリペプチドッグナル配列を認識およびプロセシングしない原核宿主 細胞の場合は、該シグナル配列を、たとえばアルカリホスファターゼ、ペニンリ ナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定エンテロトキシン■リーダーから選ばれた原核シ グナル配列で置換する。

（ｂ）複製起点成員 発現およびクローニングベクターは、１または２以上の選択した宿主細胞中での Ｆａｂ核酸の復製を可能にする核酸配列を含有していてもよいが、含有する必要 はない。一般に、クローニングベクターにおいては、この配列は宿主染色体ＤＮ Ａと独立に該ベクターを復製させるものであり、複製起点または自律複製配列を 含む。そのよ−うな配列は、種々の微生物について非常によく知られている。プ ラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は、はとんどのグラム陰性細菌に適してい る。

ＤＮＡはまた、宿主ゲノム中に挿入することによっても複製される。このことは 、宿主としてバシラス種を用い、たとえばハシラスゲノムＤＮＡ中に認められる 配列に相補的なりＮＡ配列をベクター中に導入することによって容品に達成でき る。このベクターでバシラスをトランスフェクションすると、該ゲノムと相同組 換えが起こり、標的ポリペプチドＤＮＡが挿入される。しかしながら、標的ポリ ペプチドＤＮＡの切り出しに制限酵素消化が必要とされるので、外部で複製され るベクターの場合に比べて標的ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの回収は 一層複雑である。同様に、ＤＮＡはまた、を椎動物および哺乳動物細胞のゲノム 中に常法に従って挿入することができる。

（ｃ）選択遺伝子成員 発現およびクローニングベクターは選択遺伝子（選択マーカーとも呼ばれる）を 含有すべきである。この遺伝子は、選択培地中で増殖させた形質転換宿主細胞の 生存または増殖に必要なタンパク質をコードしている。選択遺伝子を含有するベ クターで形質転換されなかった宿主細胞は培地中で生存できないであろう。典型 的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質や他の毒素、たとえばアンピシリン、ネオマ イシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタ ンパク質、（ｂ）栄養要求欠損を補足するタンパク質、または（Ｃ）複合培地か らは利用できない重要な栄養を供給するタンパク質（たとえばバシラスの場合の Ｄ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）をコードする。

選択計画の一つの例は、宿主細胞の増殖を阻止する薬剤を利用することである。

異種遺伝子で形質転換されている細胞は薬剤耐性を付与するタンパク質を発現し 、それゆえ選択条件を生き残る。そのような主要な選択の例示としては、薬剤の ネオマイシン（サザーン（３ｏｕｔｈｅｒｎ）ら、Ｊ　、　Ｍｏ１．ｅｃ、　Ａ 　ｐ吐Ｊ≧朋Ｖ、　１　：　３２７［１９８２］）、ミコフェノール酸（マリガ ン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）ら、ＳｃｉｅｎｃｅＳ２る。上記３つの例では、それぞ れ適当な薬剤、Ｇ４１８すなわちネオマイシン（ジェネチシン）、ｘｇｐｔ（ミ コフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性を付与するため真核制 御下で細菌遺伝子を使用する。

（ｄ）プロモーター成員 発現ベクターおよびクローニングベクターには、通常、宿主生物によって認識さ れＦａｂポリペプチド核酸と機能的に連結したプロモーターが含まれるであろう 。プロモーターは、Ｆａｂ構造遺伝子（一般に約１００〜１０００ｂｐ内）の開 始コドンの上流（５′側）に位置する非翻訳配列であって、該構造遺伝子の転写 および翻訳を制御する。そのようなプロモーターは、一般に誘導性および構成的 の２つのクラスに分けられる。誘導プロモーターとは、培養条件におけるある種 の変化、たとえば栄養物の存在もしくは不在または温度変化に応じて、その制御 下でＤＮＡからの増加したレベルでの転写を開始するプロモーターである。

高制御下の誘導プロモーターが、Ｆｖ含有ポリペプチドの微生物発現には好まし い。現在、種々の可能な宿主細胞により認識される多数のプロモーターがよ（知 られている。これらプロモーターは、採取源のＤＮＡから制限酵素消化によって 取り出し、単離したプロモーター配列をベクター中に挿入することによってＦａ ｂポリペプチドをコードするＤＮＡに機能的に連結される。Ｆａｂポリペプチド ＤＮＡの増幅および／または発現を指令するため、天然のＦａｂポリペプチドプ ロモーター配列および多くの異種プロモーターの両方とも用いることができる。

しかしながら、一般に異種プロモーターの方が天然標的ポリペプチドプロモータ ーに比べて大きな転写および発現される標的ポリペプチドの高収率を可能とする ので異種プロモーターが好ましい。

原核宿主に用いるのに適したプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよびア ルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（ゲラデル、 旦Δ、８０：２１〜２５　［１９８３］　）などのハイブリッドプロモーターが 挙げられる。しかしながら、他の知られた細菌プロモーターも適している。それ らのヌクレオチド配列は刊行されているので、当業者は、必要な制限部位を与え るためのリンカ−またはアダプターを用い、標的ポリペプチドをコードするＤＮ Ａに機能的にライゲートさせることができる（ジ−ベンリスト（Ｓ　１ｅｂｅｎ ｌｉｓｔ）ら、９県、２０　：　２６９　［１９８，０］）。細菌系に使用する プロモーターはまた、一般に標的ポリペプチドをコードするＤＮＡに機能的に連 結したシャインーダルガーノ（Ｓ、Ｄ、）配列を含有するであろう。

上記成員の１または２以上を含有する適当なベクターを構築するには、標準的な ライゲーション法を用いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡ断片を開裂し、修 飾しくｔａｉｌｏｒｅｄ）　、必要なプラスミドを生成するのに望ましい形態で 再ライゲートさせる。

宿主細胞の選択および形質転換 Ｆａｂを発現するのに適した宿主細胞は、酵母、真菌、および原核生物などの微 生物細胞である。適当な原核生物としては、グラム陰性菌やダラム陽性菌などの 真正細菌、たとえば、大腸菌、枯草菌（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）などのバシラ ス（Ｂａｃｉｌｌｉ）　、ンユードモナス・アエルギノーサ（ＰｓｅｕｄｏＩｌ ｌｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などのシュードモナス種、サルモネラ・チ フィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）　、またはセ ラチア・マルセソセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）が挙げら れる。一つの好ましい大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４　（ＡＴＣＣ３１ ，４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌χ１７７６　（ＡＴＣＣ３１，５３７） 　、大腸菌ＲＶ３０８　（ＡＴＣＣ３１，６０８）　および大腸菌Ｗ３１１０　 （ＡＴＣＣ２７，３２５）などの他の株も適している。これらは単に例示であっ て本発明を限定するものではない。宿主細胞は最小量のタンパク質付酵素を分泌 するのが好ましく、さらにプロテアーゼインヒビターを細胞培養液中に添加する のが望ましい。

宿主細胞をこの発明の上記発現ベクターまたはクローニングベクターでトランス フェクションおよび好ましくは形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の 選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように修飾した通常 の栄養培地で培養する。

宿主細胞の培養 この発明のＦａｂポリペプチドを生成させるのに使用する細胞の培養は、サンプ ルツクら（モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアルニュー ヨーク、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−プレス、１９８９）により一 般に記載されているようにして適当な培地中で行う。他の必要な添加物も、当業 者に知られた適当な濃度にて用いることができる。温度、ｐＨなどの培養条件は 、発現選択のために宿主細胞で用いたのと同様であり、当業者には明らかであろ う。

現在のところ、３７℃〜２９℃の温度で宿主細胞を培養するのが好ましいが、２ ０℃という低い温度も適している。最適温度は、宿主細胞、Ｆａｂ配列および他 のパラメータに依存するであろう。一般に３７℃が好ましい。

Ｆａｂポリペプチドの精製 組換え細胞培養液から可溶性ポリペプチドを回収し、Ｆａｂに関して実質的に均 一な調製物を得る。第−工程として、培地またはべりプラズム調製物を遠心分離 にかけて微粒の細胞破砕物を除去する。ペリプラズム調製物を、通常の仕方、た とえば凍結−解凍法または浸透ショック法により得る。ついで、膜および可溶性 タンパク質画分を分離する。ついで、Ｆａｂポリペプチドを可溶性タンパク質両 分から精製する。以下の手順が適当な精製手順の例示である：イムノアフィニテ ィーカラムまたはイオン交換力ラムトでの分画：エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ ノリカ上またはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂上のクロマトグラフィｍ：りロ マトフォーカシング；　５ＤＳ−ＰＡＧＥ　、硫酸アンモニウム沈殿：たとえば セファデックスＧ−７５を用いたゲル濾過、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇア フィニティーマトリックス（たとえば、セファロース）カラム：および疎水性相 互反応クロマトグラフィー。

残基が欠失、挿入または置換したＦａｂポリペプチド変種も、該変異に伴う特性 の実質的変化を考慮に入れて同様にして回収することができる。たとえば、他の タンパク質やポリペプチド（たとえば、細菌またはウィルス抗原）とのＦａｂポ リペプチド融合物の調製により、該融合物を吸着させるために該抗原に対する抗 体を含有するイムノアフィニティーカラムを用いることができるので精製が容易 になる。ウサギポリクローナル抗標的ポリペプチドカラムなどのイムノアフィニ ティーカラムを用い、標的ポリペプチド変種を少な（とも一つの残留免疫エピト ープに結合させることにより該ポリペプチド変種を吸着させることができる。

精製中のタンパク質加水分解を阻害するためにプロテアーゼインヒビターが有用 であり、偶発的な汚染物の増殖を防ぐために抗生物質を用いることもできる。

Ｆａｂ含有ポリペプチドの有用性 この発明の抗体フラグメントは、特定の細胞、流体もしくは組織中の抗原の診断 アッセイ、抗原のイムノアフィニティー精製、および抗原拮抗作用に基づ（治療 に有用である。

Ｆａｂによって結合される抗原の分析法は通常のものであり、Ｆａｂに結合した 標識を用いることができる。Ｆａｂポリペプチドに使用する標識は、Ｆａｂへの 結合を妨害しない検出可能な官能基である。放射性同位元素３４ｐ、３２３．１ ４ｃ１１２５）、３Ｈおよび＋３１１、蛍光団、たとえば希土類キレートまたは フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウ ンベリフェロン、ルシフェラーゼ、たとえば発光飛翔昆虫（ホタル）ルシフェラ ーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４．７３７．４５６Ｍ）、ルノフェ リン、２．３−ノヒドロフタールアジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ ＨＲＰ）　、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトンダーゼ、グルコアミラー ゼ、リゾチーム、サツカリドオキ／ダーゼ、たとえばグルコースオキシダーゼ、 ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、 ペテロ環オキシダーゼ、たとえばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ、ラ クトペルオキシダーゼ、ビオチン／アビシン、スピン標識、バクテリオファージ 標識、安定フリーランカル、造影放射性核種（テクネチウムなど）などを含む多 くの標識が知られている。

これら標識をタンパク質またはポリペプチドに共有結合により結合させるには、 通常の方法を利用することができる。たとえば、ジアルデヒド、カルボジイミド 、シマレイミド、ビス−イミデート、ビス−ジアゾ化ベンジジンなどのカップリ ング剤を用い、上記蛍光標識、化学ルミネセンス標識および酵素標識で抗体を標 識することができる。たとえば、米国特許第３．９４０．４７５号（蛍光測定） およａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、　３０　：　４０７−４１２　（１９８２） を参照。本発明において好ましい標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびア ルカリホスファターゼなどの酵素である。そのような標識（酵素を含む）のＦａ ｂ含有ポリペプチドへの結合は、イムノアッセイ法における当業者にとって標準 的な操作手順である。たとえば、オサリバン（０’　５ｕｌｌｉｖａｎ）ら、［ エンザイムイムノアッセイに使用するための酵素−抗体結合体の調製法Ｊ　（Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ランボン（Ｊ。

Ｊ　、　Ｌａｎｇｏｎｅ）およびパン・ブナキス（Ｈ，Ｖａｎ　Ｖｕｎａｋｉｓ ）編、Ｖｏｌ、７３（アカデミツクプレス、ニューヨーク、ニューヨーク、１９ ８１）、１４７〜１６６頁）を参照。そのような結合法は、この発明のＦａｂポ リペプチドに使用するのに適している。

Ｆａｂ含有ポリペプチドはまた、イムノトキシンをも包含する。たとえば、ＡＩ ＤＳ治療に使用するりソンなどの細胞毒素にＦａｂ　Ｈ鎖を任意に結合させるこ とができる。別の聾様として、毒素は、細胞毒性薬剤または細菌、真菌、植物も しくは動物由来の酵素的に活性な毒素、またはそのような毒素の酵素的に活性な 断片であってよい。酵素的に活性な毒素およびその断片としては、ジフテリアＡ 鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・アエルギ ノーサから）、リンンＡ鎮、アブリンＡ鎖、モデンン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）　Ａ 鎖、α−サルノン（ａｌｐｈａ−ｓａｒｃｊｎ）　、アレウリテス・フォルディ （Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ　ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈ ｉｎ）タンパク質、フィトラカ・アメリカナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ　ａｍｅｒｊ ｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰｌｌ、およびＰＡＰ−８）、モモルデ ィ力・カランティア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ　ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター 、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）　、クロチン、サパオナリア・オフインナリス（ｓ ａｐａｏｎａｒｉａ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲｏ＝ン（ｇｅ ｌｏｎｉｎ）　、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）　、レストリフトシン（ ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）　、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）　、 エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅ ｎｅｓ）が挙げられる。他の態様において、シスープラチンや５ＦＵなどの非ペ プチド性薬剤に抗体を結合させる。モノクローナル抗体とそのような細胞毒性残 基との結合体は、種々の２官能性タンパク質カツプリング剤を用いて調製する。

そのような試薬の例示としては、５ＰＤＰ、ＩＴ、イミドエステルの２官能性誘 導体、たとえばジメチルアジピミデートＨＣＩ、活性エステル、たとえばノスク シンイミジルスベレート、アルデヒド、たとえばグルタルアルデヒド、ビス−ア ジド化合物、たとえばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン、ビス− ジアゾニウム誘導体、たとえばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレ ンジアミン、ジイソシアネート、たとえばトリレン２．６−ジイソシアネートお よびビスー活性フッ素化合物、たとえば１゜５−ジフルオロ−２，４−ジニトロ ベンゼンが挙げられる。毒素の溶解部分をＦａｂ抗体フラグメントに結合させて よい。

イムノトキシンは、本明細書に記載するように、種々の仕方で作製することがで きる。一般に知られた架橋剤を用いて安定な結合体を生成することができる。

インビボの治療用に用いる場合、本発明のＦａｂ含有フラグメントを、完全免疫 グロブリンと同様にして治療学的有効量（すなわち、所望の治療学的効果を示す 量）にて患者に投与する。この発明の方法に従って調製した生成物は、実質的な 分子的均一性という利点を有し、それゆえこれまでＦ（ａｂ’）ｔの調製に使用 された毒性汚染物が回避される。

治療に使用する抗体組成物を調合し、投与量は、治療しようとする疾患、個々の 患者の状態、該組成物を投与する部位、投与方法および実務家に知られた他の因 子を考慮に入れて良好な医療実務に従った仕方にて確立される。抗体組成物は、 以下の投与のためのポリペプチドの調製の記載に従って投与のために調製される 。

実施例・活性なＦａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）を抗体フラグメントの発 現ＨＥＲ２癌原遺伝子産物（ｐ　１８５　””’）の過剰発現は、種々の浸潤性 のヒト悪性物（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ　ｈｕｍａｎ　ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ ）と関連している。ヒト化抗体ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の機能性ＦａｂおよびＦａ ｂ’フラグメントを、抗原ｐ１８５””への結合によって決定されるように１リ ツトル当たり約１から過剰で約２グラムの力価にて分泌する大腸菌発現系を開発 した。２価Ｆ（ａｂ’）ｚ抗体フラグメントを生成するためのインビトロでの効 率的な部位指定ジスルフィド結合生成が可能となるように、単一のヒンジ領域シ スティンが主として遊離チオールとして存在する（約９０モル％まで）ようにし てＦａｂ’フラグメントを回収した。この分子は、抗原結合親和性においておよ びヒト乳腫瘍細胞株５Ｋ−ＢＲ−３（ｐ１８５”Ｒ２を過剰発現する）に対する 抗増殖活性において完全な抗体のタンパク質加水分解から得られたＦ（ａｂ’） ｚと区別することができないが、該タンパク質加水分解産物と違って本発明のＦ （ａ　ｂ’）ｘはＣ末端側が均一である。この発明は、研究および治療目的のた めの天然由来またはヒト化抗体フラグメントを含む１特異的および２特異的Ｆ（ ａｂ’）２抗体フラグメントの構築を容易にする。

この発明は、ＨＥＲ２癌原遺伝子の過剰発現によって特徴付けられる腫瘍病巣な どの標的抗原に診断用残基または治療用残基を指向させることのできる抗体フラ グメントを開発するのにとりわけ適している。

ｍｕＭＡｂ４Ｄ５　（フェンドリー（Ｆｅｎｄｌｙ、　Ｂ、Ｍ、）ら、Ｃｎｃｅ ｒ　Ｒｅｓ、　５　Ｑ１５５０〜１５５８　（１９９０））として知られるマウ スモノクローナル抗体は、ｐ　１８５１１Ｆ”の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の対 して向けられる。ｍｕＭＡｂ４Ｄ５およびその用途については、同時継続中のＰ ＣＴ出願ＷＯ８９１０６６９２号（１９８９年７月２７日公開）に記載されてい る。このマウス抗体はＡＴＣＣに寄託してあり、ＡＴＣＣＣＲＬ　１０４６３の 番号が付与されている。この記載において、ｍｕＭＡｂ４Ｄ５、ｃｈＭＡｂ４Ｄ ５およびｈｕＭＡｂ４Ｄ５なる語は、それぞれモノクローナル抗体４Ｄ５のマウ ス態様、キメラ化態様およびヒト化剪様を表す。

ｍｕＭΔｂ・４ｒ）５は、ｐｌ、　Ｂ　５　ＩＩ　ｔ　Ｒ２を過剰発現するヒト 腫瘍細胞株の増殖を特Ｗ的に阻害し、　（２，３）　ｆｆ的細飽によって迅速に インターナリゼーノヨンされるのて（データは示していない）、臨床的介入の可 能性を有する。ＨＥＲ２の増幅および／または過剰発現は複数のヒト悪性物と関 係しており、主要なヒト乳癌および卵巣癌の２５〜３０％の進行に完全に関与し ていると思われる（５）。ｍｕＭＡｂ４Ｄ５は、免疫原性を減少させヒトエフェ クター機能を支持するのを可能にすることによって臨床的有効性を改善するため の試みにおいて以前に「ヒト化」されている（６）。ヒト化抗体ｈｕＭＡｂ４Ｄ ５−８は、本質的に、マウス親抗体の抗原結合ループとヒト可変領域フレームワ ーク残基および定常ドメインのみを含む。このヒト化抗体は、マウス親抗体に比 べてｐ１８５１″Ｉ！ＥＣＤに対する親和性が３倍高く、ｐｌ　ｓ　５ＨＩＲ１ を過剰発現する腫瘍細胞に対して匹敵する抗増殖活性を有し、抗体依存性細胞障 害を支持する。

ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）ｚ抗体フラグメントを包含す るように抗ｐＩ　Ｂ　５　ＨｌＲＩ抗体試薬の範囲を広げることが望まれた。完 全な抗体に比べてこれらフラグメントのサイズが小さいことは、腫瘍への侵入の 改善および血清からの一層迅速な除去の促進によって、固体腫瘍への特異的局在 化を向上させると思われる（文献８を参照）　。ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８　Ｆａｂ およびＦ（ａｂ’）ｔフラグメントを、これらフラグメントの処理を容易にする ために直接組み合え発現によって得た。さらに、この方法により、完全抗体の制 限タンパク質加水分解および部分還元によって得られるものよりも一層均一な抗 体フラグメントの調製物を得ることができた（文献９を参照）。機能性のＦｖお よびＦａｂフラグメントが大腸菌から分泌された（１０）。

本発明における抗体フラグメントの大腸菌分泌のための方法は（図１）、他の研 究者の仕事と２つの基本的な類似点を有する（１０）。第一に、対応り鎖および Ｈ鎖フラグメントの同時発現を指令するためにンンストロンオペロンを用いてい る。第二に、大腸菌のペリプラズム腔中への分泌を指令するために抗体鎖に細菌 シグナル配列が先行しており、該ペリプラズム腔ではノスルフィド結合形成には 酸化還元環境が有利であり、■、鎖および■」鎖フラグメントが組み立てられる 。

本発明の系は従来の方法と３つの基本的な点て異なっている。第一に、転写単位 に、リン酸飢餓によって誘導される高度に制御されたプロモーター、大腸菌ｐｈ ｏＡプロモーター（１１）　、および熱安定なエンテロトキソン■シグナル配列 （１２）を利用している。第二に、Ｌ鎖の遺伝子切片がＨ鎖Ｆｄフラグメント（ ■□およびＣｓ１ドメイン）の遺伝子切片に先行している。第三に、ｈｕＭＡｂ ４Ｄ５−８のＦａｂ’フラグメントを発現させるため、ＣＨＩ遺伝子切片がシス ティン含有抗体ヒンジ領域の一部をコードするべく延長されている。システィン のつぎに２つのプロリンおよび他のシスティンが続く配列（ＣＰＣ末端）を最初 に選択した。というのは、該配列がｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の完全長態様（６）を 含むヒ）　１　ｇＧ、分子のヒンジ領域に認められるからである（１７）。ｐＢ Ｒ３２２ベース発現ベクターのカセット突然変異誘発（１８）による別のＦａｂ ’変種の構築を、Ｃ，１遺伝千切片の末端および停止コドンのすぐ３゛側にそれ ぞれ唯一の５ａｌｌおよびｓｐｈ　Ｉ制限部位を設けることにより容易にした。

発酵槽中で高細胞密度にて増殖させた（２０）大腸菌ＲＶ３０８のファージ耐性 誘導体（１９）中にてｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８　Ｆａｂフラグメントを発現させた 。発酵培地中での機能性ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８　Ｆａｂの力価は、ｐ　ｉ　ｓ　 ５　ＨＩ　＊　ＮＥＣＤ結合ＥＬＩＳＡによって決定されるように、普通に１リ ツトル当たり１〜２グラムである。適度の量（通常、＜２００ｍｇ／Ｉ）のｈｕ ＭＡｂ４Ｄ５−８Ｆａｂが細胞ペーストに含まれることが認められ、浸透ショッ クによって放出させることができる。ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８　Ｆａｂフラグメン トのコンセンサスフレームワーク傾城はスタフィロコッカスタンパク質Ａおよび ストレプトコッカスタンパク質Ｇの両方に強く結合することがわかり、これらを アフィニティー精製に利用することができた。抗原結合ＥＬＩＳＡに先立つタン パク質Ａ上のアフィニティー精製後の培地または細胞ペースト試料で極めて類似 した力価評価が得られる。ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８　Ｆａｂ変種（システィン、２ つのプロリンおよび他の７ステイン）および以下に記載する別のＦａｂ’変種に ついても、同様のｐ］　８５””ＥＣＤ結合活性の発現力価が得られた。

Ｆ（ａｂ’）２分子の生成には、完全な抗体の場合には可能なＣ，＋３ドメイン 間の広範囲の相互作用の助けを借りることなく、Ｆａｂ’ヒンジシスティンチオ ールが偶然に出会ってジスルフィド結合を形成する必要がある。それゆえ、イン ビボでのＦ（ａ　ｂ’）２の形成を促進するため、大腸菌のペリプラズム腔中で のＦａｂ’の高レベル発現を先行させる。事実、ＣＰＣ末端を有するＦａｂ’分 子（培地または細胞ペーストのいずれかから単離された）のく１０％が、タンパ ク質入精製後の５ＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるように２価の形態で回収さ れた。高分解能マススペクトルおよび他の研究は、２つのヒンジシスティン残基 間で分子内ジスルフィド結合の実質的な生成が起こっていることを示唆していた 。この可能性は、単一のヒンジシスティン残基を有しＣｙｓ　Ａｌａ　Ａｌａの Ｃ末端配列を有するＦａｂ’変種を構築することにより排除した。このＦａｂ’ 変種が大腸菌から分泌されＤＴＮＢ分析で遊離のチオールが検出されない場合に は、ごくわずかな量のＦ（ａ、ｂ’）ｔが生成する。

Ｆａｂ’分子をヒンジシスティンが遊離のチオールとして存在するように維持す る条件下で回収し、ついでインビトロで直接カップリングすることにより容易か つ有効にＦ（ａｂ’）２に生成させる。たとえば、ブレナンら（２３）は、Ｆ　 ａ　ｂ’遊離チオール（Ｆａｂ’−８Ｈ）をＤＴＮＢと反応させてチオニトロベ ンゾエート誘導体（Ｆａｂ’　−ＴＮＢ）を生成させ、ついでこれを第二のＦ　 ａ　ｂ’　（Ｆ　ａ　ｂ’−３Ｈ）とカップリングさせて２特異的Ｆ（ａｂ’） ｚを生成させた。以下の方法により、完全な機能性ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８　Ｆａ ｂ’　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｌａ変種の日常的な精製が可能となり、ＤＴＮＢ分析 により決定されるように（図２）該分子の７５〜９０％が遊離のヒンジチオール を含有している。第一に、増殖条件をうまく修飾して（２０）　、Ｆａｂ’の分 泌を培地中（Ｆ　ａ　ｂ’ヒンジチオールが定量的および共有結合によりブロッ クされることがわかった）にではな（大腸菌のペリプラズム腔中になるようにし た。第二に、Ｆａｂ’フラグメントを細胞ペーストから単離し、システィンのチ オールを一層反応性の小さいプロトン化形態に維持するために低ｐＨ（ｐＨ５， ０）にてタンパク質Ｇセファロース上でアフィニティー精製した。第三に、ＥＤ ＴＡを加え、ジスルフィド結合生成を触媒し得る金属イオンをキレート化し、メ タロプロテアーゼを不活化した。最後に、プロテアーゼインヒビターのカクテル （フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプス タチンおよびベンズアミジン）により、精製中の大腸菌プロテアーゼによるＦａ ｂ’のタンパク質加水分解を実質的に排除した。

Ｆａｂ’調製物中の小量の混入タンパク賃加水分解断片を、疎水性相互反応クロ マトグラフィーにより容易に除去した。浸透ショックによって凍結−解凍細胞か ら放出されたＦａｂ’−８Ｈを過剰のＤＴＮＢの存在下で中性のｐＨに調節した 他は、同様にしてＦ　ａ　ｂ’　−ＴＮＢ誘導体を調製した。

等モル量のＦａｂ’−３ＨとＦａｂ−ＴＮＢとをカップリングさせ、ジスルフィ ド交換反応によりＦ（ａｂ’）ｚ抗体フラグメントを有効に生成させた（図２） 。カップリング反応をチオニトロベンゾエートアニオンの放出による４１２ｎｍ における吸光度の増加をモニタリングすることにより追跡し、３７℃で３０〜６ ０分後に完了することがわかった。カップリング後の反応混合物では遊離のチオ ールは検出されず、残留するＦａｂ’の量はＦａｂ’−３ＨおよびＦａｂ’−Ｔ ＮＢ調製物中の未反応物質の量と一致している。）”（ａｂ’）ｚを５１００− ＨＲサイジングカラム−Ｆのゲル濾過によりＦａｂ’から分離した。文献記載さ れているように（２３）　、Ｆａｂ’−３ＨまたはＦ　ａ　ｂ’−ＴＮＢのいず れかのみを含有する模擬カップリング反応では、痕跡最のｈｕＭＡｂ４Ｄ５　８ 　Ｆ（ａｂ’）２Ｌか生成しなかった。

精製ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８　ＦａｂおよびＦ（ａ　ｂ’）ｚの物理的および化学 的完全性を、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（、図２）、アミノ末端配列、アミノ酸組成お よび遊離チオール含量の分析、および円偏光二色性により評価した。非還元条件 下で５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した精製ｈｕＭＡＩＪ４Ｄ５−８　Ｆａｂ　（ Ｍｒ＝４７．７ｋｄａ　Ｉ）およびＦ（ａｂ”）ｚ　（Ｍｒ＝９６．０ｋｄａ　 ｌ）フラグメントは、それぞれ、期待される移動度の単一の主要なバンドを与え た。還元条件下での５ＤＳ−ＰＡＧＥの後では、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）ｚ抗 体フラグメントの両方とも、遊離のＬ鎖（２３，４ｋｄａｌ）および■］鎖Ｆｄ 　（２４，３ｋｄａ＋）またはＦｄ’（２４，６ｋｄａｌ）フラグメントの化学 量論的な量の放出により期待される同様の強度の二本のバンドを与えた（示して いない）。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）ｚ抗体フラグメントのアミノ末端配列分析 （８サイクル）は、Ｌ鎖とＨ鎖との化学量論的１１混合から期待される混合配列 を与え（ＶＬ／ＶＨ：　Ａ　ｓ　ｐ／Ｇ　ｌ　ｕ、　ＩＩｅ／Ｖａ１．Ｇｌｎ／ ＧＩｎ＝Ｍｅｔ／Ｌｅｕ、Ｔｈｒ／Ｖａｌ、Ｇｌｎ／ＧＩｕ、Ｓｅｒ／Ｓｅｒ、 およびＰｒｏ／Ｇｌｙ）、別の配列の証拠はなかった。

ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）ｚ調製物のいずれにおいても、期待されるようにＤＴ ＮＢ分析によって遊離のチオールは検出されなかった。酸加水分解したＦａｂま たはＦ（ａｂ’）ｚのアミノ酸分析（２７）は、期待される組成と極めてよく一 致していた（６）。Ｆａｂフラグメントの円偏光二色性スペクトルは、免疫グロ ブリンの畳み込みに特徴的なものである。

ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８　ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）ｚ抗体フラグメントの機能を 、ｐ１８５””ＥＣＤに対する結合親和性を測定することにより、およびｐ１８ ５″１２を過剰発現するヒト乳癌細胞株５Ｋ−ＢＲ−３の増殖に及ぼす影響を調 べることにより調べた（表１）。

轟１．ｐ１８５ＭＥ”ＥＣＤ結合親和性および乳癌５Ｋ−ＢＲ−３細胞に対する 抗増殖活性によるｈｕＭＡｂ４Ｄ５　８フラグメントの分析ｈｕＭＡｂ４Ｄ５− ８変種　採取源　Ｋｄ＊　ｐＭ　相対的細胞増殖４Ｆａｂ　大腸菌　５７０　９ １ Ｆ（ａｂ’）ｚ工　大腸菌　２９０　５３Ｆ（ａｂ’）２　２９３細胞　３００ 　５０＊ｐ１８５ＨＦ″２ＥＣＤのＫｄ値はすてに記載されたようにして決定し く５）、推定値の標準誤差は≦±１０％である。

’ｈｕＭＡｂ４Ｄ５変種とともに９６時間インキュベートした５Ｋ−ＢＲ−３細 胞の増殖は、記載に従い（５）、未処理コントロールのパーセントとして示した 。

データは、各変種について１０μｇ／ｍｌのフラグメント濃度にて３回決定した ものの平均として計算した最大抗増殖作用を表す。データはすべて同じ実験から のものであり、推定標準誤差は≦±１５％である。

ｊｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｌａ変種 ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８　Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントのｐ１８５”！２ＥＣ Ｄに対する結合親和性は、哺乳動物中で発現された完全抗体の制限タンノくり質 加水分解からの対応フラグメントのものと同一である。大腸菌由来の２価Ｆ（ａ ｂ’）ｚ抗体フラグメントは、５Ｋ−ＢＲ−３細胞に対する抗増殖活性が、２９ ３細胞由来の完全な２価ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８親抗体（６）および完全な抗体の 制限ペプシン消化から得られるＦ（ａｂ’）ｚ抗体フラグメントの両方のものと 同一である。対照的に、−価Ｆａｂ分子は５Ｋ−ＢＲ−３細胞の増殖に有意な影 響を及ぼさない。

このことは、細胞表面上のｐｌ　ｓ　５１１川の架橋が細胞の増殖を阻害するの に必要であることを示唆している。Ｆ（ａｂ’）ｔに比べてＦａｂの抗原結合親 和性が２倍弱いことが、Ｋｄの数百倍上までの濃度でＦａｂの抗増殖活性が存在 しないことを説明しているとは極めて考えにくいと思われる。さらに、２価親抗 体ｍｕＭＡｂ４Ｄ５の抗増殖活性を１価ｈｕＭＡｂ４Ｄ４　Ｆａｂフラグメント でブロックすることが可能である。

この実施例では、機能性Ｆａｂフラグメントの発現力価は、大腸菌について文献 で報告されているものに比べて約１０００倍から１リツトル当たり１〜２グラム に増加した。加えて、Ｆａｂ’分子を回収した。この増大した発現は、高細胞密 度（１０〜２０倍）および簡単なソエークフラスコに比べて一層正確に制御した 発酵槽の環境、誘導前発現の非常に厳格な制御および使用したヒト化可変ドメイ ン配列の特徴にのみその一部が原因すると極めて強く思われる。ｐｈｏＡプロモ ーターを用いて本発明で得られたＦａｂ’の力価は驚くほど高く、この強力なプ ロモーターを低コピー数の（ｐＢＲ３２２ベースの）ベクターに使用した結果で ある。それゆえ、このリプレッサーは一層有効でないレベルでは滴定されない。

細胞はまた、余分のリプレッサーを作製するために形質転換することができた。

重要なことは、プロモーターが誘導前に不活性であることである。ベクターの設 計およびＦａｂフラグメントの高い熱安定性（Ｔ、、＞　８０℃）も重要である こともあり得る。この系は、大量の抗体フラグメントを必要とする臨床的または 生物物理学的研究を極めて容易にするに違いない。

抗原結合ループ中またはフレームワーク残基の近傍に１または２以上のアミノ酸 変化を有するｈｕＭＡｂ４Ｄ５　８　Ｆａｂの別の変種についても同様の高い発 現レベルが観察された（６）。抗原結合残基をうまく置換することにより２つの 別の抗原結合特異性をｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８　Ｆａｂ’中に補充し、高発現力価 を示すことがわかった。このことは、実質的にｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８　Ｆａｂ’ からなるポリペプチドのフレームワークが高度に発現されたヒト化Ｆａｂ’分子 に一般に有用であるという概念と一致する。

ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８　Ｆａｂ’　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｌａは、可変領域内のド メイン内ジスルフィドのみかけ上定量的な生成にもかかられす、インビボでＦ（ ａｂ゛）、を生成する傾向は非常に小さい。しかしながら、インビトロでは、ｐ Ｈ７゜５、ＥＤＴＡの不在下、インビボで認められるよりも少なくとも１０倍低 い濃度にてＦａｂ’−８Ｈの空気酸化によりＦ（ａｂ’）＊が容易に生成する。

特別の機構に付することなく、大腸菌のペリプラズム腔の酸化還元電位は充分に 酸化的であり、ドメイン内ジスルフィド結合の生成を可能とするがＨ鏡開のジス ルフィド（おそらく熱力学的に有利でない）は生成させないと思われる。にも・ 　かかわらず、不対ヒンジシスティンを主として遊離のチオールとして有する大 腸菌のペリプラズム腔中に分泌された機能性Ｆａｂ’フラグメントの回収により 、部位指定カップリングのための必須の出発物質が得られる（２３．３２．３３ ）。

本発明者らは、さらに、ｐ１８５””ＥＣＤを溶液からアフィニティー精製する ことを可能とするため、すでに記載されたように（３４）、活性化チオール支持 体上へのｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８　Ｆａｂ’フラグメントの固定化のために遊離チ オールを利用した。遊離ヒンジチオールはまた、蛍光−活性化細胞選別のための 蛍光プローブの付着のために使用した。造影または治療のため放射性核種の部位 特異的付着のために遊離システィンチオールを使用することもこの発明の範囲に 包含される。このことは、抗原結合親和性を損なう危険もなく、所定の化学量論 および付着部位の通常の標識法に対して利点を提供するであろう。

引用文献 １　フェンドリーら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、５０　：１５５０　（１９９０） ２　ハドジアク（Ｒ，Ｍ、　Ｈｕｄｚｉａｋ）ら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉ ｏｌ、　９　：１１６５　（１３　ルブー（Ｒ，Ｌｕｐｕ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ 　２４９　：　１５５２　（１９９０）５　スラモン（Ｄ、　Ｊ　、　Ｓ　ｌａ ｍｏｎ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３５　＋１７７　（１９８７）；スラモンら、 ５ｃｉｅｎｃｅ　２４４　＋　７０７　（１９８９）６、カーター（Ｐ　、　Ｃ ａｒｔｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８９ 　（１０）：４２８５〜９　（１９９２） ７　ジョーンズ（Ｐ、　Ｔ、　Ｊ　ｏｎｅｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３２１　：　 ５２２　（１９８６）：リーチマン（Ｌ、　Ｒ１ｅｃｔ＋ｍａｎｎ）ら、Ｎａｔ ｕｒｅ　３３２　：　３２３　（１９８８）；フェアホーエン（Ｍ、　Ｖｅｒｈ ｏｅｙｅｎ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３９　：１５３４　（１９８８）８、プル メンタール（Ｒ，Ｄ、　Ｂｌｕｗｅｎｔｈａｌ）ら、Ａｄｖ、　Ｄｒｕｇ　Ｄｅ ｌ、　Ｒｅｖ、　４　：　２９、バーハム（Ｐ、　Ｐａｒｈａｍ）　、細胞免疫 学（ウェア（Ｅ、　Ｍ、　Ｗｅｉｒ）編、ブラフ、フラニル・サイエンティフィ ック、カリフォルニア州）第４版、１巻、１４章（１１０　スケラ（Ａ、　５ｋ ｅｒｒａ）およびブリュックツン（Ａ、　Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ）　、５ｃｉｅｎ ｃｅ　２４０　：１０３８　（１９８８）；ベクター（Ｍ、　Ｂｅｔｔｅｒ）ら 、同書、１０４１頁 １１　チヤツクら、Ｇｅｎｅ　４４　：１２１　（１９８６）１２　ピッケン（ Ｒ，Ｎ、　Ｐｉｃｋｅｎ）ら、Ｉｎｆｅｃ、Ｉｍｍｕｎ、４２：２６９　（１９ ８１３　パームおよびヒルンユマン、Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、３５６　 ：　１６７　（１９１４　エリソン（Ｊ　、　Ｗ、　Ｅ　ｌ１ｉｓｏｎ）ら、Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１０　：　４０７１５　ボリノく　（Ｆ 、ＢｏＨｖａｒ）　ら、Ｇｅｎｅ　２：９５　（１９７７）１６　／ヨルティセ ソク（ＳＳ（１１０１ｔｉｓｓｅｋ）　ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ５１５１７　カバット（Ｅ、　Ａ、　Ｋａｂａｔ）ら、免疫学的に重要なタンパ ク質の配列、第３版（国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、１９８７） １８、ウェルズ（Ｊ　、　Ａ、　Ｗｅｌｌ、ｓ）ら、Ｇｅｎｅ　３４　：３１５ 　（１９８５）１９　モーラ−（Ｒ，Ａ、　Ｍａｕｒｅｒ）　、博士論文、バー バード大学（１９８７）２０、ｔｏｎＡ遺伝子を不活化することにより株ＲＶ３ ０８　（参照２２、ＡＴＣＣ１３１６０８）から得た大腸菌株２５Ｆ２中でｈｕ ＭＡｂ４Ｄ５−８　Ｆａｂ゛フラグメントを発現した。最初に１２ｇ　１−１消 化カゼイン、１７ｍＭグルコース、２．４ｍＭイソロイシン塩酸塩、４７ｍＭ　 （ＮＨ４）＊ＳＯ＜、１０ｍＭＮａ　Ｈ２Ｐ　Ｏ＜、１８ｍＭ　ＫｔＨＰＯ４， ４，１ｍＭクエン酸三ナトリウム、１２ｍＭＭｇ５Ｏ，，１２５μＭ　ＦｅＣ＋ 、および各２０μＭのＺｎＳＯ４、Ｍｎ５Ｏ，、Ｃｕ　Ｓ　Ｏｓ、ＣｏＣ１，、 Ｈ３ＢＯ３およびＮａＭｏ０．プラス１２ｍｇ　ヒ１テトラサイクリンを含有す る培地中、低い撹拌速度（６５０ｒｐｍＳＫｌａ〜６００ミリモルＩ”ｈｒ−Ｉ ａｔｍ−’）にて、３７℃で曝気１０リットル発酵槽中、３２〜４０時間細胞を 増殖させ、ｐＨを７．０に維持するためにアンモニアを自動的に供給し、８０〜 １０００Ｄｓｓ。の細胞密度に依存してわずかな過剰を維持または嫌気生活を回 避するためにグルコースも供給した。回収時の細胞密度は、通常、１２０〜１５ ００Ｄａｓｏである。

２１、エルｖン（Ｇ、　Ｌ、　Ｅｌｌｍａｎ）　、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ 、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　８２　：　７０　（１２３　ブレナンら、５ｃｉｅｎｃ ｅ　２２９　：　８１　（１９８５）２４　ラモイ（Ｅ、　Ｌａｍｏｙｉ）ら、 Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１２１　：　６５２　（１９８２５、クレ イトン（Ｔ、　Ｅ、　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）　、タンパク質構造、実際的アプロ ーチ（ＩＲＬブレス、オックスフォード、英国、１９９０）　、１５７頁２６　 マツダイラ（Ｐ、Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ）　、Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅ＋ｎ、２６ ２　：　１００３２７　ムア（Ｓ　、　Ｍｏｏｒｅ）およびスタイ：／　（Ｗ、 　Ｈ，Ｓ　ｔｅｉｎ）　、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、６　：　８１９　 （１９６３） ３２　ブレニー（Ｍ、　Ｊ　、　Ｇ　１ｅｎｎｉｅ）ら１．１．　Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、　１３９　＋　２３６７　（１９８７）、ブレニーら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ 、１４１＋３６６２　（１９８８）３３、ニソタ（Ｔ、　Ｎ１ｔｔａ）ら、Ｊ、 Ｉ＋ｎｍｕｎｏ１．１９　＋１４３７　（１９８９）：ニックら、Ｌａｎｃｅｔ 　３３５　：　３６８　（１９９０）３４、カーターおよびウェルズ、５ｃｉｅ ｎｃｅ　２３７　：　３９４　（１９８７）ＦＩＧ、　７ ．。１２３　４５６７　８　９ ４５　＝　ｍ−ｍｍ　＋Ｆａｂ’、Ｆａｂ国際唄杏報失

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．免疫グロブリンＨ鎖Ｆｖ領域および免疫グロブリンＬ鎖Ｆｖ領域を含有する Ｆｖポリペプチドを組換え徴生物細胞培養液のペリプラズム中に発現および分泌 し、その際、該Ｌ鎖およびＨ鎖はまた不対システイン残基を遊離チオールとして 含み、ついで該システイン残基を遊離チオールとして実質的に維持する条件下で 該ポリペプチドを回収することからなる方法。
2. ２．少なくとも一つのヒンジ領域システインを遊離チオールとして有するＦａｂ ′抗体ポリペプチド（Ｆａｂ′−ＳＨ）の製造法であって、（ａ）Ｆａｂ′を含 む免疫グロブリンプレ配列をコードする核酸（徴生物宿主細胞によって認識され る制御配列に機能的に連結されている）を含むベクターで形質転換した該宿主細 胞中で、宿主細胞のペリプラズム腔ヘのＦａｂ′の分泌およびＦａｂ′−ＳＨの 生成に適した条件下にて該核酸を発現させ；ついで（ｂ）該宿主細胞からＦａｂ ′−ＳＨを回収することを特徴とする方法。
3. ３．工程ｂの間に該Ｆａｂ′−ＳＨを還元条件に暴露しない請求項２に記載の方 法。
4. ４．該Ｆａｂ′−ＳＨがヒンジ領域システインを一つだけ有する請求項２に記載 の方法。
5. ５．該Ｆａｂ′−ＳＨの回収を、ヒンジシステインチオールをプロトン化形態に 維持するのに適した条件下で行う請求項４に記載の方法。
6. ６．形質転換細胞を培養する間に金属イオンキレート試薬を存在させる請求項２ に記載の方法。
7. ７．該Ｆａｂ′−ＳＨの回収の間に金属イオンキレート試薬を存在させる請求項 ２に記載の方法。
8. ８．該Ｆａｂ′−ＳＨの回収の間にプロテアーゼインヒビターを存在させる請求 項２に記載の方法。
9. ９．形質転換細胞を培養する間にプロテアーゼインヒビターを存在させる請求項 ８に記載の方法。
10. １０．該Ｆａｂ′−ＳＨの回収を、宿主細胞を凍結−解凍し、ついでリゾチーム の存在下で浸透ショックに供することにより行う請求項２に記載の方法。
11. １１．Ｆａｂ′がＣ末端アミノ酸配列ＣｙｓＡｌａＡｌａを有する請求項２に記 載の方法。
12. １２．該微生物宿主が大腸菌である請求項２に記載の方法。
13. １３．Ｆ（ａｂ′）２からなるポリペプチドの調製法であって、（ａ）第一Ｆａ ｂ′を含む免疫グロブリンプレ配列をコードする核酸（微生物宿主細胞によって 認識される制御配列に機能的に連結されている）を含むベクターで形質転換した 該宿主細胞中で、宿主細胞のペリプラズム腔ヘの該第一Ｆａｂ′の分泌およびＦ ａｂ′−ＳＨの生成に適した条件下にて該核酸を発現させ（該第−Ｆａｂ′は第 一のエピトープに結合し得る）；（ｂ）第二Ｆａｂ′を含む免疫グロブリンプレ 配列をコードする核酸（微生物宿主細胞によって認識される制御配列に機能的に 連結されている）を含むベクターで形質転換した該宿主細胞中で、宿主細胞のペ リプラズム腔ヘの該第二Ｆａｂ′の分泌およびＦａｂ′−ＳＨの生成に適した条 件下にて該核酸を発現させ（該第二Ｆａｂ′は第二のエピトープに結合し得る） ；（ｃ）該第一Ｆａｂ′−ＳＨおよび第二Ｆａｂ′−ＳＨを該宿主細胞から回収 し；ついで （ｄ）該第一Ｆａｂ′−ＳＨおよび第二Ｆａｂ′−ＳＨのシステインの遊離チオ ール間で共有結合を形成して２価Ｆ（ａｂ′）２を形成させることを特徴とする 方法。
14. １４．該共有結合がジスルフィド結合である請求項１２に記載の方法。
15. １５．該第一Ｆａｂ′−ＳＨと第二Ｆａｂ′−ＳＨとの間の結合形成が下記工程 からなる請求項１３に記載の方法。 （ａ）第一Ｆａｂ′−ＳＨを（ｉ）５，５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸 ）（ＤＴＮＢ）と反応させてチオニトロベンゾエート誘導体Ｆａｂ′−ＴＮＢを 生成させるか、または（ｉｉ）２官能性マレイミドと反応させ；（ｂ）該Ｆａｂ ′−ＴＮＢまたはマレイミド化Ｆａｂ′を第二Ｆａｂ′−ＳＨに直接カップリン グしてＦ（ａｂ′）２を生成させ；ついで（ｃ）該Ｆ（ａｂ′）２を回収する。
16. １６．２つのＦａｂ′によって結合されるエピトープが同じ抗原上に位置する請 求項１２に記載の方法。
17. １７．２つのＦａｂ′によって結合されるエピトープが異なる抗原上に位置する 請求項１２に記載の方法。
18. １８．各Ｆａｂ′が約１ｇ／１を越えるレベルで培地中に存在する請求項１２に 記載の方法。
19. １９．各Ｆａｂ′が、非ヒト免疫グロブリンからの相補性決定領域アミノ酸配列 およびヒト免疫グロブリンからの他のアミノ酸配列からなる請求項１２に記載の 方法。
20. ２０．該アミノ酸配列がＩｇＧから得られたものである請求項１２に記載の方法 。
21. ２１．（ａ）天然のＦｖ領域に認められるジスルフィド結合を除いて、誘導体化 されたスルフヒドリル基を有するシステイン残基を含有するＦ（ａｂ′）２Ｆｖ 領域を本質的に含有せず、 （ｂ）ヒンジ領域の鎖内ジスルフィド結合を有するＦ（ａｂ′）２を全く含有せ ず、（ｃ）混入する亜ヒ酸塩を全く含有せず、および（ｄ）Ｈ鎖のＣ末端アミノ 酸残基に関して全く均一であるＦ（ａｂ′）２を含む組成物。
22. ２２．免疫グロブリンポリペプチドの高収率製造法であって、免疫グロブリンポ リペプチドをコードする核酸で形質転換した宿主細胞を誘導プロモーター／オペ レーター系の転写制御下で培養し、それによって細胞培養液中の誘導後ポリペプ チドレベルが細胞培養液１リットル当たり約１グラム以上のポリペプチドとなる に充分、該ポリペプチドの発現を誘導前に抑制することを特徴とする方法。
23. ２３．該Ｆａｂ′−ＳＨが２以上のヒンジ領域システインを有する請求項２に記 載の方法。
24. ２４．該Ｆａｂ′のＬ鎖とＨ鎖が共有結合により結合していない請求項２に記載 の方法。