JPH02298A - 細胞成長調節物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は血中及び／または生物の体内に存在する細胞の
成長を調節する物質に関する。本発明中には。

細胞の発育、細胞の増殖、細胞の発育の増強、細胞の発
育の制御、および診断、並びに臨床応用に用いることが
できる物質の組成並びに製法に関する。

〔従来の技術〕

高等動物の組織または血液から得られた正常または異常
双方の細胞の生理並びに成長を研究するために、科学者
は、化学的に定められた培養基を用いて試験管内でこれ
等の細胞を発育させるための研究を行ってきた。はとん
どすべての細胞が培養基中で発育するが、増殖すなわち
１発育し分裂するためには、成長因子を必要とする。

一般に、それらの成長因子を供給するために。

血清が用いられる。しかし、血清は、非常に複雑な材料
であシ、多くの物質を含有する。さらに。

血清中の成長因子の濃度は極めて低く、そのために精製
して利用可能な形とすることが極めて困難箒参である。

−収約な文献としては、　Ｓ、に、Ｄｉｎｋａ　Ｇ″Ｇ
ｒｏｗｔｈ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒｓ　
ｉｎ　Ｓｅｒｕｍ　Ｕｓｅｄ　ＦｏｒＩｎ　Ｖｉｔｒｎ
　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　ｎｆ　　Ｃａ１ｌｓ：　　Ｐｒ
１ｎｃｉｐｌｅｓ　　　ａｎｄＴｅｃｈｎｉｑｕｅａ：
　　　Ｉｎ　二Ｅ、Ｋｕｒａｔａｋ：　　Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ　　　ｉｎ　　ｔｈｅＬｉｆｅ　　５ｃｉｅｎ
ｃｅｓ　　ｃ、，Ｓｅｔｔｉｎｇ　Ｕｐ　　ａｎｄ　Ｍ
ａｉｎｔｅｎａｎｃｅｎｆ　Ｔｉ５ｓｕｅ　ａｎｄ　Ｃ
ｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ”１−３３　（１９８５）参
照。

成長因子のある物は、特定の細胞に影響するが。

一方、他の成長因子は、より広いスペクトルの型の細胞
に対して成長を促す。多くの科学者が細胞の成長に関与
する物質を単離し、精製する方法をさがしてきた。いく
つかの物質が、化学的に同定されておシ、それらは２９
４プチドもしくはタンパク質に類する。しかし、その様
な成長因子の精製は、一般に血中の濃度が非常に低いた
め、極めて困難である。この様な複雑な系からの成長因
子の抽出に現在利用できる技術は、一般に大量の血清を
処理するのには不適当である（Ｄ、Ｇｎｓｐｎｄａｒｎ
ｗｉ　ｃｚａｎｄ　　Ｊ、Ｓ、Ｍｎｒａｎ、　　　４５
　　Ａｎｎ、　　Ｒｅｖ、Ｂｉｎｃｈｅｍ、　　５３１
−５８８＋血清からタンパク性の成長因子を分取する為
に利用できる方法は、私の以前の特許である米国特許第
４，１８９，５３５号及び４，４３６．ａ、６号に示さ
れている。前者の特許は、血清タン・ぐりを陰イオン交
換樹脂に吸着させた後、溶液の塩もしくは−を変化させ
る事により成長促進物質を個別に溶出させる方法を示し
ている。後者の特許は、血清または血しょうに過塩素酸
を加え沈澱を得た後、溶液の−を増加することにより成
長因子を抽出する方法を示している。

血液中の成長因子のうちのひとつの群は、ソマトメジン
である。これは、成長ホルモンにより制御されると考え
られる肝臓由来と思われる分子量の大きいタンパク質と
複合した一群の環状ペプチドである。ソマトメジンは、
酸性の環境で分子量の大きい担体タンノクク質から分離
されておりダルトン分子量１０，０００未満の活性ソマ
トメジン分子は、酢酸によりｐｉ−１２，３に酸性化し
たヒト血清の限外ろ過液中に溶液状で存在する事が示さ
れている（　Ｂ、Ｈ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、
、　４８　（２）　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　　ａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏ
ｌｉｓｍ　４２−４９．１９７９　）。

ソマトメジンは、　Ｃｏｈｎの分離のあいだに形成され
た血清タンノククの沈澱中に存在し、更に酸性化するこ
とによｂ、担体タンノ９りから分離する。ソマトメジン
の酸性分離法は、これらの成長促進物質をＣｏｈｈの方
法による血清タンパクの沈澱から分離する種々の方法中
で用いられている（　Ｈ，Ｂｕｄｒｇｉｅｔ　ａｌ、　
１２１　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ
、　３４９−３５９゜１９６６　：　Ｋｎｕｔ　Ｕｔｈ
ｎｅ、　１７５　Ａｃｔａ　７ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙ（５ｕｐｐｌ　）　１−３５ｔ　１９７３　：　Ｅ、
　Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｅｈｔ　ａｎｄＲ，Ｅ、　Ｈｕｍ
ｂｌｅ、　７３（７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎｔｌ、　Ａｅａ
ｄ、　Ｓｅｔ、　Ｕ。

Ｓ、Ａ、　２３６５−２３６９．１９７６　）。

血液凝固の過程だおいて、血液中血小板から成長因子が
放出される。研究者によっては、血清中の成長促進物質
の主要な部分が、血小板由来であるとしている（例えば
、　Ｒ，Ｒｏｓｓ　ａｎｄ　Ａ、　Ｖｏｇｅｌ。

１４　Ｃｅ１ｌ　２０３−２１０．１９７８参照）。成
長因子にょっては血清中の全タンパクのうちのわずかの
部分しか説明できないということから、研究者は、イオ
ン交換クロマトグラフ法を用いて溶解した洗浄血小板か
ら、血ｌＪｎ性成長因子を分離してきた。Ｃ，Ｈ。

Ｈｅ１ｄｉｎ等は、　１０９　Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒ
ｅｓ、　４２９−４３７゜１９７７中で、それぞれダル
トン分子量が４０．０００及び１０，０００以下のふた
つの陰性部分及びダルトン分子量が、２５，０００から
３５，０００の混合陽性部分が活性を有すると述べてい
る。Ｒｏｓｓ等は２分子量１０．０００から３０．００
０の陽イオン部分を分離した（　Ｈｏｒｍｏｎｅｓ　ａ
ｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　Ｂｏｏｋ　Ａ、　
Ｅｄｓ。

Ｇ、Ｈ，５ａｔｏ　ａｎｄ　Ｒ，Ｒｏｓｓ、　ｐｐ３−
１６　（Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａ／１ｏｒｙ＋　１９７９））。更に１ａ０００か
ら１８．０００ダルトンの分子に分裂活性が示されてい
る。

これらの血小板由来の成長因子は細胞の成長を促進する
為に使用されてきた。しかし、これらの成長因子が有効
であるためには、血小板除去血清とともに使用しなけれ
ばならない。

研究者のグループのいくつかは、血液中に一種以上の成
長因子が含まれる点について意見が一致している。この
ことから、細胞分裂活性を有する分子の広いグループを
他の血液タンパクから分離する実用的な方法の開発が望
まれる。更に全血清または血しょうの代わりに精製され
た成長物質を使うという利点があるといった実際的な多
くの適用分野があるだけでなく、成長物質を利用できる
事によｂ、細胞成長の制御の新しい応用分野を開くこと
ができる。精製された成長物質を利用することが非常に
有益である分野の中には、新生物疾患、小人症、神経発
達、細胞免疫、移植（組織移植）、創傷治療、ビールス
に対するワクチンの生産における血清の代用、特定の生
物活性のある分子の生産（例えば、ウロキナーゼ、イン
ターフェロン、モノクロナール抗体等）、畜産において
成長を促進し保持するといった血清もしくは血しょうが
細胞分裂に必要とされる全ての場合が含まれる。

これらの１成長因子”に関する知識が増加することによ
ｂ、細胞成長の制御に関する我々の知識が増加するだろ
う。精製された因子が利用できることによｂ、新生物疾
患１発育及び成熟、加令。

創傷治療及び組織の再生のみならず細胞の成長及び成長
の制御に関する全ての分野に関する研究が促進される。

これらの因子は生物活性を有する分子例えばビールスの
ワクチン、組織プラスミノ−ｒン活性化因子（ＴＰＡ　
）　、ウロキナーゼ、モノクロナール抗体等のは乳類及
び鶏の細胞を利用した生産のような高等動物の真核細胞
を使用した生命。

工学において必須である。

これまで動物並びにヒトにおいて小さな化合物として存
在する成長因子の同定に研究が集中していた。本発明は
、成長促進及び阻害物質が血清。

血しょう又は他の体液例えば母乳、唾液及び脳を髄液中
に糖タンパク質の形で存在するという新しい発見にもと
すく。ここでは炭水化物部分及びその構成が重要な役割
を果たす。

〔発明の目的〕

本発明は血清、血しょう又はその他の体液或はそれらか
ら分離された抽出部分から得られる細胞の成長の調節（
即ち成長の活性化或は阻害）に適する物質、これらの物
質の製法又は生産並びにこれら物質を得る方法に関する
。

〔発明の構成〕

細胞の成長調節物質の取得方法について本方法はレクチ
ン（特定の炭水化物部分に特異的に且つ可逆的に結合す
るタンノＪ？り質）を生物的溶液から特定の成長因子を
親和結合させる為に用いる。適当なレクチンは通常１例
えば小麦麦芽レクチン、キャスタービーンレクチン、赤
いんば豆レクチン、コンカナバリンＡ、大豆レクチン、
えんどう豆レクチン等の様に植物物質から製造される。

レクチンは、特定の炭水化物に結合させる為に遊離又は
非遊離の形（クロマトグラフィー）で用いることが出来
る。因子はレクチン抑制糖を用い、その濃度を増加させ
ながら、又は高濃度で及び／又はイオン濃度を増加させ
たシ、溶液の−をかえたり又は変性剤を用いて抽出され
る。時にはほう酸塩を用い或は上記の要因を組み合わせ
る。

因子又は細胞の成長調節物質は２８０　ｎｍの波長で光
を吸収する。細胞の成長調節物質（活性化物質又は阻害
物質）は、凍結乾燥することもできる。

細胞の成長調節物質は生理的溶液中で適用される。

細胞成長増強物質Ｅの取得方法について赤血球製剤、増
強物質”Ｅ″は、凍結及び解凍による又は蒸留水中での
分散或はその他の従来の又は適当な手段により細胞を崩
壊させることによって得られる。遠心分離後抽出した生
理的溶液中の上澄み液を種々応用するために細胞の成長
活性化物質と結合させる。

増強物質“Ｅ＃は、それだけでは殆ど或は全く細胞の成
長促進活性を有していないが９通常レクチン又は他の手
段により得られた細胞の成長活性物質と共に用いること
により特定の細胞の成長を数倍増強させる。

次のデータは方法論と装置を述べた細胞成長促進或は阻
害物質の特定の実施例である。このデータは、実施例と
して示しただけであり１本発明の限定を意味するもので
もない。

操作の原理 特定のレクチンは種々の炭水化物とおよび、糖付加蛋白
質または糖蛋白質の一部分またはそれに付加したオリゴ
糖鎖中の炭水化物と特異的に結合する。この炭水化物個
有結合性は、オリが糖の炭水化物構成および、結合に対
する情報１例えば。

糖蛋白質中の炭水化物部分の構造的特異性に関する情報
を与える。特定のレクチンと結合すること。

レクチンの結合部位個有の炭水化物により成長活性化物
質が溶出することは、それ等が糖タンパク質であること
を示す。ここでは１個有の炭水化物部分及びその構造的
成り立ちが結合の為に本質的条件となる。この特異性が
種々の成長調整物質を区別する基盤を提供し、細胞型に
特有な生物学的活性を定めることを助ける。レクチン個
有の炭水化物構成と、細胞成長促進または阻害作用の特
異性の間の関係を基に９種々の細胞成長活性化物質およ
び阻害物質を特徴づけることは鋭敏な方法である。

以下忌日 〔実施例〕 実施例１．小麦麦芽レクチンクロマトグラフィー（炭水
化物選択性：）ＩＪ−Ｎ−アセチル−〇−グルコースア
ミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸）。

市販の有効な小麦麦芽アガローズのスラリーをクロマト
グラフィーのカラムに導入し、開始緩衝液（本実施例で
は０．０２　Ｍ　ＴｒｉｌＩ−ＨＣＬ緩衝液と０．１　
ＭＮａＣ２ｅＰＨ７−４）で平衡にする。開始緩衝液で
透析した使用する生物的液体（本実施例では血清に由来
する血しょう）をカラムに導入する。その物質を用いた
後カラムを開始緩衝液で洗浄し特に目的としていない吸
着物質を取シ除く。１次いで同じ緩衝液中の０．５　Ｍ
ＮａＣ４で弱吸着物質を溶出させる。

そして溶出液の２８０　ｎｍの吸収が殆ど無くなったト
キｅ　ｏ、　ｓ　Ｍ　Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコースア
ミンにより同じ緩衝液中で溶出する。グラフ（図ＩＡ）
はｐ　Ｎ−７セチルーＤ−グルコースアミンの溶出した
抽出液の２８０　ｎｍにおける相対的な高吸収を示して
いる。この抽出液は０．８５％ＮａＣ４で透析し、無菌
の０．２ミクロン膜フイルタを透過させる。

約９チ無菌試料並びに１　％　（Ｖ／Ｖ　）の増強剤″
′Ｅ”（実施例５参照）を合成培養基（特定の細胞に通
常用いる）に加え異なる細胞の型についての細胞の成長
促進活性を試験する（図ＩＢ）。

細胞の成長促進活性は３７℃における適当時間の保温の
後赤血球計を用いて測定される。

グラフ（図ＩＣ）は２個のフラクションの、細胞の型に
特有の活性の顕著な差異を示している。

又赤血球由来の増強物質の、細胞の活性に対する顕著な
効果も示している。

実Ｍ例２．　　コンカナバリンＡレクチンクロマトグラ
フィー（炭化水素選択性＝Ｄ−マンノース、Ｄ−グルコ
ース及び立体的関係を有する糖類）市販のコンカナバリ
ンＡセファローズのスラリーヲクロマトグラフィーのカ
ラムに導入し、開始緩衝液（本実施例では０．０２　Ｍ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ緩衝液と０．５　Ｍ　Ｎａｃ、゜ｐ
Ｈ７，４）で平衡にする。開始緩衝液で透析した使用す
る生物的液体（本実施例では血清に由来する血しょう）
をカラムに導入する。その物質を導入した後、カラムを
開始緩衝液で洗浄し吸着されていない物質を取り除く、
その後２８０　ｎｍの吸収が減少すると、特定の吸着物
質を溶出するためコンカナバリンに対する親和力の順に
特定の糖類を順次導入する。

グラフ（図２Ａ）は、ダルコース、メチル−グルコピラ
ノシドを用いた後の高吸収とメチル−マンノピラノシド
を用いた後のかなり低い吸収を示している。抽出液は０
．８５　’Ｉｒ　ＮａＣＬで透析し、無菌の０．２ミク
ロン膜フィルターを透過させる。

約９％（ｖ／ｖ）の濃度の抽出試料のみ及び約１％（ｖ
／ｖ）の増強剤１Ｅ”（実施例５参照）を加えた約９％
の濃度の抽出試料を合成培養基に加え。

異なる細胞の型についての細胞の成長促進活性を試験す
る（図２Ｂ）。

細胞の成長促進活性は３７℃における適当時間の保温の
後赤血球計を用いて測定する。グラフ（図２Ｃ）は３個
の抽出液中の、細胞の型に特有の活性の顕著な差・異を
示している。又赤血球由来の増加物質”Ｅ”のいくつか
の細胞の活性に対する顕著な効果も示している。

実施例３　キャスタービーンレクチン−１２０クロマト
グラフイー（炭化水素選択性＝Ｄ−ガラクトース）市販
のキャスタービーンレクチン−１２０アガロースのスラ
リーをクロマトグラフィーのカラムに導入し、開始緩衝
液（本実施例では０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈｃ、緩衝液
と０．５　Ｍ　ＮａＣｔ、　ｐＨ７，４）で平衡にする
。開始緩衝液で透析した使用する生物的液体（本実施例
では血清に由来する血しょう）をカラムに導入する。そ
の物質を導入した後、カラムを開始緩衝液で洗浄し吸着
されていない物質を取シ除く、その後２８０　ｎｍの吸
収が減少すると特定の吸着物質を溶出させるためにキャ
スタービーン−１２０に親和力の大きい特定の糖類を導
入するグラフ（図３Ａ）は。

ガラクトースを用いた後の高吸収を示している。

抽出液は０．８５％、ＮａＣｔで透析し、無菌の０．２
ミクロン膜フィルターを透過させる。

約９％（ｖ／ｖ　）の濃度の抽出試料のみ及び約１％　
（ｖ／ｖ　）の増強剤“Ｅ”（実施例５参照）を加えた
約９％の濃度の抽出試料を合成培養基に加え異なる細胞
の型についての細胞の成長促進活性を試験する（図３８
） 細胞の成長促進活性は３７℃における適当時間の保温の
後赤血球計を用いて測定する。

グラフ（図３Ｃ）は活性の顕著な差異を示している。ウ
シの胎児の血清は、成長が非常に遅いＣＣＤ−１８Ｃｏ
細胞を除き試験した全ての細胞の非常に良好な成長を助
けていた。コントロールのみの合成培養基中でさえ、１
０例のうち６例の細胞が試験期間中残存していた。Ｄ（
＋）ガラクトース抽出液を用いると２４時間以内に全て
の細胞が死滅した。

実施例４　大豆レクチンクロマトグラフィー（炭化水素
選択性二Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクト−サミン及びＤ−
がラクトース） 市販の大豆レクチン−のスラリーをクロマトグラフィー
のカラムに導入し、開始緩衝液（本実施例では０．０２
　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液とＯ；　５　Ｍ　ＮａＣ
Ｌ、　ｐＨ７）で平衡にする。開始緩衝液で透析した使
用する生物的液体（本実施例では血清に由来する血しょ
う）をカラムに導入する。その物質を導入した後カラム
を開始緩衝液で洗浄し吸・着されていない物質を取り除
く。その後２８０　ｎｍの吸収が減少すると特定の吸着
物質を溶出させるために、大豆レクチンに対する親和力
の順に特定の糖類を順次導入する。

グラフ（図４Ａ）は、ガラクトースを用いた後の高吸収
を示している。メチル−ガラクトピラノシドを加えた後
吸収は低下するが、Ｎ−アセチル−グルコ−サミンを用
いると再び増加する。抽出液は０．８５４　ＮａＣＬで
透析し、無菌の０．２ミクロン膜フィルターを透過させ
る。

約９　％　（ｖ／ｖ　）の濃度の抽出試料のみ及び約１
％（ｖ／ｖ）の増強剤″′Ｅ”（実施例５参照）を加え
た約９％の濃度の抽出試料を合成培養基に加え異なる細
胞の型についての細胞の成長促進活性を試験する。

細胞の成長促進活性は３７℃における適、当時間の保温
の後凝固及び染色後形成した細胞板の細胞群の数を数え
ることにより測定する。

グラフ（図４０）は活性の顕著な差異を示している。合
成培養基のみを含むコントロール中で。

細胞が試験期間中残存していた。ウシの胎児の血清は試
験をした全ての細胞についての非常に良好な成長を助け
る。高濃度の塩化ナトリウム＋　Ｄ（＋）ガラクトース
（２個の抽出液）及びＮ−アセチル−Ｄ−ガラクト−サ
ミン抽出液を用いると２４時間以内に全ての細胞が死滅
した。

実施例５ 実施何重ないし４で概説した方法をえんどう豆を用いて
繰り返す、細胞の成長を促進する糖タン、ｐｅり質抽出
液は、フコースによる溶出から生成する。

実施例６　増強剤″′Ｅ” 抗凝固剤（例えばクエン酸す）　ＩＪクム）を含有する
血液を遠心分離する。細胞質状物質及び血小板の沈澱の
上層部とともに、血しょうを注意深く取シ除く、赤血球
沈澱を０．８５％塩化ナトリウム溶液中で注意深く再懸
濁し再度遠心分離する。上澄み液を取り除き、赤血球沈
澱を０．８５％塩化ナトリウム溶液中で再懸濁し、遠心
分離する。上澄み液を取シ除き、赤血球沈澱を赤血球沈
澱の塊の２倍の量の０．８５％塩化ナトリウム溶液中（
赤血球の量プラス２倍の量０．８５％塩化ナトリウム溶
液）で再懸濁する。

懸濁液は血小板が無いか調べる。赤血球懸濁液が血小板
を含む場合は次いで洗浄する。赤血球懸濁液に血小板が
無くなったら、細胞を崩壊させる為に赤血球の塊にその
６倍の蒸留水を加える。全ての細胞が溶解したら、濃縮
塩化ナトリウム溶液を、塩化ナトリウムの濃度が懸濁液
の０．８５％にそして赤血球の塊の希釈が１：１０にな
るように加える（赤血球の量が１．０．８５％塩化ナト
リ９ムの量が９）。

別　法： 赤血球の量に０．８５％塩化ナトリウムの量９を加え細
胞を再懸濁する。再懸濁した赤血球を３回凍結、解凍す
る。溶解した赤血球懸濁液（適当な方法で得た）を遠心
分離する。上澄み液を取°シ出ｂ、０．２ミクロンのフ
ィルターでろ過する。得られた増強剤″′Ｅ”を１；１
０の希釈で冷凍保存する。

次の表は上記実施例で用いた細胞を記載したものである
。

ＡＴＣＣＮｏ、　　　　　　　　　　　細　　　胞ＣＲ
Ｌ　１５ａ、５Ｐ２１０−　Ａｇ１４　　ハイプリ←、
非分泌型マウスＣＲＬ　１５８０　Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ　
８．６５３　　骨髄腫、非分泌型マウスＣＲＬ　２１５
５　ＷＩＬ２−ＮＳ　　　　　リンパ芽球、非分泌型変
種、ヒトＴＩＢ　　１９５　ＣＥＭ−０Ｍ３　　　　　
　　リンノぐ芽球性白血病、ヒト上皮細胞、同上 ｎｏｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ グラフ（図ＩＣ，２Ｃ，３Ｃ及び４Ｃ）にみられる様に
、異なるレクチン選択性細胞の成長及び／又は阻害物質
は相当に特定の細胞の型の成長を促進及び阻害する。こ
のことは９選択的な細胞の成長の促進及び阻害物質を単
離する為にいかにレクチンを使用できるかということを
示している。

上記の結果、Ｄ−グルコースｔトリ−Ｎ−アセチル−Ｄ
−グルコーサミド、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｄ−マ
ンノース、フコース、及びソレラの立体異性体と特異的
に結合するレクチンによって体液から単離された成長調
節物質が細胞の成長の促進活性を有するということが見
いだされたことを示している。これらの結果は又Ｄ−ガ
ラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−がラクト−サミン及び
それらの立体異性体と特異的に結合するレクチンによっ
て体液から単離された成長調節物質が細胞の成長を阻害
する性質を有することが見いだされたことを示している
。これらの細胞の成長活性化剤又は阻害剤は広範囲の応
用に有用である。上に述べたように単独でも増強剤″′
Ｅ”と組み合わせて、も、試験管内の細胞培養基に代用
して用いることが出来る。それゆえそれらは、ウシの胎
児の血清の様な高価でいつも少ない培養基の代わりに使
用できる。ポリクロナールおよびモノクロナール型のよ
うな固有の抗体を細胞成長調節物質に対して一般的な方
法により、高めることができる（　Ｇ。

Ｋｏｈｌｅｒ　　ａｎｄ　　Ｃ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　
　２５６　　Ｎａｔｕｒｅ　　４９５（１９７５））、
これらの抗体は免疫沈澱または免疫親和性クロマトグラ
フィーにより、特定の細胞成長調節物質を分離し、さら
に精製するのに有用である。

さらに、これらの特定の抗体を直接または間接的に放射
性同位元素、酵素、螢光体、螢光体により標識化を行い
９診断、検出、定量分析及び病理化学に用いることがで
きる。例えば、何人かの研究者は種々の成長促進物質と
ある種の疾患例えばガンとの関連を研究して来ている。

抗体を細胞成長伝達物質の存在または定量に用いること
により。

それらの状態を診断することが出来る。

これらの細胞成長促進物質および阻害物質はさらに細胞
成長の操作、細胞の成長促進に対し、細胞の種類によっ
て単独または特定の組み合わせにより使用することが出
来る。更に、利用法として。

細胞の分別、生物活性を有する分子例えば、ビールスワ
クチン、　ＩＰＡ　（組織プラスミノ−ｒン活性化物質
）、ウロキナーゼおよびモノクロナール抗体の生産があ
る。

それらは自然の（本質的には変化していない）生物学的
な物質であシ、試験管内と生体内で本質的に同じ作用を
有しておシ、成長障害や過形成疾患、創傷治癒及び組織
の再生に於て診断または治療に臨床的に用いることが出
来る。それ等は、健常人および９種々の腫瘍に侵されて
いる患者について、成長および加令について、それ等の
有無ならびに濃度との関連を見出すことによｂ、有用に
なる。最後に、それ等は動物の健康及び畜産に於て２例
えば増殖及び急速な成長を行なうことにより利用できる
。

本発明は選択した範囲について述べているが、専問家で
ちれば容易に理解出来る様な修正や変法は。

本発明の主旨及び目的から離れないで実施され得るもの
である。その様な修正や変化は２本発明及び付属する特
許請求の範囲及び目的に含まれると見なされる。

【図面の簡単な説明】

図ＩＡから図ＩＣは、小麦麦芽レクチンクロマトグラフ
ィーにより得らｎた結果を表す。図ＩＡは、試料の２８
０ｎｍにおける紫外線吸収スイクトラムを表す。グラフ
はＦｒ、＆ｌ及びＦｒ、Ａ２とラベルされた二つのフラ
クションを示している。こｎらフラクションは分離、収
集さｎ、生理的食塩水で透析され、０．２ミクロンの無
菌フィルターでろ過される。 図ＩＢは成長促進試験に用いらｎた９個の異なる細胞列
を示す。明部は細胞成長増強物質″′Ｅ″の含まｎない
培養基をそして暗部は細胞成長増強物質“Ｅ”を含む培
養基を表す。 図ＩＣはＦｒａ　Ａ　１及びＦｒａ　Ａ　２　（図ＩＡ
参照）で成長した図ＩＢの９個の細胞列の細胞の成長を
表す棒グラフである。この細胞列は３７℃で適当な時間
保温さｎ次いでＸ　１０５／　１１１６細胞数を数えた
。 図ＩＣにおいてＦｒ、　Ａ　１及びＦｒ、Ａ２それぞれ
左から右の各細胞（ａからｉ）はそれｔ’ｎ図ＩＢの上
から下の細胞列（ａから五）に対応する。図ＩＢと同様
に２図ＩＣの棒グラフの明部も細胞成長増強物質“Ｅ”
を含まない培養基中の細胞の成長にそして暗部は細胞成
長増強物質″′Ｅ″を含む培養基中の細胞の成長に対応
する。 図２Ａから図２０は、コンカナバリンＡレクチンクロマ
トグラフィーで得られた結果を示す図２Ａは、試料の２
８０ｎｍにおける紫外線吸収スペクトラムを表す。グラ
フはＦｒ、ＡＩからＦｒ、　＆　８とラベルされた８個
のフラクションを示している。こｎらのフラクションは
９分離、収集さｎ、生理的食塩水で透析さ７１，０．２
ミクロンでろ過された。 図２Ｂは成長促進試験で用いらｎた９個の異る細胞列を
示す。明部は細胞成長増強物質″′Ｅ”を含まない培養
基中の細胞の成長を示し、暗部は細胞成長増強物質”Ｅ
”を含む培養基中の細胞の成長を示す。 図２ＣはＦｒ、　＆　２　ｅ　Ｆｒａ　Ａ　４及びＦｒ
、　Ａ８　（図２Ａ参照）で成長した図２Ｂの９個の細
胞列の細胞の成長を表す棒グラフである。この細胞列は
３７℃で適当な時間保温さｎ次いで×１０５／ｒｎｌ細
胞数を数えた。図２ＣにおいてＦｒ、　Ａ　２　、　Ｆ
ｒ、　Ａ４及びＦｒ、Ａ８のそｆｉ−１’＋ｎ左から右
の各細胞列（ａからｉ）はそれぞｎ図２Ｂの上から下の
細胞列（ａから１）に対応する。図２Ｂと同様に１図２
０の棒グラフの明部も細胞成長増強物質“Ｅ″を含まな
い培養基中の細胞の成長にそして暗部は細胞成長増強物
質“Ｅ”を含む培養基中の細胞の成長に対応する。 図３Ａから図３０は、キャスタービーンレクチンクロマ
トグラフィーで得らｎた結果を示す。図３Ａは、試料の
２８０ｎｍにおける紫外線吸収スペクトラムを表す。グ
ラフはＦｒ、　Ａ　１及びＦｒ、　Ａ　２とラベルされ
た２個のフラクションを示している。 これらのフラクションは９分離、収集され、生理的食塩
水で透析さ−ｎ、ｏ、２ミクロンでろ過された。 図３Ｂは成長促進試験で用いられた１０個の異る細胞列
金示す。明部は細胞成長増強物質″′Ｅ”を含まない培
養基中の細胞の成長を示し、暗部は細胞成長増強物質“
Ｅ”を含む培養基中の細胞の成長を示す。 図３０はウシの胎児の血清による成長及びコントロール
としての（合成）培養基のみ並びにＦｒ。 煮１及びＦｒ、　Ａ　２　（図３Ａ参照）で成長した図
３Ｂの１０個の細胞列の細胞の成長或は成長の欠如を表
す棒グラフである。この細胞列は３７℃で適当な時間保
温さｎ次いでＸＩＯ’／ｍｌ細胞数を数えた。 ウシの胎児の血清、　Ｆｒ、　＆　１　＃　Ｆｒ、　Ａ
　２及び培養基のみのそれぞｎ左から右の細胞列（ａか
らｊ）はそれぞ１図３Ｂの上から下の細胞列（ａからｊ
〕に対応する。図３Ｂと同様に９図３Ｃの棒グラフの明
部も細胞成長増強物質“Ｅ”を含まない培養基中の細胞
の成長にそして暗部は細胞成長増強物質“Ｅ″を含む培
養基中の細胞の成長に対応する。 図４Ａから図４０は、大豆レクチンクロマトグラフィー
で得らｎた結果を示す。図４Ａは、試料の２８０ｎｍに
おける紫外線吸収スペクトラムを表す。グラフはＦｒ、
　／ａ　１　、　Ｆｒ、　Ａ　２　、　Ｆｒ、　＆　３
及びＦｒ、Ａ４とラベルされた４個のフラクションを示
している。こｎらのフラクションは９分離、収集さｎ、
生理的食塩水で透析さ；ｎ、０．２ミクロンでろ過され
た。 図４Ｂは成長促進試験で用いられた異なる２個の細胞列
を示す。明部は細胞成長増強物質″′Ｅ”を含まない培
養基中の細胞の成長を示し、暗部は細胞成長増強物質”
Ｅ”を含む培養基中の細胞の成長を示す。 図４Ｃは（合成）培養基のみ及びコントロールとしてウ
シの胎児の血清を含む培養基並びにＦｒ。 Ａ　Ｉ　Ｔ　Ｆｒａ　＆　２　＋　Ｆｒ−Ａ　３及びＦ
ｒ、　Ａ　４　（図４Ａ参照）で成長した図４Ｂの２個
の細胞列の細胞の成長或は成長の欠如を表す棒グラフで
ある。この細胞列は３７℃で適当な時間保温さｎ次いで
ＸＩＯ’／ｍＪ細胞数を数えた。ウシの胎児の血清。 Ｆｒ、　Ａ　ｌ　、　Ｆｒ、煮２及び培養基のみのそれ
ぞｎ左から右の細胞列（ａ及びｂ）はそれぞｎ図４Ｂの
上から下の細胞列（ａ及びｂ）に対応する。図４Ｂと同
様に２図４Ｃの棒グラフの明部も細胞成長増強物質“Ｅ
′″を含まない培養基中の細胞の成長にそして暗部は細
胞成長増強物質“Ｅ”を含む培養基中の細胞の成長に対
応する。 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　ＩＡ ＦＩＧ、　２Ａ ＦＩＧ、　３Ａ トＩＧ。 Ｃ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ａ、体液のサンプルを提供する； ｂ、炭水化物と可逆的に結合するレクチンと体液を反応
   させる； ｃ、体液から反応レクチンと炭水化物を分離する；そし
   て ｄ、レクチンと結合している炭水化物を溶出し収集する
   ； よりなり、溶出されたレクチンにより収集された炭水化
   物は細胞成長調節物質を構成する血清、血しょう及びそ
   の他の体液から単離された細胞成長調節物質。 ２、細胞成長調節物質の分離に用いられるレクチンが小
   麦麦芽レクチン、コンカナバリンＡ、キャスタービーン
   レクチン、大豆レクチン、赤いんげん豆レクチン及びえ
   んどう豆レクチンからなるグループから選択される特許
   請求の範囲第１項記載の細胞成長調節物質。３、ａ、体
   液の試料の用意 ｂ、体液をレクチンと反応させ、該当レクチンは可逆的
   に糖蛋白質に結合する ｃ、体液からのレクチンの分離 ｄ、レクチンからの糖蛋白の溶出、及び ｅ、細胞成長調節作用を有する糖蛋白の集収により構成
   される糖蛋白物質成長調節物質の製造方法。 ４、特許請求の範囲第３項記載の糖蛋白質性の細胞成長
   調節物質。 ５、血清および血しょうより成る体液のグループを用い
   た特許請求の範囲第３項記載の糖蛋白質性の細胞成長調
   節物質の製造方法。 ６、小麦麦芽レクチン、コンカナバリンＡ、キャスター
   ビーンレクチン、大豆レクチン、えんどう豆レクチンよ
   り成る一群より選ばれたレクチンを使用した特許請求の
   範囲第３項記載の製造方法。 ７、成長促進作用を有する、特許請求の範囲第１項記載
   の細胞の成長調整物質。 ８、成長阻害作用を有する特許請求の範囲第１項記載の
   細胞の成長調整物質。 ９、特許請求の範囲第７項記載の細胞成長調節物質の成
   長促進に有効な量と、合成培養基を混合し、試験管内で
   細胞を成長させるのに有用な組成を有する培養基。 １０、赤血球を崩壊し、上澄を細胞残渣から分離するこ
   とによって得られる細胞成長増強物質“Ｅ”の成長に対
   して有効な量を、特許請求の範囲第９項に述べた培養基
   に更に加えた培養基。 １１、細胞成長調節物質の、成長阻害に有効な量と、合
   成培養基を混合し、試験管内で細胞を阻害するのに有用
   な組成を有する特許請求の範囲第８項記載の培養基。 １２、赤血球を崩壊し、上澄を細胞残渣から分離するこ
   とによって得られる細胞成長増強物質“Ｅ”の、成長に
   対して有効な量を特許請求の範囲第１１項に述べた培養
   基に更に加えた培養基。 １３、特許請求の範囲第１項に述べた細胞の成長調節物
   質の、成長促進に有効な量を、生理的に許容できる担体
   と共に創傷に投与することにより、創傷治癒を促進する
   方法。 １４、ａ、糖蛋白質； ｂ、体液内に存在する； ｃ、糖蛋白質の糖付加部分に結合するレクチンにより、
   体液より精製される；および ｄ、約２８０ｎｍの波長で光を吸収する成長促進性の調
   節物質。 １５、下記より成る成長阻害物質； ａ、糖蛋白質； ｂ、体液内に存在する； ｃ、糖蛋白質の糖付加部分に結合するレクチンにより、
   体液より精製される；および ｄ、約２８０ｎｍの波長で光を吸収する １６、下記の操作により得られる細胞成長増強物質Ｅ； ａ、赤血球の試料の作成 ｂ、上記試料中の赤血球の崩壊；および ｃ、上記試料よりの赤血球の除去； ここで、当該増強物質Ｅ、単独では、ほとんど或は全く
   細胞の成長促進作用を有しない。しかし、細胞成長活性
   化物質と混合されると、この細胞成長活性化物質に依る
   細胞の成長を増強する。 １７、細胞成長活性化物質： ａ、体液中に見出される； ｂ、Ｄ−グルコース、トリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコ
   ースアミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｄ−マンノー
   ス、フコースおよび それ等の立体異性体と特異的に結合するレクチンにより
   体液から精製される；および ｃ、波長２８０ｎｍで光を吸収する よりなる細胞成長活性化物質。 １８、ａ、体液中に見出される； ｂ、Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトー
   スアミンおよびそれ等の立体異性体に特異的に結合する
   レクチンにより体液から精製される；および ｃ、波長２８０ｎｍで光を吸収する細胞成長阻害物質。 １９、特許請求の範囲第７項に述べられた成長促進性の
   細胞成長調整物質。ここで、体液と反応させるレクチン
   はＤ−グルコース、トリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコー
   スアミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｄ−マンノース
   、フコースおよびそれ等の立体異性体と特異的に反応す
   る。