JPH03505575A - 幹細胞阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 幹細胞阻害剤 本発明は幹細胞（ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）阻害剤に関し、特に癌化学療法の管理の 改善に関する。

癌の化学療法の際の細胞周期（ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ）に活性である細胞毒性薬 物の臨床的使用には、骨髄の形成不全（ａｐｌａｓｉａ）が制限因子を表すこと は周知である。化学療法の現在の方法は、細胞毒性薬物で処置する間に造血性幹 細胞を保護することが可能であれば改善できることが多年に亙って認められてい たが、この分野における広範な研究にも拘らず、制御し易い由来源からの適度に 特異的な阻害剤は従来見出されていない。この進歩の欠如の一つの理由は、幹細 胞の調節を制御する適当な試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）アッセイの困難にある と考えられている。

癌化学療法に使用される細胞周期特異性薬物に対して幹細胞を保護するように造 血幹細胞と作用する能力を有する、或種のマクロファージ細胞系統（ｃｅｌｌ　 １ｉｎｅ）から得られる蛋白質様物質を単離し同定することが本発明者等により 新規に可能となった。

従って本発明は下記の性質を有することを特徴とする造血性幹細胞阻害剤を提供 する：即ち； １、阻害剤活性はトリプシンによる分解に感受性があり、従って阻害剤は蛋白質 様である。

２、阻害剤は陰イオン交換体での処理により部分的に精製された時に、分子量分 析用樹脂上で４５−６０Ｋｄの範囲の分子量を示す。

３、阻害剤は還元性条件を用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動上で単一のバ ンドとなるまで精製されると、８−１０Ｋｄの分子量範囲を示し、非還元条件下 では僅かに高い分子量を示す。

４、阻害剤は下記： （ｉ）阻害剤活性は３７℃、５５℃及び７５℃で１時間加熱後も保存される、 （ｉｆ）阻害剤活性は１００℃で１０分間加熱後も保存される、のように熱−安 定性である。

５、阻害剤は陰イオン交換体と結合し、０．２６及び０．２８モルの間のＮａＣ １の塩類グラジェントで溶離される。

６、阻害剤はヘパリン・セファロース・アフィニティークロマトグラフィー樹脂 に結合し、該樹脂から１モルの塩化ナトリウム緩衝液で溶離できる。

７、阻害剤はブルー・セファロース・アフィニティークロマトグラフィー樹脂に 強く結合し、５Ｍ塩化マグネシウムで樹脂から溶離できる。

８、細胞周期中の幹細胞が部分的に精製された阻害剤で処理された時には、シト シンアラビノシドの作用に抵抗性となる。処理された幹細胞が次いで細胞毒性薬 物及び阻害剤を除去するために食塩緩衝液で洗浄されると、生存する幹細胞は培 養基中で正常な増殖を示す。

阻害剤の単離及び同定は幹細胞調節体を制御する試験管内アッセイの開発により 初めて容易となった。細胞周期中の前駆体細胞（幹細胞ではなく、もっと成熟し た細胞）は阻害剤により影響を受けない。このアッセイに精製された阻害剤を直 接添加すると、巨視的なコロニーの発現の阻害をもたらすが、アッセイ中の他の コロニーには影響しない。

試験管内幹細胞（ＣＦＵ−Ａ）アッセイ試験管内幹細胞の検出のために、２５％ の牛又は馬の胎児の血清及び０．３％の寒天を含む、補充されたアルファー変形 最小必須培地（ＭＥＭ）４ｍＡ中の１０４の骨髄細胞を、５　ｃｍのペトリ皿に 容れた、０．６％の寒天、１０％のＬ９２９細胞順化（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ）培地（Ｌ９２９ＣＭ。

成長因子Ｃ３Ｆ−１の源）及び１０％のＡＰＩ−１９Ｔ細胞順化培地（ＡＰＩ、 −１０００ＭＸ成長因子ＧＭ−Ｃ３Ｆ及び他の未特定の幹細胞成長因子の源）を 含む同じ培地の下層の頂部に接種した。培養基を１０％の００２．５％の０２． ８５％のＮ２を含む充分に湿潤した雰囲気中で３７℃でインキュベートした。コ ロニーをＩＮＴ２−（ｐ−ヨードフェニル）−３−（ｐ−ニトロフェニル）−５ −フェニルテトラゾリウム塩化物の水和塩で一夜染色した。ＣＦＵ−Ａアッセイ において２菖翼よりも小さい直径を有するコロニーがあったが、我々はシトシン アラビノシドを用いて予備実験を行った後に、この値を有用な見切り点として選 択した。我々は、個々の皿中で、２富肩より小さい直径を有するコロニーは主と して周期中の細胞から誘導されるが、２翼雪より大きいコロニーは最小の増殖細 胞から誘導されることを見出した。２麗冨よりも大きいコロニーだけがこれらの アッセイで点数を算定された。

本発明の阻害剤は数種のマクロファージ細胞系統から得ることができる。始めに 骨髄由来の各種の既知のマクロファージ細胞、典型的にはかようなマクロファー ジ細胞系統の主要な資源であるので、ネズミの骨髄が関心の的である。かような 細胞系統の集団をスクリーニングして本発明の阻害剤を生産できる少なくとも二 つの既知の細胞系統が特定された。

本発明を例示する実施例中において、こうした既知のマクロファーシュ細胞系統 からの単離が記載されている。

既知のマクロファージ細胞系統の使用とは別な方法として、骨髄細胞をレトロウ ィルス形質転換剤を用いる骨髄細胞の形質転換により適当なマクロファージ細胞 系統を生産することも可能である。

本発明の阻害剤は阻害剤生産マクロファージ細胞系統を慣用の条件、例えば３７ ℃、で適当な増殖培地中で培養することにより極めて簡単に生産することができ る。細胞濃度が１ｍＡ’当たり約１０６になるまで、空気中で５％ｖ／ｖの二酸 化炭素を用いる好気的条件の使用は、理想的な増殖環境を提供する。この段階で なお成長する細胞を増殖培地から例えば遠心又は好適には膜濾過により分離し、 次いで阻害剤を上澄液から回収できる。阻害剤の活性を示すために、最初上澄液 を例えば膜透析を用いて濃縮し、約２０倍の濃度とすることが望ましい。次いで 阻害剤をクロマトグラフィー的手法により濃縮された上澄液から単離することが できる。

精製の最初の段階は、濃縮された上澄液を陰イオン交換樹脂に通し、そして０． ２５−０．３０ＭのＮａＣｌ溶液を用いて画分を溶離することを含んでいる。

精製の第二の段階は第一の段階からの生成物をセファロース−ヘパリンカラムに 通し、少な（ともＩＭのモル濃度のＮ　ａ　ＣＩ溶液を用いて画分を溶離するこ とを含む。

精製の第三の段階は第二の段階からの生成物をセファロ−スーブルーに通し、少 なくとも３Ｍのモル濃度のＭｇＣｌ２溶液を用いてフラグメントを溶離すること を含む。この溶離液は還元条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動により単 一のバンドを示す生成物を与える。

本発明の阻害剤の主な用途は、下記に一層詳細に記載されるように、臨床的診療 においてであるが、阻害剤又はその免疫原的に活性な画分は宿主動物を免疫化し 、宿主動物の抗体又は抗体生産細胞から回収することにより、一部又は総ての阻 害剤を認識する抗体を集める免疫原として使用することもできる。こうした抗体 は例えば兎の血清から多クローン性抗体を回収できる兎を用いて生産することが でき、又は慣用の技術により単クローン性抗体の生産のために免疫原としてネズ ミを使用することができる。

本発明は又本発明の阻害剤を符号化（ｅｎｃｏｄｅ）するＤＮＡ配列に拡張され る。こうしたＤＮＡは組換えＤＮＡ技術による阻害剤の生産に興味がある。こう した技術は二種の異なるアプローチを含むことができる。両方のアプローチとも 第一段階として阻害剤を自然に生産する、マクロファージ細胞系統からのメツセ ンジャーＲＮＡからの遺伝子ライブラリーの生産を必要とする。これは細菌又は 他の宿主細胞中に発現できる相補的ＤＮＡの生産を含んでいる。

ｃＤＮＡライブラリーが生産されると、第一のアプローチはＤＮＡプローブの生 産と使用を含んでいる。阻害剤の限定的な配列分析によって、プローブと雑種形 成するライブラリー中のこれらのｃＤＮＡを同定するためにＤＮＡライブラリー を調べるのに使用できるオリゴヌクレオチドの合成が可能となり、全体の阻害剤 を符号化するメツセンジャーＲＮＡの同定が可能となるであろう。マクロファー ジから由来した遺伝子ライブラリーを調べる別法として、ヒト起源の遺伝子ライ ブラリーが、現在周知の技術を用いて宿主細胞系統中で発現可能であるヒト起源 の阻害剤を符号化するＤＮＡを同定し、且つ単離するために調べることができる 。

阻害剤の生物学的性質の予備実験によれば、細胞周期中の幹細胞に及ぼす効果が 可逆的であることが指示されている。癌の化学療法に使用されている化学療法剤 の大部分は通常２４時間以内の比較的低い生体内半減期を有しているから、本発 明の阻害剤の阻害効果は化学療法剤が生体内で活性である間に、少なくとも有効 時間の大部分に亙って維持される。

本発明者の予想は体内の正常な生理学的機構が、細胞周期中の幹細胞に関する阻 害剤の有効活性持続期間を限定するであろうということである。

臨床的用途において、造血組織に本発明の阻害剤の目標を定めることが望ましい 。この目標は通常は輸液又は静脈内ポーラス投与により阻害剤を注射することに より達成することができ、本発明は阻害剤及び適当な希釈剤又はこうした非経口 的投与に適当な担体を含む製薬学的な組成物に及んでいる。

本発明の阻害剤における関心は造血組織に特異的な幹細胞に限定されず、他の幹 細胞、例えば骨髄細胞に及ぼす細胞毒性の薬物治療の副作用を軽減することに関 するのみならず、固化した（ｓｏｌｉｄ）腫瘍の治療に関係ある阻害剤を生産す る、上皮幹細胞にまで広がっている。正常の幹細胞の増殖が防止され、それで増 殖する白血病の細胞が細胞毒薬剤で処置できるようになり、白血病の骨髄細胞が 阻害剤を用いて試験管内又は生体内で治療されるので、阻害剤は又白血病の治療 にも興味あるものである。

本発明は下記の実施例において更に説明が加えられる。

広く利用されている１７７４．２が使用された。これはＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、 （１９７５）　１１４．８９８、及びＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　　（１９７７） 　３７．５４６に記載された通りである。

撹拌培養における無血清増殖のための選択Ｊ７７４．２細胞は始め１０％の牛脂 児血清を補充した変形イーグル培地中で増殖された。細胞は下記培地中で継代培 養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）されたダルべ・ソコＸＩＯ５０冨！ ５Ｆ１２Ｘ１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５０諺 ！グルタミン　２００翼Ｍ　　　　　　　　　　　１０菖！ピルビン酸ナトリウ ム　１０（ｂＭ　　　　　　　５寓！蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　 ８４０ｍ１ヌードリド−ｖ（ｎｐｔｒｉｄｏｍａ）　Ｓ　Ｐ　　　　　　　１０ 　ｍｌ炭酸水素ナトリウム７．５％　　　　　　　４１ｍ１ヌードリド−ｖｓＰ はサセックス（Ｓｕｓｓｅｘ）、ルーウエス（Ｌｅｗｅｓ）のべ−リンジャ−（ ３０６ｈｒｉｎｇｅｒ）社製、カタログ番号１０１１３７５であり：他の試薬は フロー・ラボラトリーズ（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）ＵＫ及びギブ コーパイオカルト（Ｇｉｂｃｏ−Ｂｉｏｋｕｌｔ）ＬＩＫ製である。

７７４．２細胞は一週間の間牛脂児血清（５％）を上記の培地中で継代培養され 、更に同じ培地中で三日継代培養された。細胞は更に一週間２．５％の牛脂児血 清を加えた培地中で継代培養され、次いで血清を総て除去するまで更に一週間１ ％の牛脂児血清を加えた培地中で継代培養された。この段階において二日毎に継 代培養され、８Ｘ１０’／肩ｌの濃度まで増殖し、そして継代培養基中で２Ｘ１ ０’／ｍＡ’まで希釈された。

次いで細胞を撹拌培養基に移し、上記のように二日毎に継代培養して懸濁液中で の増殖に順化させた。Ｊ７７４．２（Ｓ）と呼称され、無血清懸濁培養基中で増 殖可能なこの細胞系統を１次いで阻害剤の生産に使用した。

５００ｍｌ　（８Ｘ　１０’／ｍｌ）のＪ７７４．２　（Ｓ）を１５００ｍＡ’ の培地を含む大きい発酵槽（テクネ［Ｔｅｃｂｎｅ］、７／）中に接種した。空 気中に５％のＣＯ２を含む気体を供給し、３７℃で２日間２Ｏｒｐｍで撹拌し、 次いで６１の培地を補充し、３日間続けて増殖させた。

８Ｘ１０’の細胞からの未希釈の培地を０．４５μ調の微多孔質の膜を持ったミ リポア・ペリコン−カセット（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ　Ｐｅ１ｌｉｃｏｎ−Ｃａｓｅ ｔｔｅ）装置を用いて細胞から分離する。細胞を除いた培地を次いでＩＯＫカッ トオフ（ｃｕｔ−ｏｆｆ）膜を用いて同じ装置中で濃縮し、最終容積を約４００ １Ａとする。この濃縮物を生化学的に精製するために次いで下記のように処Ｇ− ２５ＨＲ１６１５０（ファルマシア）により脱塩し、陰イオン交換モノＱＨＲＩ Ｏ／１０カラム（ファルマシア、ＦＰＬＣ装置）にかけ、及び最終的に塩グラン エンド（０ないし１ＭＮａｃＩ）で溶離する。

阻害剤の活性画分は領２６ないし０．２８ＮａＣＩの間で溶離する。

第２段階。第１段階からの不純な阻害剤を直接セファロース−ヘパリン（ファル マシア）カラム、ＨＲＩＯ／１０にかける。阻害剤は樹脂に結合し、蛋白質の大 部分（９０％以上）はｐＨ７，６の領ＩＭＮａＣ］−０，０２Ｍ　）リスＨＣＩ を用いて樹脂から洗い出すことができる。次いで阻害剤はｐＨ７，６のＬＭ　Ｎ ａＣｌ−０，０２ＭトリスＨＣＩ中で樹脂から溶離される。

第３段階。第２段階からの部分的に精製された阻害剤を脱塩せずに直接ブルー・ セファロース（ファルマシア）カラムにかける。次いでカラムを第２段階で阻害 剤を溶離するのに用いた緩衝液で洗浄し、他の蛋白質を除去する。強く結合して いる精製された阻害剤はｐＨ７，６の５ＭＭｇｃ１２−０．０２Ｍ　　）リスＨ ＣＩで溶離される。

阻害剤の他の生化学的特性は ａ）熱安定性、 ｂ）３７℃、５５℃７５℃で１時間安定である、ことを含んでいる。

分子の大きさ 精製された阻害剤は還元条件下でポリアクリルアミドゲル上に分子量８−１０に 、ｄの単一なバンドとして見ることができる。阻害剤を非還元的条件下でポリア クリルアミドゲル電気泳動にかけると、それは僅かに高い分子量でのものあるこ とが分かる。これらの観察は阻害剤が電気泳動的移動度に影響する内部的ジスル フィド結合を有する単鎖ポリペプチドであることを示唆する。

阻害剤の生物学的特質 多能性幹細胞の細胞周期外への可逆的誘発（ｔｒｉｇｇｅｒ）　（試験管内アッ セイにおいて述べたようなＣＦＵ−Ａ）骨髄細胞を２０％の馬血清が補充された ＩＫｌのフッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）の培地中に５Ｘ１０’の細胞を含む一対 の試験管中でインキュベートした。阻害剤又はアルファーＭＥＭが各試験管に添 加され、フッシャーの培地が対照試験管に添加された。混合物を３７℃で５時間 インキュベートした（阻害アッセイ）。インキュベーションの最後の６０分間に １０−３Ｍのシトシンアラビノシドを一つの試験管に添加し、等容積の培地を他 の試験管に添加した。次いで上記のようなＣＦＵ−Ａア・ソセイにより分析する 前に細胞を二度洗浄した。阻害剤は周期中の幹細胞の数を平均３０％から平均的 ３％まで減少させることが見出された。未処理の細胞は阻害剤で処理された幹細 胞と対照的に細胞毒性薬物処理により殺害された。阻害剤の不純な製剤も、文献 中に記載されたＣＦＵ−Ａア１．／セイを用いて生体内でアッセイすると、多能 性幹細胞を可逆的に周期外に誘発する。

補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成２年１０月１９ 日 特許庁長官　植　松　　　敏　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＧＢ８９１００３９６ ２、発明の名称 幹細胞阻害剤 ３、特許出願人 住　所　イギリス国ロンドンニスダブリュー１ワイ　５エイアール・カールトン テラスハウス２ 名　称　キャンサー・リサーチ・キャンペーン・テクノロジー・リミテッド 代表者　フオーデン、スーザン ４、代理人　〒１０７ 住　所　東京都港区赤坂１丁目９番１５号５、補正書の提出年月日 １９９０年６月１８日 ６、添付書類の目録 １０行の補正であります。

阻害剤の生物学的性質の予備実験によれば、細胞周期中の幹細胞に及ぼす効果が 可逆的であることが指示されている。癌の化学療法に使用されている化学療法剤 の大部分は通常２４時間以内の比較的低い生体内半減期を有しているから、本発 明の阻害剤の阻害効果は化学療法剤が生体内で活性である間に少なくとも有効時 間の大部分に亙って維持される。

本発明者の予想は体内の正常な生理学的機構が細胞周期中の幹細胞に関する阻害 剤の有効活性持続期間を限定するであろうということである。

臨床的用途において、造血組織に本発明の阻害剤の目標を定めることが望ましい 。この目標は通常は輸液又は静脈内ポーラス投与により阻害剤を注射することに より達成することができ、本発明は阻害剤及び製薬学的に許容し得る希釈剤又は 担体、好適には非経口的投与に適当した希釈剤又は担体を含む製薬学的な組成物 に及んでいる。

国際調査報告 Ｉｗｗ＋ａ＋、ａ＋ａ＋　Ａｍ＆”＋ＩＵ６Ｍ　１＋ｅ、　　ＰＣＴ　／Ｇ己９ ９１００２９ら１＋ｌ＃＋沖ａＡｊｌ＾ｅａ１．ｔｊｌ、ａＡＮａ、ｓ（ｍＴ／ Ｇ”　　ａ９／ＧＯ３９６

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．下記の特性： １）阻害剤活性はトリプシンによる分解に感受性があり、従って阻害剤は蛋白質 様である。 ２）阻害剤は陰イオン交換体での処理により部分的に精製された時に、分子量分 析用樹脂上で４５−６０Ｋｄの範囲の分子量酸を示す。 ３）阻害剤は還元性条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動により単一のバン ドとなるまで精製されると、８−１０Ｋｄの分子量範囲を示し、非還元条件下で は僅かに高い分子量を示す。 ４）阻害剤は下記： （ｉ）阻害剤活性は３７℃、５５℃及び７５℃で１時間加熱後も保存される、 （ｉｉ）阻害剤活性は１００℃で１０分間加熱後も保存される、のように熱一安 定性である。 ５）阻害剤は陰イオン交換体と結合し、０．２６及び０．２８モルの間のＮａＣ １の塩類グラジエントで溶離できる。 ６）阻害剤はヘパリン・セファロース・アフィニティークロマトグラフィー樹脂 に結合し、該樹脂から１モルの塩化ナトリウム緩衝液で溶離できる。 ７）阻害剤はブルー・セファロース・アフィニティークロマトグラフィー樹脂に 強く結合し、５Ｍ塩化マグネシウムで樹脂から溶離できる。 ８）細胞周期中の幹細胞が部分的に精製された阻害剤で処理された時には、シト シンアラビノシドの作用に抵抗性となる。処理された幹細胞が次いで細胞毒性薬 物及び阻害剤を除去するために食塩緩衝液で洗浄されると、生存する幹細胞は培 養基中で正常な増殖を示す。 を有することを特徴とする、造血性幹細胞阻害剤。
2. ２．マクロファージＪ７７４．２細胞から得られる、上記１に記載の阻害剤。
3. ３．上記１又は２に記載の阻害剤を製薬学的に許容し得る担体又は希釈剤と共に 含有して成る製薬学的組成物。
4. ４．非経口的投与のための上記３に記載の組成物。
5. ５．上記１又は２に記載の阻害剤に対する抗体。
6. ６．上記１又は２に記載の阻害剤又は阻害剤の免疫原的に活性なフラグメントで 宿主動物を免疫化し、及び宿主動物から抗体又は抗体生産細胞を回収することを 含んで成る、抗体を高める方法。
7. ７．宿主細胞中に発現可能な上記１又は２に記載の阻害剤を符号化するＤＮＡを 含む合成ＤＮＡ。
8. ８．下記段階： １）増殖培地中で骨髄起源の阻害剤生産マクロファージ細胞系統を増殖して阻害 剤を含む上澄液を生産すること；２）上澄液を陰イオン交換体と接触させ、及び 陰イオン交換体を０．２５−０．３０ＭＮａＣｌで溶離して阻害剤を含む第一の 溶離液を得ること； ３）第一の溶離液をセファロースーヘパリンと接触させて、セファロースーヘパ リンを少なくとも１Ｍのモル濃度のＮａＣ１の溶液で溶離して、阻害剤を含む第 二の溶離液を得ること；４）第二の溶離液をセファロースープルーと接触させ、 及びセファロースープルーを少なくとも３Ｍのモル濃度のＭｇＣ１２の溶液で溶 離して阻害剤を含む第三の溶離液を得ること；を含んで成る上記１に記載の阻害 剤を単離し且つ精製する方法。
9. ９．治療のためにヒト又は動物体の処置方法中で使用するための上記１又は２に 記載の阻害剤。
10. １０．患者の造血性幹細胞を細胞毒性薬物による損傷から保護するように上記１ 又は２に記載の阻害剤を投与することを含む、細胞周期特異性細胞毒性薬物を受 ける患者を治療する方法。