JPH02300663A - アンフェタミン様分析対象物の検出のための蛍光偏光イムノアッセイ法およびそれに用いるアッセイキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、尿のような試料中のアンフェタミン様薬物の
検出のための試薬おＪ：び方法に関する。

さらに詳しくは、本発明は、試料中のアンフェタミン様
薬物の存在または量を決定するための蛍光偏光イムノア
ッセイ法、該方法に試薬として使用する新規なトレーサ
ー化合物、および該方法に使用する抗体を産生させるた
めの免疫原化合物に関する。

（従来の技術および発明か解決しようとする課題）アン
フェタミン様薬物は、中枢神経系興奮作用を有する交感
神経興奮性のフェネチルアミン誘導体である。これらの
薬物は、肥満症、ナルコレプシー、および低血圧の治療
に用いられている。しかしながら、これらの薬物を過剰
に使用することは、耐性および身体的な依存症を引き起
こすし、さらにこれらの薬物は興奮作用を有するために
一般に濫用されている。非常に多量のアンフェタミン様
薬物を摂取したときにしばしば伴う生理学的な兆候とし
ては、血圧の」二昇、瞳孔の拡散、高熱、前章、および
急性のアンフェタミン精神病が挙げられる。

アンフェタミン様薬物の検出または定量のために最もし
ばしば用いられる生物学的流体は尿である。しかしなが
ら、血清、血漿または唾液などの他の生物学的流体もま
た試料として用いることができる。過去において、アン
フェタミンは、薄層クロマトグラフィー（Ｔ　Ｌ　Ｃ）
、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、および高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む多くの方法によっ
て検出されてきた。これらの方法は、一般に該薬物の試
料からの複雑な化学的抽出を含むものであるが、これは
高度の熟練者と長いアッセイ時間を要する込み入った手
順である。

分析対象物を検出するｆ二めのガスクロマドクラフィー
（ＣＣ）や薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）や高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のような化学的方法
に代わる好ましい方法は、結合アッセイである。抗原お
よび抗体を検出するための結合アッセイは、これらの物
質を特徴付（プる免疫学的反応性に依存する。一般に、
これらのアッセイは一括してイムノアッセイと呼ばれる
。

イムノアッセイ法は、高等生物において該生物にとって
病原性であるかまたは異物である抗原の存在に応答して
抗体が産生されるという免疫系の機構を利用したもので
ある。特定の抗原に応答して該抗原に反応性の１種また
は２種以」−の抗体か産生されることにより高度に特異
的な反応機構か得られ、この機構を生物学的試料中の特
定の抗原の存在または濃度をインヒドロで決定するのに
用いることができる。

分析対象物を測定するための競合結合イムノアッセイは
、試料中の該分析対象物と標識試薬（トレーサー）との
両方に特異的な結合成分（たとえば抗体）」二の限られ
た数の結合部位に対して、該分析対象物と該トレーサー
との間で競合か起こることに基づいている。一般に、試
イ４中の分析対象物の濃度か抗体に結合するトレーサー
の量を決定する。

トレーサー／抗体複合体の量を定量的に測定することが
でき、これは試料中の分析対象物の量に反比例する。

蛍光偏光法は、競合結合イムノアッセイにおいて生成し
たトレーサー／抗体複合体の量の測定手段を提供する。

蛍光偏光法は、直線偏光により励起されたときに蛍光標
識試薬が急速に回転し、その回転するトレーサーによっ
て放射される蛍光がその急速な回転のために部分的に脱
偏光されるという原理に基づいている。その結果、トレ
ーサーは、その回転度とは逆の関係にある偏光の度合を
有する蛍光を放射する、すなわち、回転か大きくなるほ
ど放射光の偏光は小さくなる（あるいは放射光の脱偏光
が大きくなる）。回転のスピードと脱偏光の程度は、ト
レーサーが重い分子に結合しているとき、たとえば比較
的重い抗体分子に結合しているときには減少する。蛍光
トレーサー／抗体複合体を含む反応混合物を直線偏光て
励起させた場合、複合体中の蛍光団は急速な回転が抑え
られているので放射光は一般に偏光したままである。

「遊離の」トレーサーか直線偏光により励起された場合
は、その回転はトレーサー／抗体複合体のものよりもは
るかに速く、それゆえ放射光の脱偏光は増加する。

既知濃度の分析対象物を含有する標準調製物を未知濃度
の分析対象物を含有する試料と比較することにより、蛍
光偏光法は、競合結合アッセイにおいて生成したトレー
サー／抗体複合体の量を測定するための定量手段を提供
する。この方法は、現在、アボット・ラホラトリーズよ
り市販のＴＤＸセラビューティック・ドラック・モニタ
リング０システム（ＴＤｘ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　
ＤｒｕｇＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ）（米国
特許第４．．２６９．５１１号および同第４．４．２０
，５６８号各明細書に記載）および同社より市販のＩＭ
ｘおよびＡＤＸ自動装置に採用されている。

上記米国特許第４．２６９，５］］号および同第４．４
．２０，５６８号各明細書に開示されているように、蛍
光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）においてトレーサー
は抗体への結合に対して分析対象物と競合しなげればな
らないので、トレーサーは分析対象物に特異的な抗体に
より認識され得るように、分析対象物に充分似た分子構
造を有していなければならない。この理由により、トレ
ーサーはまた、その実質部分が分析対象物と同じ空間的
および極性的構成を有し、抗体上の結合部位に対して分
析対象物と競合し得る１または２以上の抗原決定基を定
める蛍光標識した分析対象物類似体として言及される。

特定のアンフェタミン様化合物の検出または定量のため
の正確で信頼性のおけるイムノアッセイを行うためには
、抗体の交差反応性、すなわち所望の分析対象物以外の
化合物の認識を最小にずろ必要がある。米国特許出願第
０１０，３５５号（１９８５年２月３日出願）および同
第２６５，３６１号（１９８８年１０月２８日出願）各
明細書には、フェネヂルアミンの交差反応性を排除しな
がら試料中のアンフェタミンおよびメタンフェクミンの
定量を行うためのアッセイ試薬およびＦＰＩＡｊ去が開
示されている。

しかしながら、現在のところ、広範囲のアンフエクミン
様薬物について試料をスクリーニングすることの可能な
蛍光偏光イムノアッセイ法は開示されていない。従って
、アンフェタミン様薬物の存在および量の両方を同時に
検出するために正確で高感度のＦＰＴＡを行うｆ二めの
アッセイ法および試薬を開発する必要性か存在する。

（課題を解決するための手段） 本発明は、一般式 ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はト■、○
Ｔ−ＩおよびＣｌ−１３よりなる群から選ばれた基であ
り、ただしＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のうち少
なくとも一つは一般式・（Ｍ）ｚＷＱ（式中、Ｑは担体
物質、Ｗ　はＮＨｌＣｏＸＣＯＯＨｌＣＨＯおよびＯＨ
よりなる群から選ばれ該担体物買上に存在する連結基、
Ｚは０またはＬＭは０〜１５個の炭素原子およびヘテロ
原子からなり６個未満のへテロ原子を含む直鎖または分
枝鎖の飽和または不飽和結合基であって、２個以上のへ
テロ原子が連続して結合することはなく該分枝は炭素原
子上でのみ生じ、該へテロ原子は窒素原子、酸素原子、
硫黄原子、ケイ素原子およびリン原子よりなる群から選
ばれた原子であるもの）］で示される免疫原化合物。

一般式 ［式中、Ｒ１’、Ｒ２°、Ｒ３’、Ｒ４”およびＲ５’
は■１、ＯＨおよびＣＨ３よりなる群から選ばれた基で
あり、ただしＲ１’、Ｒ２’、Ｒ３°、Ｒ”およびＲ５
’のうち少なくとも一つは一般式ＭＦＩ（式中、Ｆｌは
蛍光物質、Ｍは０〜１５個の炭素原子およびヘテロ原子
からなり６個未満のへテロ原子を含む直鎖または分枝鎖
の飽和または不飽和結合基であって、２個以上のへテロ
原子が連続して結合することはなく該分枝は炭素原子上
でのみ生じ、該へテロ原子は窒素原子、酸素原子、硫黄
原子、ケイ素原子およびリン原子よりなる群から選ばれ
た原子であるもの）］で示される）・レーザー化合物：
試料中の１種または２種以上のアンフェタミン様分析対
象物の存在または量を決定する方法であって、 （ａ）該試料を請求項（／Ｉ）に記載のトレーサー化合
物、および該分析対象物および該トレーサー化合物を認
識し結合することのてきる抗体と接触させて、（ｉ）該
抗体への該分析対象物の結合または（ｉｉ）該抗体への
該トレーサー化合物の結合がそれぞれ（ｉ）該抗体への
該トレーサー化合物の結合または（１１）該抗体への該
分析対象物の結合を抑制するようにし、 （ｂ）得られた試験溶液に平面偏光を通して蛍光偏光応
答を得、ついで （ｃ）蛍光偏光応答を検出して試料中のアンフェタミン
様分析対象物の存在または量を決定することを特徴とす
る方法、および 試料中の１種または２種以」二のアンフェタミン様分析
対象物の存在または量を決定するためのアッセイキット
てあって、上記トレーサー化合物、および該アンフェタ
ミン様分析対象物および該トレーサー化合物を特異的に
認識することのできる抗体からなることを特徴とするア
ッセイキットを提供するものである。

本発明はまず、蛍光偏光イムノアッセイ法を用いた、試
料中のアンフェタミン様化合物の検出または定量法に関
する。本発明の方法は、（ａ）１種または２種以上のア
ンフェタミン様化合物を含有すると思われる試料を蛍光
標識トレーサー、および該アンフェタミン様化合物およ
び該トレーサーを認識し結合することのできる抗体と接
触させて、（１）該抗体への該アンフェタミン様化合物
の結合または（１１）該抗体への該トレーサーの結合が
それぞれ（１）該抗体への該トレーサーの結合または（
１１）該抗体への該アンフェタミン様化合物の結合を抑
制するようにし、 （ｂ）得られた試験溶液に平面偏光を通して蛍光偏光応
答を得、ついで （ｃ）蛍光偏光応答を検出して試料中のアンフェタミノ
様分析対象物の存在または量を決定する工程からなる。

本発明はさらに、そのような方法に試薬として用いるト
レーサー化合物、およびそのような方法に試薬として用
いる抗体を産生させるための免疫原化合物にも関する。

本発明はまた、アンフェタミン様化合物のアッセイに使
用する試薬のキットにも関する。

本発明の免疫原化合物は、一般に、上記一般式（１）で
示される化合物である。式（Ｄにおいて、Ｒ１、Ｒ２、
Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はＪ−ＩＸＯＨまたはＣＩ−１３
であり、ただしＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ′およびＲ５のう
ち少なくとも一つは一般式１（Ｍ）ＺＷＱ（式中、Ｑは
担体物質、Ｗ　Ｌｌ：　Ｎ　ＨｌＣＯｌＣＯＯＩ（。

ＣＨＯまたはＯＨから選ばれ該担体物質上に存在する連
結爪、ＺはＯまたはＩ、Ｍは結合基である）で示される
基である。

本発明のトレーサー化合物は、上記一般式（ビ）で示さ
れる化合物である。式（Ｉりにおいて、ＲＰ、Ｒ”、Ｒ
３°、Ｒ”およびＲ”ＬｔＪ（、ＯＨまたはＣＲ３であ
り、ただしＲ１’、Ｒ２°、Ｒ３’、Ｒ４°およびＲ”
のうち少なくとも一つは一般式：Ｍ　Ｆ　Ｉ（式中、Ｆ
ｌは蛍光物質、Ｍは結合基である）で示される基である
。

アンフェタミン様薬物の例としては、フェネチルアミン
に構造上および薬理学上で関連し、アンフェタミンの作
用に種々の程度に類似する作用を有する物質の誘導体お
よび異性体が挙げられる。

アンフェタミン様薬物は、その治療用途に基づいて少な
くとも５つの主要なりラス、すなわち（１）交感神経興
奮剤（たとえば、アンフェタミンおよびメタンフェタミ
ンなど）、（２）食欲抑制剤（たとえば、フェンテルミ
ンおよびフェンフルラミンなど）、（３）抗欝剤（たと
えば、トラニルシプロミンなど）、（４）欝血除去剤（
たとえば、エフェドリンおよびフェニルプロパノラミン
など）および（５）メトキシ幻覚剤（たとえば、３，４
−メチレンジオキシアンフェクミンおよびＮ−エチル−
３，４−メチレンンオキシアンフェタミンなど）に分類
される。

本発明はまた、そのように濫用される可能性のある薬物
の検出、および医師の処方によらないで入手できるダイ
エツト製品および感冒軽減製剤（ｃｏｌｄ　ｒｅｌｉｅ
ｆ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の過剰投与を決定することので
きる試薬および半定量的アッセイ法をも提供する。本発
明の試薬は、アンフェタミン様薬物のアッセイ、すなわ
ち広範囲のアンフェタミン様薬物についての試料のスク
リーニングが可能となるように意図的に交差反応性にし
である。本発明の試薬はまた、他の薬物のためのトレー
サーおよび抗体と組み合わせて用いて、複数の濫用物質
のための多分析対象物アッセイ法を提供することもでき
る。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。

定鍜 本明細書において「抗原決定基」とは、抗原と抗体との
間の結合に代表されるような特異的結合反応に関与する
抗原の領域をいう。本質において、免疫学的特異性に基
づいて抗原、従って抗体を互いに識別することのできる
ものが抗原決定基てあ本明細書において「分析対象物」
とは、それに対して抗体のような結合成分が得られるか
または生成することのできる分子をいう。本発明の分析
対象物は、一般に、下記一般式 （式中、Ｒ１はＨまたはＯＩ−Ｉ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４お
よびＲ５はそれぞれ独立してＨ，ＣＨ，、Ｃ２Ｈ５また
はベンジル基、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立して水素
原子、塩素原子、メチル基、水酸基またはメトギン基で
あるかまたは一緒になってメヂレンジオギシ架橋を生成
する）で示されるフェネチルアミン誘導体である。所定
の分析対象物は、抗原すなわち免疫原を生成することの
できるハプテンである。「ハプテン」とは、一般に低分
子量からなるタンパク質不含の化合物であり、それ自身
は抗体の産生を引き起こすことはないが、免疫原性担体
と結合したときに免疫応答を引き起こす。

１９一 本明細書において「分析対象物類似体」とは、所定の分
析対象物の１または２以上の抗原決定部位と実質的に同
じ空間的および極性的構成を含む分子をいう。このよう
に抗原決定基が重複していることにより、分析対象物特
異的結合成分（抗体など）上の結合部位に対して分析対
象物類似体が試料中の分析対象物と競合することが可能
となる。

加えて、分析対象物類似体は、分析対象物と同一ではな
いが分析対象物特異的結合成分への結合に必要な抗原決
定基を保持しているように修飾することがてきる。すな
わち、分析対象物類似体が適当な抗原決定基を実質的に
重複させていることで充分なのである。それゆえ、分析
対象物類似体は、該分析対象物類似体が分析対象物の抗
原決定基を実質的に重複させていることによって特異的
結合成分が該実質的に重複した抗原決定基を認識し結合
することができる限り、分析対象物のものとは異なる化
学基、アミノ酸またはヌクレオヂトを含有していてもよ
いし、さらに分析対象物のものよりも少ない化学基、ア
ミノ酸またはヌクレオヂ）〜を含有していてもよい。

本明細書において「免疫原」とは、免疫応答を引き起こ
すことのできる物質、すなわち、それを投与した宿主動
物において抗体の産生を引き起こすことのできる物質を
いう。本発明における免疫原は、とりわけ、抗原性を付
与する担体に結合した分析対象物または分析対象物類似
体をいう。

本明細書において「担体」とは、抗原性を付与すること
のできる物質をいう。担体は、不完全な抗原であってハ
プテンに結合させたときに初めて完全な抗原となるもの
でもよいが、一般にはそれ自身が抗原性である。担体物
質は天然物質または合成物質のいずれてあってもよいが
、抗原または部分抗原でなければならず、結合を可能に
する１または２以」二の官能基を有していなければなら
ない。

たとえば、担体物質は、タンパク質、糖タンパク質、核
タンパク質、ポリペプチド、多糖、リボ多糖またはポリ
アミノ酸であってよい。明らかに不完全な抗原の例は、
ポリペプチド、タルカゴンである。そのような天然タン
パク質担体の具体例としては、ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）、キーポールリンペソトヘモソアニン、卵白アル
フ゛ミン、ウシクーグロブリン、チロキシン結合グロブ
リノおよびヒト免疫γ−クロプリンが挙げられる。合成
担体の例としては、ポリアミノ酸、ポリリジンか挙げら
れる。実際には、単一の担体に複数のハプテン残基か結
合していてよい。立体妨害のため、その最大数は担体物
質上の反応性結合基の数により決定されるであろう。

本明細書において「トレーサー」とは、蛍光物質に結合
した分析対象物または分析対象物類似体をいう。蛍光物
質とは、トレーサー試薬の検出可能な成分である。

本発明の方法に従い、１種または２種以上の所定の分析
対象物を含有するど思われる試料を、トレーサー、およ
び該分析対象物および該）・レーサーに特異的な抗体と
混合する。試料中の分析対象物は、抗体上の限られた数
の結合部位に対してｌ・レーザーと競合し、その結果、
分析対象物／抗体複合体およびトレーサー／抗体複合体
を生成する。

トレーサーと抗体の濃度を一定のレベルに保つことによ
り、生成したトレーサー／抗体複合体に対する分析対象
物／抗体複合体の比は、試料中の分析対象物の量に正比
例することになる。

上記混合物を偏光で励起させ遊離のトレーサーおよびト
レーサー／抗体複合体から放射される蛍光の偏光を測定
することにより、試料中の分析対象物の量を定量的に決
定することができる。抗体と複合体を形成していないト
レーサーは、吸収し蛍光を再放射するのに必要な時間よ
り６短い時間自由に回転できる。その結果、再放射され
た光は相対的に無秩序に配向しており、抗体と複合体を
形成していないトレーサーの蛍光偏光は低い。特異的抗
体と複合体を形成すると、トレーサーは抗体分子の回転
度を示し、これは比較的小さなトレーサー分子の回転度
よりも遅いため再放射光の偏光が増加する。それゆえ、
抗体部位への結合について分析対象物がトレーサーと競
合するときには、トレーサー／抗体複合体から観察され
る蛍光偏光は、トレーサーの蛍光偏光とトレーサー／抗
体複合体の蛍光偏光との間のいずれかの値である。試料
が高感度の分析対象物を含んでいるときは、観察される
偏光値は遊離トレーサーの偏光値に近くなる、すなわち
低くなる。試料が低濃度の分析対象物を含んでいるとき
は、偏光値は結合トレーサーの偏光値に近くなる、すな
わち高くなる。イムノアッセイの反応混合物を垂直偏光
ついて水平偏光で順番に励起させ、放射光の垂直成分の
みを分析することにより、反応混合物の蛍光偏光を正確
に決定することかできる。決定しようとする分析対象物
の濃度と偏光との正確な関係は、既知濃度の検量体の偏
光値を測定することにより確立される。分析対象物の濃
度は、この方法で作成した標準曲線から外挿することが
できる。

本発明によるイムノアッセイは均一アッセイであり、最
終の偏光の読み取りを結合トレーサーを遊離のトレーサ
ーから分離せずに溶液から行うアッセイである。このこ
とは、読み取りを行う前に結合トレーサーを遊離のトレ
ーサーから分離しなければならない不均一イムノアッセ
イに比へて明らかな利点である。

Ｋ栗 分析対象物および分析対象物類似体は、アッセイのため
のトレーサー試薬、並びに抗体を産生させるのに用いる
免疫原のための基本的な鋳型を提供する。分析対象物ま
たは分析対象物類似体は、担体と結合して免疫原を、検
出可能な標識と結合してトレーサーを生成する。

本発明において、抗体を産生させるのに用いる免疫原お
よびトレーサー試薬の両方とも、上記分析対象物と類似
の下記一般式により表すことができる。

一般に、Ｒ１はＩ−１またはＯＨであり、Ｒ２、Ｒ３、
Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立してＨ，Ｃｌ−１３、Ｃ
７Ｈ５またはヘンシル基であるが、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、
Ｒ４およびＲ５のうち少なくとも一つは担体物質である
か担体物質を含んていなければならない。この場合の構
造は、アッセイに用いる抗体を産生させるための免疫原
を表す。Ｒ’、Ｒ’、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のうち少な
くとも一つが蛍光物質であるか蛍光物質を含むときは、
この構造はトレーサーを表す。

本発明のＦＰＩＡの目的とするところは、抗体試薬に対
してトレーサー試薬と試料中に存在するかもしれないア
ンフェタミン様薬物との間に競合を起こさせることにあ
る。この目的を達成するために、免疫原およびトレーサ
ーの構造に関して種々の変化を許容することができる。

■、抗体 本発明に用いる抗体は、下記免疫原の一つに対して宿主
動物中で応答を引き起こすことにより調製する。免疫原
は、分析対象物または分析対象物類似体に結合した担体
からなる。この担体は分析対象物または分析対象物類似
体に抗原性をイ」与する巨大分子てあって、トレーサー
と複数のアンフェタミン様薬物の両方に特異的な抗体を
産生ずることができる。この免疫原を投与し、当業者に
公知の方法に従って適当な抗体を選択する。本明細書で
詳細に述へた実験ではウサギとヒツジを免疫宿主として
用いたが、該免疫原に対して抗体を産生ずることのでき
るあらゆるインビボまたはインビトロの宿主を使用する
ことが可能であることが理解されなければならない。得
られた抗体は、試料中のアンフェタミン様薬物およびト
レーサーの分析対象物成分または分析対象物類似成分に
結合する。

（ａ）免疫原の構造： 免疫原は、広範囲のフェネチルアミン誘導体から調製す
ることができる。本発明の新規な免疫原化合物は、上記
の一般的構造を有する。一般的には、ポリアミノ酸から
なる担体をフェネチルアミン誘導体のＲ’−Ｒ５のうち
の一つの結合基により結合させる。本発明の好ましい態
様においては、免疫原は、下記一般式により表される。

［式中、Ｒ’ＳＲ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はＨｌ　０
Ｉ−１お上びＣＨ３よりなる群から選ばれた基であり、
ただしＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のうち少なく
とも一つは一般式（Ｍ）ｚＷＱ（式中、Ｑは担体物質、
ＷはＮＨ，Ｃｏ、Ｃ０ＯＨ，ＣＴイ０およびＯＨよりな
る群から選ばれ該担体物質上に存在する結合基、Ｍは０
〜１５個の炭素原子およびヘテロ原子からなり６個未満
のへテロ原子を含む直鎖または分枝鎖の飽和または不飽
和結合基であって、２個以上のへテロ原子が連続して結
合することはなく該分枝は炭素原子上でのみ生じるもの
、Ｚは０または１）Ｅ０上記式において、ＺはＯまたは
１である、すなわち、ある場合には結合アームが存在し
なくて２＝０の場合がある。Ｍが炭素原子のみを含むと
きは、Ｍは炭素数が１〜１０であるのが好ましい。適当
なヘテロ原子としては窒素原子、酸素原子、硫黄原子、
ケイ素原子およびリン原子が挙げられる。たとえば、Ｍ
がへテロ原子として窒素原子および酸素原子を含む場合
は、Ｍは−ＣＨ２ＣＨ＝　Ｎ〜Ｏ−ＣＩ−Ｉ　２−であ
ってよい。

＝２８− それゆえ、免疫原の例としては、Ｒ５がＣ０ＮＨ〜ポリ
アミノ酸、ＣＨ２ＣＯＮ　Ｈ〜ポリアミノ酸、ＣＨ２Ｃ
Ｈ２ＣＯＮ　Ｈ〜ポリアミノ酸またはＣＨ、ＣＨ＝　Ｃ
ＨＣＯＮ　Ｈ〜ポリアミノ酸を含むもの；またはＲ１が
ＯＣＨ、ＣＯＮ　Ｈ〜ポリアミノ酸を含むもの１または
Ｒ３がＣＯＮ　Ｈ〜ポリアミノ酸を含むものか挙げられ
る。最も好ましい免疫原は、下記式で示されるＮ−カル
ポキノメヂルーｄ、■−アンフェタミン〜ウシ血清アル
ブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）である。

この免疫原は、抗体応答を最もよく引き起こすので好ま
しい。上記式において、Ｒ２とＲ３、Ｒ４とＲ５は相互
に置き換えが可能であることが理解されなければならな
い。この好ましい形態にはポリアミノ酸担体としてＢＳ
Ａを用いているが、上記のように種々の担体を用いるこ
とができることが理解されなければならない。

（ｂ）免疫原の合成。

本発明の免疫原において、カルホキノル基含有フェネチ
ルアミンハプテンとタンパク質担体」二のアミノ基との
間に、当業者に知られた種々の方法を用いて化学結合を
生成することができる。フェネチルアミンハプテンのカ
ルボン酸残基をまず脱離基試薬（たとえばＮ−ヒドロギ
ノスクシンイミド、■−ヒドロギンベンズトリアゾール
、ｐ−ニトロフェノールなど）と反応させることにより
アミド結合か生成される。ンノクロヘギンルｌＪルボノ
イミド、ジイソプロピルカルボジイミドなどの活性化試
薬を用いることがてきる。ついで、このフェネチルアミ
ンハプテンの活性体をタンパク質担体を含む緩衝溶液と
反応させる。

フェネチルアミンハプテンがカルポギノル基とともに第
一級アミノ基まｆこは第二級アミノ基を含んでいる場合
は、ハプテン同士の反応を防ぐために活性化および結合
反応の間にアミン保護基を使用する必要かある。一般に
、ハプテン」二のアミンは、対応するＮ−１−リフルオ
ロアセ）・アミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブヂルオキンカルボ
ニルウレタン（Ｎ−ｔ−ＢＯＣウレタン）、Ｎ−カルホ
ヘンジルオキンウレタンまたは同様の構造を生成するこ
とによって保護する。上記のようにしてタンパク質担体
への結合反応が完了したら、免疫原の構造を他の仕方で
変えることのない試薬を用いてアミン保護基を除くこと
ができる。そのような試薬および方法は当業者には一般
に知られており、その例よしては、たとえば弱（または
強）酸水溶液または酸無水物、弱（または強）塩基水溶
液または塩基無水物、水素化ポウ素ナトリウムや水素化
ンアノポウ素す１ヘリウムなどの水素化物含有試薬、お
よび接触水素化が挙げられる。ハプテンと担体を結合す
る種々の方法はまた、米国特許第３，９９６．３４４号
および同第４．０１６．１４６号各明細書に開示されて
いる（該公報は参照のため本明細書中に引用する）。

２、トレーサー （ａ）トレーサーの構造・ 本発明の免疫原と同様に、本発明のトレーサーちまた多
くの変化形が可能である。トレーサーは広範囲のフェネ
チルアミン誘導体から製造することがてきる。本発明の
新規な）・レーザーは上記と同し基本構造を有するが、
蛍光物質がＲ１−Ｒ５のいずれか一つで直接または結合
基を介してフェネチルアミン誘導体に結合している。本
発明の好ましい聾様において、一般にトレーサーは下記
一般式て示される構造を有する。

［式中、Ｒｌｏ、Ｒ２°、Ｒ３’、Ｒ４°およびＲ”は
＋（、ＯＩ〜［およびＣＨ３よりなる群から選ばれた基
であり、ただしＲ１”、Ｒ２’、Ｒ３′、Ｒ”およびＲ
”のうち少なくとも一つは一般式ＭＦＩＣ式中、Ｍは」
二記と同じ、Ｆｌ（」蛍光物質である］）・レーザーの
例としては、Ｒ”が、 Ｃｏ−Ｆｌ、 ＣＨ２−Ｆｌ、 Ｃ０ＮＨ−ＰＬ Ｃ０ＮＨＣＨ２−ＦＬ （ＣＨ２）ｎＣＯＮ　ＨＣＨ２Ｆ　Ｉ（式中、ｎはＩま
たは２）、ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ０ＮＨＣＨ２−ＦＬ （以下余白） ＣＨ２ＣＯＮ（ＣＨ２Ｃトｈ）ＣＩ−１２−ＦＬＣＨ、
ＣＯＮ（ＣＨ２ＣＴ−ＬＣＴ−１ｔＣ＋−１＋）Ｃｉ−
１、Ｆ　　ｌ、（ＣＨ、）ｎＮ　ＨＣＯＦ　ｌ　（式中
、ｎは１，２または３）、ＣＨ’　、　ＣＯＮ　ＨＣＨ
、ＣＨ２Ｎ　Ｔ（ＣＯ−Ｆ　１を含むか、Ｒ３°が ＣＯＮ■１ＣＨ２−Ｆｌ、 ＣＯＮ　ＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ　ＨＣＯＦ　１を含むか、Ｒ
２°が （ＣＨ２）ｎｃＯＮＨｃＨ２Ｆｌ（式中、ｎは１または
２）（ＣＨ３）ｎＮＨＣＯＦｌ（式中、ｎは１．２また
は３）を含むか、またはＲ１’か ＯＣＨ２ＣＯＮ　　ＦＩ　　ＣＴ−１、−Ｆ　　１を含
む構造が含まれる。

最も好ましいトレーサーは、下記式て示されるＮ−アセ
タミドメチルフルオレセインーｄ、ｌ−アンフェタミン
〜Ｆｌである。

上記式においても、Ｒ２°とＲ３゛、Ｒ４°とＲ５°は
相互に置き換えが可能であることが理解されなければな
らない。

分析対象物または分析対象物類仰体を標識してｌ・レー
ザーを生成するだめの蛍光物質の選択は、有利なこきに
柔軟性に富んでおり、主として実施者の好みによる。蛍
光標識はその大きさに従って理想的に選択されること、
ずなわぢ、分子が大きいほど一層急速に回転することか
でき、Ｆ　Ｐ　Ｉ　Ａトレーサー成分として一層有効で
あることが容易に理解されるであろう。本発明において
は、好ましい蛍光標識はフルオレセインおよびフルオレ
セイン誘導体である。これらの化合物は適当な波長の偏
光で励起させたときに蛍光応答を得ることかでき、その
ため蛍光偏光測定が可能となる。たとえば、下記フルオ
レセイン化合物または誘導体のいずれをも用いることが
できる。

フルオレセイン誘導体。

ツノルポギノフルオレセイン： α−ヨードアセトアミドフルオレセイン。

アミノメチルフルオレセイン； ２．４−ジクロロ−１，３，５−トリアノン−２−イル
アミノフルオレセイン。

４−クロロ−６−メドキノー１．３．５４リアジン−２
−イルアミノフルオレセイン、およびフルオレセインイ
ソンアネ−１・。

特に好ましい蛍光物質は、アミツメデルフルオレセイン
、Ｎ−アルギルアミノメチルフルオレセインおよびカル
ボキノフルオレセインである。

フルオレセインは、環境の酸濃度（ｐＨ）に依存して２
つの互変体で存在する。開環（酸）形では、フルオレセ
イン分子（またはフルオレセイン残基を含む化合物）は
、約４ナノ秒の励起状態寿命の後に青色の光を吸収し緑
色の蛍光を放出することができる。開環形と閉環形が共
存する場合には、ｐ　Ｉ−Ｔレベルを調節することによ
り開環形と閉環形の分子の相対濃度を容易に変えること
かできる。

一般に本発明の１〜レーザーはす１ヘリウム塩、カリウ
ム塩、アンモニウム塩などの生物学的に許容し得る塩と
して溶液中で調製されるので、本発明の＝３５＝ トレーサーは開環形の蛍光形で存在することができる。

存在する特定の塩は、ｐＨレベルの調節に用いたバッフ
ァーに依存するであろう。たとえば、リン酸ナトリウム
バッファーの存在下では、本発明のトレーサーは一般に
開環形のナトリウム塩として存在するであろう。

本明細書にいう「フルオレセイン」なる語は、個々の化
合物としてかまたは一層大きな複合体の成分としてかに
かかわらず、蛍光との関連以外では特定の分子として存
在するならば開環形と閉環形の両方を含む。蛍光を生し
るためには開環形であることが必要である。

本発明に従って調製した特定のトレーサーからは、以下
の実施例でも示すように驚くほど良好なアッセイが得ら
れることがわかった。本発明に従ってアッセイすること
のできる分析対象物の濃度は、一般に約１０−２〜約１
０−１３Ｍの範囲、より普通には約ｌ０−４〜約１０−
１０Ｍの範囲である。恭度の高い分析対象物は、もとの
試料を希釈してアッセイすることができる。試料中の分
析対象物の濃度範囲が試薬（すなわちトレーサーおよび
抗体）の濃度範囲を決定するので、個々の試薬の濃度は
アッセイの感度か最適となるように経験的に決定さ、ｉ
するてあろう。当業者であればトレーサーおよび抗体の
適当な濃度範囲を知ることかできる。

（ａ）トレーサーの合成 本発明のトレーサーは、アミノまたはカルボキシル結合
基のいずれかを有するフェネチルアミンハプテンに蛍光
物質を結合させることにより調製する。末端カルホキシ
ル基を有するフェネチルアミンハプテンは、まず該ハプ
テンのカルボン酸残基を活性化することによりアミノ末
端フルオレセイン誘導体に結合させることができる。活
性化は、■、３−ノシクロヘキノルカルボジイミトなと
の活性化試薬を用い、ハプテンをＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミド、１−ヒドロキシベンズトリアゾール、ｐ−二
トロフェノールなとの脱離基試薬と反応させることによ
り行うことができる。ついて、活性化ハプテンをフルオ
レセイン誘導体の塩基性ジメチルホルムアミド中液と反
応させる。Ｎ、Ｎ’−ンスクシンイミンルカーボネート
や２−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３゛−
スルホネートなどの他の活性化基を用いることもできる
。

末端アミンを有するフェネチルアミンハプテンは、アセ
トニトリルかまたはジメチルホルムアミド中でＮ、Ｎ’
−ジスクシンイミノルカーボネートと反応させることに
より、高度に反応性のＮ−ヒドロキシスクシンイミドウ
レタンに変換することができる。ついて、ハプテンウレ
タンをジメチルポルムアミドの塩基溶液中でフルオレセ
イン残基を混合することにより、アミノ末端フルオレセ
イン誘導体への尿素結合を行う。アミノ基含有ハプテン
はまた、ジメチルポルムアミドのような溶媒を用いてＮ
−ヒドロキシスクシンイミドで活性化した５−カルボキ
ンフルオレセインかまたは６−カルボキシフルオレセイ
ンに結合することができる。

結合にあずかるカルボン酸またはアミンに加えてハプテ
ンが第一級アミノ基または第二級アミノ基を含んでいる
場合は、ハプテン同士の反応を防−３８＝ ぐために活性化および結合反応の間にアミン保護基を使
用する必要がある。このことは、当業者に知られた種々
の方法を用いて行うことかできる。

たとえば、ハプテン」二のアミンは、対応するＮ−トソ
フルオロアセトアミド、Ｎ　−Ｌｅｒｔ−ブヂルオキン
力ルポニルウレタン、Ｎ−カルホベンンルオキシウレタ
ンまたは同様の構造を生成することによって保護するこ
とができる。」１記のようにしてフルオレセイン誘導体
への結合反応が完了したら、トレーサーの構造を他の仕
方で変えることのない試薬を用いてアミン保護基を除く
ことができる。

そのような試薬および方法としては、弱（または強）酸
水溶液または酸無水物、弱（または強）塩基水溶液また
は塩基無水物、水素化ホウ素ナトリウムや水素化シアノ
ホウ索ナトリウムなどの水素化物含有試薬、および接触
水素化が挙げられる。

３　アッセイ： 本発明の新規なトレーサーおよび抗体は、アンフェタミ
ン様薬物の蛍光偏光アッセイにおいて優れた結果をもた
らず。本発明のアッセイは、迅速−３９＝ な半定量的蛍光偏光スクリーニングアッセイを提供する
ものであり、試料中の１種または２種以上のアンフェタ
ミン様薬物またはその代謝産物の存在を示すことができ
る。

本発明のアッセイは、下記の一般手順に従って行う。

（＋）容量を測定した、１種または２種以上のアンフェ
タミン様薬物を含有しているかまたは含有していると思
われる標準試料または試験用試料を試験管に入れる。

（２）既知の濃度のトレーサーを試験管に加える。

（３）ｌ記免疫原を用いて産生させた既知の濃度の分析
対象物特異的抗体を試験管に加える。

（４）反応混合物を室温でインキュベートし、限られた
数の抗体決定基に対してトレーサーと分析対象物との間
て競合を起こさせ、トレーサー／抗体複合体および分析
対象物／抗体複合体を生成させる。ついて （５）蛍光偏光法によりｌ・レーザー／抗体複合体の量
を測定して試料中の分析対象物の存在または量を決定す
る。

本発明の原理は手作業で行うアッセイにも適用できるが
、自動性能を有するＴＤｘンステムを用いれば、アッセ
イを行いデータを解釈するための技法上の時間が最小と
なる。その結果は、「ミリ偏光単位（ｍｉｌｌｉｐｏｌ
ａｒｉｚａｔｉｏｎ　ｕｎｉｔｓ）Ｊ、「スパン（Ｓｐ
ａｎ）Ｊ（ミリ偏光単位にて）および「相対強度」によ
り定量化することがてきる。ミリ偏光単位を測定するき
、試料中にアンフェタミン様物質が存在せず最大量のト
レーサーが抗体に結合したときの最大の偏光が示される
。正味のミリ偏光単位が大きくなるほど、トレーサーの
抗体への結合が大きくなる。本発明の目的のためには、
約２００〜約２８０の正味のミリ偏光値が好ましい。約
２２５〜約２５０の範囲の値がより好ましい。約２／Ｉ
Ｏの値が最も好ましい。

スパンは、抗体に結合したトレーサーの量か最大のとき
と最小のときの正味のミリ偏光の差異を示す。スパンが
大きいほどデータの数値分析はよくなる。本発明の目的
のためには、約８０〜約１５０の範囲のスパンが好まし
い。約８５〜約１００の範囲の値がより好ましい。

強度は、バックグラウンドの蛍光を越えるトレーサーの
蛍光シグナルの強さまたは大きさの測定単位である。そ
れゆえ、強度か高いほど一層正確な測定が得られる。強
度は、垂直偏光強度と水平偏光強度を２倍したものとの
合計として決定される。強度は、トレーサーおよび他の
アッセイ変量の濃度に依存して、パックグラウンドノイ
ズの約３倍から約６０倍のシグナルの範囲である。本発
明の目的のためには、パックグラウンドノイズの約１３
倍から約５０倍の強度か好ましい。

本発明の方法を行うときのｐＨは、トレーサーのフルオ
レセイン残基が開環形て存在することのできるのに充分
なものてなければならない。ｐ　Ｉ−Ｉ範囲は、約３〜
約１２、より普通には約５〜約１０、最も好ましくは約
６〜約８である。このｐｉ−■をアッセイ手順中に達成
し維持するために種々のバッファーを用いることができ
る。代表的なバッファーとしては、ホウ酸バッファー、
リン酸バノファー、炭酸バッファー、トリス、バルビツ
ールなどを挙げられる。特定のバッファーを使用するこ
とは本発明にとって重要ではないが、トリスおよびリン
酸バッファーが好ましい。バッファーのカヂオン部分が
一般に溶液中のトレーサーのカヂオン部分を決定するで
あろう。

加えて、所定の分析対象物への試薬の結合や蛍光シグナ
ルの検出を妨害する物質を除くために、１種または２種
以上のアッセイ試薬中にある種の物質を用いることがで
きる。たとえば、試料中のリボフラビンの存在による蛍
光妨害を防ぐために、リボフラビン結合タンパク質（Ｒ
ＢＰ）をアッセイ中に用いることができる。リボフラビ
ン、すなイっちビタミンＢ２は、多くの食品および市販
のビタミン補強剤の共通成分である。リボフラビンは尿
中に排泄され、フルオレセインと同様の蛍光スペクトル
を示す。リボフラビンの通常の摂取では尿中に痕跡量以
上のりホフラヒンを生しることはないが、所定の分析対
象物の検出を妨害しようとする意図を有する被験者によ
り過剰徂のりボフラヒンが摂取された場合の尿試料を用
いた試験結果は歪められたものとなる。

つぎに、実施例に基づき本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限られるものではない。なお、実
施例１〜７は免疫原の合成を、実施例８〜Ｉ８はトＩノ
ーザーの合成を、実施例１９〜２０はアンフェタミン様
物質の蛍光偏光イムノアッセイをそれぞれ説明する。

実施例Ｉ Ｎ−カルボキシメチル−ｄ、ｌ−アンフェタミン〜ＢＳ
Ａ免疫原の合成 ｄ、ｌ−アンファクミン硫酸塩（５００ｘｇ、１．３６
ミリモル）を蒸留水（２０ｉＱ）中に溶解し、ｌＮＮａ
ＯＨを加えてｐｉ−Ｉを１３に調節した。この塩基性溶
液をクロロホルム（２０ｉ１２）で４回抽出した。

抽出物を集めて無水硫酸ナトリウムで乾燥し、有機溶媒
を蒸発させて透明な浦秋物を得た。残渣をクロロポルム
（２０靜）中に再溶解しブロモ酢酸エチル（３３１μρ
、２９９ミリモル）を加えた後、この溶液を２４時間加
熱還流した。トリエチルアミン（３７８μＱ、２７２ミ
リモル）を加え、この溶液をさらに２時間還流した。こ
の溶液を酢酸ゴ。

デル（３０ｘＣ）て希釈し、水（＋ｏｏ＊Ｑ）で３回洗
浄し、ついで有機抽出物を集めて無水硫酸ナトリウムで
乾燥することによって反応生成物を単離しノー。

真空下で溶媒を蒸発させてＮ−カルボエトキノメチル−
ｄ、ｌ−アンフェタミン（５０９＋＋＋ｇ）を無色の油
状物として得た。

Ｎ−カルポエトギシメチルーｄ、ｌ−アンフェタミン（
３１３Ｍｈ、１．４１ミリモル）を無水テトラヒドロフ
ラン（２Ｏｍｇ）中に溶解した。ついで、ンーｔｅｒｔ
−プチルンカーホネート（３２８μＣ１２１２ミリモル
）および４−Ｎ、Ｎ−ツメチルアミノピリノン（２０π
ｇ）を加えて反応混合物を生成させた。この反応混合物
をトリエチルアミン（２＋７７１Ｑ、１．５６ミリモル
）のジメチルホルムアミド（２，０ｆｆｆ２）中の溶液
で処理し、室温て６時間撹拌した。この溶液を酢酸エチ
ル（２０ｉＱ）て希釈し、水（１００ｚＣ）で５回洗浄
し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて反応生成
物を単離した。真空下で溶媒を蒸発させてＮ−ｔｅｒｔ
−ブトキンカルボニル−Ｎ−カルボエトキシメチル−ｄ
、ｌ−アンフェタミン（４００ｍｇ）を無色の油状物と
して得た。

Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキンカルボニル−Ｎ−カルボエトキ
シメチル−ｄ、］−アンフェタミンＣ３８１ｍｇ、１１
８ミリモル）を、メタノール（６，０ｘｆｆ）と１０％
水酸化ナトリウム水溶液（４，０ｘＣ）の溶液中に溶解
した。室温で３時間撹拌した後、この塩基性溶液をクロ
ロホルム（２０ｍＱ）で３回洗浄した。

ＩＮ　ＨＣＩを用いて水相をｐＨ３に調節し、クロロホ
ルム（＋５ｆｆｃ）で３回抽出し、ついで無水硫酸ナト
リウムで乾燥させた。真空下で溶媒を除いてＮ　−ｔｅ
＋ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−カルボキノメチルーｄ
、Ｉ−アンフエクミン（＋７０ｆｆ９）を無色の４１１
状物として得た。

Ｎ−Ｌｅｒｔ−ブトギシカルボニルーＮ−カルポキンメ
チル−ｄ、ｌ−アンフェタミン（２４ｚｇ、００８３ミ
リモル）を無水ツメチルポルムアミド（４００μＱ）中
に溶解し、ついてＮ＝ヒドロギンスクンンイミド（Ｉ　
Ｏｍｇ、　　０．０９２ミリモル）とジンクロヘキンル
カルポジイミド（１９ｍ７．００９２ミリモル）の混合
物で処理した。室温で６時間撹拌した後、Ｎ−ヒドロキ
ノスクシンイミド（１０並、０．０９２ミリモル）およ
びシンクロへギンルカルボジイミド（１９１１９，００
９２ミリモル）をさらに加え、この懸濁液をさらに３時
間撹拌した。この撹拌か終わった時点て懸濁液を濾過し
、メタノール（４００μｃり含有０　、　Ｉ　Ｎ　’）
　ン酸バッファー（３６１１夕、ｐＨ８，０）中のＢＳ
Ａ（１４ｌａｇ）の撹拌溶液に滴下した。室温で１８時
間撹拌した後、得られた懸濁液を濾過し、蒸留水に対し
て充分に透析した。このタンパク質溶液を凍結乾燥して
白色粉末（１３１ａ９）を得た。ついて、この乾燥免疫
原をクロロポルム（ＩＯｌｌＣ）中に＠澗し、無水トリ
フルオロ酢酸（ＩＯ７７Ｃ）を加えることにより、ハプ
テン残基からＬｅｒｔ−ブトキノカルボニル基を除いた
。

得られた透明な溶液を室温で５分間撹拌し、ついで真空
蒸発して透明な油状残渣を得た。ｐＨを１１に上げるの
に充分な量のｌＮＮａＯＨを加え、この溶液を蒸留水に
対して充分に透析した。このタンパク質溶液を凍結乾燥
してＮ−カルホキジメチル−ｄ、ｌ−アンフェタミン免
疫原（２０２ｘｇ）を白色の綿毛状の固体として得た。

実施例２ Ｎ−カルポニルーフエンテルミン〜ＢＳＡ免疫原の合成 無水アセトニトリル（５、ＯｍＱ）中に溶解したフエン
テルミン塩酸塩（１００７！ｙ、０５４ミリモル）を、
同溶媒（Ｉ　Ｏｍの中に溶解したジスクシンイミジルカ
ーボネート（２７６７１ｇ、１，０８ミリモル）の撹拌
溶液に１５分間力）１−１で滴下した。室温で３時間撹
拌した後、真空下で溶媒を除去し、残渣をクロロポルム
中に集めた。この残渣を、水（２０ｍＱ）、Ｉ　ＨＨＣ
ｌ（２０ｍ（Ｄ、水（２０ｍｆ２）、飽和重炭酸ナトリ
ウム溶液（２０ｆｆ１２）および食塩水（２０ｍｇ）で
２回洗浄した。有機抽出物を硫酸マクネンウムて乾燥さ
せた後、溶媒を蒸発させてフエンテルミンーＮ−ヒドロ
キンスクシンイミドウレタン（１１０ｍｇ）を得た。

ンメチルホルムアミドとテトラヒドロフランとの１１溶
液（４００μＱ）中に溶解したフエンテルミンーＮ−ヒ
トロギソスクノンイミドウレタン（２０ｍｇ、００７ミ
リモル）を、リン酸バッファー（１０ｖｒ（１，ｐｉ−
Ｉ８．２）中に溶解したウシ血清アルブミン（ｚ９ｙｔ
ｇ）に加えた。室温で一夜撹拌した後、この溶液をリン
酸バッファー、ついて蒸留水に対して充分に透析した。

このタンパク質溶液を凍結乾燥して、表記免疫原（Ｉ］
Ｏｘｇ）を白色綿毛状の固体として得た。

（以下余白） 寒旌甜主 α−メチル−ｄ、ｌ−フェニルアラニン〜ＢＳＡ免疫原
の合成 α−メチル−ｄ、ｌ−フェニルアラニン（１００ｍ八〇
　へ６ミリモル）のピリジン中の撹拌懸濁液に、無水ト
リフルオロ酢酸（１，０ｘＱ、７．０８ミリモル）を０
℃にて滴下した。固体は徐々に溶解し、溶液は淡黄色に
なった。さらに２０分間撹拌した後、冷却浴を除き、撹
拌をさらに１時間続（Ｊた。

ついて、この溶液を水上に注ぎ、２ＮＨＣｕｌＯ靜）で
酸性にし、酢酸エチル（１５ｍので抽出した。有機相を
集めて食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。真
空蒸発させてＮ−トリフルオロアセチル−α−メメチー
ｄ、ｌ−フェニルアラニン（１５０ｆｇ）を得た。

ジシクロへキノルカルホジイミド（１９７１９，０゜０
９２ミリモル）、Ｎ−ヒドロキノスクソンイミト’（Ｉ
　１１１１ｇ、　　０．０９２ミリモル）およびＮ−ト
リフルオロアセチル−α−メチル−ｄ、Ｉ−フェニル７
−ｙ−ニア（２３ｘｙ、００８３ミリモル）を無水ツメ
デルポルムアミド（５００μＱ）中に溶解した。

この反応混合物を室温で３時間撹拌した。この不透明な
懸濁液を濾過し、ついてＯ，１Ｎリン酸ノ＼・ノフｙ−
（３，６ｍＬ　ｐＨ８）中に溶解したＢＳＡ（１４１次
０の撹拌溶液に滴下した。室温で１８時間撹拌した後、
このＶ−濁液を蒸留水に対して充分に透析し、凍結乾燥
して白色の綿毛状の粉末（１３５ｍｙ）を得た。このタ
ンパク質をメタノール（９゜ＯｍＱ）、ピペリジン（３
，０１１ｆりおよび飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１，
０＋＋＋Ｑ）の溶液中に溶解することにより、Ｎ−トリ
フルオロアセチル保護基を除いた。水で容量を３０ｍＱ
に調節した。室温て６時間放置した後、この溶液を蒸留
水に対して充分に透析し、凍結乾燥して表記免疫原（Ｉ
Ｏ＝１ｉｇ）を白色の綿毛状粉末として得た。

実施例４ Ｎ−カルボギンメチル−フェニルプロパノ−ルアミン〜
ＢＳＡ免疫原の合成。

フェニルプロパツールアミン（６，７８ｇ、４４゜９ミ
リモル）をクロロホルム（４０ｍｇ）中に溶解し、還流
した。ブロモ酢酸エチル（５，９７９，５３８ミリモル
）を滴下し、得られた懸濁液をさらに３０分間還流した
。トリエチルアミン（６，８７ｍＬ４．９．３ミリモル
）を加えて生成物の塩を溶解し１こ。

全部で７時間加熱した後、溶媒を真空下で除いて油状結
晶残渣を得た。この残渣を酢酸エチル（５０ｍＱ）とＴ
−Ｉ　ＣＩ溶液（２０Ｍ、ｐＨ１）との間に分配した。

水相を取り、ｌＮＮａＯＨでｐＨ７に調節１７、クロロ
ポルム（２０ｉＱ）で３回抽出した。有機抽出物を硫酸
ナトリウムで乾燥した後、溶媒を除いてＮ−カルボエト
キシメチルーフェニルプロバノールアミン（７，１９９
）を無色の油状物として得た。

Ｎ−カルボエトキシメチルーフェニルプロパノ−ルアミ
ン（２，５７ｇ、］　０．８ミリモル）およびシーＬｅ
ｒｔ−ブヂルノノノーポネ−１−（２，０１ｇ、Ｉ３．
０ミリモル）を無水テトラヒドロフランＣ２ＧｒｎＯ中
に溶解した。ついて、トリエチルアミン（２７３ｍ１２
．１９６ミリモル）および４−Ｎ、Ｎ−ンメチルアミノ
ビリンン（２０Ｍ９）を加えた。室温で３時間撹拌した
後、さらに５００μｇのジーｔｅｒｔ−ブヂルンカーホ
ネート（３２ミリモル）を加え、撹拌をさらに１時間続
（）１コ。この溶液を真空濃縮し、酢酸エチル（３０〃
の中に溶解し、水（２０Ｍのて４回洗浄し、硫酸ナトリ
ウムで乾燥した。溶媒を除去して粗製の生成物（４、１
ｈ）を得た。この生成物をシリカケルカラム」二のクロ
マトグラフィーにかけて、Ｎ　−ｔｅｒｔ−ブトギン力
ルホニルーＮ−カルボエトキシメヂル−フェニルプロパ
ツールアミンのノアステレオマ−混合物（３，３ｇ）を
得た。

Ｎ　−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−カルボエト
ギソメヂルーフェニルプロパノールアミン（１７８！？
、５．３０ミリモル）を、テトラヒドロフラン（２０祿
）、メタノール（２０靜）および１０％水酸化ナトリウ
ム水溶液（２０ｉＱ）からなる溶液中に溶解した。撹拌
を３時間続け、ついてこの淡黄色の溶液を水（５０ｎ０
．）で希釈し、クロロポルム（３０靜）で３回抽出した
。この水溶液を２Ｎ　ＨＣＩでｐＨ４に調節し、ついて
クロロホルム（２０ｏ２）で抽出した。有機抽出物を集
めて硫酸ナトリウムで乾燥し、真空蒸発してＮ　−ｔｅ
ｒｔ−ブトキンカルボニル−Ｎ−カルポギシメチルーフ
ェニルプロパノールアミン（０，９６ｇ）を白色の泡と
して得た。

Ｎ　−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−カルボキン
メチル−フェニルプロパツールアミン（７３ｍｇ、０２
４ミリモル）、ジンクロヘギンルカルボジイミド（９７
ｍｇ、０．４７ミリモル）およびＮ−ヒドロキシスクン
ンイミド（５４１１９，０，４７ミリモル）を、室温に
て無水ジメチルホルムアミド（ｌ　、　５　ｍＱ）中に
溶解し、室温にて３時間撹拌した。得られた懸澗液を濾
過し、０．１Ｍリン酸バッファー（７２ｍ（！、ｐＨ８
）中に溶解したＢＳＡ（４０１ｚｇ）の撹拌溶液に滴下
した。−夜撹拌した後、この溶液を水（ＩＯｕＯ）で希
釈し、蒸留水に対して充分に透析した。凍結乾燥して白
色の綿毛状の粉末（３９５＊ｇ）を得た。このタンパク
質を塩化メチレンとトリフルオロ酢酸との１．１溶液（
５０ｚＣ）中に溶解することにより、ｔ−ＢＯＣ保護基
を除いた。この透明な溶液を室温で５分間撹拌した後、
溶媒を真空除去し、得られた油状残渣を重炭酸ナトリウ
ムの４％水溶液（３０ｍ（り中に溶解した。この塩基性
溶液を蒸留水に対して充分に透析し、凍結乾燥してＮ−
カルボキシメチルーフェニルプロノくノールアミン免疫
原（３５７ｉ！７）を得た。

実施例５ Ｎ−メチルーｄ、］−フェニルアラニン〜ＢＳＡ免疫原
の合成・ １ｌ−ＢＯＣ−Ｎ−メチル−ｄ、ｌ−フーｒ−ニルアラ
ニン（４９Ｂ、０．１フロミリモル）をンメチルホルム
アミド（ｏ、ｓｏ酎）中に溶解した。この溶液にＮ、Ｎ
’−ジスクンンイミジルカーボネート（５−５５＝ ４ｍｇ、０．２１１　ミリモル）を加え、この反応混合
物を窒素雰囲気下で２時間撹拌した。ついて、この反応
混合物を、リン酸バッファー（６，３ｕ０．、ＯＬＭ、
ｐＨ７，５）と１．４−ジオキサン（２３ｍの中に溶解
したＢＳＡ（３００ｍｇ、０．００４４ミリモル）の溶
液に滴下した。６時間撹拌した後、この反応混合物を蒸
留水に対して透析し、ついで凍結乾燥した。生成物の収
量は、Ｎ−ＢＯＣ−Ｎ−”メチルーｄ、Ｉ−フェニルア
ラニン〜ＢＳΔ（２５８ｍｇ）であった。

Ｎ−ＢＯＧ−Ｎ−メチル−ｄ、Ｉ−フェニルアラニン−
Ｂ　Ｓ　Ａ（２３０ｍ９）を塩化メチレン（ＩＥＭｃ）
中に部分的に溶解した。トリフルオロ酢酸（１５ｘＱ）
を加え、この反応、昆合物を５分間撹拌した。溶媒を真
空除去し、得られた残渣をリン酸バッファー（４０ｉＱ
、Ｏ，１Ｍ、ｐＴ（７，５）中に再溶解し、反応混合物
を蒸留水に対して充分に透析した。凍結乾燥後の生成物
の収量は、表記免疫原（１８２ｍｇ）てあった。

実施例６ ｄ、ｌ−フェニルアラニン〜ＢＳΔの合成。

Ｎ−ＢＯＣ−１−フェニルアラニン（２３，５Ｎ９．０
．０８８６ミリモル）とＮ−ＢＯＣ−ｄ−フェニルアラ
ニン（２３，５ｍｇ、０．０８８６ミリモル）とをジメ
チルホルムアミド（０，５０１１＋（り中で混合し、実
施例５（Ｎ−メチルーｄ、ｌ−フェニルアラニン〜ＢＳ
Ａ）に記載した手順に実質的に従ってＢＳＡ（３００ｍ
ｇ、０．００４４ミリモル）に結合させた。生成物の収
量は、Ｎ−ＢＯＣ−ｄ、］−フェニルアラニン〜ＢＳＡ
（１９８７１ｇ）であった。

実施例５（Ｎ−メチルーｄ、ｌ−フェニルアラニン〜Ｂ
ＳＡ）に記載の手順に実質的に従い、Ｎ−ＢＱＣ−ｄ、
ｌ　　フェニルアラニン−ＢＳＡ（１７ｏｘｙ）をトリ
フルオロ酢酸／塩化メチレンと反応させた。

生成物の収量は、免疫原（１３５Ｒｙ）であった。

実施例７ ■−カルホキンメトキシーフェンテルミン〜ＢＳＡ免疫
原の合成・ ２−アミノ−２−メチル−１−プロパツール（２９，２
２，４ミリモル）をジメチルホルムアミド（２０ｘｆＤ
中に溶解した。トリエチルアミン（５，’６ｘｉ２．４
０３ミリモル）およびンーｔｅｒｔ−ブヂルジカーボネ
−１−（５，３８ｇ、２４．７ミリモル）を加え、この
反応混合物を窒素雰囲気下で１６時間撹拌した。溶媒を
真空除去し、得られた粗製の生成物をシリカゲルカラム
上で酢酸エチルで溶出して精製した。生成物の収量は、
３．９８ｉ？てあった。

得られた１１−ＢＯＣ−２−アミノル２−メヂルー■−
プロパツール（３，６９９，１９，５ミリモル）を塩化
メチレン（７４ｍρ）中に溶解し、塩化メチレン（８９
ｉρ）中のデスーマーチンパーヨーディナン（Ｄｅｓｓ
−Ｍａｒｇｉｎ　ｐｅｒｉｏｄｉｎａｎｅ）［ｌ　０　
、７５　ｇ、２５゜３５ミリモル、アルドリッヂ・ケミ
カル・カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
　Ｃｏｍｐａｎｙ）、ミルウォーギー、Ｗ＋］の撹拌懸
濁液に加えた。窒素雰囲気下で２０分間撹拌した後、こ
の反応混合物をノエチルエーテル（３７０ｘ＆）で希釈
し、水酸化ナトリウム（１４８＊Ｃ１１，３Ｍ）中に注
ぎ、１０分間撹拌した。水酸化ナトリウム水溶液層を分
離し、廃棄した。残った有機溶液を水酸化ナトリウム（
１４８１１１（！、１．３Ｍ）および水（１８５ｉＣ）
で順番に洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶
媒を真空除去してＮ−ＢＯ（、−２−アミノ−２−メチ
ル−１−プロパナール（３，２１ｙ）を得た。

Ｎ−ＢＯＣ−２−アミノ−２−メチルーＩ−プロパナー
ル（１ｇ、５３４ミリモル）を新たに蒸留したテトラヒ
ドロフラン（１０ｍ（２）中に溶解し、−７８℃に冷却
した。フェニルリヂウム（６，５ｉＱ。

１１．７５ミリモル）を加え、この溶液を一７８°Ｃて
１０分間撹拌した。ついで、酢酸でｐＨを４に調節した
。この反応混合物を氷水（２００ｘｆｆ）中に注ぎ、ン
エヂルエーテル（２００ｉρ）ですばやく抽−５９＝ 出した。有機抽出物を水（２Ｘ２００ｚρ）で洗浄し、
硫酸マグネシウムで乾燥した。ついで溶媒を真空で除去
した。粗製の生成物をシリカゲルカラム上で酢酸エヂル
／ヘキザン（２０／８０）で溶出して精製した。生成物
の収量は、Ｎ−ＢＯＣ−１−ヒドロキシーフェンテルミ
ン（９５６１１９）であった。

水素化ナトリウム（２８８即、６０％、７．２０ミリモ
ル）をヘキサジで洗浄し、ジメチルホルムアミド（４，
５ｚρ）中に撹拌懸副し、０°Ｃに冷却した。Ｎ−ＢＯ
（、−１−ヒドロキシーフェンテルミン（９１９Ｂ、３
４６ミリモル）をツメデルホルムアミド（２，０ａｊ）
中に溶解し、上記水素化ナトリウム懸濁液に加え、この
反応混合物を窒素雰囲気下、０℃にて２０分間撹拌した
。この時点てブロモ酢酸エチル（０，４，７９ｍＱ、　
４．．３２ミリモル）を加え、この反応混合物を窒素雰
囲気下、０°Ｃにて４５分間撹拌した。ついで、この反
応溶液を酢酸エチル（５０ｉ１２）で希釈し、酢酸でｐ
ｌ（５に調節し、濾過した。濾液の溶媒を真空除去し、
得られた粗製の生成物をシリカゲルカラム上で酢酸エチ
ル／ヘギザン（２０／８０）で溶出して精製した。

生成物の収量は、Ｎ−ＢＯＣ−１−カルボエトギンメト
キン〜フェンテルミン（１４，５ｘｇ）であった。

Ｎ−ＢＯＣ−１−カルポエトキンメトキノ−フェンテル
ミ：／（１４５ｉ９．０４１３ミリモル）をメタノール
（１，５１Ｑ、）中に溶解し、０°Ｃに冷却し、水酸化
ナトリウム（０，８２５杼、ＩＭ、０８２５ミリモル）
を加えた。０°Ｃて４０分間撹拌した後、０．１Ｍ塩酸
でｐＴ−１５に調節し、溶媒を真空除去した。得られた
白色固体を酢酸エチル（１００叶）でトリヂュレートし
、濾過した。濾液の溶媒を真空除去してＮ−ＢＯＣ−１
−カルポキンメトギン−フェンテルミン（１１０ｚ９）
を得た。

Ｎ−ＢＯ（、−１−カルボキノメ１−ギンーフェンテル
ミン（６２，０ｘ９．０１９２ミリモル）をツメデルホ
ルムアミド（０，５０ｉＱ）中に溶解しｆこ。入Ｔ−ヒ
ドロキシスクノンイミド（２６Ｍ９．０．２３０ミリモ
ル）および１．３−ノシクロヘキシルカルホジイミト（
４７ｍｇ、０２３０ミリモル）を加え、この反応混合物
を窒素雰囲気下で１７時間撹拌した。ついで、この反応
混合物を濾過し、Ｏ，１Ｍリン酸ハソファー（５，４Ｒ
ＱＳｐｉ（７，６）とｐ−ジオキサン（３，６ｉＱ）中
に溶解したＢＳＡ（３２６ｍｇ、０．００４８ミリモル
）の溶液に滴下した。６時間撹拌した後、この反応混合
物を蒸留水に対して充分に透析し、凍結乾燥してＮ−Ｂ
ＯＣ−［−カルボキノメ）・キンーフェンテルミン〜Ｂ
ＳＡ（１６６ｍｇ）を得た。

実施例５（Ｎ−メチルーｄ、ｌ−フェニルアラニン〜Ｂ
ＳＡ）に記載した手順に実質的に従い、Ｎ−ＢＯＣ−１
−カルポキシメトキンーフエンテルミン〜ＢＳＡ（８０
Ｍ＠）をトリフルオロ酢酸／塩化メヂレンと反応させた
。生成物の収量は、表記免疫原（７ｅｘｇ）であった。

実施例８ Ｎ−アセタミドメチルフルオレセイン−ｄ、１−アンフ
ェタミントレーサーの合成 Ｎ−ＢＯＣ−Ｎ−酢酸−ｄ、ｌ−アンフェタミン（３０
ｍ！？、０１０２ミリモル）をツメデルホルムアミド（
０，４００ｉの中に溶解した。Ｎ−ヒ１−口キンスクシ
ンイミド（１４ｕｇ、０．１２３ミリモル）、ついて１
．３〜ンシクロヘキンルカルポジイミド（２５ｍ９、Ｏ
１２３ミリモル）を加え、この反応溶液を窒素雰囲気下
で１６時間撹拌した。ついて、この溶液を、アミノメチ
ルフルオレセイン塩酸塩（４Ｉｒｔｒｇ、０．１０２ミ
リモル、トリエチルアミンてｐＨを９に調整）を入れた
フラスコ中に濾過し、この溶液を窒素雰囲気下て１時間
撹拌した。溶媒を真空下で除去し、得られた粗製の生成
物を、２つの１．ＯｕｍＣＩ８逆相プレパ逆相プレパラ
ンイブ薄層クロマトグラフィープレート上ノール／酢酸
（３０／７０１０．４−）で溶出して精製した。精製し
た生成物の収量は、Ｎ−ＢＯＣ−Ｎ−アセタミドメチル
フルオレセイン−ｄ、ｌ−アンフェタミン（３４仄９）
であった。

Ｎ−ＢＯＣ−Ｎ−アセタミドメチルフルオレセイン−ｄ
、ｌ−アンフェタミン（３／Ｉｍｇ、００５３４ミリモ
ル）を塩化メチレン（０，５０ｘＱ）中に溶解した。ト
リフルオロ酢酸（０，５０順）を加え、５分間撹拌した
後、溶媒を真空除去した。得られた残渣を塩化メチレン
（約］ＯｍＱ）中に再溶解し、トリエチルアミンでｐＨ
を９に調節した。溶媒を再び真空除去し、得られた粗製
の生成物を、２つの１．０ｉｉＣ１８逆相プレパ逆相プ
レパラティブトグラフィープレート上で水／メタノール
／酢酸（３０／７０１０．４）で溶出して精製した。精
製した生成物の収量は、Ｎ−アセタミドメチルフルオレ
セイン−ｄ、ｌ−アンフェタミントレーサー（２６ｆｆ
？）であった。

実施例９ ５−カルボギシフルオレセインフェンテルミンアミドお
よび６−カルポキンフルオレセインフエンテルミンアミ
ドトレーサーの合成・ フエンテルミン塩酸塩（５０ｇｇ、０２７ミリモル）を
ジメチルポルムアミド（１，０ｉｆ２）中に溶解した。

この溶液に室温で撹拌しながらトリエチルアミン（２７
ｚｙ）を加え、ついで５−カルボキノフルオレセイン−
Ｎ−ヒドロキンスクシンイミドエステル（１’２７ｍ９
．０．２７ミリモル）を加えた。得られたオレンジ色の
溶液を室温、暗所にて１８時間撹拌した。溶媒を真空除
去し、５−カルボキノフルオレセインフェンテルミンア
ミド）・レーザーをプレパラティブ薄眉クロマトクラフ
ィーにより単離した。

５−カルボキンフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステルの代わりに６−カルポキシフルオレセ
インーＮ−ヒ）・ロギソスクソンイミドエステルを用い
た他は同様にして、６−カルポキシフルオレセインフエ
ンテルミンアミドトレーサーを得た。

（以下余白） 実施例１０ アミノメチルフルオレセインーフエンテルミン尿素ｌ・
レーザーの合成 実施例２に記載の手順に実質的に従い、フェンテルミン
ーＮ−ヒドロギシスクノンイミドウレタンを調製した。

フェンテルミンーＮ−ヒドロキシスクンンイミドウレタ
ン（５０即ｇ、０１７ミリモル）およびアミツメデルフ
ルオレセイン塩酸塩（６９ｍｇ、Ｏ１９ミリモル）を無
水ジメチルホルムアミド（１，０ｘ（！、トリエチルア
ミン（１７ｚ９）を含有）中に溶解した。室温で２時間
撹拌した後、得られたトレーサー生成物を、溶離液とし
て水／メタノール（８／２）を用いた逆相プレパラティ
ブ薄層クロマトグラフィーにより単離した。アミノメチ
ルフルオレセインーフェンテルミン尿素トレーサーの収
量は２８即であった。

一６６＝ 実施例１１ Ｎ−（２−アミノエヂル）−ｄ、Ｉ−アンフェタミン５
−および６−カルボ′キンフルオ１ノセインアミ）・ト
レーサーの合成・ ２−ブロモ−１−フェニルプロパン（１，Ｉ　Ｉｙ、５
．５８ミリモル）およびエチレンジアミン（９５５９，
１５９ミリモル）を混合し、１８時間還流した。過剰の
エチレンジアミンを高真空下で除き、得られた残渣を０
　、　Ｉ　Ｎ　Ｎａ０Ｈ（５０ｚｆりとベンゼン（１０
０ｚＱ）との間に分配した。有機相を水（５０好）で３
回洗浄し、ベンゼン層を硫酸マグネンウムで乾燥し、蒸
発させてＮ−（２−アミノエヂル）−ｄ、ｌ−アンフェ
タミン（０，５０９）を無色油状物として得た。

Ｎ−（２−アミノエヂル）　−ｄ：、＋−アンフェタミ
ン（２”ｌｒｔｒｇ、０．１５ミリモル）および５−カ
ルホキンフルオレセインＮ−ヒドロギンスクンンイミド
エステルと６−カルポキンフルオレセインＮ−ヒドロキ
シスクノンイミトエステルとのＩ　Ｉ混合物（７２ｍｇ
、０．＋５．：リモル）をジメチルホルムアミド（］　
、Ｏｍ夕、トリエチルアミン（２１μρ）を含有）中で
混合した。室温で１８時間撹拌した後、溶媒を真空除去
し、溶離液としてメタノール／水／トリフルオロ酢酸（
４０１５９／］）を用いた逆相ブレパラティブ薄層クロ
マトクラフィーにより表記トレーサーを単離した。

実施例１２ Ｎ−（３−アミノプロピル）−ｄ、ｌ−アンフェタミン
５−カルボキシフルオレセインアミドトレーサーの合成
： ２−ブロモ−１−フェニルプロパン（１，２４，ｙ、６
２３ミリモル）およびプロピレンジアミン（１５、Ｏｍ
ρ、１８０ミリモル）を無水エタノール（Ｉ２０ｚρ）
中で混合し、１８時間還流した。過剰のプロピレンジア
ミンを高真空下で除き、得られた残渣を濾過して不溶の
塩を除き、４Ｎ　Ｎａ０１（（１０ｍＱ）とベンゼン（
５０ＵＣ）との間に分配した。有機相を水（５ｍ（りで
２回洗浄し、ベンゼン層を硫酸マグネシウムで乾燥し、
蒸発させてＮ−（３−アミノプロピル）−ｄ、ｌ−アン
フェタミンを無色油状物として得た。

Ｎ−（３−アミノプロピル）−ｄ、ｌ−アンフェタミン
（３５ｍｇ、０．１２ミリモル）および５−カルポギソ
フルオレセインＮ−ヒトロキノスクンンイミドエステル
（５５ｕｙ、０１２ミリモル）を無水のジメチルポルム
アミド（６００７１ｆり中に溶解した。室温で１８時間
撹拌した後、溶媒を高真空下で除去し、溶離液としてメ
タノール／水（８０／２０）を用いた逆相プレパラティ
ブ薄層りロマトグラフィーにより表記トレーサーを単離
した。

実施例１３ Ｎ−メチルーｄ、Ｉ−フェニルアラニンーエヂレンジア
ミン−５−ノＪルボキノフルオレセインアミトトレーサ
ーの合成： Ｎ−メチル−１−フェニルアラニン（３００ｍｇ、１．
６８ミリモル）およびＮ−メチルーｄ−フェニルアラニ
ン（３ｏｏｉｇ、１．６８ミリモル）をツメチルホルム
アミド（６，０ｕρ）中で混合した。トリエチルアミン
（０，８４ｙｔρ、６．０４ミリモル）およびジーｔｅ
ｒｔ−プチルンカーボネート（０，８４６ｕρ、３．６
９ミリモル）を加え、この反応混合物を窒素雰囲気下で
１８時間撹拌した。ついで反応混合物を濾過し、溶媒を
真空除去してＮＢＯＣ−Ｎ−メチルーｄ、ｌ−フェニル
アラニン（１，１９）を淡黄色の油状物（いくらかのジ
メチルポルムアミドは依然存在している）として得た。

得られたＮ−ＢＯＣ−Ｎ−メチルーｄ、Ｉ−フェニルア
ラニン（５０ｚｇ、０１７９ミリモル）をジメチルポル
ムアミド（０，５０ｚＱ）中に溶解した。

Ｎ、Ｎ’−ジスクンンイミジルカーボネート（５５ｍ？
、０．２１５　ミリモル）を加え、この反応混合物を窒
素雰囲気下で２時間撹拌した。ついて、この反応混合物
の小アリコート（０、Ｉ　５６ｚ（！、００５６ミリモ
ル）を、ジメチルポルムアミド（０５０ｉＱ）中に溶解
したＮ−５〜カルポギシフルオレセインーエヂレンジア
ミン（２４ｍ９．０．０５６ミリモル）の溶液に加えた
。トリエチルアミンを用いてＩ）Ｈを９に調節し、この
反応混合物を窒素雰囲気下で３０分間撹拌した。溶媒を
真空除去し、得られた生成物を］、　、　Ｏｍｍソリカ
ケルプレパラティブ薄層クロマトグラフィープレート上
で酢酸エチル／メタノール（８０／２０）て溶出するこ
とにより単離した。生成物の収量は、Ｎ−１３０Ｃ−Ｎ
　−メチル−ｄ、ｌ−フェニルアラニンーエヂレンンア
ミンー５−カルボキノフルオレセイン（＋９ｆｆ９）で
あった。

実施例８（Ｎ−アセタミドメチルフルオレセイン−ｄ、
ｌ−アンフェタミントレーサー）に記載した手順に実質
的に従い、」二記生成物（１９Ｂ、００２８ミリモル）
をトリフルオロ酢酸／塩化メヂレンと反応させた。生成
物の収量は、表記トレーサ７ｌ− −（１４ｚｙ）であった。

実施例１４ Ｎ−メチルーｄ、ｌ−フェニルアラニンーアミノメヂル
フルオレセイントレーサーの合成：１ｌ−ＢＯＣ−Ｎ−
メチルーｄ、ｌ−フェニルアラニン（５０ｍ９．０１７
９ミリモル）をジメチルポルムアミド（０，５０ｉＱ、
）中に溶解した。Ｎ、Ｎ″−ジスクシンイミジルカーボ
ネート（５５π９．０．２１５ミリモル）を加え、この
反応混合物を窒素雰囲気下で２時間撹拌した。ついて、
この反応混合物の小アリコー１−（０，３００ｍ１２．
０．１０８ミリモル）を、ツメチルホルムアミド（０，
２０ｉＱ）中に溶解したアミツメデルフルオレセイン塩
酸塩（３５ｍｇ、００８８ミリモル）の溶液に加えた。

トリエチルアミンを用いてｐＨを９に調節し、この反応
混合物を窒素雰囲気下で６０分間撹拌した。溶媒を真空
除去し、得られた生成物をｌＯｒｎｍノリカケルプレパ
ラティブ薄層りロマトクラフィープレート上で酢酸エチ
ル／メタノール（８０／２０）て溶出することにより単
離した。生成物の収量は、Ｎ−ＢＯＣ−Ｎ−ノヂルーｄ
、ｌ−フェニルアラニン−アミノメチルフルオレセイン
（２７＋１１９）であった。

実施例８（Ｎ−アセタミドメチルフルオレセイン−ｄ、
ｌ−アンフェタミントレーサー）に記載した手順に実質
的に従い、Ｎ−ＢＯＣ−Ｎ−メチルーｄ、ｌ−フェニル
アラニン−アミノメチルフルオレセイン（２３ｍｇ、０
．０３７ミリモル）をトリフルオロ酢酸／塩化メヂレン
と反応させた。生成物の収量は、表記トレーサー（１４
ｍｇ）であった。

実施例１５ ｄ、ｌ−フェニルアラニンーアミノメチルフルオレセイ
ントレーサーの合成 Ｎ−ＢＯＣ−１−フェニルアラニン（１０η、００３７
５ミリモル）およびＮ−ＢＯＣ−ｄ−フェニルアラニン
（１，Ｏ１１ｇ、０．０３７５ミリモル）をシメチルホ
ルムアミド（０，’２０ｕρ）中で混合した。

２−エチル−５−フエニルイソキザゾリウム−３′−ス
ルホネート（１９ｘｇ、００７５ミリモル）、ついでト
リエチルアミン（０，０１ＯｍＱ、　　０．０７５ミリ
モル）を加え、この反応混合物を窒素雰囲気下で３０分
間撹拌した。ついて、この反応混合物を、ツメチルホル
ムアミド（０，２０ｕρ）中に溶解したアミツメデルフ
ルオレセイン塩酸塩（ｌ　Ｏｘ９．００２５ミリモル）
とトリエチルアミン（０６００５ｒρ、０．０３６　ミ
リモル）の溶液に加えた。

窒素雰囲気下で１８時間撹拌した後、溶媒を真空除去し
、得られた生成物を１，０ｘｚＣＩ８逆相プレパ逆相プ
レパラティブトグラフィープレート」二て水／メタノー
ル／酢酸（３０／７０１０．４）で溶出することにより
単離した。生成物の収量は、Ｎ−ＢＯＣ−ｄ、ｌ−フェ
ニルアラニン−アミツメデルフルオレセイン（９，５ｚ
ｙ）であった。

実施例８（Ｎ−アセタミトメチルフルオレセインーｄ、
１−アンフェタミントレーサー）に記載した手順に実質
的に従い、上記生成物（９，Ｅｉｍｇ、００１５６ミリ
モル）をトリフルオロ酢酸／塩化メヂレンと反応させた
。生成物の収量は、表記トレーサー（６，０ｉ９）であ
った。

実施例ｌ６ Ｎ−カルポキンエヂルーアンフェタミン−アミノメチル
フルオレセイントレーサーの合成フェニルアラニン（１
００７１ｇ、０７４５ミリモル）を無水メタノール（２
，０，Ｉ＋の中に溶解した。β−アラニン（３９１３＋
９．４．４７ミリモル）、ついて水素化シアノポウ素ナ
トリウム（９４ｍｇ、１．４９ミリモル）を加えた。窒
素雰囲気下で１８時間撹拌した後、この反応混合物を濾
過し、濾液の溶媒を真空除去した。得られた粗製の生成
物を、４つの１．０７１ｘＣＩ８逆相プレパラティブ薄
層クロマトグラフィープレート上て水／メタノール／酢
酸（４０／６０１０．４）で溶出することにより精製し
た。得られた物質を酢酸エチル（２０ＲＣ）中に溶解し
、１．０Ｍ重炭酸ナトリウム（３Ｘ　２　ＯｍＱ）で抽
出した。水性抽出物を集め、１．０Ｍ塩酸てｐＨを４に
調節し、溶媒を真空除去した。ついで、得られた結晶性
固体を酢酸エチル（５０ｍｇ）で２回トリヂュレートし
、濾過した。濾液を集め、溶媒を真空除去してＮ−カル
ボギシエチルーアンフェタミン（９３ｍ９）を得た。

Ｎ−カルボキシエチル−アンフェタミン（９３ｎ９．０
４４９ミリモル）をジメチルホルムアミド（１、ＯｍＱ
）中に溶解した。トリエチルアミン（０，１１３ｕ（！
、０．８０８ミリモル）、ついてンーＬｅｒＬ−ブチル
ジカーボネート（１０８ｘ９．０．４９３ミリモル）を
加えた。窒素雰囲気下で３時間撹拌した後、溶媒を真空
除去し、得られた粗製の生成物を、２つの１．０ｉｘｃ
Ｉ８逆相プレパ逆相プレパラティブトグラフィープレー
ト上て水／メタノール／酢酸（３０／７０１０．．１）
て溶出することにより精製した。生成物の収量は、Ｎ　
−Ｂ　ＯＣ−Ｎ−カルボキシエチルーアンフエタミン（
３３ｆｆｇ）であった。

Ｎ　−ＩＢＯＣ−Ｎ−カルホキノエチルーアンフエタミ
ンＣ３３ｍｇ、０．１０７ミリモル）をジメチルポルム
アミド（０，８０ｍρ）中に溶解した。Ｎ−ヒドロキン
スクシンイミド（１５ｚｇ、０１２９ミリモル）、つい
て１．３−ンノクロへギンル力ルホノイミト（２７ｚｙ
、Ｏ１２９ミリモル）を加えた。

窒素雰囲気下で１９時間撹拌した後、この反応混合物を
、アミノメチルフルオレセイン塩酸塩（４３ｔｔｒ９．
０１０７ミリモル）を入れたフラスコ中に濾過した。ト
リエチルアミンでｐ　ｌ−ｉを９に調節し、この溶液を
窒素雰囲気下で２４時間、暗所にて撹拌した。溶媒を真
空除去し、得られた粗製の生成物を、２つの１．０１１
ｉＣ１８逆相プレパラテイブＡＶｍクロマトグラフィー
プレート」二て水／メタノール／酢酸（３０／７０１０
　７１）で溶出することにより精製した。生成物の収量
は、Ｎ−ＢＯＣ−Ｎ−カルボキシエヂルーアンフェタミ
ンーアミノメチルフルオレセイン（２６ｆｆｇ）であっ
た。

実施例８（Ｎ−アセタミドメチルフルオレセイン−ｄ、
Ｉ−アンフェタミントレーサー）に記載した手順に実質
的に従い、Ｎ−ＢＯＣ−Ｎ−カルポギシエヂルーアンフ
ェタミンーアミノメチルフルオレセイン（２０ｚ７．０
０３１ミリモル）をトリフルオロ酢酸／塩化メチレンと
反応させた。生成物の収量は、表記トレーサー（ｚ１１
９）であった。

実施例ｌ７ Ｎ−カルポキンメチル−アンフェタミン−エチルアミノ
メチルフルオレセイントレーサーの合成実施例＋６（Ｎ
−ＢＯＣ−Ｎ−カルボキソエヂルーアンフェタミンーア
ミノメチルフルオレセイントレーサー）に記載した手順
に実質的に従い、Ｎ−ＢＯＣ−Ｎ−カルポキンメチルー
アンフヱタミン（２１ａｙ、０．０７１６ミリモル）を
Ｎ−エチル−アミツメデルフルオレセイン（３３ｍｇ、
００７１６ミリモル）に結合させた。生成物の収量は、
Ｎ−ＢＯ（、−Ｎ−カルボキンメチルーアンフェタミン
ーエヂルアミノメチルフルオレセイン（３１Ｒｇ）であ
った。

実施例８（Ｎ−アセタミドメチルフルオレセイン−ｄ、
ｌ−アンフェタミントレーサー）に記載した手順に実質
的に従い、Ｎ−ＢＯＣ−Ｎ−カルボギンメヂルーアンフ
ェタミンーエチルアミノメチルフルオレセイン（２１１
１ｙ、０．０３０ミリモル）をトリフルオロ酢酸／塩化
メチレンと反応させた。

生成物の収量は、表記トレーサ−（１５ｚ９）てあった
。

実施例１８ Ｎ−カルポキシメチル−アンフェタミンーブチルアミノ
メチルフルオレセイントレーサーの合成実施例＋　５（
Ｎ−ＢＯ（、−ｄ、ｌ−フェニルアラニン−アミノメチ
ルフルオレセイン）・レーサー）に記載した手順に実質
的に従い、Ｎ−ＢＯＣ−Ｎ−カルボキシメヂルーアンフ
ェタミン（１６Ｂ、００５４５ミリモル）をＮ−ブチル
−アミツメデルフルオレセイン（２７ｍｇ、０．０５４
５ミリモル）に結合させた。生成物の収量は、Ｎ−ＢＯ
Ｃ−Ｎ−カルボキシメチルーアンフエタミンーブチルア
ミノメチルフルオレセイン（２８ｘｇ）であった。

実施例８（Ｎ−アセタミドメチルフルオレセインーｄ、
］−アアンフェタミントレーサーに記載した手順に実質
的に従い、Ｎ−Ｂ　ＯＣ−’Ｎ−カルホキシメヂルーア
ンフェタミン−ブチルアミノメチルフルオレセイン（２
０ｙ＋１？、００２９ミリモル）をトリフルオロ酢酸／
塩化メチレンと反応させた。

生成物の収量は、表記トレーサー（＋２ｘ９）であった
。

アンフェタミン様物質蛍光偏光イムノアッセイ上記のよ
うに、本発明のＦＰＩＡ試薬は、トレーサー、およびア
ンフェタミン様分析対象物に特異的な抗体からなる。加
えて、従来用いられているアッセイ溶液、たとえば希釈
バッファー、ｄ、１−アンフェタミンカリプレーターお
よびｄ、ｌ−アンフェクミンコントロールを調製する。

これら試薬の代表的な溶液は、アボット・ラボラトリー
ズ（アボットパーク、イリノイ）からアッセイ「ギソト
」として市販されている。

ＴＤｘ、ＩＭｘまたはＡＤχシステム（アボット・ラボ
ラトリーズ、アボットパーク、イリノイより市販）で行
うべく、好ましいアッセイ手順を設計した。そのような
装置を用いると、前処理から最終の読み取りにいたるま
で完全に自動化される。

しかしながら、手動のアッセイを行うこともてきる。い
ずれの場合も、バックグラウンドの読み取りを行う前に
試料を希釈バッファー中の前処理溶液と混合することが
できる。ついて、トレーサーを試料溶液に加え、ついで
抗体を加える。インキコベーノヨンした後、蛍光偏光を
読み取る。

自動化アッセイにおいては、各カリブレーター、コント
ロールまたは試料の蛍光偏光値を測定し、装置の出力テ
ープ」二にプリントされる。装置はまた、非線型回帰分
析により、各カリブレーク−の濃度に対しその偏光をプ
ロットすることにより標準曲線を作成する。検量曲線か
ら各コントロールまたは試料の濃度が読み取られ、出力
テープ上にプリントされる。

実施例１つ リボフラビン蛍光妨害の除去 リボフラビンによる蛍光妨害はアッセイの結東を不正確
にする。それゆえ、試料にリボフラビン結合タンパク質
を加えることにより、リボフラビンによる妨害の可能性
を除くことが有利である。

試料をリボフラビン結合タンパク質で前処理するこ七に
よる利点は、下記第１表にまとめである。

第１表において、２番目と３番目のカラムは、それぞれ
、トレーサーを未処理の尿試料および前処理して（５ｍ
ｇ／ｙｘ（のリボフラビン結合タンパク質）リボフラビ
ンを含まない尿試料に加える前に得られた蛍光強度の測
定値を示すものであり、４番目と５番目のカラムは、そ
れぞれ、トレーサーを未処理の尿試料および前処理して
リボフラビンを含まない尿試料に加えた後の偏光の測定
値を示すしのである。前処理溶液は、０．１Ｍトリスバ
ッファー（ｐ＋（７，５）、００１％ウシγ−グロブリ
ン、−８２＝ ｏ、１ｇアジ化ナトリウムおよび５１１９／ｍ（！のり
ポフラビン結合タンパク質からなっていた。

第１表（リボフラビン結合タンパク質を用いバッククラ
ラント強度（蛍光強度単位）＊２　トレーサーを加える
前の前処理試料のバックグラウンド強度（蛍光強度単位
）＊３１・レーザーを加えた後の未処理試料の偏光（ミ
リ偏光単（ガ） ＊４．トレーサーを加えた後の前処理試（４の偏光（ミ
リ偏光単位） 第１表の２番目と３番目のカラムを比較すれば、リボフ
ラビン結合タンパク質で試料を前処理することにより試
料のバックグランド強度が減少することがわかる。第１
表の４番目と５番目のカラムを比較すれば、アッセイに
先立って試料をそのように前処理することによりリボフ
ラビンによる蛍光妨害が減少することがわかる。

実施例２０ ＦＰＩＡ特異性 本発明のアッセイシステムは、アンフェタミン、メタン
フェタミン、フェニルプロパツールアミン、エフェドリ
ン、偽エフェドリンおよびフェンテルミンなどのアシフ
ェタミン様薬物を検出するのに適している。種々のアン
フェタミン様薬物の交差反応性を試験した。アッセイは
、既知量の供試化合物を薬物不含の正常ヒト尿試料に加
え、ＴＤｘ装置でアンフェタミン様薬物をアッセイする
ことにより行った。交差反応性（％）は、１００Ｘ（観
察された被験化合物の農産／添加した被験化合物の濃度
）で表される。得られた結果を下記第２表に示す。これ
らのデータは、本発明のアッセイシステムおよび試薬が
、刺激または毒性作用を示す濃度のアンフェタミン様薬
物を検出するのに充分な交差反応性を有することを示し
ている。それと同時に、ある種の食品に一般にみられる
フェネヂルアミン様物質、たとえばトリプタミンやヂラ
ミンなどの濃度は容易に検出されず、それゆえ妨害の問
題は起こらない。

第２表　（続き） ８７一 好ましい自動アンフェタミン様薬物アッセイにおいて下
記試薬を用いた。

（１）リボフラヒン結合タンパク質を含む」二記前処理
溶液。

（２）０．０１％ウンγ−グロブリンおよび０１％アジ
化ナトリウムを含む０１Ｍトリスハソファー（＋）Ｈ７
、５）中のトレーサー（０，３６Ｉ１９／靜、上記実施
例８で調製）。

（３）アンフェタミン免疫原（上記実施例１で調製）に
対して産生じたヒツジ抗血清からなり、０１Ｍトリスバ
ッファー（ｐＨ７，５Ｘ０．０　］］％ウシγ−グロブ
リン０１％アジ化ナトリウム、０４％ＢＳＡおよび２％
エチレングリコールを含有）中に希釈した抗体。

（４）０．４５％ＮａＣ１中に５０％ジメヂメチルホギ
ンドからなる洗浄溶液； （５）Ｏ，ＩＮリン酸ナトリウム（ｐＨ７、５）、０．
０１％ウシγ−グロブリンおよび０１％アシ化ナトリウ
ムからなる希釈バッファー： （６）ｄ、１−アンフェタミン（０００μ９ＩＲＱ、　
　０５０μｇ／ｘＱ、１　、００　μ９／ｍＱ、２　、
００　ｔｔｇ／ｍＱ、４　、００　ｔｉ　ｇ／ｙｎＱお
よび６　、　ＯＯμ９／ｘｃ）を含み、０１％アジ化ナ
トリウムで保存したプール化正常ヒＩ・尿からなるカリ
ブレーク−；および（７）ｄ、ｌ−アンフェタミン（０
，７５μ’ｊ／ｍＱおよび５．００μｇ／ｚ＆）を含み
、０１％アジ化ナトリウムで保存したプール化正常ヒト
尿からなるコントロール。

偏光蛍光測定は、すべてＴＤχセラビューティック・ド
ラッグ・モニタリング・システムを用いて行い、アッセ
イは下記プロトコールに従った。

（１）２５μＱの標準試料または未知試料を前希釈ウェ
ル中に入れ、充分な量の希釈バッファーを加えて容量を
５００μρまで増加させた。

（２）前希釈ウェルからの試料（８０μＱ）、前処理溶
液（１２５μＱ）および希釈バッファー（容量を１．０
靜まで増加させるのに充分な量）をピペットでキュベツ
トに加え、バソクグラウント強度を読み取った。

（３）ついで前希釈ウェルからの試料（８０μＱ）、前
処理溶液（１２５μＱ）、およびトレーサーおよび抗体
（各２５１ＩＣ）をキコヘソトに入れ、充分な量の希釈
ハソフア−を加えて容量を２　、　ＯｍＱに増加させた
。

（４）この反応混合物をインキコベートした。

（５）混合物の最終の偏光蛍光強度からバッククラ〜９
１− ランドの偏光蛍光強度を差し引くことにより、トレーサ
ーの抗体への結合による蛍光偏光を得た。

（６）未知の試料の偏光値を、既知のアンフェタミン含
量のカリプレーターを用いて作成した標準白線表比較し
た。

［キャリーオーバー（ｃａｒｒｙｏｖｅｒ）Ｊ、すなわ
ち、ＴＤｘ装置のプローブへの試料および試薬の付着を
最小にするために、洗浄溶液を用いて該プローブを濯い
だ。キャリーオーバーは、正常ヒト尿中のアンフェタミ
ン溶液（１４００μｇ／ｍ（り、ついで薬物不含の正常
ヒト尿試料をアッセイすることにより決定した。キャリ
ーオーバー（％）は、１００×（薬物不含尿中てのアン
フェタミンの測定濃度／アンフェタミン溶液の濃度）で
示される。キャリーオーバー（％）は、００２％以下と
測定された。許容し得るキャリーオーバー（％）は、０
．０５％未満てあった。

本発明の概念の多くは他のタイプの結合アッセイにも同
様に適用できることが当業者には理解されるであろう。

上記態様は、あくまで例示を示すものに過ぎず、本発明
を限定することを意図するものではない。

特許出願人　アボット・ラボラトリーズ化　理　人　弁
理士　青　山　　葆はか１名＝９４−

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） ［式中、Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾４およびＲ＾５
   はＨ、ＯＨおよびＣＨ＿３よりなる群から選ばれた基で
   あり、ただしＲ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾４およびＲ
   ＾５のうち少なくとも一つは一般式：（Ｍ）ｚＷＱ（式
   中、Ｑは担体物質、ＷはＮＨ、ＣＯ、ＣＯＯＨ、ＣＨＯ
   およびＯＨよりなる群から選ばれ該担体物質上に存在す
   る連結基、ｚは０または１、Ｍは０〜１５個の炭素原子
   およびヘテロ原子からなり６個未満のヘテロ原子を含む
   直鎖または分枝鎖の飽和または不飽和結合基であって、
   ２個以上のヘテロ原子が連続して結合することはなく該
   分枝は炭素原子上でのみ生じ、該ヘテロ原子は窒素原子
   、酸素原子、硫黄原子、ケイ素原子およびリン原子より
   なる群から選ばれた原子であるもの）］で示される免疫
   原化合物。
2. （２）該担体に複数のハプテン残基が連結した請求項（
   １）に記載の免疫原化合物。
3. （３）式； ▲数式、化学式、表等があります▼ で示されるＮ−カルボキシメチル−ｄ，１−アンフェタ
   ミン〜ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である請求項（１
   ）に記載の免疫原化合物。
4. （４）一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ’） ［式中、Ｒ＾１＾’、Ｒ＾２＾’、Ｒ＾３＾’、Ｒ＾４
   ＾’およびＲ＾５＾’はＨ、ＯＨおよびＣＨ＿３よりな
   る群から選ばれた基であり、ただしＲ＾１＾’、Ｒ＾２
   ＾’、Ｒ＾３＾’、Ｒ＾４＾’およびＲ＾５＾’のうち
   少なくとも一つは一般式：ＭＦｌ（式中、Ｆｌは蛍光物
   質、Ｍは０〜１５個の炭素原子およびヘテロ原子からな
   り６個未満のヘテロ原子を含む直鎖または分枝鎖の飽和
   または不飽和結合基であって、２個以上のヘテロ原子が
   連続して結合することはなく該分枝は炭素原子上でのみ
   生じ、該ヘテロ原子は窒素原子、酸素原子、硫黄原子、
   ケイ素原子およびリン原子よりなる群から選ばれた原子
   であるもの）］で示されるトレーサー化合物。
5. （５）Ｒ＾５＾’が、ＣＯ−Ｆｌ、ＣＨ＿２−Ｆｌ、Ｃ
   ＯＮＨ−Ｆｌ、ＣＯＮＨＣＨ＿２−Ｆｌ、（ＣＨ＿２）
   ｎＣＯＮＨＣＨ＿２−Ｆｌ（式中、ｎは１または２）、
   ＣＨ（ＣＨ＿３）ＣＯＮＨＣＨ＿２−Ｆｌ、ＣＨ＿２Ｃ
   ＯＮ（ＣＨ＿２ＣＨ＿３）ＣＨ＿２−Ｆｌ、ＣＨ＿２Ｃ
   ＯＮ（ＣＨ＿２ＣＨ＿２ＣＨ＿２ＣＨ＿３）ＣＨ＿２−
   Ｆｌ、（ＣＨ＿２）ｎＮＨＣＯ−Ｆｌ（式中、ｎは１、
   ２または３）およびＣＨ＿２ＣＯＮＨＣＨ＿２ＣＨ＿２
   ＮＨＣＯ−Ｆｌ（式中、Ｆｌは前記と同じ）よりなる群
   から選ばれた基である請求項（４）に記載のトレーサー
   化合物。
6. （６）Ｒ＾３＾’が、ＣＯＮＨＣＨ＿２−ＦｌおよびＣ
   ＯＮＨＣＨ＿２ＣＨ＿２ＮＨＣＯ−Ｆｌ（式中、Ｆｌは
   前記と同じ）よりなる群から選ばれた基である請求項（
   ４）に記載のトレーサー化合物。
7. （７）Ｒ＾２＾’が、（ＣＨ＿２）ｎＣＯＮＨＣＨ＿２
   −Ｆｌ（式中、ｎは１または２、Ｆｌは前記と同じ）お
   よび（ＣＨ＿２）ｎＮＨＣＯ−Ｆｌ（式中、ｎは１、２
   または３、Ｆｌは前記と同じ）よりなる群から選ばれた
   基である請求項（４）に記載のトレーサー化合物。
8. （８）Ｒ＾１＾’が、ＯＣＨ＿２ＣＯＮＨＣＨ＿２−Ｆ
   ｌ（式中、Ｆｌは前記と同じ）である請求項（４）に記
   載のトレーサー化合物。
9. （９）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｆｌは前記と同じ）で示されるＮ−アセタミド
   メチルフルオレセイン−ｄ，１−アンフェタミン〜Ｆｌ
   である請求項（４）に記載のトレーサー化合物。
10. （１０）試料中の１種または２種以上のアンフェタミン
    様分析対象物の存在または量を決定する方法であって、 （ａ）該試料を請求項（４）に記載のトレーサー化合物
    、および該分析対象物および該トレーサー化合物を認識
    し結合することのできる抗体と接触させて、（ｉ）該抗
    体への該分析対象物の結合または（ｉｉ）該抗体への該
    トレーサー化合物の結合がそれぞれ（ｉ）該抗体への該
    トレーサー化合物の結合または（ｉｉ）該抗体への該分
    析対象物の結合を抑制するようにし、 （ｂ）得られた試験溶液に平面偏光を通して蛍光偏光応
    答を得、ついで （ｃ）該蛍光偏光応答を検出して試料中のアンフェタミ
    ン様分析対象物の存在または量を決定することを特徴と
    する方法。
11. （１１）抗体が請求項（１）に記載の免疫原化合物によ
    って産生されたものである請求項（１０）に記載の方法
    。
12. （１２）トレーサー化合物が請求項（９）に記載のトレ
    ーサー化合物であり、抗体が請求項（３）に記載の免疫
    原化合物により産生されたものである請求項（１１）に
    記載の方法。
13. （１３）工程（ｂ）の前にリボフラビン結合タンパク質
    を加え、リボフラビンによる妨害を減少させるのに充分
    な量で存在させる請求項（１０）に記載の方法。
14. （１４）試料中の１種または２種以上のアンフェタミン
    様分析対象物の存在または量を決定するためのアッセイ
    キットであって、請求項（４）に記載のトレーサー化合
    物、および該アンフェタミン様分析対象物および該トレ
    ーサー化合物を特異的に認識することのできる抗体から
    なることを特徴とするアッセイキツト。
15. （１５）抗体が請求項（１）に記載の免疫原化合物によ
    り産生されたものである請求項（１４）に記載のアッセ
    イキット。
16. （１６）リボフラビンによる妨害を減少させるのに充分
    な量のリボフラビン結合タンパク質をさらに含む請求項
    （１４）に記載のアッセイキット。