JPH02308796A - Ｌ―セリンの分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、グリシンを原料に用いて、酵素法または醗酵
法より得られるＬ−セリンを原料グリシンと分離し、回
収する方法に関する。

Ｌ−セリンは、輸液原料、医薬原料、トリプトファンな
どのアミノ酸合成中間体として有用な化合物である。

（従来の技術〕 グリシンを原料として酵素法で、Ｌ−セリンを製造する
方法としては、セリンヒドロキシメチルトランスフェラ
ーゼ（ＥＬ、２．１．２．１）を利用する方法が知られ
ている。（特開昭６２−１９０９２号公報）すなわち、
原料であるグリシンとホルムアルデヒドに対して、補酵
素であるピリドキサール−５’−リン酸およびテトラヒ
ドロ葉酸の存在下、該酵素生産能を有する微生物を作用
させてＬ−セリンを製造する方法である。この反応は平
衡反応のためグリシンのＬ−セリンへの転換率は、７５
％程度であり、反応終了液中には必ず、グリシンとＬ−
セリンが共存してしまう、グリシンとＬ−セリンの分離
は、Ｌ−セリンを製品として得るために必要であり、ま
た、回収されたグリシンを反応に再使用して、コストダ
ウンをはかるためになくてはならない技術である。一方
、醗酵法によるＬ−セリンの製造法としては、グリシン
含有培地に微生物を生育させ、培地中にＬ−セリンを蓄
積させる方法（特開昭５８−３１９９５号公報、特開昭
５６−８８７９８特開昭５５−３７１６９号公報）など
が知られている。

グリシンとＬ−セリンは、水に対する溶解度が非常に近
接しており、（中性付近の２０゛Ｃでの飽和濃度は、グ
リシンで２２％、Ｌ−セリンで１８％）両者の一方を溶
解度差で淘汰する方法で高純度のし一七リンを単離する
ことは出来ない。

そのため、たとえば特開昭５８−３１９９５号公報に記
載されているようなトキシレンー４−スルホン酸のグリ
シンおよびＬ−セリンの塩の溶解度差を利用して、Ｌ−
セリンを単離する方法があるが、操作が繁雑であり、か
つロスも多く工業的には難点がある。　また、イオン交
換樹脂を用いてグリシンとＬ−セリンを分離する方法も
知られているが、両者は等電点も近接しているため（グ
リシンで５゜９７、Ｌ−セリンで５．６８）　、通常の
イオン交換による保持、溶離手段により両者を分離する
のは困難である。　そこで特開昭５３−７２８９３号公
報には、グリシンとＬ−セリンを強酸性陽イオン交換樹
脂に保持させたあと、クエン酸などの緩衝液のｐｌ＋を
変えながら、分別溶出させる方法が記載されている。

しかしながら、その操作は繁雑であり、工業的に実施可
能であるとは言い難い。

さらに、特開昭６２−１１１９５３号公報には、強酸性
陽イオン交換樹脂を用いる方法として、その粒径が、汎
用タイプのものより小さくて特定の大きさを有し、かつ
、粒径分布の狭い樹脂を用いることにより、クロマト的
にグリシンとＬ−セリンを分離する方法が開示されてい
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

前記特開昭６２−１１１９５３号公報に記載の方法は操
作上単純なので、工業的に使用しろる技術ではあるが、
次のような欠点がある。すなわち溶離が進行して溶出中
のＬ−セリン濃度が減少してくると、かわって、グリシ
ンの溶出が始まり、Ｌ−セリンとグリシンが同時に溶出
してくるフラクシヨンが存在することである。これは、
グリシンを含まない高純度のＬ−セリン結晶を効率よ（
単離する上での障害となる０本発明は、高純度のＬ−セ
リン結晶を単離するために、グリシンとＬ−セリンの混
合溶液を強酸性陽・イオン交換樹脂に保持させたあと、
Ｌ−セリンのみをグリシンの混入なしに溶出させる簡便
、確実でかつ効率よい方法を提供するためになされたも
のである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者は、強酸性陽イオン交換樹脂に保持されたグリ
シンとＬ−セリンの溶出方法について鋭意検討を重ねた
結果、保持されたＬ−セリンに対して１．０〜１．５倍
モルのアルカリ溶液を線速度２．０ｍ／ｈｒ以下で通液
したあと、水押し出しすることによりＬ−セリンのみを
グリシンの混入することなく高い回収率で溶出させうろ
ことを見い出し、この知見にもとづいて、本発明を完成
するにいたった。

即ち、本発明は■グリシンを原料として、酵素法または
醗酵法により得られた未反応グリシンを含むＬ−セリン
溶液を、■有効径０．１５〜０．４０ｍｍ、均一係数１
．７以下でＨ°型の強酸性陽イオン交換樹脂の充填層に
通液してグリシンとＬ−セリンを保持し、■続いて保持
されたＬ−セリンに対して１．０〜１．５倍モルのアル
カリ溶液を通液後、水による押出しをすることによって
グリシンを含まないＬ−セリン溶液を溶出させることか
らなっている。

本発明におけるグリシンを原料とした酵素法によるＬ−
セリンの製造方法としては、セリンヒドロキシメチルト
ランスフェラーゼの触媒能を利用する方法を使用するこ
とができる。セリンヒドロキシメチルトランスフェラー
ゼの給源としては、エシェリヒア・コリ）Ｉ７−１０３
５０（ＦＥＲＭ　Ｐ−７４３７）、エシェリヒア・コリ
’ＭＴ−１０３５］（ＦＥＲ？Ｉ　Ｐ−７４３８）をあ
げることができる、これらの培養菌体から得た酵素を水
に溶かし、補酵素としてテトラヒドロ葉酸とピリドキサ
ール−５′−リン酸を添加する。原料のグリシジを添加
し、２０〜６０’Ｃに保温して適当なアルカリ溶液でｐ
１１６〜９に調整する。アルカリ溶液止しては、たとえ
ばＮａＯＨ−、ＫＯＨｓ　ＫａＰｚＯｔ、アンモニア等
の水溶液を使用することができる０反応液を攪拌しなが
らもう一方の原料であるホルムアルデヒドを連続的に装
入して、Ｌ−セリンの合成反応を行う、　セリンヒドロ
キシメチルトランスフェラーゼは、高濃度のホルムアル
デヒドによって失活するので、反応中のホルムアルデヒ
ド濃度を分析し、２０１１Ｍ以下となるようにホルムア
ルデヒドの装入を行う０反応液のｐＨは酸性側に変化し
ていくので、アルカリ溶液を添加して、ｐＨ６〜９に調
整する。アルカリ溶液としては、たとえばＮ　ａ　ＯＨ
％ＫＯ１ｌ、Ｋ４Ｐ２Ｏ７、アンモニア等の水溶液を使
用することができる。

この反応は平衡反応なので、原料のグリシンが全量Ｌ−
セリンに転換されることはなく転換率が７５％程度に達
したところで反応は停止する。この反応液を酸性化した
上で、活性炭を装入し、加熱、濾過を行うて酵素や菌体
の成分を除去する。こうして得た濾過液はＬ−セリンと
未反応グリシンの混合液である。この混合液を強酸性陽
イオン交換樹脂の充填塔に通液して、Ｌ−セリンとグリ
シンの分離を行う。

本発明で用いられる強酸性陽イオン交換樹脂は、有効径
０．１５〜０．４０謔、均一係数１．７以下、という条
件を有している必要がある。このようなイオン交換樹脂
としては、たとえばレバチットＴＳＷ−４０、同ＴＳＷ
−４０−ＰＫ、同問Ｓ−１３６８（以上バイエル社製）
、ダイヤイオンＰＲＫ−０１（三菱化成■製）などの銘
柄として市販されており容易に入手することができる。

ここでいう有効径とは、通常業界で定義づけられている
ように樹脂全体の９０％を網上に残すふるい目の大きさ
である。また、均一係数とは粒径分布の程度を示す指標
であって、樹脂全体の４０％を網上に残すふるい目の大
きさを前記有効径で割った値である。すなわち、均一係
数の値が１に近いほど粒径分布がシャープとなる。

本発明で用いられる強酸性陽イオン交換樹脂は、あらか
じめ塩酸で処理することによって、Ｈ°型にしておく、
これにグリシンを原料として、酵素法または醗酵法によ
り得られる、未反応グリシンを含むＬ−セリンの溶液を
塔頂より通液し、イオン交換樹脂に陽イオン類を保持す
る。咳Ｌ−セリン溶液には、Ｌ−セリン、グリシンの他
に、夾雑アミノ酸、カリウムイオン、ナトリウムイオン
、アンモニウムイオン等の各種陽イオン類が含まれてい
るが、これら全陽イオンのモル数が、イオン交換樹脂の
総交換容量をこえないように、通液するＬ−セリン溶液
量を決める。該Ｌ−セリン溶液の通液速度は、線速度に
して２．０ｍ／ｈｒ以下に設定する。イオン文相樹脂に
陽イオン類を保持したあと、塔頂より純水を通液してイ
オン交換樹脂に保持されない陰イオンや、電気的に中性
の夾雑物質を洗い流す、純水の通液量は塔内に充填した
イオン交換樹脂と同体積程度とし、線速度にして２．０
ｍ／ｈｒ以下で通液する。

次にアルカリ溶液を塔頂から通液して、イオン交換樹脂
に保持された陽イオンのうちから、Ｌ−セリンのみを溶
出させる。アルカリ溶液としては、たとえば、アンモニ
ア、ＮａＯＨ，ＫＯＨの水溶液を使用することができる
。いずれの場合も０．５〜１．２Ｍの濃度範囲で使用す
る。Ｌ−セリンを溶出させる場合、純水では溶出させる
ことができない、低濃度のアルカリ水溶液では、し−セ
リンの溶出はブロードとなる。アルカリの濃度が増すに
したがって、溶出がシャープになると同時に、グリシン
の溶出も早（なる、そしてついには、グリシンとＬ−セ
リンが同時に溶出するにいたり、両者の分離は不可能に
なる。したがってアルカリの濃度は０．５〜１．２Ｍの
範囲に、設定しなければならない、ここで重要なことは
通液するアルカリの総量が、イオン交換樹脂に保持され
たＬ−セリンに対して１．０〜１．５倍モルであること
である。アルカリの量がこの範囲を越える場合には、所
定のアルカリ濃度範囲内であってもＬ−セリンの溶出の
後期にグリシンの溶出が始ま・って、Ｌ−セリンとグリ
シンが混合した両分が生じてしまい本発明の目的を達す
ることができない。

一方、少なすぎる場合には、グリシンを含まないＬ−セ
リン溶出液が得られるものの、Ｌ−セリンの回収量が少
なくなる。

流速が大きい場合にもＬ−セリンとグリシンの分離不良
が生じるので、溶出操作は、線速度にして２．０ｍ／ｈ
ｒ以下で行う。

塔頂からのアル々す溶液の通液が終了した時点では、樹
脂充填層内はまだアルカリ溶液が充液された状態であり
、Ｌ−セリンの溶出は完了していない、そこで、塔頂よ
り純水を通液してアルカリ溶液を押し出し、Ｌ−セリン
の溶出を完全たらし・　める、純水の量は、塔内に充填
したイオン交換樹脂体積の１〜３倍量が好ましい、流速
は線速度にして２．０ｍ／ｈｒ以下とする。

グリシンを含まないＬ−セリン水溶液が、溶出したあと
、グリシンと若干量のＬ−セリンがイオン交換樹脂に保
持されたままになっているので、Ｌ−セリンの溶出と同
様の操作によりグリシンと若干量のＬ−セリンの溶出が
できる。すなわち、塔頂よりアルカリ溶液を通液する。

アルカリ溶液としては、たとえば、アンモニア、ＮａＯ
Ｈ１ＫＯＨなどの水溶液を使用することができる。いず
れの場合も０．５〜１．２Ｍの濃度範囲で使用する。

ただし、今度の溶出では、アルカリの量を保持されたグ
リシンのモル数に対して１．０〜１．５倍使用する。ア
ルカリが過剰の場合でもグリシンの溶出は可能であるが
、グリシンの溶出終了後もアルカリを樹脂充填層内に流
し続けることになり、経済的ではない、アルカリが少な
い場合には、グリシンの溶出が不十分となり回収率が低
下して望ましい事ではない、流速は線速度にして２．０
＋ｍ／ｈｒ以下とする。溶出操作後、純水を塔頂より通
液して水押し出しを行って、グリシンの溶出を完全にす
る。

純水の量は塔内に充填したイオン交換樹脂と同体積程度
とする。流速は線速度にして２．Ｏｓ＋／ｈｒ以下とす
る。

以上の操作終了後、イオン交換樹脂はＮＨ４’型となっ
ているので、塔頂より適宜酸溶液を通液して、■ゝ型に
再生して次回のグリシンとＬ−セリンの分離操作にそな
える。イオン交換樹脂の再生には、例えば、イオン交換
樹脂の総交換容量の・１．２倍のモル数の塩酸を含む１
０重量％の塩酸水溶液を線速度にして１．１ｍ／ｈｒで
通液した後、塔内に充填したイオン交換樹脂の体積の約
２倍の純水を線速度１　、５ｍ／ｈｒで通液して洗浄す
る方法などを採用することができる。

〔発明の効果〕

このような操作を行うと、塔底からは、まず、グリシン
を含まないＬ−セリン溶液が溶出する。

この溶液に常用されるアミノ酸の単離操作をほどこすこ
とにより高純度のＬ−セリンの結晶を得ることができる
。

つづいて、グリシンを主体にした、グリシンとＬ−セリ
ンの混合溶液が溶出してくる。この溶液は濃縮操作をへ
て、グリシンを原料としたＬ−セリン合成反応原料の一
部として再使用することができ、Ｌ−セリンのコストダ
ウンに寄与することができる。

〔実施例〕

グルコース４ｇ／２、クエン酸２ｇ／２、Ｍｇ５Ｏａ・
７Ｈｘ００．２ｇ／　ｌ、に＊ＨＰＯａ　１０ｇ／　ｊ
！、ＮａＮＨａＨＰＯ４−４Ｈ＊００．２ｇ／ｌ酵母エ
キス０．５ｇ／　ｊ！　（ｐｌ（７，０）の組成からな
る培地２００ｄづつを含む１２容三角フラスコ１０本に
、ブイヨン寒天培地で生育したエシェリヒア・コリＭＴ
−１０３５０（ＦＥＲＭ　Ｐ−７４３７）の菌体を１白
金耳ずつ接種し、３０℃、２１０ｒｐ−で２４時間振盪
培養した。得られた培養液より遠心分離により湿菌体８
ｇを得た。

この湿菌体８ｇを１０ｇＭリン酸緩衝液（ρ１１７．５
）に懸濁した後、４℃で１５分間超音波処理し、粗酵素
液２０−を得た。

グリシン１１７ｇ、テトラヒドロ葉酸０．２１ｇ　、ピ
リドキサール−５′−リン酸３ｇ、粗酵素液２０ｄを含
む反応液４２０ｄを調整し、〜反応液中のホルムアルデ
ヒド濃度を４−アミノ−３−ヒドラジド−５−メルカプ
ト１，２．４−トリアゾールを用いて比色分析しつつ、
その濃度が２０ｍＭを越えないように制御しながら、３
７％ホルマリンをペリスタポンプにより連続的に供給す
ることによって、Ｌ−セリンの合成反応を行った０反応
温度は５０℃、ｐＨは２Ｍ　ＫａＰｔＯｑを添加するこ
とにより、常時７．０に制御した。ＰｉＬ拌は２００ｒ
ｐ−で行った。

反応液へのホルマリン供給は４２時間継続し、反応液に
添加したホルマリン（３７重量％ホルムアルデヒド溶液
）の総量は９６．５ｇだった。

反応終了後、硫酸を用いて反応液のｐｕを４．０に調整
、活性炭３８を装入後、９０°Ｃで３０分間の熱処理を
行い、熱濾過して菌体由来の残渣を除去した。

こうしてＬ−セリン溶液７０５ｇを得た。このＬ−セリ
ン溶液２４６ｄ（Ｌ−セリンを１７．４３ｇ／ｄ、グリ
シンを４．０２ｇ／ａ、　Ｋ”を１．０７ｇ／ｄ１含む
）を内径４０閣ノ円筒に強酸性陽イオン交換樹脂レバチ
ットＭＤＳ−１３６８（バイエル社製）を４８０４充填
し、Ｈ３型に再生した樹脂塔に通液しく総交換容１ｋ　
０．７７ｅｑ）、Ｌ−セリン、グリシン、Ｋ゛をイオン
交換樹脂に保持した。引続き純水４８０　ｄを通液して
イオン交換樹脂に保持されない不純物を洗い流した。　
０．８８Ｍアンモニア水５４４ｄを通液したあと純水９
００ｄで押し出し、Ｌ−セリンのみを溶出させた。さら
に０．８８Ｍアンモニア水１８２ｍの通液、純水４００
１ｍ１による押し出しにより、グリシンを主体としたグ
リシンとＬ−セリンの混合液を溶出させた。全工程、線
速度１．５ｍ／ｈｒで通液を行った。

溶出液を２５０ｉずつ分取し、ＨＬＣにてグリシンとＬ
−セリンを分析した結果は表１に示すごとくであり、図
示すると図１のようになる。Ｌ−セリンの溶出画分をフ
ラクション漱５からＮα７とし、Ｌ−セリン濃度４ｇ／
ａでグリシンを含まない溶出液を得た。このＬ−セリン
溶液から単離したＬ−セリンの純度は９９．９％で、Ｌ
−セリン以外のアミノ酸を含有していなかった。

（以下、余白） 表１　各フラクション中のＬ−セリンとグリシンの濃度 〔比較例） 実施例で調整したＬ−セリン溶液２４６ｄ（Ｌ−セリン
を１７．４３ｇ／ｄ１、グリシンを４．０２ｇ／ｄ１、
Ｋ４を１．０７ｇ／ｄ！含む）を、内径４０■の円筒に
強酸性陽イオン交換樹脂レバチッ）　？１ＤＳ−１３６
８　（バイエル社製）を４８０ｄ充填し、Ｈ４型に再生
した樹脂塔（総交換容量０．７７ｅｑ）に通液し、Ｌ−
セリン、グリシン、ｋ゛を保持させた。純水４８０−を
通液してイオン交換樹脂に保持されない不純物を洗い流
した。アルカリによる溶出を２回に分けて行わず、今度
は連続して実施した。すなわち、０．８８Ｍアンモニア
水８１６ｄを通液、Ｌ−セリンとグリシンを溶出させた
。全工程線速度１．５＋ｗ／ｈｒで通液を行った溶出液
を２５０　ｄずつ分取し、ＨＬＣにてグリシンとＬ−セ
リンを分析した結果は表２に示すごとくであり、図示す
ると図２のようになる。

Ｌ−セリンの溶出画分をフラクションＮα６から魔７と
し、Ｌ−セリン濃度８．４ｇ／ａ、グリシン濃度０．４
ｇ／ａの溶出液を得た。このＬ−セリン溶液から単離し
たし一セリフの純度は９８．５％でグリシンを１．２％
含有していた。

表２　各フラクション中のＬ−セリンとグリシンの濃度

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明実施例における表１をプロットした図で
あり、図２は、本発明比較例における表２をプロットし
た図である。 （以下、余白） 特許出願人　三井東圧化学株式会社 （フラクシヨン　漱） 図１ （フラクシヨン　阻） 図２

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）グリシンを原料として酵素法、または醗酵法によ
   り得られる未反応グリシンを含むＬ−セリン溶液から、
   Ｌ−セリンを分離する方法において、該Ｌ−セリン溶液
   を有効径０．１５〜０．４０ｍｍ、均一係数１．７以下
   でＨ＾＋型の強酸性陽イオン交換樹脂の充填層に通液し
   て、グリシンとＬ−セリンを保持し、続いて保持された
   Ｌ−セリンに対して、１．０から１．５倍モル量のアル
   カリ溶液を線速度２．０ｍ／ｈｒ以下で通液した後、充
   填層に充填した強酸性陽イオン交換樹脂の１〜３倍量の
   水で押し出しをすることを特徴とするＬ−セリンの分離
   方法。
2. （２）強酸性陽イオン交換樹脂に保持されたＬ−セリン
   を溶出させるのに通液するアルカリの濃度が、０．５〜
   １．２Ｍである請求項１記載の方法。