JPH0231699A - 競合オリゴヌクレオチドのプライミングによる変異の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は競合オリゴスクレオチドのプライミングによる
遺伝子配列中の違い（変異）を検出する分野に関する。

この検出法は遺伝病、感染症、ガンなどの検索や法医学
、農業やレクリエーションの目的で育種することを含む
畜産業等を含む、いろいろな領域に有用な発明である。

〔従来の技術〕

ＤＮＡ配列の違いの検出は次のような典型的領域におい
て必要とされ、望まれえている方法である；ヒトや、そ
の他の種における遺伝病に関わる対立形質の検出や診断
。ヒトやその他の種における病気に関わるか、または関
わることのない遺伝子に関係したＤＮＡ配列の検出と診
断。新生物の検出と診断及び新生物に対する治療の効果
。色々な病原体（例えばウィルス、バクテリア、カビな
ど）の間の違いを検出する。

動物種や系統の純粋性を決める。法医学においてヒトや
動物標本の違いを区別し同定すること。

しばしば検出されるべきＤＮＡ配列の違いは単一のＤＮ
Ａ塩基の置換（点変異）である。ＤＮＡは通常アデニン
（Ａ）、チミジン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びグアノシ
ン（Ｇ）と言われる４つの塩基の色々な組合せで成り立
っている。すなわちＤＮＡ配列の１例はＡＴＣＧＣＧＡ
ＴＣＧＴというものである。点変異は、その位置で通常
具られる塩基について、その場所では通常は見られない
３つの塩基のいずれか１つの置換である。例えば、ＤＮ
Ａ配列ＡＴＣＧＣＧＡＴＣＧＴのＡＴＣＧＧＧＡＴＣＧ
Ｔへの変異は下線部での点変異である。

点変異は無作為に選ばれたＤＮＡ配列の間では、大きな
違いとはみなされないけれども、それらはＤＮＡに一関
連した多型性や「病気」に関係しているＤＮＡ配列の間
の多くの違いがあると考えられる。

点変異によってのみ違っているＤＮＡは現在の技術によ
っては区別しにくい。点変異を検出する方法は２つの主
要なカテゴリーに分けられる；（１）正確なりＮＡ配列
の変化が予測されるときの点変異を検出する方法と（２
）個々のＤＮＡ遺伝子変化の正確な性格が分らないとこ
ろで点変異を「探索」する方法である。本発明は相方の
場合に働くであろう。

本発明以前に正常と変異したＤＮＡの間のＤＮＡ配列の
違いに知見がある点変異は次のような方法で検出されて
いた、すなわち （１）制限酵素断片長の多型性（［１，Ｒｏｔｓｔ、ｅ
ｉｎ。

ｅｔａｌ、Ａ＋ｍ、Ｊ、）ｌｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、、３２
，３１４〜３３１．（１９８０））または（２）対立遺
伝子特異的なオリゴヌクレオチド（＾ＳＯ）を検索する
こと（Ｇ、Ａｎｇｅｌｉｎｉ、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ。

（ＵＳＡ）、８３．４４８９−４４９３（１９８６））
。

制限酵素断片の長さの多型性を調べる方法においては、
制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡを測定可能な色々な鎖
長に切るために使われる。

対立遺伝子特異性オリゴヌクレオチド探索では、熱力学
的な違いによって単一の塩基のミスマツチが調べられる
。完全に対になる鎖は二重鎖となり、不完全な対の鎖は
二重鎖にならないような二重鎖形成条件を組立てられる
。

〔発明が解決しようとする課題〕

アメリカ特許筒４，６８３，２０２号と第４，６８３，
１９５号に示されているポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）
は特異的なりＮＡ配列を増幅するために使われるが、Ｐ
ＣＲはそれ自体では単一の塩基の変異を検出する方法を
提供しない。ＰＣＲは点変異やその他のＤＮＡ配列の差
を検出するために本発明のような他の手法と一緒に使う
ことはできる。

本発明の競合オリゴヌクレオチドプライミング（ｃｏｐ
）は対象と成るＤＮＡ配列にびったリマッチする２つ、
またはそれ以上のＤＮＡの競合二重鎖形式を比較するこ
とによって関連したＤＮＡ配列を区別する。ｃｏｐ法は
対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド検索法やポリ
メラーゼ鎖反応法にある類似性をもつが、ＡＳＯ検索法
、ＰＣＲ増幅法とも単一の塩基が異なる特定の配列を検
出するために本発明の独特の競合的二重鎖形成法を利用
することはない。

本発明のＣｏＰ法は簡便で迅速な利点をもっている。そ
の上ハイブリダイゼーションのための決過操作を必要と
せず、固体の担体上で利用され、全体の操作を安価に自
動化できる。これはＤＮＡ配列中の単一の塩基変異の検
出を改善し、単純化するために長い間要望されている課
題を解決する方法を提供する。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の目的は特に知られたポリヌクレオチド配列を検
出する方法である。

本発明は異なるヌクレオチド配列の間の違いを区別する
方法も目的とするものである。

本発明のもう一つの目的は、遺伝子病の検出である。

本発明の別の目的は既知の遺伝配列における遺伝的な多
型性と検出する方法である。

かくして、前記の目的を成就するのに１本発明の一面に
従って特定の既知の核酸配列の有無を検出し、あるいは
次のようなステップを含む異なる配列を区別するための
方法を提供する。

すなわち、核酸試料または核酸混合物試料に少くとも２
つのプライマーを含み１つは、その特定の既知の配列と
相補的なもので少くとも１つは、その既知の特定配列と
１つのミスマツチ塩基のあるような競合オリゴヌクレオ
チドプライマーを加え；競合的条件下において特定の既
知の配列と相補的なプライマーが選択的にハイブリダイ
ズし、プライマーがハイブリダイズした塩基鎖に相補的
な伸長産物を合成するために、その３′末端から選択的
にハイブリダイズしたプライマーを伸長し、その伸長産
物を同定するものである。

本発明には伸長産物を容易に検出するために競合オリゴ
ヌクレオチドプライマーに標識をつけることも含んでい
る。この標識にはラジオアイソトープ、蛍光体、化学発
光、酵素、抗体等も含まれる。

その他の態様では、検出されるべき配列が競゛金的オリ
ゴヌクレオチドプライマー法の間において、または競合
オリゴヌクレオチドプライマー法を実行する前に増幅さ
れる。

もう一つの実施態様は単一の遺伝子座での遺伝的多型性
を同時に検出したり、異なった座を検出するために別々
に標識づけされた複数の競合オリゴヌクレオチドプライ
マーを使っている。

別のもう一つの態様には遺伝子病、法医学、家系調査、
遺伝子マツピング、病原体検出、腫瘍形成を診断や治療
したりするのにも使われる。

付加的な態様には個人からとった核酸試料を部分し、異
なる部分について同時に競合オリゴヌクレオチドプライ
マーアッセイを行うことを含んでいる。

本発明は遺伝性の多型性を検出するのに有用である。特
別な適用には次のようなものがある７すなわち、鎌形赤
血球貧血、α１−アンチトリプシン欠損症や血友病のよ
うな遺伝病を検出すること；リンクさせた解析によって
病気の関連をスクリーニングをする；組織のタイプ分け
；遺伝子のマツピング；新生物のスクリーニングや治療
効果を見る；既知の病原体（例えばウィルス、バクテリ
ア、酵素、カビ）の検出；家系を調べたり、動物種の純
粋性を調べる；動物の病気をスクリーニングするこなど
である。

その他の別の目的、特徴、利点は添付した図面とともに
明細書の目的として与えられた発明の、ここに選んだ内
容の以下に示す記載から明らかである。

この技術分野に通じた者にとって、ここに示された発明
に対して、その目的と精神から離れることなく、いろい
ろな置換や修正がなされることは容易に明らかである。

ここで用いられるような「オリゴヌクレオチドプライマ
ー」なる言葉は３つ以上のデオキシリボヌクレオチドま
たはりボヌクレオチドを含む分子と定義する。その正確
な長さは根本的な機能に関連する多くの要因、または温
度やプライマーの起源、その方法の利用などを含むオリ
ゴヌクレオチドプライマーを使うことによって左右され
よう。

オリゴヌクレオチドプライマーは精製された制限酵素消
化物中のような自然に出来るものもあれば合成的に作ら
れるものもある。オリゴヌクレオチドプライマーは核酸
鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成を誘起する条件
下におかれるとき合成を始める点として働くことができ
る。その条件は適当な温度とｐＨでＤＮＡポリメラーゼ
のような誘起剤とヌクレオチドが存在することを含んで
いる。プライマーは専ら単一の鎖であるけれど、二重鎖
でもありうる。もし二重鎖とするとプライマーはまず、
伸長産物を作るために利用する前に、その鎖を分ける処
理をしなければならない。実施例においてはプライマー
はオリゴデオキシリボヌクレオチドである。

プライマーは誘起剤の存在下に伸長産物の合成をひきお
こさせるに十分な長さでなければならない。競合オリゴ
ヌクレオチドプライマー法ではオリゴヌクレオチドは約
８から３０個の長さである。望ましくは競合プライマー
は１２〜１６個の長さである。その競合オリゴヌクレオ
チドプライマー法の感度と特異性はその長さによって決
められる。短かすぎるプライマー、例えば８個未満のも
のでは染色体中の広い範囲での配列と非特異的な結合を
示し、それ程有用でない。他方、長すぎるプライマーす
なわち３０個より大のものは競合的結合を示さない。な
ぜなら単一の塩基ミスマツチは通常長いオリゴヌクレオ
チドでは結合効率に影響しないからである。

ここで用いられるものとして「競合オリゴヌクレオチド
プライマー」は少くとも１つの塩基のミスマツチで異な
っているようなオリゴヌクレオチドプライマーを指して
いるものとする。

この違いは既知のヌクレオチド配列と結合する割合の違
いと結合力に起因している。その結合速度と結合力をコ
ントロールすることによって。

競合オリゴヌクレオチドプライマーを有利に使うことが
できる。温度、緩衝液のイオン強度や科学的組成を含む
色々な条件が結合能力を変えるだろう。適当な条件下で
競合オリゴヌクレオチドプライマーをＤＮＡ鋳型とイン
キュベートすると、ハイブリダイズされる既知の配列と
殆どマツチするオリゴヌクレオチド配列は一つの塩基の
ミスマツチまたは多くのミスマツチをもった配列上に選
択的に結合するであろう。

ここで使われている「塩基ミスマツチ」とはプライマー
が既知の配列と並列したときヌクレオチドの異常な結合
対ができるようなヌクレオチドの変化と考えている。通
常グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）が、またアデニン（
Ａ）とチミン（Ｔ）が結合して二重鎖の核酸を作ってい
る。かくして、標準的な塩基対形成すなわちＡ−Ｔまた
はＧ−Ｃは塩基のミスマツチ対形成では見られない。多
くの塩基ミスマツチは生じうる。例えば、Ｇ−Ｇ、Ｃ−
Ｃ，Ａ−Ａ、Ｔ−Ｔ、Ａ−Ｇ。

Ａ−Ｃ，Ｔ−Ｇ、Ｔ−Ｃなどである。この誤った対形成
と結合効率へ及ぼす影響はオリゴヌクレオチドプライマ
ーの競合的結合の基本である。

ここで使われている「共通プライマー」とは競合オリゴ
ヌクレオチドプライマーが結合する鎖に相補的な鎖に結
合し、競合オリゴヌクレオチドプライマーから離れた場
所に結合するプライマーである。この距離は２つの結合
部位の間に伸長産物の合成ができる程度に十分なもので
あるが、一方、共通プライマーの伸長産物が競合オリゴ
ヌクレオチドプライマーに重なり、また競合オリゴヌク
レオチドプライマーの伸長産物が共通プライマーと重な
るようなほど近いところにあるべきである。共通プライ
マーと競合プライマーからの伸長産物はお互いに相補的
である。

ここで使われているオリゴヌクレオチドプライマーは全
て、そのプライマーがその特定の鎖とハイブリダイズす
るために、検出すべき既知の特定の配列にある各々の異
なる鎖（鋳型）と本質的に相補的であるように選ばれて
いる。プライマー配列は競合オリゴヌクレオチドプライ
マー検査法における鋳型の正確な配列を必ずしも反映す
る必要はない。しかし競合オリゴヌクレオチドプライマ
ーとして使われる色々な配列は色々な数の塩基ミスマツ
チをもっていることが重要である。例えば、正常な遺伝
子配列の検出において、競合オリゴヌクレオチドプライ
マーは正常な遺伝子配列に相補的な鎖を正確にコピーし
たプライマーと、１つの塩基対ミスマツチをもった相補
鎖をコピーしたプライマーを含んでいる（第１Ａ図参照
）。完全に−マッチしたプライマーと１つのＤＮＡ塩基
のミスマツチをもったプライマーとも、鋳型に結合する
ことができる。しかし２つの密接に関連したプライマー
をＤＮＡ！ｉ型とインキュベートするとき、完全にマツ
チしたプライマーの結合が１つの塩基ミスマツチをもっ
たプライマーよりも結合しやすいであろう。一方、プラ
イマーの１つが既知の遺伝子配列に対して１つの塩基ミ
スマツチがあり、他のオリゴヌクレオチドが少くとも２
つのミスマツチを含むこともある。かくして、一般に必
要なことは１つの配列にＮ個のミスマツチをもち、他の
配列にはＮより多いミスマツチがあり、Ｎは零から本質
的に類似の配列と結合できるだけのミスマツチの数まで
ありうるというものである。単一のＤＮＡ塩基が異なる
２つのオリゴヌクレオチドがプライマーとして単一のＤ
ＮＡまたはＲＮＡ鋳型を含む反応系で加えられるとき、
完全にマツチしたオリゴヌクレオチドプライマーは１つ
の塩基ミスマツチのあるプライマーよりも一層結合しや
すいであろう。同様に、もしプライマーが完全にマツチ
したものでなければ、よりマツチしたプライマーが結合
することになろう。問題となる配列と他の配列の違いが
大きければ大きいほど競合オリゴヌクレオチドプライマ
ー検査法の機能がより効率的である。しかしながら、そ
の差が大きすぎれば競合的な検査法として働かなくなる
であろう。

ここで用いられる「遺伝子多種性」の言葉はＤＮＡの同
じ遺伝子座に２つ、またはそれ以北の異なったヌクレオ
チド配列が共存している遺伝子座で見られる変異につい
て言っている。違った配列は病気を起こしたり、あるい
は起こさなかったりする。例えば、ＨＬ−Ａハブ口タイ
プは変化しているが病気を起こさない異なる遺伝子配列
をもっているが、鎌形赤血球貧血症は遺伝子配列の単一
の変化によってひきおこされる病気である。

ここに用いている「正常遺伝子配列」とは遺伝子病の場
合には正常な表現型になり、あるいは病気でない場合に
は、その集団にみられる最も普遍的なハブロタイブをも
たらす配列について言っている。

ここに用いられる「変異した遺伝子配列」とは、ＤＮＡ
配列において少くとも１つの塩基が正常な遺伝子配列と
違った変化をもった配列を言っている。変異した配列ま
たは配列群は遺伝子病に関与しており、あるいはその遺
伝子座で表現されるハブロタイブとして普遍性の少ない
ものである。

ここで用いられている「伸長産物」という言葉はオリゴ
ヌクレオチドプライマーの３′の末端から合成され、オ
リゴヌクレオチドプライマーが結合する鎖に相補的な産
物のことである。

「競合伸長産物」は競合オリゴヌクレオチドプライマー
の１つの３′末端から合成される伸長産物を指している
。

ここで用いられている「特異的に標識した」とは個々の
競合オリゴヌクレオチドプライマーが別々の標識をつけ
られていることを示していることを指す。この技術に通
じたものは、色々な標識が用いられることを認めるであ
ろう。例えば、ラジオアイソトープ、蛍光剤、化学発光
。

酵素、抗体などが含まれる。標識の選択には種々の要因
が関係する。これらは標識のハイブリダイゼーションの
速度への影響、プライマーのＤＮＡへの結合、標識の感
度、標識されたプライマーの作りやすさ、自動化しやす
さ、装置としての作りやすさ１便宜性といったものが含
まれる。例えば、別々に標識されたプライマーを使う方
法にあっては、各プライマーは別々のラジオアイソトー
プ、例えば”Ｐ、３Ｈ，”Ｃのようなもので標識される
。または各プライマーは同じ元素の異なる同位体で標識
もできる。フルオレセイン、テトラメチルローダミン、
テキサスレッド、４−クロロ−７−二トロベンゾー２−
オキサ−１−ジアゾール（ＮＢＤ）のような蛍光体、あ
るいはラジオアイソトープ、蛍光体、化学発光体、等の
異なる標識体の混合物が用いられる。これらの例では、
各プライマーが混合体である場合には、他のプライマー
全てと区別されねばならない。

ここで検出されている特定の既知の核酸配列は、いかな
る素材からも精製された形でも、精製されていない形で
も取り出される。これらの材料にはプラスミドやクロー
ン化されたＤＮＡ及びバクテリア、カビ、酵母、ウィル
ス及び植物、鳥、爬虫類、哺乳類のような高等生物を含
む素材からとった染色体ＤＮＡがある。望ましい例にお
いては、素材は染色体のＤＮＡである。

染色体ＤＮＡは血液、尿あるいは絨毛膜の絨毛や羊膜細
胞のような組織材料から、この技術に通じたものにとっ
て、既知の色々な技法によって調製される。

どんな特定の既に知られた核酸の配列でも、この方法で
検出される。その配列に沿った相対的な部位で求める配
列の異なる鎖にハイブリダイズするような２つのオリゴ
ヌクレオチドプライマーを調製するために、その配列の
両端で十分な数の塩基を十分、詳細に知ることがまず必
要である。そのプライマーをハイブリダイズした後、１
つのプライマーから伸長産物が合成される。伸長産物が
その鋳型から分離されるとぎは、決められた長さの核酸
の中にもう一つのプライマーを伸長させるための鋳型と
して使われる。配列の両端の塩基についての知見が大き
ければ大きいほど、標的とされる核酸配列に対するプラ
イマーの特異性が大きくなり、従ってこの方法の効率が
大きくなる。

オリゴヌクレオチドプライマーは適当な方法、例えばホ
スフィルトリエステル法とホスフィルジエステル法、ま
たはそれらの自動化された例、修飾された固相支持体上
でのオリゴヌクレオチドの合成、生物材料からの分離（
制限エンドヌフレアーゼ消化）及びＤＮＡまたはＲＮＡ
の鋳型を酵素的に転写することによる生成等の方法を使
って調製される。

本発明の実施内容は特定の既知の核酸配列の有無を検出
する方法または次のようなステップを含む異なる配列を
区別する方法である。すなわち少くとも２つのプライマ
ーを含み、１つはその特定の既知の配列と相補的であり
、少くとも１つは特定の既知配列と１個の塩基ミスマツ
チがある競合オリゴヌクレオチドプライマーを核酸、ま
たは核酸混合物標品に添加し、競合的条件下で特定の既
知配列に対して本質的に相補的なプライマーをハ・ｒブ
リダイズし、選択的にハイブリダイズしたプライマーを
３′末端から伸長させてプライマーがハイブリダイズし
ている鎖に相補的な伸長産物を合成し、そして伸長産物
を同定するものである。

本発明によれば、２つの密接に関連したＤＮＡ配列が競
合オリゴヌクレオチドプライミングによって区別されう
る。

基本的に既知ＤＮＡ配列と１つまたはそれ以上の塩基が
違うＤＮＡ配列を検出するために、既知ＤＮＡ配列とマ
ツチしているオリゴヌクレオチドプライマーと少くとも
１塩基対がマツチしたオリゴヌクレオチドプライマーと
異なるオリゴヌクレオドブライマーをテストすべきＤＮ
Ａの存在の中でインキュベートする。プライマーの少く
とも１つが以下にのべるように検出できるように標識さ
れる。本発明の検査法はその標識したプライマーが伸長
産物の中にとり込まれていることを調べることによって
それに対応する鋳型に結合するあるいはハイブリダイズ
するより密接にマツチしたＤＮＡプライマーに選択性が
あることを検出するものである。

例えば、反応条件は２つのオリゴヌクレオチドプライマ
ーを含めている。望ましくは少くともプライマーが鋳型
に対して過剰にあるようにする。デオキシリボヌクレオ
シドトリホスフェートのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
、ＴＴＰが新しいＤＮＡ鎖の合成にとって十分な基質を
もたらすに十分な量で使われるポリメラーゼの活性に十
分な濃度で加えられる。この溶液を約１００℃に約１５
秒から２分間、望ましくは１分間はど二重鎖のものを変
性させるために加熱する。

いろいろな緩衝液を競合ハイブリダイゼーションを行う
のに使える。緩衝液の条件の厳しさは最もよくマツチし
たプライマーがＤＮＡ伸長させるために効率よく結合で
きるようなものが求められる。緩衝液はまたＤＮＡ伸長
を触媒する酵素を作用させるものでなければならない。

存在するプライマーの量は存在する鋳型のモル量より多
くなければならないが、各々のプライマーは同モル量で
存在する必要はない。

変性時間の長さはいろいろ変えられる。必要なことは混
合液中の二重鎖の鋳型成分の変性をさせるのに十分であ
ることである。変性が行われる温度は緩衝液組成、変性
時間の長さ、混合液の二重鎖成分の量、濃度及び融点の
ような二重鎖成分の物理的な性格のような変性の条件に
よっても変えられる。望ましくは変性過程の温度はおお
よそ９０℃から１１０℃の間にあり、更に好ましくはお
およそ１０５℃で変性が行われる。

変性が完結すると溶液は冷却され、プライマーは競合的
条件下で鋳型鎖にハイブリダイズ（すなわち接合）され
る。接合温度はおおよそ１０℃から６５℃の間にあり望
ましくは２８℃である。

理想的な温度はこの技術に通じたものにとって知られて
いる方法に従って決められ、最もよくマツチするプライ
マーの融解温度のような要因やその他、上記の検定条件
等によって左右される。接合過程は少くとも５秒間進行
させられる。

望ましくは接合過程は２８℃で３０秒間行われる。

接合過程が完結したら、プライマーの伸長反応を起こさ
せるために誘起剤すなわち触媒作用試薬が溶液に入れら
れる。誘起剤または触媒作用試薬はＥ、ｃｏｌｉのＤＮ
Ａポリメラーゼ■のに１ｅｎｏｗ断片あるいはＴｈｅｒ
ｍｕｓ凹ｕａｔｉｃｕｓの熱安定性のＤＮＡポリメラー
ゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）のようなオリゴヌクレオチド
プライマーの伸長を促がすものであればよい。加えられ
る触媒量は標品のもつ活性によって左右され、この分野
に精通する者にとって知られていよう。例えば、Ｅ　、
　ｃｏｌｉのに１ｅｎｏｔｉ断片を触媒として使った場
合少くとも０．１から１００単位である。にｌｅｎｏｗ
活性の１単位はポリ（ｄ（Ａ−Ｔ））を鋳型プライマー
として用いて３７℃で３０分間に１０ｎＨの全デオキシ
リボヌクレオチドを酸沈殿性物質にとりこませるのを触
媒する酵素量と定義される。望ましくは５単位加えられ
る。この技術に通じたものにとっては色々な条件が知ら
れているが、伸長反応は例えばＤＮＡポリメラーゼ（Ｋ
ｌｅｎｏｗ）または熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａ
ｑ）を使うと８℃から９０℃で行うことができる。伸長
反応は通常３０ＷＩＭトリスー酢酸（ｐＨ７，９）、６
０１ｕＭ酢酸ソーダ、］ＯｍＭの酢酸マグネシウム、１
０ｍＭのジチオスレイトール、１．５ｍＭずつのｄＡＴ
Ｐ、　ＴＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ及び４μＭの各
プライマーまたはプライマー群と約０．５から１μＭの
ＤＮＡを含む１００μＱの最終容量で行われる。

伸長産物を同定するために使われる方法によってこれに
関するステップは色々変えられる。

例えば、共通プライマーが固相支持体に結合されると、
既知の配列に結合する伸長プライマーの配列は同相支持
体に結合されるであろう。かくして、固体担体上に配列
の有無を検出すれば、そのプライマーを同定できる。他
方、もしプライマーが固相担体に結合されていないと単
一の鎖を作らせるために二重鎖の伸長産物−鋳型を処理
する必要がある。この技術に通じた首は物理的、酵素的
、化学的手段が鎖を分離するのに使うことができること
を認識しよう。典型的には熱変性が使われる。

核酸配列を検出するための技術には色々な方法が知られ
ている。例えば、核酸配列はラジオアイソトープ、蛍光
、化学発光、酵素、抗体などで標識できる。標識の有無
が伸長産物が特定のプライマーからのものであるかどう
かを示している（第１Ｂ図）。

一方、対象となる配列は正常配列と変異した配列で異な
る制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいる。この場合
には二重鎖の伸長産物−鋳型は分離することなく制限エ
ンドヌクレアーゼによる消化にかけられ出来た制限酵素
断片の長さが測られる。

その方法の別の内容では同定のステップの前に伸長産物
を増幅させるステップを入れることがある。増幅には共
通プライマーを加えて少くとも１回次のステップを繰返
すことを含んでいる：すなわち（１）伸長産物をその相
補的な鎖と分離しく２）プライマーを選択的にハイブリ
ダイズさせ（３）ハイブリダイズさせたプライマーを伸
長させる。

増幅法のステップはいくらでも、繰返すことができる。

繰返し回数は競合プライマー、共通プライマー、デオキ
シヌクレオチドの量によって規制される。伸長産物は指
数的に増加する。

この過程は第１Ｃ図に見ることができる。この過程は検
出すべき配列の数を増すことによってその感度を上げる
ために使われる。かくして対象とする配列がバックグラ
ウンドに対して高くできる。

一方、競合オリゴヌクレオチドプライマーを添加する前
に、対象とする配列を増やすことも約に立つだろう。配
列を増幅する方法は「核酸配列を増幅する方法」　（米
国特許４，４８：１，２０２）と「核酸配列を増幅し、
検出し、またクローニングする方法」（米国特許４，６
８３，１９５）に記載されているが、この両方を参考文
献としてここに示す。

基本的にはこの方法は次のステップを含んでいる。すな
わち、容具なった特定の配列の各々の鎖に対してオリゴ
ヌクレオチドプライマーを接合させ、そのプライマーを
各々の鎖に相補的な伸長産物を合成する条件下で３′末
端からプライマーを伸長させ、その伸長産物は他のプラ
イマーの伸長産物の合成のために鋳型として用いられて
いる相補体から分離されたあとのものであり、そのプラ
イマーの伸長産物を単一の鎖分子を作るために合成され
た鋳型から分離し、そして少くとも１回は接合、伸長、
分離のステップを繰返すことによって特定の配列を増幅
するステップである。

増幅が行われれば、競合オリゴヌクレオチドプライマー
が添加でき、そして先に述べたような競合オリゴヌクレ
オチドプライマー法が行われる。これまでの報文に比べ
本発明が違っていて優れている主な点は本質的に相補的
な配列と少くとも１つ以上の塩基ミスマツチを含むもの
との間で結合の競合性があることである。例えば点変異
検出のための対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（Ａ
ＳＯ）プローブ法はプライマーとしてではなく、ハイブ
リダイゼーションのプローブとしてオリゴヌクレオチド
が使われている。ちがうＡＳＯ法のプローブは別々の反
ノ１６で用いられ、競合は起らない。

ＣＯＰ法がＰＣＲ法と違うことの一つは、ＰＣＲが特定
のＤＮＡ配列を増幅するために異なる部位で作用する反
対の側のプライマーの対を使用していて、一方ＣＯＰは
結合を競合させるために単一の部位でプライマーのセッ
トを使うところにある。

ＰＣＲ法においては２つ以上のオリゴヌクレオチドプラ
イマーが同じ反応容器中に存在し、別々の部位を増幅す
るのに使われる。さらに、ＰＣＲはＤＮＡｕ型に完全に
マツチしていないが単に「本質的に相補的Ｊなプライマ
ーを使っている。しかしながら、ＰＣＲはもし最もよく
競合するオリゴヌクレオチドプライマーがなければ、次
によくマツチしている競合プライマーが結合し、同じ場
所でＤＮＡ合成をひきおこすようにしてポリヌクレオチ
ド鋳型上での単一の結合部位で競合するプライマーの混
合物を利用しない。かくして、ｃｏｐを独特なものにし
ているのは共通の部位からのＤＮＡ合成のためのプライ
マーとして夫々機能することを競合オリゴヌクレオチド
プライマーができるが、最もよくマツチしたプライマー
を取り込むのが先行するということである。個々の競合
オリゴヌクレオチドプライマーを色々に標識すると、競
合状態を監視することができ、従って鋳型のＤＮＡ配列
を最もよくマツチしているオリゴヌクレオチドプライマ
ーを知ることによって推しはかることができる。

これまでの方法からもう一つのすぐれた主な点は約１２
個の短いプライマーを競合オリゴヌクレオチドプライマ
ー検査法に容易に使うことができることであるが、一方
、増幅過程に対してはより長いプライマーを使うことが
通常は望まれる。塩基のミスマツチ検査法が敏感な性質
をもつために１通常増幅のために使われるより長いプラ
イマーは競合法においてはそれ程効果的でない。

競合オリゴヌクレオチドプライミング法は検査されるべ
きＤＮＡ配列が正確にはわからない場合に機能できる。

最低の要求は正常なりＮＡ鋳型に結合してＤＮＡ合成を
引き起こすオリゴヌクレオチドプライマー誘導体の合成
を可能にするに十分なりＮＡ配列の知見である。競合的
オリゴヌクレオチドプライマーは正常なりＮ、Ａ鋳型に
結合するオリゴヌクレオチドプライマーと異なるもので
使われる。どの１個のプライマーが他の競合オリゴヌク
レオチドプライマーと区別できるように標識されていれ
ば、標識プライマーと他のプライマーの間での競合を標
識がＤＮＡ伸長産物にとり込まれていることによって追
跡できる。

競合オリゴヌクレオチドプライミング法は色々な目的の
ために利用できる。既知の遺伝子配列を検出するために
使われる。応用例には遺伝子病の検出がある。変異が分
かっていて、その周囲のヌクレオチド配列が分かってい
る遺伝子病はこの方法によって検出することができる。

例えば鎌型赤血球性貧血では、単一の塩基の変化が遺伝
子病をもたらす。その変異と周囲の配列が分かりそれで
競合オリゴヌクレオチドプライマー法が鎌型赤血球貧血
症を検出するのに使われる。競合オリゴヌクレオチド法
は比較的簡単で迅速で安価で正確な方法であるから、診
断に選択される方法になるものと思われる。例えば、試
料がとられてから結果がわかるまでたった６時間はどで
ある。サラセミア、オルニチントランスカルバミラーゼ
欠損症、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシル−
トランスフェラーゼ欠損症、フェニルケトン尿症などは
容易にこの方法で検出できる。この方法は生検試料、羊
膜穿刺、あるいは絨毛膜の絨毛のような細胞試料に適用
できる。この方法はＤＮＡ塩基の変化を直接測定するの
で発生の時期や測定しなければならない組織について制
限はない。唯一必要なことはプライマーが結合するであ
ろう部位の配列が分かっていることである。この利点は
通常は肝でしか発現しないフェニルケトン尿症のような
病気では容易に評価できる。水沫は羊膜液、絨毛膜絨毛
または血液でも、肝の生検をすることなくフェニルケト
ン尿症を検出することができる。かくしてこの技術に通
じるものは水沫の迅速性、安全性及び操作性について莫
大な利点を容易に認めるであろう。

その他の適応も容易に明らかにできる。例えば、既知の
配列をもった遺伝子座のどんな数でも遺伝子多形性をテ
ストすることによって家系のテストをすることである。

競合オリゴヌクレオチドプライマー法によって異なる標
識が夫々の座に対して使われ、従って色々な異なる座を
同時にテストすることができる。同様に、競合オリゴヌ
クレオチドプライマー法は遺伝子のマツピングやリンケ
ージ解析に使える。かくして。

もし遺伝子自体が分らなくても多形性に密接に関連して
いる配列は分かっていたとすれば、競合オリゴヌクレオ
チドプライマー法は関連した遺伝子の多様性を検出する
のに使え１診断のために用いられる。

この方法が広い利用性をもつもう一つの領域は法医学の
領域である。法医学では遺伝子の変異を検出することが
、その試料の起源を決める方法になる。競合オリゴヌク
レオチドプライマー法は同じ標本からの多くの遺伝子座
の配列を決定する迅速で正確な方法を提供する。

染色体に余分の遺伝子材料を付加することも競合オリゴ
ヌクレオチドプライマー法によって検出できる。例えば
、色々な感染症が原因となる微生物の特定のＤＮＡ配列
特性をもった臨床標本中にあれば診断できる。これらに
はサルモネラ、ストレプトコッカス、スタフィロコッカ
ス菌のような属のバクテリア、全てのカビ、全ての酵母
、サイトメガロウィルス、ヘルペスシンプレックス夏型
、■型、ＨＩＶ　（エイズウィルス）にような感染症を
起こすウィルスが含まれる。ここでも競合オリゴヌクレ
オチドプライマー法の迅速で比較的簡便な性質が病気の
検出に簡単な方法を提供している。生体標本中ではこれ
ら微生物の多くは少量であるので本発明の競合オリゴヌ
クレオチドプライマー法を適用する前に米国特許４，６
８３，１９５と４，６８３，２０２に記載されたＰＣＲ
法を使って対象となる配列を増幅する必要がある。

この方法のもう一つの重要な用途は新生物の検出と新生
物の治療を追跡することにある。多くの新生物が宿主の
染色体または既知の配列の挿入部に遺伝子配列の変異を
もたらすので競合オリゴヌクレオチドプライマー法はこ
れらの配列を検出するのに使用できる。新生物の検出が
重要であるけれどももっと有用なのは治療の進行を追跡
することである。薬物、外科或いは放射能であれ治療を
行った後、新生物の治療が成功したかどうかは病気に関
連した配列の消失によっている。かくして治療がはじま
った後に試料をとって、競合オリゴヌクレオチドプライ
マー法が治療の効果と経過を追うために使われる。

このことは少量の配列が検出できこのテストが比較的迅
速で多数の試料を同時に追跡できるので治療の予後をみ
るのによいと思われる。

ヒトにおける競合オリゴスクレオチドプライマー法の使
用が多いのに加えて、動物にこの方法を利用する機会も
広大である。例えば多くの場合、競馬やウシ、ブタ、イ
ヌ、ネコその他の動物で種属の保存などその株の純粋性
を調べるために競合オリゴヌクレオチドプライマー法が
使われている。株の純粋性を調べることは遺伝子配列の
同等性を測ることであり、また競合オリゴヌクレオチド
プライマーは遺伝子配列を迅速に調べるために使われる
から動物の株の純粋性を調べるのに利用できる。ヒ１〜
におけると同様に動物においても競合オリゴヌクレオチ
ドプライマー法が家系の解析や病気のスクリーニングに
使われる。また、これは例えば競走馬、荷牛、乳牛ある
いは食中の育種、トリやブタの育種計画などの動物の系
統にとっても重要である。

さらに、病気の状況が正確に迅速に決められるので輸入
動物の検疫の期間が大いに短淵す匙よう。

以下の例は説明のために提供するものであって、いかな
るものでもこの発明を限定するもののつもりでない。こ
の実施例においては他に断らなければ百分比は全て固体
ならば重量比、液体ならば容量比であり温度は摂氏温度
である。

〔実施例〕

実施例１ 競合オリゴヌクレオチドプライマー法による点変異検出
の例がネズミのオルニチントランスカルバミラーゼの○
ＴＣ遺伝子からクローン化したｃＤＮＡ配列を使って示
されている（Ｖｅｒｅｓ等：　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３
７．４１５（１９８７））。

標的となる配列は正常なＯＴＣマウスからクローン化さ
れたｃＤＮＡとＯＴＣ欠損の１毛のうすい」マウスから
の変異したＯＴＣｃＤＮＡである。

これらは以前に決定されている部位でＣＯＧ塩基対に対
してＡ：Ｔ塩基対の置換がある以外は同一である。（＋
）または（ｓｐｆ）　ｃＤＮＡ配列のいづれかに相補的
な２つのオリゴマー（１２個）が合成されたが夫々＃９
２と＃９３として第１表に示されている。プライマーと
結合する部位の周辺の領域の完全なりＮＡ配列が第２Ｂ
図に示されている。

点遣ノ野υ丸匿 第１表 ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴ ＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣ ＡＧＣＴＣＧＧ（ＴＡ）ＡＣ（ＣＧ）ＣＡＡＴＴＣＧＡ
ＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＡＡＴＴＣ（ＧＣ）ＡＧＣ
ＴＣＧＧ（ＴＡ）ＡＣ（ＣＧ）ＣＧＧＣＡＡＧＴＧＡＡ
ＴＧＴＣ ＣＡＡＧＴＴＡＡＴＧＴＣ ＣＴＧＴＣＣＡＣＡＧＡＡＡＣＡＧＧＣＭ１３　　共通 Ｍ１３　　Ｃ０Ｐ ＯＴＣ（＋） ＯＴＣ（ｓｐｃ） ＯＴＣ共通 ａ：カッコは単一の部位でのオリゴヌクレオチドが混っ
ていることを示す。

この例で使われているＤＮＡｕ型は単一のＤＮＡ塩基対
の変化があることによってちがっている。＃９２と＃９
３の２つのプライマーは第３の共通オリゴヌクレオチド
プライマーで２つの競合するプライマー（＃９２と＃９
３）とは反対の性質にある＃９４と一緒に用いられた。

＃９２と＃９３のプライマーは１２個の長さで＃９４は
１８個の長さである。＃９２かまたは＃９３オリゴマー
のいずれかが３２ｐで放射ラベルされて複製反応が行わ
れた。これらの反応においては＃９２と＃９３のプライ
マーはｓｐｆ変異の存在を検出するのに競合した。プラ
イマー＃９４はその反応では共通プライマーである。

以下の４つの反応を行った。すなわち（１）正常鋳型を
放射ラベルした正常プライマーと非標識の変異プライマ
ーとを混合する。（２）正常鋳型を非標識の正常プライ
マーと放射標識した変異プライマーとを混合する。（３
）変異鋳型を放射ラベルした正常プライマーと非標識の
変異プライマーとを混合する。（４）変異鋳型を非標識
の正常プライマーと標識変異プライマーとを混合する。

かくして４つの全ての反応の化学組成は同じであり、た
だ正常または変異鋳型のいずれかが正常または変異の競
合プライマーのいずれかにある放射標識と一緒に存在さ
せた。

鋳型は各々おおよそ５００ｎｇの量を入れた。プライマ
ー＃９４は４μ阿、プライマー＃９２と＃９３は夫々２
μＮであった。そのプライマーは５′末端に３２ｐを放
射ラベルされている。約３０μ阿のトリス酢酸緩衝液（
ｐＨはおおよそ７．９）　、約１０μＨの酢酸マグネシ
ウム、約１０μＮのジチオスレイトール、約１．５μ台
づつのｄＡＴＰ、ＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを加えて
反応を行なった。反応全量はおおよそ１００μＱであっ
た。試料を約１０５℃で２分間加熱し、約２８６で３０
秒間接合させたのちＥ　、　ｃｏｌｉからとったＤＮＡ
ポリメラーゼ■のにｌｅｎｏｗ断片を約５単位を添加し
た。ＤＮＡのポリメリゼーションを約２分間持続させた
。

加熱、冷却及びＤＮＡポリメリゼーションのサイクルを
約１０回繰返した。反応産物を４％Ｎｕｓｉｅｖｅアガ
ロースゲルで電気泳動しオートラジオグラフィーにかけ
て解析した。プライマーの＃９４と＃９２または＃９３
のいづれかとの間の領域に相当する７２ｄＰの断片が各
フラクションで生成した（第３Ａ図）。各レーンは（＋
）ＯＴＣでクローン化したｃＤＮＡ（レーン１と２）ま
たは５ｐｆＯＴｃでクローン化したｃＤＮＡ　（レーン
３と４）のいずれかを使って１０サイクルのＰＣＲ増幅
を行って得た産物を含んでいる。レーン１と３は（＋）
ＯＴＣｃＤＮＡに特異的な放射標識したプライマーを含
み、レーン２と４は５ｐｆＯＴＣｃＤＮＡに特異的な放
射標識プライマーを含んでいる。ＣＯＰの結果はＰＣＲ
増幅によって７２ｄＰ産物に増幅されている。

各フラクションに７２ｄＰの断片が存在することは、期
待された場所の夫々でオリゴヌクレオチドプライマーの
効果的な伸長が起ったことを示しており、また増幅が達
成されたことを示している。アガロースゲルのオートラ
ジオグラフ解析は２つの競合しているプライマーが結合
すると思われる場所で完全にマツチしたプライマーを選
択的に利用していることを示している（第３Ｂ図）。か
くして１反応（１）と（４）は放射能を反応産物にとり
込んで逆に（２）と（３）は反応産物には放射能をとり
込むことはなかった。この検査法を識別するレベルすな
わち、正しくマツチしたプライマーをミスマツチプライ
マーよりも選択的に利用する程度は第３Ｂ図に示されて
いる。放射能がとり込まれると思われるところでは放射
性シグナルは放射性かつ取りのぞかれたと思われる場合
の１００倍程大きくなる。

実験例２ ＣＯＰの原理をさらに説明するため、またＣＯＰ現象に
及ぼす競合しているオリゴマーの長さの効果を研究する
ために、フィラメント状のファージ、Ｍ１３ｍρ１８か
らとった単一鎖のＤＮＡ鋳型を使って実験が行った。　
ｍｐｌｇの有用な特性はそれが、その配列の中に多くの
制限エンドヌクレアーゼによる分解のための認識部位を
もっているＤＮＡ領域を含んでいることである。ｍｐｌ
ｇがＤＮＡ合成によって忠実にコピーされれば、制限エ
ンドヌクレアーゼの認識部位が再生産される。ミスマツ
チしたＤＮＡプライマーがとり込まれたときのような異
常型のＤＮＡ再生産は制限エンドヌクレアーゼ認識部位
を破壊するであろうし、それらの酵素による分解を妨げ
るであろう。２つのプライマーがＤＮＡ肋９としてｍｐ
ｌｇを使ってのＤＮＡ合成のためのプライマーとして同
時に用いられるときに、１つのプライマーは鋳型に対し
て完全に相補的でもう１つのプライマーは制限エンドヌ
クレアーゼ認識部位を破壊するような１個のＤＮＡ塩基
変化を含んでいるとすれば、ＤＮＡ合成反応ではその２
つのプライマーの各々の相対的利用性は合成産物に対す
る制限エンドヌクレアーゼの活性によって決められよう
。この例は完全にマツチした１２個のオリゴマー（Ａ）
と２０個のオリゴマー（Ｂ）の夫々がｍｐ１８ＤＮＡを
コピーし、元々存在する制限エンドヌクレアーゼ認識部
位を含む合成産物を産生ずるために使うことができるこ
とを示している。

次に、１２個まはた２０個のプライマーを制限エンドヌ
クレアーゼの認識配列をこわす単一のＤＮＡ塩基の置換
が存在する以外は同一な他のオリゴヌクレオチドプライ
マーと混ぜ、ＤＮＡ合成反応を行った。プライマー混合
物が１２ａＩのものを含むときは完全マツチしたオリゴ
マーがＤＮＡ合成反応で優勢にとり込まれ、そのことは
ＤＮＡ合成産物中の制限エンドヌクレアーゼ認識部位が
保たれていることによって示されている。競合効果はオ
リゴマーが２０個である場合は減少した。かくして、こ
こで用いられた条件下では１２個のプライマーが２０個
のものよりより効果的なｃｏｐを示す。

この例ではＤＮＡの鋳型はフィラメント状ファージのＭ
　１３Ｍｐ１８（ｍｐ１８）からとった単一鎖のＤＮＡ
であった。競合オリゴヌクレオチドプライマー法を示す
ためたに３つのプライマーを用いた。ＲｓａＩとＭｓｐ
Ｉに対する制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むｍｐ
１８ＤＮＡ鋳型の領域に対して完全に相補的な１２個の
プライマー＃８５を合成した。１２個のプライマー＃８
６はオリゴヌクレオチド合成機により混合−カッブリン
グ機能を使って合成した。＃８６のプライマーは＃８６
の配列の中で２つのヌクレオチド部分でＤＮＡ塩基対が
合成の間に加えられた以外は＃８５プライマーと同一で
ある。かくして、４８６群はおおよそ２５％のＡＧＣＴ
ＣＧＵ工ＡＣＣＣ１２５％のＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＧＣ
１２５％のＡＧＣＴＣＧＧＡＡＣＧＣ及び２５％のＡＧ
ＣＴＣＧＧＡＡＣＧＣから成っていた。２つの部位での
塩基置換（ａ）ｍρ１８９型に完全に相補的か或いは（
ｂ）もしハイブリダイズすればＲｓａＩまはたＭｓρ■
制限エンドヌクレアーゼによって認識され分解するため
の正しいＤＮＡ配列はもはや有しない反応生成物を産生
ずるであろうｍｐ１８９型と相補的ないずれかのファミ
リーメンバーを表わすために用いられた。１５個のプラ
イマーの＃１はｍｐｌｇＤ　Ｎ　Ａと相補的であるが＃
８５と＃８６の結合部位の反対側にあるかそれから約７
５塩基対にあるがこれも合成された。

プライマー＃１は共通オリゴヌクレオチドプライマーで
あった。＃１プライマーは５′末端に３２Ｐで放射標識
した。プライマーの配列は第１表に示されている。プラ
イマーの結合部位に囲まれている領域のＤＮＡ配列は第
２Ａ図に示されている。

２つの反応が行われた。各々は約５００ｎｇのｍｐ１８
ＤＮＡＩ型と約４μＭの放射標識したプライマー４１を
約３０μＭのトリス酢酸緩衝液（約ｐｌ＋７．４）、約
５０μＭの酢酸ナトリウム、約ＩＯμＭの酢酸マグネシ
ウム、約１０μＭのジチオスレイトール及び約１．５μ
Ｍづつの、ｄＡＴＰ、　ＴＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴ
Ｐを入れ全容量おおよそ１００μ悲となった。１つの反
応はプライマー＃８５を含み他のプライマーはプライマ
ー群の＃８６をもっている。

反応混合物を約１０５℃約２分間加熱し、冷却しておお
よそ３０秒で約２８℃に冷却する。　Ｅ、ｃｏＱｉから
とったＤＮＡポリメラーゼ■の大きな断片約５単位を加
えた。加熱と接合、ＤＮＡのポリメリゼーションは１０
回を繰返す各反応液の一部は増幅を５ないし１０回繰返
し続け、そしてゲル電気泳動やラジオオートグラフィー
によって直接分析できるようにするか、制限酵素で処理
しそしてゲル電気泳動とラジオオートグラフによって分
析する。

第４Ａ図は制限エンドヌクレアーゼで処理されていない
材料（非切断）が８５ｂｐ断片を表わしていることを示
している。この８５ｂｐ断片はプライマー＃１を含むの
で放射活性がある。最初の反応から採取したプライマー
＃８５を含んでいる試料をプライマー＃１と＃８５の結
合部位の間のＤＮＡ配列を認識して分解する制限エンド
ヌクレアーゼＰｓｔＩで処理すると予期されるように放
射標識された４８ｂｐの産物が生成される。ＰｓｔＩの
認識配列はオリゴヌクレオチドプライマーの間のＤＮＡ
合成のくり返しの間に忠実にコピーされているのでＰｓ
ｔＩで処理した試料は対照試料として使われる。

プライマー＃８５を含む最初の反応からとった試料を制
限エンドヌクレアーゼＲｓａＩまたはＭｓｐｒで処理す
ると、予期される放射標識された７６ｂｐと７５ｂｐの
断片が生成された（第４Ａ図）。ＲｓａＩとＭｓｐＩ制
限エンドヌクレアーゼの認識配列の存在はプライマー＃
８５がＤＮＡ合成がくり返されている間に忠実に取り込
まれていることを示している。

同族プライマーの＃８６を含む第２の反応産物を同様に
して解析すると同様な結果が８０された（第４Ａ図）。

すなわち、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔｌは４８ｂｐ
断片を分解し、プライマー＃ｌと同様プライマーの＃８
６の間の領域がＤＮＡ合成がくり返されている間に忠実
にコピーされていることを示した。この結果は、ＤＮＡ
合成がくり返されている間に４つあるプライマー＃８６
オリゴヌクレオチド群のうちの１つが選択的に取り込ま
れたことを示している。ＤＮＡ塩基ミスマツチを含む他
の３つのオリゴヌクレオチドがどれも取り込まれにくい
ことをＤＮＡ鋳型に対して完全な適合をしていないプラ
イマーに対して完全にマツチしているプライマーが効果
的に競合していることを示している。

２０個のオリゴマーを使ったこの方法は概念的に１２個
のオリゴマーを使った上記の例と同様である。

ここでもフィラメント状のファージ旧３ｍρ１８から採
った１本鎖ＤＮＡを鋳型として使った。

競合オリゴヌクレオチドプライマー法を示すために３つ
のプライマーが使われた。２０個のプライマーである＃
８９が５ａｃ１．　Ｒｓａｌ、　ＭｓｐＩに対する制限
エンドヌクレアーゼの認識部位を含むｍｐ１８ＤＮＡ＄
１型領域と完全にマ型子域るものとして用いられた。「
同族」のオリゴヌクレオチドである２０塩基プライマー
＃９０をオリゴヌクレオチド合成機で混合結合機能を用
いて合成した。＃９０ブライマーは＃９０配列の中の３
ケ所でＤＮＡ塩基対が合成の間に加えられた以外はプラ
イマー＃８９と変わっていない。かくして、＃９０オリ
ゴヌクレオチド群は８種ありその１つの３つの制限エン
ドヌクレアーゼの全てによって認識されるＤＮＡ配列を
含み、３つは２つの部位を合わせもっており、３つは１
つの部位をもち、１つは制限部位をもたない。さらに、
各々の部位はｍｐ１８ＤＮＡ鋳型に完全にマツチするこ
とが等しく証明されている。１５塩基のプライマー＃１
は共通プライマーとして用いられた。プライマーの配列
は第１表に示されている。プライマーの結合部位の周辺
のＤＮＡ配列は第２Ａ図に示されている。各反応の条件
は１２塩基をもったｍｐ１８の競合オリゴヌクレオチド
プライミングに用いられた上記力と同様に行った。

プライマー＃８９を含む反応から採った試料をｌＯサイ
クルのＤＮＡ合成を行った後採取し、制限エンドヌクレ
アーゼＰｓｔ１．５ａｃＩ、　ＲｓａＩ、またはＭｓｐ
Ｉで処理すると９１ｂＰの放射標識された断片が夫々の
制限エンドヌクレアーゼによって８１．７６または７５
ｂρにまで減ることが観察された（第４Ｂ図）。このこ
とはプライマーの＃１と８９の間の領域と、＃８９プラ
イマーとオーパーラシブしているＤＮＡ配列ともＤＮＡ
合成をくり返している間忠実にコピーされていることを
示した。

反対しこ、オリゴヌクレオチドプライマー群である＃９
０を含む反応産物のいくつかは制限エンドヌクレアーゼ
の５ａｃ１．　ＲｓａＩ、　ＭｓｐＩによる分解を受け
にくかった（第４Ｂ図）。オリゴヌクレオチドのプライ
ミング部位の間のＤＮＡ配列を認識する制限エンドヌク
レアーゼＰｓｔＩは反応産物を効率よく分解した。それ
故この分解しないことは＃９０のオリゴヌクレオチドか
らのミスマツチのあるオリゴヌクレオチドを取り込んだ
ためであった。かくして、１ｐ１８ＤＮＡと１２塩基オ
リゴヌクレオチドで行った上記の実施例２（Ａ）にある
実験はこの反応条件では１２塩基成分が特定のＤＮＡプ
ライミング部位に対して効果的な競合を示す一方、より
長い（２０塩基）のオリゴマーは競合オリゴヌクレオチ
ドプライミングに対して効率が悪いことを示している。

実施例３ −グロビン組型　血球対立形　） 鎌型赤血球貧血を起こすヒトの変異も競合オリゴヌクレ
オチドプライミングによって検出される。β−鎌梨型赤
血球対立形質領域にあるヒトのβ−グロビン遺伝子の正
常ＤＮＡ（β０）は次のとおりである。

八ＣＡＴｒＴＧＣＴＴ　　ＣＴＧＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴ
ＧＴＴＣＡＣ丁　ＡＧＣＡＡＣＣＴＣＡ　　ＡＡＣＡＧ
ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＡ
　　ＧＧＡＧＭＧＴＣＴ　　ＧＣＣＧＴＴＡＣＴＧ　　
ＣＣ７０７０００００客 τ−０ｓ そしてβＳ（鎌型赤血球）へモグロビノパシーを起こす
単一のＤＮＡ塩基変化の部位が矢印で示されている。β
５遺伝子型をもたらす塩基変化はＡ−＞Ｔである。かく
して、次のようなプライミングが作成され、競合オリゴ
ヌクレオチドプライマー法に使われる。

（１）５’−ＣＴＣＣＴＧ　ＡＧＧ　ＡＧＡ−３’　（
１２塩基−β０特異的）（２）５’−ＣＴＣＣＴＧ　Ｔ
ＧＧ　ＡＧＡ−３’　（１２塩基−β５特異的）プライ
マーの（１）と（２）は別々に標識され、Ｃ○Ｐ反応に
おいてクローン化された９士グロビンまたはβ５−グロ
ビンの配列のいずれかと一緒に使われる。

ＤＮＡとよく結合した競合プライマーの伸長産物を増幅
するために次のような第３のプライマーを使ってうまく
競合しているプライマーを同定する。

（３）５’−ＣＧＴ　ＴＣＡ　ＣＣＴ　ＴＧＣＣＣＣＡ
ＣＡ　ＧＧ−３’プライマー（３）はプライマー（１）
または（２）と反対の方向にＤＮＡ合成を開始するだろ
う。この検査法は３組のプライマー（１）、（２）、（
３）を使って行うと、４７ｂｐの断片が作られ、それは
ＤＮＡ鋳型の真のＤＮＡ配列を示しているだろう。

もし、検査すべき出発物質が複雑ＤＮＡ混合物例えばヒ
トの染色体ＤＮＡのようなものであれば、β５変異した
対立遺伝子を含む部位を合成するために２つのプライマ
ーがまず使われる。

例えば。

５’−ＴＧＧ　ＴＣＴ　ＣＣＴ　ＴＡＡ　ＡＣＣＴＧＴ
　ＣＴＴ　Ｇ−３’５’−ＡＣＡ　ＣＡＡ　ＣＴＧ　Ｔ
ＧＴ　ＴＣＡ　ＣＴＡ　Ｇ−３’の２つのオリゴヌクレ
オチドがここで述べられているプライマー（１）、（２
）及び（３）に対して相補的なりＮＡを含むヒトのβ−
グロビン遺伝子の１６７ｂｐ断片を増幅する。

β５変異を含む領域を増幅するのに続いて上記のように
して競合オリゴヌクレオチドプライマー法が行われる。

各々の場合にβ０またはβいずれの対立遺伝子に相応す
るオリゴマーが標識されて他のオリゴマーと区別できる
ようにする。特定の標識の検出がこの検査法の終点であ
る。

実施例４ α−アンチトリプシン２　立　　°Ｓ　立α、アンチト
リプシンの欠損をもたらすヒトの変異も競合オリゴヌク
レオチドプライミング法で検出される。α１−２対立形
質を含む部位の周辺のα□−アンチトリプシン遺伝子に
おける正常ヒトＤＮＡ配列（Ｍ）は ５′−＾ＣＣ，ＡＴＣ，ＧＡＣ，ＧＡＧ、ＡＡＡ、ＧＧ
Ｇ、Ａ−３’↓ であり、矢印（Ｃ→Ａ）で示された変異が変異２対立形
質を起こす。

同様にα１−５対立形質を含む部位の周りのα□アンチ
トリプシン遺伝子における正常ヒトＤＮＡ配列（Ｍ）は ５’−ＡＧＣ，ＡＣＣ，ＴＧＧ、ＡＡＡ、ＡＴＧ、ＡＡ
Ｃ，Ｔ−３’であり、（Ａ−）Ｔ）を示す変異がＳ対立
形質対を起こす。

かくしてＭ／Ｚ対立形質またはＭ／Ｓ対立形質の違いに
特異的なプライマーを次のようなものとして作製される
。すなわち プライマーの（１）、（２）、（３）、（４）は別々に
標識され、クローン化された正常のα、−アンチトリプ
シンＤＮＡ配列（Ｍ）または変異した配列（２またはＳ
）を区別するために競合オリゴヌクレオチドプライマー
法に用いる。うまく競合しているプライマーの伸長産物
は共通プライマーを用いることによって増幅した後に検
出される。

例えば、プライマー（１）と（２）とさらにプライマー
（５）　（５’　−ＣＡＧ、ＣＣＡ　、（ＥＣＴ、ＴＣ
Ａ、ＧＴＣ，ＣＣＴ、ＴＴＣ−３′）を加えるとこの反
応で８１ｂｐの断片を産生ずるであろう。プライマー（
３）と（４）とプライマー（６）　（５’−ｃｃｃ、＋
ｕｒ、ｃＡｃ、ｃｏ、ｃＴｃ、ＴｃＴ、ｒｃ−３′）で
は７０ｂρの断片を産生ずるだろう。

もし、出発材料がヒトの染色体ＤＮＡ標品を含んでいれ
ばＺ対立遺伝子に対する変異部位の脇にあるが含まれて
はいないプライマーのセットすなわち５’　−ＡＣＧ、
ＴＧＧ、ＡＧＴ、ＧＡＣ，ＧＡＴ、ＧＣＴ、ＣＴＴ、Ｃ
ＣＣ−３’と５’−ＧＴＧ、ＧＧＡ、ＴＴＣ，ＡＣＣ，
ＡＣＴ、ＴＴＴ、ＣＣＣ−３’がＺ対立遺伝子を含むα
、−アンチトリプシン遺伝子の４５０ｂｐ断片を予め増
幅するために利用される。Ｓ対立遺伝子に対する変異部
位の脇にあるがそれを含まないプライマーセットである
５’　−ＧＡＡ、ＧＴＣ，ＡＡＧ、ＧＡＣ，ＡＣＣ，Ｇ
ＡＧ、ＧＡＡ−３’と５’　−ＡＧＣ，ＣＣＴ。

ＣＴＧ、ＧＣＣ，ＡＧＴ、ＣＣＴ、ＡＧＴ、Ｇ−３’が
Ｓ一対立遺伝子を含むα、−アンチトリプシン遺伝子の
３４０ｂｐ領域を予め増幅するのに利用できよう。

競合オリゴヌクレオチドとその対立する共通プライマー
を使ってのＣＯＰ解析のための初発材料として増幅され
た変異部分が利用された。

例えば増幅された４５０ｂρ断片の中のＺ対立遺伝子の
部分にプライマー（１）と（２）は競合して結合する。

うまく競合したプライマーの伸長産物は（１）であって
も（２）でもあっても共通プライマー（５）を使うこと
によって増幅したあと検出できる。同様にプライマー（
３）と（４）は３４０ｂｐ断片内にあるＳ対立遺伝子の
部位に競合して結合し、競合しているプライマー伸長産
物は（３）でも（４）でも共通プライマーの（６）を使
うことによって増幅した後検出される。

この技術に精通したものは本発明がその目的とするとこ
ろを実行し、その目的と利点をここに表にあられれずに
内存しているものを含めこれまで述べてきた目的と利点
を得るために適用することを容易に評価できよう。ここ
に述べた方法、手技及び技術は代表的な内容として選ん
だもので説明をするためのものでありその目指すところ
に限定を加えるつもりはない。この技術に通じたものに
とってこの発明の精神に含まれあるいは特許請求の範囲
の示すものによって規定される中での変更及び他への利
用を行うことができよう。

【図面の簡単な説明】

第１図は競合オリゴヌクレオチドプライミング系の基本
原理を示している。第１Ａ図は２つの類似したプライマ
ーが単一のＤＮＡ鋳型に対して競合するとき完全にマツ
チしたプライマーが単一の塩基ミスマツチをもったプラ
イマーより選択的に鋳型に接着またはハイブリダイズす
るであろうということを示している。第１Ｂ図はオリゴ
ヌクレオチドプライマーがその検出を容易にするために
、放射活性にされている場合を示している。第１Ｃ図は
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって競合オリゴヌク
レオチドプライミングを検出する場合を示している。Ｄ
ＮＡ鋳型の２つの部位でプライムされる。ひとつのオリ
ゴヌクレオチドプライマーがその部位の一つの（共通プ
ライマー）に使われ、競合しているオリゴヌクレオチド
プライマーはＤＮＡ変異のあるもう一つの場所に用いら
れる。ＰＣＲ増幅をした後、「正しく」完全にマツチし
たプライマーがＰＣＲ増幅産物にとり込まれている。第
２図は実施例１及び２におけるオリゴヌクレオチドプラ
イミング部位の周辺領域のＤＮＡ配列。 第２Ａ図はＭ１３＋＋＋ｐ１８のフィラメント状のファ
ージＤＮＡの配列を示している。第２Ｂ図はオルニチン
トランスカルバミラーゼのｃＤＮＡ配列を示している。 第３Ａ図は十と５ｐｆＯＴｃ対立形質に特異的なプライ
マーから生じる競合オリゴヌクレオチドプライミング産
物の解析を示している。第３Ｂ図は第３Ａ図において示
されるゲルのラジオオートグラフで放射活性をもったプ
ライマーが第１と第４レーンで７２ヌクレオチド断片に
とりこまれていることを示しており、そこでは放射活性
をもったプライマーが完全に鋳型にマツチし、−力筒２
，３レーンにおいては放射活性のミスマツチプライマー
が排除されている。第４Ａ図は１２ケのオリゴヌクレオ
チドを競合に使ってＭ］３ｍｐ１ｇＤ　Ｎ　Ａのｃｏｐ
とＰＣＲから生成した断片をオートラジオグラフ解析し
たものである。第４Ｂ図は２０ケのオリゴヌクレオチド
を競合に使ってＭ　１３ｍｐ１８　Ｄ　Ｎ　Ａのｃｏｐ
、ＰＣＲから生じた断片をオートラジオグラフで解析し
たものである。 図面は必ずしも計測してはいないが本発明の特徴は大き
さで大きくみせているし、明確さのために模式的に示さ
れている。 特許出願人　ベイラー　カレッジ　オブ　メディシンソ
、４’　ｒ　：マツ手するアライマーーＸ−ミスマ・／
＋−リドろプライマーＸ− ミスマツチのあるフ゛ライマー１コ別痒さ君ろＬｔ＜マ
・ソチするブライマーｌて ハイプリタンス°゛ず４４作゛ヤ Ｆ／（３、／Ａ 図面の浄書（内容に変更なし） 一×− ！ｒτ１よ Ｘ　− Ｘ　　− ４Ｆで１２ □×− ＦＩＧ、　／Ｂ １〜目”Ｓ、Ｊ７人 ＦＩＧ、４Ａ Ａ　（１２□’＄、乎） 「ｌ（′−４［−３ Ｈ（ａｏ−１禿） Ｆ′：；ｔ＝、；　、　３　Ｆ−３ 平成１年８月〉［１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少くとも２つのプライマーを含み、その１つが特定
   の既知の配列に本質的に相補的で、少くとも１つは、そ
   の特定の配列について１つの塩基ミスマッチがある、競
   合オリゴヌクレオチドプライマーを核酸、または核酸混
   合物試料に加え、競合するような条件下で特定の既知の
   配列に対して、本質的に相補的なプライマーを選択的に
   ハイブリダイズさせ、プライマーがハイブリダイズされ
   るヌクレオチド鎖に相補的な伸長産物を合成するために
   、その３′末端から選択的にハイブリダイズしたプライ
   マーを伸長させ、その伸長産物を同定するステップを含
   む、特定の既知の核酸配列の有無を検出する、或いは色
   々な配列の違いを見分ける方法。 ２、競合オリゴヌクレオチドプライマーが、おおよそ８
   −２４塩基の長さである請求項１の方法。 ３、競合オリゴヌクレオチドプライマーの少くとも１つ
   が標識されていて、その伸長産物が、その中に標識の有
   無を調べることによって同定される請求項１の方法。 ４、標識が、ラジオアイソトープ、蛍光体、化学発光体
   、酵素、抗体の群から選ばれる請求項３の方法。 ５、その同定のステップの前に共通オリゴヌクレオチド
   プライマーを加え、その相補的なヌクレオチド鎖から伸
   長産物を分離し、その選択的ハイブリダイズステップと
   伸長ステップを繰り返すステップを含む請求項１の方法
   。 ６、その分離する、選択的ハイブリダイズする、伸長す
   るステップを、少くとも１回繰り返すステップを、さら
   に入れた請求項５の方法。 ７、少くとも２つのプライマーを含み、その１つが特定
   の既知の配列に本質的に相補的であり、少くとも１つは
   その特定の配列に塩基ミスマッチがある競合オリゴヌク
   レオチドプライマーを核酸、或いは核酸混合試料に加え
   、共通プライマーが相補的なヌクレオチド鎖の１つに接
   合し、その本質的な相補的な競合オリゴヌクレオチドプ
   ライマーが、特定の既知の配列を含む他の相補的な鎖に
   接合するような条件下に、相補的な鎖を分離するために
   本質的に相補的競合オリゴヌクレオチドプライマーと共
   通ヌクレオチドプライマーを接合させ、そのプライマー
   に接合した鎖に相補的な伸長産物を合成するために、そ
   の接合したプライマーを３′末端から伸長させ、その伸
   長産物を相補体から分離後、その接合したプライマーの
   他の伸長産物を合成するための鋳型として使い、１本鎖
   分子を作るために、その鋳型から伸長産物を分離し、そ
   の特定の既知の配列を含む１本鎖分子を、その接合、伸
   長、分離のステップを少くとも１回繰り返すことによっ
   て増幅し、その増幅された伸長産物を同定するステップ
   を含む別々の相補的な核酸のヌクレオチド鎖混合物を含
   む試料中に、特定の既知の核酸配列の有無を検出するか
   、または、その試料中の少くとも２つの異なる配列の違
   いを区別する競合オリゴヌクレオチドプライマー法。 ８、競合オリゴヌクレオチドプライマーの少くとも１つ
   が標識されていて、その標識が、ラジオアイソトープ、
   蛍光体、化学発光体、酵素及び抗体から成る群から選択
   される請求項７の方法。 ９、同定のステップが増幅された伸長産物にある標識の
   有無を検出することを含んでいる請求項８の方法。 １０、共通オリゴヌクレオチドプライマーが固体支持体
   に結合されていて、増幅された伸長産物が、その固体支
   持体に付けられた標識の有無を調べることによって同定
   される請求項８の方法。 １１、特定の核酸配列が遺伝病を起こす、少くとも１つ
   の変異を含む請求項７の方法。 １２、各々の特定の既知配列に特定のオリゴヌクレオチ
   ドプライマーを接合し、そのプライマーに接合したヌク
   レオチド鎖に相補的な伸長産物を合成するために３′末
   端から、その接合したプライマーの各々を伸長し、その
   伸長産物をその相補体から分離した後、もう一つの別の
   プライマーの伸長産物の合成のために鋳型として使い、
   そのプライマーの伸長産物を１本鎖の分子を作るために
   合成された鋳型から分離し、接合、伸長、分離のステッ
   プを少くとも１回繰り返すことによって特定の既知の配
   列を含む１本鎖分子を増幅し、特定の既知の配列の各々
   に対する少くとも２つのプライマーを含み、その１つは
   、その特定の既知配列に本質的に相補的であり、少くと
   も１つは、その特定の既知の配列に対して塩基のミスマ
   ッチをもっているような競合オリゴヌクレオチドプライ
   マーを上記の試料に加え、競合の条件下に、その特定の
   既知配列に本質的に相補的なプライマーを選択的にハイ
   ブリダイズし、ハイブリダイズされている、そのヌクレ
   オチド鎖に相補的な競合伸長産物を合成するために、そ
   の３′末端から、その選択的にハイブリダイズしたプラ
   イマーを伸長させ、そして、その競合伸長産物を同定す
   るステップを含む核酸の、ヌクレオチド鎖の混合物を含
   む試料中の、複数の特定の既知の核酸配列の有無を検出
   する競合オリゴヌクレオチドプライマー法。 １３、競合オリゴヌクレオチドプライマーが、おゝよそ
   、８〜２４の塩基の長さをもつ請求項１２の方法。 １４、少くとも１つの競合オリゴヌクレオチドプライマ
   ーが標識されていて、その競合伸長産物がその競合伸長
   産物中に、その標識の有無を調べることによって同定す
   る請求項１２の方法。 １５、標識がラジオアイソトープ、蛍光体、化学発光体
   、酵素、抗体から成る群から選ばれる請求項１４の方法
   。 １６、その同定ステップの前に共通オリゴヌクレオチド
   プライマーを加えて、その相補的なヌクレオチド鎖から
   、その競合伸長産物を分離し、その選択的にハイブリダ
   イズするステップと伸長ステップを繰り返すステップを
   、さらに含めた請求項１２の方法。 １７、その分離、選択的ハイブリダイズ、及び伸長ステ
   ップを、少くとも１回繰り返すステップをさらに含む請
   求項１６の方法。 １８、その共通オリゴヌクレオチドプライマーが固体の
   支持体に結合され、その増幅された競合伸長産物が、そ
   の固体支持体上で標識の有無を調べることによって同定
   する請求項１４の方法。 １９、少くとも２つのプライマーを含み、その１つは正
   常な遺伝子配列に本質的に相補的であり、少くとも１つ
   は変異した遺伝子配列に相補的である競合オリゴヌクレ
   オチドプライマーを核酸または核酸混合物の試料に添加
   し、競合的な条件で、その特定の既知配列を含む適当な
   ヌクレオチド鎖に本質的に相補的なプライマーを選択的
   にハイブリダイズし、その選択的にハイブリダイズした
   プライマーを ３′末端から伸長させ、プライマーがハイブリダイズし
   たヌクレオチド鎖に相補的な伸長産物を合成し、その伸
   長産物を同定するステップを含む特定の既知核酸配列に
   ある、少くとも１つの変異がもたらす遺伝病を検出する
   競合オリゴヌクレオチドプライマー法。 ２０、少くとも１つの競合オリゴヌクレオチドプライマ
   ーが標識され、その標識がラジオアイソトープ、蛍光体
   、化学発光体、酵素、抗体から成る群から選ばれる請求
   項１９の方法。 ２１、各競合オリゴヌクレオチドプライマーが別々の標
   識されている請求項２０の方法。 ２２、その競合オリゴヌクレオチドプライマーを加える
   前に、その試料を複数の部分に分割し、その各部分に異
   なる標識をつけた競合オリゴヌクレオチドプライマーを
   添加し、そして、その部分の各々にある伸長産物中の標
   識の有無を調べるというステップをさらに含ませた請求
   項２０の方法。