JPH10505230A

JPH10505230A - 修飾ヌクレオシドを用いての核酸の増幅方法及び抗体を用いての増幅生成物の検出

Info

Publication number: JPH10505230A
Application number: JP8505525A
Authority: JP
Inventors: ニヴエロー，アラン
Original assignee: パルトーロプデヴロツプマン
Priority date: 1994-07-21
Filing date: 1995-07-21
Publication date: 1998-05-26
Also published as: WO1996003526A1; AU3081495A; FR2722799B1; CA2195480A1; EP0770144A1; FR2722799A1

Abstract

(57)【要約】ヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドプライマー、増幅生成物の合成に必要な種々のプリン及びピリミジン塩基を含有するヌクレオシド三リン酸及び／又はデオキシヌクレオシド三リン酸、及びＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮＡポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素活性を有する酵素系と、それ自体既知の要領で当該ヌクレオチド配列の増幅を実施し得る条件下で接触させる、ヌクレオチト配列の増幅方法。ヌクレオシド三リン酸及び／又はデオキシヌクレオシド三リン酸の１種は修飾形で存在するかあるいは修飾形と非修飾形との両方で存在し、前記の修飾形ではピリミジン又はプリン塩基は少なくとも１個のメチル、ヒドロキシメチル又はアセチル基で置換されている。

Description

【発明の詳細な説明】修飾ヌクレオシドを用いての核酸の増幅方法及び抗体を用いての増幅生成物の検出本発明の要旨は、増幅過程中に新合成された核酸鎖中に組込まれる修飾プリン又はピリミジン塩基を有するヌクレオシド三リン酸を用いて核酸配列の増幅（am plifi-cation）方法に関する。修飾した塩基を特異的に認識する抗体を用いて、増幅生成物を検出する及び／又は定量化することが可能である。更には、増幅生成物は、修飾した塩基で増幅した配列の幾つかのコピーを含有し且つそれに加えて当該配列に特異的な少なくとも１個の配列を含有する多量体（マルチマー）の製造に用い得る。かゝる多量体はシグナル増幅によって何れかのポリヌクレオチド配列の検出及び／又は定量化に用い得る。酵素系の方式によって試験管内で増幅する方法は、ポリヌクレオチドを単離し且つクローン化する必要なしに、試料中に少量で存在するポリヌクレオチドの配列の多数のコピーを得ることを特に意図されることは知られている。先ず開示される酵素を基剤とする配列増幅方法はＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎮反応）の名称でより広く知られるポリメラーゼ連鎖増幅である。この方法では、２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、その各々は増幅すべき配列を含有するＤＮＡ鎖の１方のセグメントに対して相補的であり、こうして前記のセグメントは前記の配列を包含する。ＤＮＡを変性するために加熱した後には、オリゴヌクレオチドプライマーはそれらの相補的な配列とハイブリッド形成し、しかも熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及び過剰量のヌクレオシド三リン酸の存在下では鋳型鎖に相補的なＤＮＡ鎖が、ハイブリッド形成したプライマーの３′末端からの延長により合成される。次いで該混合物を再び熱で変性させ、冷却するとオリゴヌクレオチドプライマーは当初から存在するか又は新たに合成したＤＮＡ鎖とハイブリッド形成し、プライマーの新たな延長等が生起する。プライマーの対合と、延長と変性とのこれらの連続的な作業周期は、各々の作業周期で有用な配列の多数のコピーの倍加を生起する。ＲＴ−ＰＣＲと呼ばれる、ＰＣＲと同様な方法は、増幅すべき原料としてＲＮＡを用いることに在り、この場合には該方法は相補的ＤＮＡに対してＲＮＡの逆転写用の予備段階を包含してなる。この方法は標的がレトロウイルスのゲノムである時あるいはイントロンの増幅防止のためにメッセンジャーＲＮＡを標的として用いた時に有用である。種々の他の増幅方法が開示され、しかも特にＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター配列を含有するプライマーを用いることに在る方法が開示されこうしてＤＮＡの二本鎖を延伸によって得、その転写はＲＮＡポリメラーゼの存在下で、増幅サイクルに組入れ得る転写ＲＮＡの形で数十倍のコピーを製造するものである。増幅方法はＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二本鎖を形成するためＲＮＡを逆転写し、次いで形成したヘテロ二本鎖を変性し、プライマーをＤＮＡ鎖にハイブリッド形成し、プライマーを延長し、続いて得られた二本鎖を転写する等からなる。前もって形成したＲＮＡ鎖は各々、次いで転写し得るＤＮＡの二本鎖を生起し得る。前記増幅方法の欠点のうちの１つは二重らせんを変性する必要性である。一般に90℃以上の温度で行なうこの増幅方法は熱安定性酵素の使用を必要とする。変性段階を回避するために等温的に使用し得る増幅方法が想定される。等温法は標的ＲＮＡ配列とＤＮＡプライマーとを原料とすることに在る。逆転写酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二本鎖が得られる。リボヌクレアーゼの作用により、ＲＮＡは加水分解される。ＤＮＡポリメラーゼの存在下に適当なプライマーを延長することにより一本鎖ＤＮＡを二本鎖に転化する。得られた二本鎖ＤＮＡを次いで転写でき、標的ＲＮＡの幾つかのコピーが次いで増幅サイクルに組入れ得る。別の等温法は同じ標的の核酸鎖とハイブリッド形成し得る２個のプライマーを用いて鎖置換の現象を用いることに在り；第２のプライマーに関して５′部位に位置した第１のプライマーの延長生成物は、一本鎖の形でかくして放出される第２のプライマーの延長生成物を置換し、然るに第１のプライマーの延長生成物は原料の標的鎖と二重らせん(duplex)を形成する。かくして形成された一本鎖は２個のプライマーの同様な系を用いて次いで増幅サイクルに組入れ得る。更には、第１のプライマーは標的の認識部位に関して５′部位にＲＮＡポリメラーゼ用の認識部位又は制限酵素用の認識部位を含有でき、制限酵素は増幅サイクルには別の方式を使用し得る：欧州特許第 0543612号参照。当該分野の全ての専門家は、増幅技術が特に病気の診断に又は細菌又はウイルスの汚染に重大な役割を演ずるようになっていると評価している。それ故ゲル電気泳動技術及び膜転移（ブロッティング）技術を代替するために増幅生成物を定量的に評価し得る簡単で迅速な技術が必要とされる。現在最も鋭敏な技術は修飾した(modified)ヌクレオシド三リン酸、即ちビオチニル化したデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）又はジゴキシゲニンに連結したｄＵＴＰを用いることに在る。修飾したヌクレオシドを含有する増幅生成物は、第１の場合にはアビジン−酵素接合体によってしかも第２の場合には抗ジゴキシゲニンモノクローナル抗体によって検出又は定量化される。今般見出された所によれば、プリン又はピリミジン塩基をメチル、ヒドロキシメチル又はアセチル基による置換の如き単なる置換によって修飾したヌクレオシド三リン酸即ちＮＴＰ（ＮＴＰはこゝではデオキシリボヌクレオシド三リン酸とリボヌクレオシド三リン酸とを表わす）を用いることにより増幅方法を使用できる。修飾したＮＴＰｓは、効率の損失なしにヌクレオチド鋳型の新しいコピーを試験管内で合成するためにポリメラーゼによって使用され得ることが見出された。修飾した塩基でヌクレオシドを特異的に認識する抗体であって非修飾形で前記の塩基を含有するヌクレオシドを認識しない抗体を用いると、かくして修飾したヌクレオシドを組入れた当該増幅した配列を検出できる。更には驚くべきことには、これらの特別の修飾したヌクレオシドに対して指向した抗体を用いての検出技術は、以下の実験部分で見られる如く、アビジン−酵素接合体（ビオチニル化したプライマーを用いる場合）を用いるか又はジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン抗体系を用いる慣用の検出技術よりも明らかにより鋭敏である。それ故本発明の要旨はヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドプライマーと、増幅生成物の合成に必要な種々のプリン及びピリミジン塩基を含有するヌクレオシド三リン酸及び／又はデオキシヌクレオシド三リン酸と、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮＡポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素活性を有する酵素系とを、それ自体既知の要領で当該ヌクレオチド配列の増幅を実施させ得る条件下で接触させる、酵素方式によるヌクレオチド配列の増幅方法において、ヌクレオシド三リン酸及び／又はデオキシヌクレオシド三リン酸の１種は修飾形で存在するかあるいは修飾形と非修飾形との両方で存在し、前記の修飾形ではピリミジン又はプリン塩基は少なくとも１個のメチル、ヒドロキシメチル又はアセチル基で置換されていることを特徴とするヌクレオチド配列の増幅方法が提供される。本発明の要旨はまたヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドプライマーと、増幅生成物の合成に必要な種々のプリン及びピリミジン塩基を含有するヌクレオシド三リン酸及び／又はデオキシヌクレオシド三リン酸と、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮＡポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素活性を有する酵素系とを、それ自体既知の要領で当該ヌクレオチド配列の増幅を実施させ得る条件で接触させる、ヌクレオチド配列を増幅し且つ増幅生成物を検出及び／又は定量化する方法において、ヌクレオシド三リン酸及び／又はデオキシヌクレオシド三リン酸の１種は修飾形で存在するかあるいは修飾形と非修飾形との両方で存在し、前記の修飾形ではピリミジン又はプリン塩基は少なくとも１個のメチル、ヒドロキシメチル又はアセチル基で置換されており、増幅生成物はそれ自体既知の方法により、前記の修飾ヌクレオシドを特異的に認識するが前記の非修飾ヌクレオシドを認識しない抗体を用いて検出及び／又は定量化することを特徴とする、ヌクレオチド配列の増幅及び増幅生成物の検出及び／又は定量化方法が提供される。増幅は二本鎖ＤＮＡ、相補的なＤＮＡを合成するために又は転写したＲＮＡを合成するためにプライマーの延長に基いた何れか既知の方法によって実施できる。例えば前記した増幅方法を使用できしかも周知であるそれらの実施の詳細はこゝでは反復しない。修飾したヌクレオシドのうちでは、特に５−メチルシチジン、Ｎ⁴−アセチルシチジン、３−メチルシチジン、Ｎ⁶−メチルアデノシン、Ｎ⁶，Ｎ⁶−ジメチルアデノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ²−メチルグアノシン、Ｎ²，Ｎ²−ジメチルグアノシン、７−メチルグアノシン、３−メチルウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン及び１−メチルイノシンを挙げ得る。これらの修飾したヌクレオシドの三リン酸は既知であるか又は既知の方法により製造できる。これらの修飾したヌクレオシドを特異的に認識し得る抗体は既知の方法により製造できる。抗体はモノクローナル抗体であるのが好ましい。これらの抗体の若干は既に記載されている；C.ReynaudらのCancer Letters 25 5〜261(1991)参照。モノクローナル抗体の製造中に、修飾したヌクレオシドを特異的に認識する抗体を一般に得ることができることを見出した。例えば抗（アンチ）−５−メチルシチジン抗体の場合には試験したハイブリドーマクローンの約３％が、５−メチルシチジンを認識するがシチジンを認識しない特異抗体を分泌することが見出されたのがこの要領である。同様に、抗−７−メチルグアノシン抗体の場合には、試験したハイブリドーマクローンの４％が、修飾したヌクレオシドを認識するがグアノシンを認識しない抗体を分泌した。実施した研究の結果は、ヌクレオチドプライマーの延長に修飾した対応のヌクレオシドと同じ仕方でヌクレオシド三リン酸を用い得ることである。増幅すべき配列が、修飾したヌクレオシドリン酸の組込みにより置換するのが望ましい少量のヌクレオシドのみを含有する時は、修飾形でのみ考えられるヌクレオシド三リン酸を原則として用い得る。然しながら、考慮されるヌクレオシドが増幅すべき配列で幾つかの隣接位置で存在する時は、修飾したヌクレオシド三リン酸のみの組込みは困難となり得る。従って、考慮されるヌクレオシドについては、修飾したヌクレオシド形と修飾していないヌクレオシド形との混合物を用いるのが一般に好ましい。修飾したヌクレオシドと対応の非修飾ヌクレオシドとの全量に関して修飾したヌクレオシド三リン酸の割合は、一般に10〜100モル％で変化でき、特に20〜75モル％で変化できる。勿論、修飾したヌクレオシドと非修飾ヌクレオシドとの混合物を用いる時には、増幅生成物は修飾形及び非修飾形での種々の割合の対応のヌクレオシドを含有するものであり、この割合は、増幅すべき配列の組成の性状及び増幅中に存在する三リン酸（修飾した及び修飾していない）の割合に応じて決まるものである。増幅すべき所与の配列について及び修飾三リン酸及び非修飾三リン酸の所与の割合について、増幅生成物中の修飾ヌクレオシドと非修飾ヌクレオシドとのそれぞれの割合は本質的に一定であることが見出された。その結果として修飾したヌクレオシドに特異的な抗体を用いて増幅生成物を検出すると定量化をも可能とするものである。増幅生成物を検出するためには、前記した特異抗体を用いる。タン白質に複合した修飾ヌクレオシドを用いての免疫化により製造した抗体はＤＮＡ又はＲＮＡ鎖中に組入れた修飾ヌクレオシドを認識し得ることが見出された。抗体は、トレーサー例えばペルオキシダーゼ又はアルカリ性ホスファターゼの如き酵素で標識した抗体の形で使用でき、これによって既知の方法により着色した生成物の形成を肉眼で見得るようにさせる。増幅生成物上への特異抗体の結合を目視化することはまた既知の要領で標識した抗−免疫グロブリン抗体で実施できる。例えば、用いたモノクローナル抗体がマウスのＩｇＧであるならば、標識した抗−マウスＩｇＧ抗体を目視化に用いるものである。抗体を用いての目視化及び可能な定量化は周知の方法であり、それらを実施する詳細はこゝでは反復しないものである。更には、既知の要領でリガンド（例えばビオチン）に結合した増幅プライマーを用いることにより、対応の抗リガンド（例えばアビジン）を付着させた微量滴定板上で検出及び／又は定量化を行ない得る。それ故本発明の方法は、細菌又はウイルスの感染又は汚染の試験で、医薬診断の分野で又は食品部門で特に用い得る。増幅法の別の利点は、それが核酸プローブを用いてのハイブリッド形成方法に信号増幅剤として用いられ得る多量体（マルチマー）の製造に使用し得る生成物を生起することである。信号増幅の原理は知られている。標的ポリヌクレオチドのコピーの個数が少ない時は、標的のコピーの個数を増幅により増殖する代りに、多量のトレーサーを含有する検出プローブを用いることができ、従って信号増幅を用いることができる。検出すべき標的に特異的な検出プローブは、トレーサーを含有する幾つかの単位を結合させたポリマー上にグラフト接合させる。信号増幅に反応剤として使用され得るマルチマーの具体例は特に欧州特許出願公開第 0,317,077号、第0,450,594 号等に特に記載されている。信号増幅用反応剤として本発明の増幅法により得られた増幅生成物を用いるのが望ましい場合には、増幅生成物よりなる複数の単位と、当該ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し得る少なくとも１個のポリヌクレオチド単位とを含有してなるマルチマーを製造するのが適当である。この場合には、増幅生成物の配列は何れかの型式のものであることができ；単に標的のポリヌクレオチドとハイブリッド形成し得るものであってはならない。信号増幅用反応剤は例えば、修飾したヌクレオシドを組入れた複数のヌクレオチド配列を分枝上に担持するポリマーの形で製造できる。ポリマーはフォーク、コーム等の形で分枝を担持する既知の要領で製造できる；例えば前記の欧州特許出願参照。修飾したヌクレオシドを特異的に認識する抗体を用いての検出に、修飾したヌクレオシドの多数の分子をかくして含有する信号増幅用試薬は高密度の信号を生成するものである。それ故本発明の要旨は、前記した増幅方法により得られる増幅生成物の使用にまた関する。この使用は、それ自体既知の要領で前記の増幅生成物よりなる複数の単位と、当該ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し得る少なくとも１個のポリヌクレオチド単位とを含有するマルチマーの製造に在る。本発明の要旨はまた、それ自体既知の方法により前記した方法により得られた増幅生成物の検出及び／又は定量化に、あるいはそれ自体既知の方法により前記した如く得られたマルチマーの検出及び／又は定量化に抗体を使用することに関し、前記のマルチマーは当該ポリヌクレオチドとハイブリッド形成されるものである。この使用は、用いた抗体が修飾ヌクレオシドを認識し得るが対応の非修飾ヌクレオシドを認識しない抗体であることを特徴とする。次の実施例は本発明を例証する。実施例１エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）のゲノムの増幅ａ）プライマー２種のプライマーを合成するが、これらのプライマーは、種々のＥＢＶ菌株のうちから高度に保存した領域であるＥＢＶゲノムの Bam HIV領域から選択した 1 86個の塩基対のセグメントの両端に位置している。各々のプライマーはP.R.Lang erらのP.N.A.S．USA78巻，11号，6633〜6637頁(1981)により記載された方法による合成中に５′末端でビオチニル化した。プライマーの配列は次の通りである：プライマー１：５′TTT GTC CCC ACG CGC GCA TA３′ プライマー２：５′AGG TGG GGT AGC AAC GCG AA３′ ＥＢＶゲノムの Bam HIW領域に関してこれらのプライマーの位置はR.Griffais らの報文、Nuc1eic Acids Research，19巻，14号，3887〜3891頁(1991)に記載されている。ｂ）ＤＮＡ鋳型の製造１つの染色体中に完全な EBV DNAを有するバーキットリンパ腫細胞、ナマルワライン(Namalwa line)を用いる：マツオらのScience 226，1322〜1325(1984)及びGarganoらの Genes Chrom．Cancer，４，205〜210(1992)参照。実際上、２個のＥＢＶゲノムが染色体１の既知部位に組込まれる、Lawrenceらの Cell 52，51 〜61(1988)参照。細胞を既知の要領で水酸化ナトリウムで溶菌した。細胞溶菌液の連続希釈液を製造し且つＰＣＲ法による増幅用の鋳型として用いた。ｃ）増幅細胞溶菌液のアリコートフラクション（10マイクロリットル）を、50mM KCl， 10mM HCl(pH8.4)、1.5mM MgCl₂を含有する緩衝剤溶液の 100μｌ、ゼラチンの10 0μg/ml、ヌクレオシド三リン酸、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰの各々の 20 0μM、ｄＣＴＰの40μM、５−メチル−ｄＣＴＰ（以下では５−Med CTP）(Boeh −ringer Mannheim)、各々のプライマーの 0.5μM 及びＴａｑポリメラーゼの１単位に添加した。パーキン−エルマー(Perkin-Elmer)180サーモサイクロ装置を用いた。増幅サイクルは次の要領で計画した：（イ）99℃で10分、62℃で２分及び72℃で２分よりなる１サイクル（ロ）次いで95℃で30秒、62℃で１分及び72℃で２分よりなる35サイクル。本法の終了時に、試料を72℃で５分間維持した。ｄ）特徴付け(characterisation) 各々の増幅生成物のアリコート部分(10μｌ)をアガロースゲル電気泳動にかけた（３％のNuesieveアガロース及び１％のSeakemアガロース）。泳動後に、紫外線照射下での臭化エチジウム蛍光によってＤＮＡを目視化した。次いでＤＮＡをナイロン膜（Hybond N＋アメルシャムインターナショナル社）上に移動させた。増幅生成物の特異性を点検するために、ハイブリッド形成は、ジゴキシゲニンで標識されしかもプライマー１及び２により包含される配列内に位置したＤＮＡ鎖の配列とハイブリッド形成し得る検出プローブで行なった。この検出プローブは、次のプライマー：（イ）プライマー３：５′CCA GGA AGC GGG TCT ATG３′ （ロ）プライマー４：５′CCT TTG GTG AAG TCA CAA ACA３′ を用いてヌクレオシド三リン酸及びジゴキシゲニンで標識したｄＵＴＰ（ジゴキシゲニン11 ｄＵＴＰ−Boeh-ringer Mannheim 社）の存在下にＰＣＲにより得られた。かくして、106ヌクレオチドのアンプリファイアが得られ、その配列を前記増幅した 186ヌクレオチド配列に包含した。かくして得られたプローブは前記のｃ）で得られたＰＣＲ増幅生成物と特異的にハイブリッド形成することを点検した。ジゴキシゲニンで標識したハイブリッド形成済みプローブの目視化は、青色の沈澱物を与えるＮＢＴ／Ｘ−ホスフェートの存在下にアルカリ性ホスファターゼと接合したアンチ−ジゴキシゲニン抗体を用いて行なう（核酸検出キット、 Boehringer Mannheim社）。ｅ）５−メチルシチジンの免疫検出増幅したＤＮＡ中への５−メチルシチジンの組込みは次の要領で証明された。前述の如く電気泳動次いでナイロン膜上への転移後に、0.05ＭのＴＲＩＳ緩衝剤(pH7.4)で希釈したブロッキング剤(Boehringer Mannheim社) の 0.5％溶液中にナイロン膜を30分間浸漬した。ナイロン膜をＰＢＳＴ（0.2％のトゥイーン20を含有するリン酸塩緩衝剤）で３回洗浄し、次いでナイロン膜をアンチ−５−メチルシチジンモノクローナル抗体と共に室温で１時間反応保持させた。モノクローナル抗体は、C.ReynaudらのC ancer Letters，Elsevier SCintifiC Publishers Ireland社 255〜262頁(1991) によって記載された抗体てある。抗体溶液は10〜15μg/mlの抗体を含有する未希釈のハイブリドーマ培養上澄み液である。次いでナイロン膜をペルオキシダーゼ接合したアンチ−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ゴート抗体と共に室温で１時間反応保持し次いでアフィニティクロマトグラフィー(Biorad Laboratories社)により精製した。ナイロン膜を再びＰＢＳＴで３回洗浄し次いでリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）でゆすいだ。基質（0.02％の過酸化水素を含有するリン酸塩緩衝剤に入れたメタノール中の４−クロロ−１−ナフトールの 0.3％溶液の60ml）を次いで添加し、室温で30分間反応保持した。ｆ）マイクロプレートの製造カルボキシル化ポリスチレン微量滴定板を用いた；参考文献：NiveleauらのJ. Immunol，Methods， 159， 177〜189頁(1993)。リン酸塩緩衝剤(pH7.2)に希釈したＮ−（３−ジメチルアミプロピル）−Ｎ′ −エチルカルボジイミド塩酸塩(Merck社)の10μg/mlを含有する溶液 100μｌを各々の凹み（ウエル）に添加した。室温で10分後に、pH7.2のリン酸塩緩衝剤に入れたアビジン(Sigma社)の10μg/mlを含有する溶液 100μｌを各々のウエルに添加した。１時間後に、プレートを、0.05％のトゥイーン20を含有するリン酸緩衝液(pH7.2)で洗浄し、次いでリン酸塩緩衝液で３回洗浄した。熱変性した増幅生成物を１個のウエルにつき50μｌの量で添加した。室温で15 分後に、ウエルをＰＢＳＴで３回洗浄した。50μｌのアンチ−５−メチルシチジンモノクローナル抗体溶液（ハイブリドーマ培養上澄み液）を次いで添加した。室温で30分間反応保持した後に、ウエルを１％のウシの血清アルブミンを含有するＰＢＳＴ（ＰＢＳＴ−ＢＳＡ）で３回洗浄した。次いで50μｌのペルオキシダーゼ接合アンチ−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ゴート抗体(Biorad Laboratories社)を添加した。室温で30分後に、プレートをＰＢＳＴ−ＢＳＡで３回ゆすぎ、次いで10容量％の過酸化水素と混合したジメチルアミドに溶かした３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジンであるペルオキシダーゼ基質を添加した。この混合物の 100μｌを各々のウエルに添加し、反応生成物の強い青色が出現するまで室温で17〜20分間プレートを反応保持させた。反応は１個のウエルにつき 100μｌの１Ｎ硫酸の添加により停止させた。655nmでの光学濃度を分光測光法により測定した。結果ＰＣＲ増幅で鋳型として用いられる EBV DNAの10倍連続希釈液はＥＢＶゲノムの２〜20,000コピーを含有した。ｄＣＴＰと５− Med CTPとの混合物及びビオチニル化したプライマーを用いて前記ｃ）の如く行なったＰＣＲ増幅の結果と、未修飾ＮＴＰｓと非ビオチニル化プライマーとを用いて慣用の要領で行なったＰＣＲ増幅の結果とを対比した。増幅生成物はアガロースゲル電気泳動により分析し、紫外線照射下での臭化エチジウム蛍光により目視化した。電気泳動分析が示す処によれば両方の場合において増幅したＤＮＡｓは移動距離に基づいて予期した大きさを有する。ゲル上の蛍光の強度によって測定した反応の感度は、本発明によるＰＣＲと慣用のＰＣＲとの両方共ＤＮＡの 200標的分子以下である。更には比較として、慣用のＰＣＲによって得られた増幅生成物は、サザンハイブリッド形成及びアンチ−ジゴキシゲニン抗体(Boehringer Mannheim)での目視化により、ジゴキシゲニン−接合した特異プローブ（前記のｄ）で得られた）で分析した。反応の感度は20標的ＤＮＡ分子以下であった。本発明によるＰＣＲ増幅生成物は一方では電気泳動及びサザン転移（前記のｅ）参照）後に分析し、他方ではアビジン（前記のｆ）参照）で被覆した微量滴定板上で分析した。第１の場合（電気泳動及びサザン転移）には、増幅生成物を水酸化ナトリウムで変性させ、検出はアンチ−５−ＭｅＣモノクローナル抗体を用いて行ない、その結合はペルオキシダーゼで標識したアンチ−マウスＩｇＧ抗体を用いて前述の如く目視される。この場合に本法の感度限界閾は２個の標的ＤＮＡ分子である。アビジンで被覆した微量滴定板上に増幅生成物を付着させることにより分析を行ない、前記の如くアンチ−５ＭｅＣモノクローナル抗体を用いて検出する時は、今回検出限界閾は２個の標的ＤＮＡ分子以下である。信号の強度は増幅生成物の量と共に増大し、これによって定量化を可能とする。

Claims

【特許請求の範囲】１．ヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドプライマーと、増幅生成物の合成に必要な種々のプリン及びピリミジン塩基を含有するヌクレオシド三リン酸及び／又はデオキシヌクレオシド三リン酸と、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮＡポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素活性を有する酵素系とを、それ自体既知の要領で当該ヌクレオチド配列の増幅を実施させ得る条件下で接触させる、酵素方式によるヌクレオチド配列の増幅方法において、ヌクレオシド三リン酸及び／又はデオキシヌクレオシド三リン酸の１種は修飾形で存在するかあるいは修飾形と非修飾形との両方で存在し、前記の修飾形ではピリミジン又はプリン塩基は少なくとも１個のメチル、ヒドロキシメチル又はアセチル基で置換されていることを特徴とするヌクレオチド配列の増幅方法。２．ヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドプライマーと、増幅生成物の合成に必要な種々のプリン及びピリミジン塩基を含有するヌクレオシド三リン酸及び／又はデオキシヌクレオシド三リン酸と、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮＡポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素活性を有する酵素系とを、それ自体既知の要領で当該ヌクレオチド配列の増幅を実施させ得る条件下で接触させる、ヌクレオチド配列を増幅し且つ増幅生成物を検出及び／又は定量化する方法において、ヌクレオシド三リン酸及び／又はデオキシヌクレオシド三リン酸の１種は修飾形で存在するかあるいは修飾形と非修飾形との両方で存在し、前記の修飾形ではピリミジン又はプリン塩基は少なくとも１個のメチル、ヒドロキシメチル又はアセチル基で置換されており、増幅生成物はそれ自体既知の方法により、前記の修飾ヌクレオシドを特異的に認識するが前記の非修飾ヌクレオシドを認識しない抗体を用いて検出及び／又は定量化することを特徴とする、ヌクレオチド配列の増幅及び増幅生成物の検出及び／又は定量化方法。３．前記の修飾ヌクレオシドは５−メチルシチジン、Ｎ⁴−アセチルシチジン、３−メチルシチジン、Ｎ⁶−メチルアデノシン、Ｎ⁶，Ｎ⁶−ジメチルアデノシン、１−メチル−グアノシン、Ｎ²−メチルグアノシン、Ｎ²，Ｎ²−ジメチルグアノシン、７−メチルグアノシン、３−メチルウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン及び１−メチルイノシンから選択されることを特徴とする、請求の範囲１又は２記載の方法。４．修飾ヌクレオシドと対応の非修飾ヌクレオシドとの全量に関して修飾ヌクレオシド三リン酸の割合は10〜100モル％であることを特徴とする、請求の範囲１〜３の何れかに記載の方法。５．前記の割合は20〜75モル％であることを特徴とする、請求の範囲４記載の方法。６．それ自体既知の要領で、増幅生成物よりなる複数の単位と当該ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し得る少なくとも１個のポリヌクレオチド単位とを包含してなる多量体を製造するに際して、請求の範囲１及び３〜５の何れかに記載の方法により得られる増幅生成物の使用。７．それ自体既知の方法により請求の範囲１〜３の何れかの方法により得られた増幅生成物を検出及び／又は定量化するに際して、あるいはそれ自体既知の方法により請求の範囲６により得られる多量体を検出及び／又は定量化するに際して、該多量体が当該ポリヌクレオチドとハイブリッド形成されている、抗体の使用において、抗体は修飾ヌクレオシドを認識し得るが対応の非修飾ヌクレオシドを認識しない抗体であることを特徴とする、抗体の使用。