JPH0235366A - アルブミン乾式分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は水性流体中のアルブミン分析用のマルチゾーン
（ｍｕｌ　ｔｉｚｏｎｅ）乾式化学分析要素に関する。

更に詳しくは、本発明は、このような要素内において指
示薬が試薬ゾーンから反応ゾーン−・連続的に放出する
ことにより競合物質（もし存在するなら）からの妨害を
除去又は低減したアルブミンの乾式分析要素に関する。

〔従来の技術〕

尿、血清又は他の体液のような水性流体中の被検体の分
析測定において、このような被検体と反応し、検出可能
な応答、たとえば色又は螢光応答を生ずる指示薬が頻繁
に用いられる。次いで応答を適当な標準又は検量体と比
較し、流体中に存在する被検体の量を決定する。

多くの場合に妨害物質は被検体に同伴し、そして指示薬
と反応して、被検体と指示薬との反応により生ずるのと
同じ色吸収特性を有する偽応答を生成する。被検体−指
示薬及び妨害物−指示薬反応は加法的であり、ずれを含
んだ全体的応答を生ずるので、そこからは被検体−指示
薬反応に関与した成分を容易には分別することかできな
い。

指示薬を用いたアルブミン分析における妨害作用を減少
せしめる試みが多くの分析に適用され−でいる。以下に
アルブミン分析に関する先行技術及び背景を以下に述べ
る。

流体中のアルブミンの測定は、緩衝されたブロムクレゾ
ールグリーン（以後Ｂ　ＣＣと呼ぶ）溶液又は米国特許
第３．５３３，７．１９号及び同第３．．１８５，５８
７号に記載のような試験片を用いて広〈実施されている
。ＢＣＣは、蛋白質との染料結合反応により色変化を示
すスルボンフタレイン種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の色原体指
示薬である。このような偽応答は存在する蛋白質、たと
えばアルブミンに比例的に関連する。前述のごとく、こ
の指示薬は緩衝されており、こうすることにより、緩衝
されていない場合は指示薬か悪心するｐ＋＋変化に対す
る偽応答が確実に回避できる。

Ｂ　ＣＧのような指示薬はアルブミンに特異的でない。

たとえば人間の体液中に通常存在するグロブリン、トラ
ンスフェリン及び他の蛋白質は染料結合を指示薬と競い
、アルブミン分析を妨害する。

この妨害は、低濃度レヘルのアルブミンに関して特に顕
著である。たとえばアルブミン及びグじＪプリンを含む
人間の血清の正常な全蛋白質含量は約６〜８ｇ／ｄｆｆ
ｉの範囲である。ごの数値に関して約２．９ｇ／ｄｊ２
がグロブリンであり、残りが主Ｇこアルブミンである。

正常な血清（即ち健康人からの）においてはアルブミン
とグロブリンの比は約１．６：１であり、一方病気の状
態ではこの比は約０．７：１に低下する。それ故、有用
な臨床分析においてしま、グロブリンとの結合を回避し
なければならず、そしてアルブミンとの選択的な結合を
生じさせなければならない。

幾人かの創始者は、Ｂ　ＣＧに基つくアルブミン測定に
おける非特異性の問題に対する解決を提案した。グスタ
フソン（Ｇｕｓｔ訂５ｓｏｎ）は、血清アルブミンとＢ
　ＣＣとの反応は、ＢＣＧと他の蛋白質との反応より速
いと報告した（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ　　、１．Ｅ、Ｃ
。

Ｃ１ｉｌ、　Ｃｈｅｍ、　、第２２巻、第６１６頁、１
９７６年）。従って、グスタフソンは、溶液の吸光度を
、血清とＢＣＧとを混合した後２回、即ち混合直後及び
ｆｉ　０分後の２回測定することを提唱した。零分と推
定する直後の読みを次いで用い、アルブミンの濃度を測
定する。（６０分の読メは、アルブミンに加えて血清蛋
白質成分の測定に用いられる。）この方法の成功は、意
味のある読みか得られる前に１分以上の固有の遅延時間
を有する自動化系にとっては、非実際的な要求である“
直後″゛の吸光度を読むことができるか否かに暴づく。

更にグスタフソンの零分操作は、たとえば血清１０μｌ
をＢ　ＣＧ試薬２．０　ｍｌ　（２０００μＺ　）と反
応させる（２００倍希釈）溶液分析へ通用することがで
きる。しかしながら、乾式化学分析要素の出現により、
試料の希釈及び空間を占める液状試薬の使用は最早必要
ではない。使用の際、このような要素は未希釈体液と接
触し偽応答を生成する。本発明者等はこのことに関して
、未希釈試料では全蛋白質−ＢＣＧ色応答（即ちアルブ
ミン及びグロブリン両方からの応答）は溶液分析におけ
るよりも明きらかに強いことを決定した。従ってグスタ
フソンの操作を用いた乾式要素におけるアルブミンの零
分測定は非実際的であるばかりでなく、溶液分析の場合
よりもアルブミンに対する特異性は低い。

ウェブスター（ＣＩ　ｉｎ、　Ｃｈｅｍ、　、第２３巻
、第６６３頁、１９７７年）は、ＢＣＧに基づくアルブ
ミンの？容液分析測定の非特異性を確認し、そして３０
秒以内の読みは、得られた結果から３゜Ｏｇ／ｅを差し
引く場合にアルブミンに対して特異的であると結論した
。グスクフソンの操作と同様に、ウェブスターの方法は
、初期の読み時間及び希釈溶液分析（試料流体の２００
倍希釈）に基づく。更に矯正因子として不定の定数を用
いることは、アルブミンの結果が最初から誇張されてお
り、そしてそれ故非特異的分析を意味するように思われ
る。更に重大なことはウェブスターの方法シＪ、不定因
子３．０ｇ／ｊ２からの実際の変化を説明していない。

Ｂ　ＣＧに裁づくアルブミン分析の非特異性に関する問
題は更に詳しくイングラエルセン（Ｉｎｇ−ｗｅｒｓｅ
ｎ）及びラホー（ｌｌａａｂｏ）により開示された（Ｃ
Ｉｉｎ、　Ｃｈｉｍ、　０ｃｔａ　、第８８巻、第５４
５頁、１９７８年）。彼らは、クスタフソン及びウェブ
スターにより研究されたよ・うな希釈系に」・９いて、
試薬溶液中の１３　ＣＧの濃度を低くすることにより、
試薬添加後１分までに読みが得られるような程度にまで
グロブリンの結合が抑えられると決定した。この読みは
ほとんど完全にアルブミン〜ＢＣＧ複合体によると報告
された。

イングラエルセン等による方法は溶液分析開始後１分ま
でに読みを得ることを可能にしている。

しかしながら、本発明者等は、ＢＣＧ指示薬を慣用の乾
式分析要素にイングラエルセンにより提案された量で用
いる時、グロブリンのような競合蛋白質からのひどい妨
害にぶつかると決定した。更に妨害か即座に、即ち１分
以内に見られるので、このことは希釈溶液系と未希釈血
清を用いた乾式化学系との相違を強調している。

前述のグロブリンによる妨害を低減させる為りこ、乾式
分析要素中のＢＣＧ指示薬の量を更に低くしようと考え
るならば、そのことば一般に感度のロス及び予期される
レベルのアルブミン、特に高（たとえば５　ｇ／ｄＩ！
、又はそれ以」二）アルブミンレベルに対する直線的な
応答を損うことなく達成することは不可能であろう。

蛋白質測定用の分析要素の使用はよく知られている。米
国特許第３，４８５，５８７号には、ＢＣＧのような緩
衝された指示薬を含浸した吸収性紙を含む単一ゾーン要
素が提唱されている。使用の際要素は体液試料で飽和さ
れ、すべての指示薬と流体との接触が即座に生じ色が発
現し始める。このような要素は全蛋白質量の測定又はそ
の存在の検出に有用である。しかしながらグロブリンが
指示薬との反応を競うので、それらによってはグロブリ
ンの存在下においてアルブミンを正確に選択的に測定す
ることはできない。

被検体（アルブミンを含む）測定用のマルチゾーン要素
は米国特許第３，９９２，１５８号及び同第４．０４２
，３３５号に開示されている。前記米国特許第３．９９
２．１５８号では、第２図に、支持体上をおおう試薬層
Ｊ−に多孔性拡散層を示している。セラヂン、アガロー
ス、及び水溶性ビニルポリマーのような多数のマＩ−リ
ックス材料が試薬層に有用なものとして開示されている
。使用の際、この特許に従った要素の拡散層は、拡散層
全体にそして試薬層中に分布される水性試料と接触する
。試薬層においては、ある材料が試料中の被検体に反応
し、検出可能な変化を生ずる。この特許には、更に、試
験試薬又は他の反応性物質の適当な選択により、要素を
アルブミンのような被検体の分析に容易に適合できると
開示されている。全蛋白質測定用のマルチゾーン要素は
米国特許第４，１３２，５２８号に開示されている。ご
のような要素は、被検体含有流体を分布する為の拡散ゾ
ーンと、試薬、アルカリ性提供組成物及びアルカリ性保
護ポリマーから成る試薬ゾーンとから構成されている。

アルカリ性保護ポリマーには、ポリ−（ビニルピロリド
ン）、ポリ　（アクリルアミド）、アガロース及びビニ
ルピロリドンとアクリルアミドとのコポリマーがある。

全蛋白質を定量的に測定する為に用いる試薬は、無差別
的にアルブミン及び他の蛋白質と反応する改質されたビ
ュレッ１へ組成物である。

−態様において、蛋白質妨害物の存在下においてアルブ
ミンを選択的に測定する本発明とは異なり、前記米国特
許第４，１３２，５２８号に開示の発明は、用いる試薬
の故に、全蛋白質の測定のみができる。

〔発明の目的〕

本発明は、被検体（アルブミン）と被検体測定のおそら
くは妨害物質とを含む水性流体中の被検体の選択的測定
を可能にする、指示薬を含むマルチヅーン乾式分析要素
を提供することを目的とする。指示薬は要素の試薬ゾー
ンから、水性流体試料を含む反応ゾーンへ連続的に放出
され、指示薬（］０） が反応ゾーンへ連続的に放出される速度により、指示薬
と被検体との選択的反応並びに指示薬と妨害物質との低
減された（しばしば除かれた）反応に関与した検出可能
な応答が特徴的に生ずるようにしたアルブミン乾式分析
要素を提供することを目的とする。

〔目的を達成するための手段〕

本発明に従った、アルブミンと、おそら（はアルブミン
の分析の妨害物質とを含む水性流体を分析する乾式分析
要素は、 Ａ、前記水性流体を受容する乾式反応ゾーン、並びに Ｂ、アルブミン及び前記妨害物質に不浸透性であり、前
記要素が前記水性流体と接触した場合に前記反応ゾーン
と流体接触する乾式試薬ゾーンを含む乾式分析要素にお
いて、前記乾式試薬ゾーンが前記アルブミン及び前記妨
害物質と反応して検出可能な応答を生成しうる発色性ア
ルブミン指示薬を含み、そして １）前記指示薬と前記アルブミンとの反応及び２）前記
指示薬と前記妨害物質との低減された反応 に対応して、検出可能な被検体応答を生ずるのに十分な
速度で、前記発色性アルブミン指示薬を試薬ゾーンから
反応ゾーンへ連続的に放出する為の、アクリルアミド及
び／又はヒニルピロリドン反覆単位を含むポリマーの放
出手段を含んで成るアルブミン乾式分析要素が提供され
る。

以下に記載の本発明は、構成の一部分において、反応ゾ
ーンが試薬ゾーンをおお・うか又はそれに隣接してなる
要素に属する。同様の構成が米国特許筒３，９９２．１
５８号及び同第４．０４２．３３５号に開示されている
。しかしながら、これら特許の開示とは対照的に、本発
明要素の試薬ゾーンはアルブミンに対し不浸透性である
。それ故被検体は反応ゾーンに保持され、一方試薬は、
試料中の流体の影響下において反応ゾーン中に泳動し検
出可能な変化を生成する。

指示薬は、好ましくは、偽応答を生ずるもの（即ち色原
体指示薬）か、又は螢光応答を生ずるもので、特に好ま
しくは、色原体指示薬である。

この明細書において使用する前記分析要素中の反応ゾー
ン及び試薬ゾーン間の゛′流体接触°”なる用語は、こ
のような要素中の反応ゾーン及び試薬ゾーンの重なった
帯域又は隣接帯域間を流体が通りうる能力をいう。流体
接触する、これら二つの流体接触ゾーンは接触している
のが好ましいが、これらの流体接触ゾーンは、場合によ
っては、介在ゾーンによって分離することもできる。し
かしながら要素中に含まれる介在ゾーン及び他の任意的
なゾーンは、反応ゾーン及び試薬ゾーン間の流体の通過
を妨げないように、それ自体互に流体接触し、そして反
応ゾーン及び試薬ゾーンと流体接触する。

アルブミン選択的要素において、試薬はＢＣＧのような
色原体指示薬を含み、そして要素は、たとえば試薬ゾー
ン中に緩衝剤をも含む。本発明に従って、色原体指示薬
が放出される速度は、色原体指示薬とアルブミンとの反
応及び色原体指示薬と蛍白質妨害物質との低減された反
応に対応するアルブミン色応答を生ずるのに十分な速度
である。

色原体指示薬の放出速度は、色原体指示薬と実質的にア
ルブミンのみとの反応に対応するアルブミン応答を生ず
るのに十分なものであるのが非常に好ましい。即ち、こ
の場合、色原体指示薬と蛋白質妨害物質との反応は実質
的に生じない。先行技術とは異なり、特に未希釈体液の
アルブミン分析に関して、本発明要素は比較的長時間、
たとえば３分か又はそれより少し長い時間、アルブミン
選択性を示す。

試薬を連続的に放出させる好ましい手段は、試薬ゾーン
のバインダとして働くポリマーである。

このポリマーは、前記速度で指示薬を試薬ゾーンから反
応ゾーンへ連続的に放出させることにより、流体の要素
への適用に応答する。

本発明は、マルチゾーン乾式分析要素の使用により、血
清、尿及びその他の流体のような水性流体中の被検体の
選択的測定を容易にする。妨害物質（もし存在するなら
）によりずれを生ずる測定が有効に最小化又は除去され
る。この目的の為に本発明者等は、指示薬、特に色原体
指示薬のある規定速度における要素の一つのゾーンから
被検体とおそらくは妨害物質とを含むもう一つのゾーン
への連続的な放出により適度な時間内に改良された被検
体選択性が与えられると決定した。

指示薬の反応ゾーンへの連続的な放出の概念は、種々の
被検体の選択的測定に適用することができる。従ってマ
グネシウムは、妨害物質としてのカルシウムの存在のも
とに、指示薬染料（１−（１ヒドロキシ−２−ナフチル
アゾ）−２−ヒドロキシ−５−二トロー４−ナフタレン
スルホン酸ナトリウム塩］により選択的に測定すること
ができる。この染料はチハーガイギー社から商品名エリ
クロム０ブラツクＴ　（ＥＢＴ）で市販されている。別
法としてはマグネシウムはチタンイエロー染料を用いて
測定することができる。本発明は、アルブミン分析に対
する蛋白質妨害物質のありうる存在のもとにアルブミン
を選択的に測定する為にも使用することができる。アル
ブミン分析では、色原体指示薬を含む試薬組成物が用い
られる。試薬は、以下に記載のごとく緩衝する。本発明
は種々の被検体及び蛋白質妨害物質の分析を意図するも
のであるが、本発明を、単に例示の目的で、アルブミン
分析について以下に更に詳しく述べる。その他の被検体
用の対応する要素はアルブミン分析の場合と同し様式で
働く。

本発明に係る要素はマルチゾーンから成る。反応ゾーン
及び試薬ゾーン並びに他の任意的なゾーンは互に相異す
る。このようなゾーンは、試料を要素の側面から適用す
るか、又は上面から適用するかによって、たとえば水平
配置層であるか又は垂直配置バンドである。これらのゾ
ーンは、場合によっては、連続反応ゾーン内の不連続試
薬ゾーンとすることができる。これらのゾーンは層形状
であるのが好ましい。

前記要素の反応ゾーンはいくつかの機能を果たす。先ず
、反応ゾーンは、たとえば分析すべきアルブミンと蛋白
質妨害物質とを含む流体試料を受容し、そしてそれを含
む。試薬ゾーンはアルブミン及び蛋白質妨害物質に不浸
透性であるので、前記アルブミン及び蛋白質妨害？ｌ質
は反応ゾーン中に有効に保持される。しかしながら、試
料中の液状成分の一部は反応ゾーンから試薬ゾーンへ移
行し、色原体指示薬を試薬ゾーン中へ連続的に放出する
。色原体指示薬とアルブミンとの反応が起こり、アルブ
ミン色応答を生成する。

反応ゾーンは場合によっては、流体試料が適用されるか
又は接触し、そして試料がその中に均一に拡散する拡散
ゾーンとして働くことができる。

別法としては、反応ゾーンと流体接触する独立した拡散
ゾーンを用いて流体試料を受容し、そしてそれを反応ゾ
ーンへ均一に分布する方法があげられる。

適当な反応ゾーンには米国特許第３，９９２．１５８号
に記載のような等方的に多孔性の層が含まれる。

このような層は種々の方法により製造することができる
。ある態様では粒状材料を用いて、粒子間の相互結合空
間により等方的な多孔性が形成される層を製造する。別
法としてはこのような層は、等方的多孔性ポリマー、た
とえば米国特許第３．９９２，１５８号に開示の“ブラ
ックｚ　（ｂｌｕｓｈ）”ポリマーを用いて製造するこ
とができる。しかしながら本発明に関しては、ＴｉＯ２
のような顔料を反応ゾーンに用いることは、このような
顔料が反応ゾーン中に生じる検出可能な応答をマスクす
る場合には避けるべきである。

好ましい反応ゾーンは、天然又は合成ポリマーに由来す
るコロイド性材料を含む等方的多孔性層を含んで成る。

アビセル０という商品名でＦＭＣ社から市販されている
微結晶性セルロースは、本発明に用いるのに好ましいコ
ロイド性材料の一例である。他の材料の例としては、シ
リカ及びケイソウ土がある。

特開昭５５−９０８５９号公報に記載されているような
ビーズ層を含む反応ゾーンも、本発明のマルチゾーンの
要素として用いるのに有益である。このようなビーズ層
は、非常に接近している隣接粒子間に特別に局在する少
量の接着剤によって一緒に保持される粒子を含む。

本発明の試薬ゾーンは、使用前は、実質的に乾燥してい
る。即ち、試薬ゾーンには流体は含まれず、このことに
より、比較的小さな空間内への要素の長期間の貯蔵が容
易になる。試薬層も被検体及び妨害物質に対しては不浸
透性であるが、反応ゾーンへ適用した流体試料中の残留
液に対しては浸透性である。従って、流体試料を適用す
る時、つのゾーン間の流体接触が確立され、そして指示
薬は反応ゾーンへ連続的に放出されて被検体と結合する
。

試薬ゾーンは種々の手段により被検体及び妨害物質に対
して不浸透性にすることができる。たとえば、直径がア
ルブミン及び蛋白質妨害物質分子の直径より小さい細孔
を有する試薬ゾーンは、これら分子の試薬ゾーン中への
通過を妨げる。一方分子直径が非常に小さいカルシウム
の存在下において同様に分子直径が非常に小さいマグネ
シウムを測定する場合、高分子量のキレ−１・化剤又は
バラスト化剤を用いるのが望ましい。このような薬品は
マグネシウム及びカルシウムと反応して試薬ゾーン中の
細孔より大きな直径の分子を生成し、試薬ゾーンを被検
体及び妨害物質に対し効果的に不浸透性にする。マグネ
シウム及びカルシウムの有用なキレート化剤には、ポリ
マー主鎖へ付いたキレート化基を有する付加ポリマーが
ある。

本発明に係る試薬ゾーンには、被検体及び妨害物質と反
応して検出可能な応答を生ずる指示薬を含む試薬組成物
が含まれる。このようなゾーンには指示薬が分布するマ
トリックスが含まれる。マトリックス材料の選択は、試
薬を連続的に反応ゾーン中へ放出する手段としてマトリ
ックスを選ぶ場合以外は広い範囲にわたるものとするこ
とができる。しかしながら、そのよ・うに選択しない場
合には、マトリックスには一般に天然及び合成物質の両
方を含む非蛋白質含有親水性材料が含まれる。

このような材料の例としては、アガロースのような多糖
類、ポリ（ビニルアルコール）のようなポリビニル化合
物、及び親水性セルロース誘導体がある。

指示薬、好ましくは色原体指示薬は試薬ゾーンに用いて
水性流体中の被検体を測定する。アルブミンの適当な色
原体指示薬には、溶液又は吸収性の強いキャリヤ中で用
いてｐＨを比色測定により測定することも知られている
ものが含まれる。このような色原体指示薬は、試料溶液
のｐＨに相当する色応答を生ぜしめることができる。し
かしながら、色原体指示薬を緩衝することによってｐＨ
変化による色応答を回避することができる。緩衝剤は反
応ゾーン、試薬ゾーン、これら両ゾーン、又はある別の
ゾーンのいずれかに含まれる。好ましくは緩衝剤は試薬
ゾーンの一部として含まれる。緩衝剤を用いることによ
って、分析下の試料のｐＨは一定に保持されるか又は、
少なくとも色原体指示薬がｐＨ変化に対し通常応答する
範囲外のｐＨに保持される。広い範囲にわたる本発明の
実施において緩衝剤の使用は任意的である。アルブミン
分析の際色原体指示薬を緩衝することは好ましい。

本発明要素の試薬ゾーンに好都合に用いられる色原体指
示薬は、１．Ｍ、ＫｏｌｔｈｏｆｆによるＡｃ１ｄ−Ｂ
ａｓｅＩｎｄｉｃａｔｏｒｓ　、　ＭａｃＭｉ　１ｅａ
ｎ社出版、ニューヨーク、１９３７年の特に第３５０〜
３５３頁に開示されているような蛋白質誤差（ｐｒｏｔ
ｅｉｎｅｒｒｏｒ）を示すものである。

このような指示薬の例としては、ブロムクレゾールグリ
ーン、メチルレッド、ブロムフェノールブルー、ブロム
クレゾールパープル、ブロムチモールブルー、フェノー
ルレッド、クレゾールレッド、チモールブルー、クレゾ
ールフタレイン、及ヒ米国特許第３．４３８．７３７号
、欄３及び４に記載の指示薬がある。インジゴカルミン
のようなインジゴ染料も本発明の実施に有用に用いられ
る。これら指示薬のうち、ブロムクレゾールグリーン及
びブロムクレゾールパープルのようなスルホンフタレイ
ン指示薬はアルブミン分析に好ましい。アルブミン以外
の被検体の分析、たとえばマグネシウムの分析では、エ
リクロムブラックＴＯ又はトライトンイエローのような
指示薬が使用に適する。

試薬ゾーンに用いる指示薬の量は、試験すべき水性流体
試料中の被検体の予期される最大量と反応するのに十分
な量である。試薬ゾーンは、１゜ｇ／ｄｌｌ又はそれよ
り少し高濃度のアルブミンと反応して直線的偽応答を生
ずるのに十分な色原体指示薬を含むことが好ましい。こ
の明細書で用いる゛直線的色応答′”なる用語は、試料
適用後所定の時間の間、時間とともに直線的に増大する
色応答を意味する。このような期間はたとえば試料適用
後約１分〜約３分である。またＢＣＧ指示薬は好ましく
は０．２　ｇ／ｒｒｆ　〜３．　Ｏｇ　／＋ｄ、より好
ましくは０．５　ｇ／ｎｆ〜１．５　ｇ／＋ｄノ濃度範
囲で試薬ゾーンに用いる。これら濃度範囲は、アルブミ
ン５ｇ／ｄｆｆｉを含む流体試料１０μノを用いた場合
に、直線的な応答を適度に生成することが決定された範
囲である。これに関しては約１．０ｇ／ｎ（の濃度が非
常によく用いられ、そしてそれは、このような流体Ｉｆ
ｆあたり約１５ミリモルのＢＣＧ濃度に相当する。従っ
て種々の試料体積に対して、試薬ゾーンにおける適用量
を１．０ｇ／ｎｆより高くか又は低く調節して１ｆ！、
あたり１５ミリモルの好ましい量を保持することが望ま
しい。

種々の緩衝剤は、アルブミン分析を実質的に一定ｐＨに
保持することにより色応答におけるｐＨ効果を回避する
のに有用である。緩衝剤の量及び型は、試験される流体
の性質及び用いる色原体指示薬の型に依存する。非アル
カリ性ｐｌ＋に緩衝することも好ましい。従ってｐｕ感
受性範囲がわかっている所定の色原体指示薬に対して、
指示薬のｐＨ感受性範囲より低い実質的に一定のｐＨを
分析にもたらす緩衝組成物を選ぶことが好ましい。この
場合このような緩衝組成物は酸又は酸と共にそれらの塩
を含む。単独もしくはそれ自身の塩又は例示した他の酸
と共に用いる適当な酸には、りんご酸、乳酸、コハク酸
、マロン酸、クエン酸及び酒石酸のような低分子量のカ
ルボン酸がある。他の酸緩衝剤は米国特許第３，４３８
．７３７号に開示されている。りんご酸は好ましい緩衝
剤である。

ＢＣＧはアルブミン分析にとって好ましい色原体指示薬
である。ＢＣＧを用いることによる未希釈血清中のアル
ブミン測定に関して、緩衝剤の量は、血清試料のｐｌ＋
を好ましくは２．０〜４．０の範囲内に、より好ましく
は３．２に保持する量である。

血清試料の体積が１０μｌの場合、約１０．８　ｇ　／
ｎ−ｒのりんご酸緩衝剤が３．２のｐＨを与えることが
決定された。

試薬組成物は場合によっては、被検体と反応する指示薬
の能力に悪影響を及ぼさない成分をも含む。このような
成分は非イオン性界面活性剤である。代表的な界面活性
剤には、たとえばロームアンドハース社により、トライ
トンＸ−１０（ｌ及びトライトンＸ−４０５０のように
トライトン０シリーズの商品名で市販されているアルキ
ルフェノキシポリエトキシエタノール；アＩ・ラスケミ
カルインダストリーズによって販売されているＢｒ１ｊ
９３０のようなポリオキシエチレンオレイルエーテル；
アトラスケミカルインダストリーズによって販売されて
いるトウィーン２００のようなポリオキシエヂレンソル
ビクンモノラウレート；及びオリーンマチェソン社によ
り商品名サーファクタント１０ＧＯで販売されている（
ｐ−ノニルフェノキシ）グリセリンがある。

本発明の要素は指示薬を試薬ゾーンから反応ゾーンへ連
続的に放出する手段（以下放出手段と称す）を更に含む
。このような連続的放出は要素と流体試料との接触に応
じて生じる。試薬放出速度は、指示薬と被検体との反応
及び指示薬と妨害物質との低減された反応に対応する検
出可能な応答が反応ゾーン中に生ずるように選ぶ。

放出手段の例にはいくつかの代りの態様が含まれる。好
ましい様式では放出手段は、同時に指示薬に対し親和力
を持つ試薬層のポリマーバインダであり、この親和力は
、流体試料の適用に応答して徐々に破壊され、連続的な
放出をもたらす。このような特性を示すポリマーには水
溶性付加ポリマーとしてはアクリルアミド及び／又はビ
ニルピロリドン反復単位から成るポリマー、特にビニル
ピロリドン２０〜８０重量％及びこれに対応してアクリ
ルアミド８０〜２０重量％とを含むポリ（ビニルピロリ
ドンーコーアクリルアミド）がある。特に好ましいもの
は、等重量のアクリルアミドとビニルピロリドンとから
成る千ツマーブレンドがら製造したアクリルアミドとビ
ニルピロリドンとのコポリマーである。

有用な連続放出はヒドロキシュチルセルロースのような
セルロース系のポリマーによっても達成された。

放出手段として用いる為の潜在的なポリマーを選別する
操作により必然的に、支持体によって支持される試薬層
上をおおう反応層を有する多層分析要素の製造が課せら
れる。試薬層には、ポリマー中に分散した指示薬に関し
て潜在的に有用なポリマーが含まれる。要素の反応層は
次いで既知量のアルブミンを含む水性対照流体と接触す
る。別法としては、対照流体を、ＮａＣ！０．９％（重
量）、ＣａＣｌ！、２０．０３３％及びＭＣＩ　０．３
％で残りが水から成る溶液試料（この溶液はｔ通リンゲ
ル液と呼ばれる）とすることができる。反射濃度（ＤＲ
）として測定する反応層中に発現する偽応答を次いでＤ
Ｒが最大に達するまで時間に対してモニターする。ＤＲ
が即座に、即ち３０秒以内に最大値に達する場合、選別
中のポリマーば放出手段として有用であるとは考えられ
ない。しかしながらＤＲが最大に達するのに３０秒以上
、好ましくは１〜１０分かかる場合、そのポリマーは有
用である。

本発明に従って測定を実施する際、たとえばアガロース
のようなポリマーはこのような連続的放出を果たしえな
いことが証明されている。即ちその分散試薬はすべて対
照流体適用の際実質的に瞬間的（即ち３０秒以内）に放
出する。

この明細書で用いる連続放出の原理は、試薬の分析要素
の反応ゾーンへの緩徐な添加を意味する。

それは、流体試料を適用した後すべての利用しうる試薬
が直ちに試料流体へ放出されるまでの期間を意図する試
薬の遅延放出とは区別すべきである。

貯蔵器全体を即座に供給するのに対して、物質の一部が
制御量及び制御速度においてこのような物質の大貯蔵器
（即ち試薬ゾーン）から供給されるという意味において
、連続放出は実質的に゛計量供給（ｍｅｔｅｒｉｎｇ）
”と同義である。更に本発明に従った測定実施の際、あ
るポリマーは、試薬ゾーンのマトリックスとして用いる
場合、連続放出を示すばかりでなく、試料流体適用後す
ぐにいわゆる遅延相を示すことが見い出された。即ち試
薬の連続放出が遅延したか又は少なくとも放出速度が試
料適用後最初の３０〜４５秒間かなり低下した。゛連続
放出パなる語は、遅延相とその後の指示薬の連続放出と
の組み合せを含んだ意味を持つ。

好ましい態様において試薬ゾーンのあるポリマーマトリ
ックスから成る放出手段については既に述べた。同じ目
的を達する為の他の態様にはたとえば、アルブミン及び
蛋白質妨害物質に不浸透性であって、反応ゾーンと試薬
ゾーンとの間に介在し両者の流体接触を保持する連続放
出ゾーンがある。このような連続放出ゾーンを含む要素
を流体試料と接触させる時、放出ゾーンは試薬ゾーンと
協働して指示薬を連続的に反応ゾーンへ放出する。

連続放出ゾーンはたとえば、試薬ゾーンに用いる為の前
記連続放出ポリマーから成るマトリックスを含む。従っ
てこのようなポリマーにはビニルピロリドン及び／又は
アクリルアミド反復単位を含むポリマーのようなビニル
ポリマーがある。連続放出ゾーンに潜在的に用いる為の
ポリマーの選別には必然的に、試薬ゾーンマトリックス
に有用な連続放出ポリマーを選別するのに用いるのと実
質的に同じ操作を用いることが必要である。しかしなが
ら、この場合、本発明要素には、反応ゾーンと試薬ゾー
ンとの間にはさまれた連続的放出ゾーンが含まれる。

放出手段には、指示薬と被検体との反応及び指示薬と妨
害物質との低減された反応に対応する検出可能な被検体
応答を生ずる放出速度を示すことも特徴とする。本発明
の分析要素におけるこのような検出可能な被検体応答は
、実質的に放出手段を含まない他の点では同一の要素（
以下対照要素と呼ぶ）と比較することにより容易に実証
される。

この比較においては、対照要素二つと本発明要素二つと
を用いる。第一の対照要素を、被検体を含む未希釈血清
のような流体試料と接触せしめて、第一の検出可能な応
答を生ぜしめ、これを時間に対して記録する。第二の対
照要素を、任意ではあるが通常５重量％の妨害物質（ア
ルブミン分析においてはγ−グロブリン）が添加されて
いる同じ流体試料と接触させて第二の検出可能な応答を
生ぜしめ、これも時間に対して記録する。任意の選定時
間におけるこれら二つの応答間の相違は、添加妨害物質
の存在に起因する。前述のごとく、本発明によってこの
相違は低減、そして多くの場合に除去される。従って、
二つの本発明要素をそれぞれ被検体流体試料及び妨害物
質添加被検体流体試料と接触させ時間に対する二つの応
答曲線を作製する。本発明に従って、本発明要素の応答
曲線間の相違は、対照要素と比べて流体試料適用後長時
間の間本来的に少ないことが判明した。成分及び被覆レ
ベルの適当な選択により、本発明要素を用いた場合の応
答間の相違は、好ましくは１分間、非常に好ましくは３
分までの時間実質的に除くことができる。これらの時間
の後は、相違は有利に低減はされるが除去されない。最
終的には、本発明要素の応答差が対照要素の差と実質的
に同じである転移点に達する。それ故、本発明要素使用
の際、転移点、好ましくは前記測定のごとく差が生じな
い点より前に生成する検出可能な応答を選ぶ。

このような応答はその後被検体測定に用いる。

試薬の放出速度は、たとえば選んだポリマー試薬ゾーン
の厚さ（一定レベルの指示薬に対して）、指示薬レベル
及び緩衝剤レヘル（緩衝剤を試薬シンに含める場合）を
含む種々の要因により影響される。これら変数をいかに
扱うかは当業者の選択の問題である。たとえばある場合
には、アクリルアミド付加ポモポリマーの放出速度は、
このホモポリマーを含む試薬ゾーン中の緩衝剤レベルを
変えることにより重大に影響されることがわかった。更
に詳しくは緩衝剤レベルを低くすることによりこのよう
な試薬ゾーンからの放出速度は速くなる。

分析要素は自己支持性であるか又は支持体上に支持され
る。有用な支持体材料には、酢酸セルロース、ポリ（エ
ヂレンテレフタレート）、ポリカーボネート及びポリビ
ニル化合物（たとえばポリスチレン）のような種々のポ
リマーが含まれる。

特定要素の為に選んだ支持体は、被検体検出の目的とす
る様式と適合する。好ましい支持体には、２００ｎｍ〜
９００ｎｍの範囲内の波長（単数又は複数）の電磁輻射
線を透過する輻射線透過性支持体材料が含まれる。要素
が支持体を含む場合、試薬ゾーンは通常支持体と反応ゾ
ーンとの間にはさまれる。

分析方法に依存して種々の異なる要素を本発明に従って
製造することができる。要素は、所望の巾の伸長テープ
、シート、又はスライドを含む種々の形状に構成するこ
とができる。

本発明要素は分析下の液状試料を要素へ適用することに
よって用いられる。適用試料は試薬ゾーンと接触する前
に反応ゾーンと接触し、そしてゾーンが層形状の場合に
は、先ず試薬ゾーンから遠い表面で反応ゾーンと接触す
る。本発明要素の分析精度は、通用試料の体積を変化さ
せることによっては実質的に低くならないので、手又は
機械により試料を適用することができる。しかしながら
分析結果検出の便宜上、試料体積は適度に一貫している
ことが望ましい。

本発明要素を用いた分析操作において、要素を供給ロー
ル、スライドパケット（ｓｌｉｄｅ　ｐａｃｋｅｔ）又
は他の源から採取し、そしてたとえば適当な分配器から
の放出滴、接触スポット又は他の形状の液状試料を受容
するように位置させる。試料適用後、そして望ましくは
液状試料が反応ゾーンに吸収された後、要素に、場合に
よっては温間又は加熱のようなコンディショニングを行
い試験結果を得易くすることができる。

被検体色応答の測定は通常、要素を、反射又は透過分光
測光測定用の適当な装置が備えられている帯域に通すこ
とによって行われる。このような装置は、光のようなエ
ネルギーのビームを支持体及び試薬ゾーンにあて、そし
て反応ゾーン中に導く働きをする。次いで光は反応ゾー
ンから反射されて検出手段に達するか、又は透過検出の
場合には要素を通過して検出器に達する。別法としては
同様の方法で、エネルギーのビームを最初に反射又は透
過検出用の反応ゾーン中へ導くことができる。反射分光
測光測定を行うことが好ましい。要素が浸透可能であり
、そして反応ゾーンにおける被検体色応答を定量しうる
任意の輻射線を用いることができるけれども、一般に２
００〜９００ｎｍの範囲の電磁輻射線がこのような測定
に有用であることが見い出された。分析の検量線を与え
るのに種々の公知の検量方法を用いることができる。

± 以下の製造及び例を実施するに際し、次の物質及び操作
を用いた。

人間の血清は病院から供給した。すくに使用しない試料
は一８０°Ｃで凍結状態とした。

人間のベンテックス（ｐｅｎ　ｔｅｘ）アルブミン、人
間のベンテックスα−及びＴ−グロブリン画分は、イン
ジアナ州、エルクハールトのマイルスラボラトリー社か
ら入手した。

ポリ（アクリルアミド−ツーＮ−ビニル−２ピロリドン
）（モノマー重量比５０：５０）は米国特許第４，１３
２，５２８号の例１のごとく製造した（以下ポリマー１
と称す）。

ポリ　（アクリルアミド）はニューヨーク化、ロチニス
ターのイーストマンオーガニソクケミカルズにより販売
されたものであった（以下ポリマー２と称す）。

シーブラック（ｓｅａ　ｐｌａｑｕｅ）アガロースはマ
リーンコロイド社により販売されたものであった。

微結晶性セルロースはＦＭＣ社からアビセル０として販
売されたものであった。

（ｐ−ノニルフェノキシ）グリセリンはオリーンマチェ
ソン社からサーファクタント１００９として販売された
ものであった。

他のすべての化学薬品はイーストマンコダック社から入
手したものであり、そして特記しないかぎり試薬グレー
ドであった。

分光測光測定はカーリ−（ＣａｒｙＨ１８又はベックマ
ン２５装置を用いて行った。反射測定は、ジプロトン化
ＢＣＧをモニターする時は６３０ｎｍに、そしてモノプ
ロ１−ン化ＢＣＧをモニターする時には４２０ｎｍに妨
害フィルターを備えた適当な反射計を用いて行った。こ
れらの装置は、例に記載の要素を透過し、そして要素中
の層によって反射される光線の反射濃度、ＤＲを測定す
る為に用いた。

要素製造 以下の組成の要素４１〜４６と呼ぶ要素を製造し、そし
て例に用いた。

ｒｄで表わす。

被覆レベルは表示物質をｇ／ 試薬層 支持体 ポリマー１ ポリマー２ アガロース ＣＧ りんご酸 ３２．２８ １．０８ １０．８ ３２．２８ １．０８ ５．４ １６、１４ ０．５４ ２．７ １６、１４ １．０８ ５．４ １６、１４ １．０８ ５．４ ３２．２８ １．０８ １０．８ ／／／　　ポリエチレン　テレフタレート　フィルム　
／／／炎＝土　潜在的に有用な放出ポリマーの選別この
例では種々のポリマーの、試薬層のバインダとして用い
た場合の色原体指示薬放出能を評価した。要素４４及び
４５それぞれに、１ｄｌあたり人間のベンテックスアル
ブミン５．０ｇを含む溶液試料１０／Ｊ１をスボッ１−
シた。アガロースを含む要素４５の６３０ｎｍにおける
Ｄｏ＋はほとんど即座に（３０秒以内に）最大に達した
ので選別中のアガロースは有用な放出ポリマーではない
ことが示された。しかしながら要素４４では６３０ｎｍ
におけるＤＲは緩徐に増大し、そして４分後に最大に達
した。従って、ポリマー１は有用な放出ポリマーである
ことが示された。

要素４１　、４２及び４３の試薬層バインダとして用い
るポリマーの色原体指示薬放出能も、リンゲル液試料１
０μＦを各要素に接触させることにより色原体指示薬放
出能が強化される場合を除いて評価した。４２０ｎｍに
おけるＤや値を時間に対して記録した。要素４１では約
２分後にＤＲが最大に達したので有用の放出であること
が示された。

要素４２ではおおよそ最初の１／２分間はＤＲの増大は
みられず、その後ＤＲは徐々に増大し約４分後に最大に
達した。それ故要素４２で用いたポリマー２は、連続放
出と共同する望ましい遅延相を示す。

要素４３ではＤＲは約４５秒後に最大に達するので有用
な放出であることが示された。

±−Ｉ　グロブリン妨害に及ぼす連続放出の影響 プールした人間の血清試料を以下の量の添加グロブリン
を含んで調製した。

零（対照）、α−グロブリン２％、α−グロフリン４％
及びγ−グロブリン２％。

これら試料の１０μ！を、要素４１として前述した型の
要素の反応層へ適用した（１０μｌを一つの要素へそれ
ぞれ適用した）。６３０ｎｍにおけるＤＲを３７°Ｃに
おいて５分間時間に対しモニターした。

添加グロブリン含有血清と接触した要素に関する最初の
２分間のり、ｌ値は、対照と接触した要素のり、ｌ値と
実質的に等しかった。従って、この時間の間、添加グロ
ブリンからの妨害色応答が実質的にないことが確認され
た。

ｌ　　連続的試薬放出と瞬間的試薬放出のグロブリン妨
害に及ぼす影響の比較 要素４１及び４６（対照Ａ）を以下に記載の種々の試料
と接触させた。要素が６３０ｎｍにおいて示すＤＲ値を
１分の読み時間において比較した。

ＢＣＧ　０．２２　ｇ　／留、りんご酸１０．７６　ｇ
　／ボ及びサーファクタントｌ０ＧＯ０，３ｇ／ｎ（を
吸収しているワットマン−３濾紙から成る三番目の単一
ゾーン要素（対照Ｂ）を製造した。濾紙中に吸収されて
いるＢＣＧの量は、要素４１で用いた染料の量の１１５
であった。このような量は、要素４１において液状試料
と接触後最初の１分間に、試薬層から反応層へ放出する
ＢＣＧの量におおよそ相当する。

それぞれの要素を、アルブミン濃度がそれぞれ１．７，
２．５及び５．０ｇ／ｄｆｆｉの人間のベンテックスア
ルブミン検量体溶液試料１０μｌと接触させ、そして各
要素が６３０ｎｍにおいて示すＤＲ値を１分において記
録した。各検量体溶液が更にＴ−グロブリン５％を含む
以外は操作を反復した。ＢＣＧとＴ−グロブリンとの反
応からの偽応答に帰因する各要素が示すずれは、グロブ
リンを含まない試料のＤＲに対しグロブリンを含む試料
のＤＲの増大百分率を計算することにより決定した。結
果を表Ｉに示す。

４１　　　　　　　　　　　１．７　　　　　．７１　
　　．８４２．５　　　　　　．８８　　　１．０５．
０　　　　　１．１８　　　１．２４４６（対照Ａ）　
　　　１．７　　　１．０　　１．．７２．５　　　　
　１．３　　　１．９ ５．０　　　　　１．７　　　２．４ 吸収紙　　　　　　１．７　　　　．１７　　．４２（
対照Ｂ）　　　　　２．５　　　　．２６　　．４６５
．０　　　　　．４２　　　．５８ 要素４１と比べて要素４６が示す大きなずれ百分率は明
きらかに、画状薬層とも最初同じ量の色原体指示薬を含
む場合に、試薬層からの色原体指示薬の連続的放出の利
点を示している。要素４１及び吸収紙要素のずれ百分率
は、等しい量のＢＣＧの瞬間使用に対する連続使用の利
点を実証している。

□□□琴 １８．３ １３．６ 五−土　　マグネシウム分析におけるカルシウム妨害の
低減 ＢＣＧのかわりに指示薬染料エリクロムブラックＴＯを
用いた以外は分析要素４１及び４６を製造する。マグネ
シウム及びカルシウムのポリマーキレート化剤も反応層
中に含め試薬層をマグネシウム及びカルシウムに対し不
浸透性にする。

一つの場合にはマグネシウムを、そしてもう一つの場合
にはマグネシウム及びカルシウムを添加妨害物質として
含む水性試料１０Ｉｉを反応層へ適用し、時間に対する
適当な偽応答曲線を作製する。

応答曲線、即ちマグネシウム曲線及びマグネシウム＋カ
ルシウム曲線間の要素４１を用いた場合の相違は、要素
４６（対照）を用いて得られた色応答曲線間の相違より
実質的に小さい。従ってマグネシウム分析におけるカル
シウム妨害は本発明に従って有効に低減される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アルブミンと、おそらくはアルブミンの分析の妨害
   物質とを含む水性流体を分析する乾式分析要素であって Ａ、前記水性流体を受容する乾式反応ゾーン、並びに Ｂ、アルブミン及び前記妨害物質に不浸透性であり、前
   記要素が前記水性流体と接触した場合に前記反応ゾーン
   と流体接触する乾式試薬ゾーンを含む乾式分析要素にお
   いて、前記乾式試薬ゾーンがアルブミン及び前記妨害物
   質と反応して検出可能な応答を生成しうる発色性アルブ
   ミン指示薬を含み、そして １）前記指示薬と前記アルブミンとの反応及び２）前記
   指示薬と前記妨害物質との低減された反応 に対応して、検出可能な被検体応答を生ずるのに十分な
   速度で、前記発色性アルブミン指示薬を試薬ゾーンから
   反応ゾーンへ連続的に放出する為の、アクリルアミド及
   び／又はビニルピロリドン反覆単位を含むポリマーの放
   出手段を含んで成ることを特徴とするアルブミンの乾式
   分析要素。