JPS6227664A - アルブミン分析用乾式分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は水性液体中のアルブミン分析用乾式分析要素に
関し、さらに詳しくは生物体液、例えば血液、髄液、唾
液、リンパ液、尿等の水性液体中のアルブミン定量分析
用の乾式操作可能な一体型多層分析要素に関するもので
ある。

〔従来の技術〕

生物体液、例えば血液、髄液、唾液、リンパ液、尿等の
水性液体中のアルブミンの測定または定量は緩衝された
ブロムクレゾールグリーン（以下、ＢＣＧという）＃液
またはＵＳＰ　３，５３３，７４９およびＵＳＰ　３，
４８５，５８７　（ＵＳＰは米国特許を表す）等に記載
の試験片を用いて実施されている。ＢＣＧは蛋白質と結
合して色変化するスルホンフタレイン色素に属する酸塩
基指示薬色素の１種である。ＢＣＧは水性液体中に存在
する蛋白質、例えばアルブミンの量に対応して色変化す
る。緩衝されたＢＣＧは、緩衝されていない場合には感
応する声変化に対応する色変化が確実に回避できる。

ＢＣＧ等の酸塩基指示薬はアルブミンに特異的ではない
。ヒトの体液中に存在するグロブリ／、トランスフェリ
ンおよび他の蛋白質は酸塩基指示薬色素との結合を枳合
し、アルブミン分析を妨害する。この競合妨害は低濃度
レベルのアルブミンに関して特に顕著である。ヒトの血
清中の全蛋白質′＠度は約６．〇−約８．０ｇ／ｄｔの
範囲で、このうち約２．９１／ｄｉがグロブリンであり
、残りが主にアルブミンである。このアルジミン濃度に
おいては競合妨害が現われる。

競合妨害を低減した乾式一体型多層分析要素が特開昭５
７−５０６６０号公報（ＵＳＰ　４，３３３，７３３）
に提案されている。この要素はポリエチレンテレフタレ
ート透明支持体の上にＢＣＧと緩衝剤とを非蛋白性バイ
ンダーポリマーに分散した試薬層と多孔性展開層（反応
層）をこの順に接着積層したものである。

上記緩衝剤にはリンゴ酸、乳酸、コノ・り酸、マロン酸
、クエン酸及び酒石酸のような有機酸のなかでは解離定
数の大きな化合物が使用されている。

展開層にヒト血清を点着すると、展開１ｄから試薬層に
水分が供給されて両層が液体接触状態になり、試薬層か
らＢＣＧが展開層に拡散移行し、アルブミンと優先的に
結合し、ＢＣＧ−アルブミン結合特有の色に変化するの
で、変色後の色濃度を測定して比色測定の原理によりア
ルブミン含有量を求める乾式操作の要素である。

先に本発明者等は特開昭５７−５０６６０号公報記載の
アルブミン分析用乾式一体型多層分析要素におけるグロ
ブリンによる妨害（特に測定時間が長引く場合に現れる
グロブリンによる妨害）を解決したアルブミン分析用乾
式分析要素を特願昭６０−８５９０６号明細書に提案し
た。先に提案したアルブミン分析用乾式分析要素におい
てはグロブリンその他の蛋白質による競合妨害は確実に
低減されているが、それでもなお高精度のアルブミンの
定量分析を実施するには精度および再現性が時折低下す
ることが経験された。この問題点は意外なことに従来用
いられていなかったジカルボン酸により解決できること
が見出され、本発明に到達した。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明の目的は簡便にアルブミンを分析できかつグロブ
リンその他の蛋白質の妨害による誤差を低減し、梢反及
び再現性を改善したアルブミン分析用乾式分析要素を提
供することである。

本発明の他の目的は簡便な層構成で製造が容易でグロブ
リンその他の蛋白質の妨害による誤差を低減し、精度及
び再現性を改善したアルブミン分析用乾式分析要素を提
供することである。

本発明の他の目的はアルブミンの選択的測定を連続して
実施できるアルブミン分析用乾式分析要素を提供するこ
とである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明はこのような目的を達成したアルブミン分析用乾
式分析要素を提供するものであシ、アルゾミンと結合し
て色変化する指示薬及び−緩衝剤を含むアルブミン分析
用乾式分析要素において。

該−緩衝剤としてグルメ／ｌ／酸、アジピン酸、ピメリ
ン酸又はそれらのいずれかの誘導体が使用されているこ
とを特徴としている。

アルブミンと結合して色変化する指示薬としては、コル
トホフ（１，Ｍ、Ｋｏｌｔｈｏｆｆ）著「酸−塩基指示
薬（Ａｃ１ｄ−Ｂａｓｅ　Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ）　ｊ
　（ＭａｃＭ１１１ａｎ社。

１９３７年発行）３５０−３５３頁等に記載の蛋白誤差
（ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｒｒｏｒ　）を示す酸塩基指示薬
色素を用いることが好ましい。蛋白誤差を示す酸塩基指
示薬色素の例としてブロムクレゾールグリーン、ブロム
クレゾールパープル、ブロムチモールブルー。

ブロムフェノールブルー、クロルフェノールレッド、フ
ェノールレッド、クレゾールレッド、チモールブルー；
クレゾールフタレイン等のスルホンフタレイン指示薬色
素、インジゴカルミン等のインジゴイド色素；メチルレ
ッド、メチルオレンジ等のアゾ色素系指示薬がある。こ
れらの指示薬のうちで、スルホンフタレイン指示薬色素
が好ましく、フロムクレゾールグリーン（ＢＣＧ）ドブ
ロムクレゾール・ぐ−プル（ＢＣＰ　）が最も好ましい
。

試薬展開層に含有させる酸塩基指示薬色素の童は１ｍ”
当シ約０．２　、Ｆから約３．０．Ｆ、好ましくは約０
．５Ｉから約１．５Ｉの範囲である。

本発明で用いられる一緩衝剤はグルタル酸、アジピン酸
、ピメリン酸またはそれらのメチレン基に炭素原子数１
〜３のアルキル基が１〜２個置換した誘導体であり、血
清あるいは尿のような水性液体試料の−を２．５〜４６
２、好ましくはｐｉ（３，２〜３．８に保持するもので
あって、水に対する溶解度が１５０で１．０　、Ｐ　／
水Ｚｏｏ−以上、そして第１解離定数ｐＫ１　（２５℃
）は３．５以上のものが適当である。

誘導体の例としては、α−メチルグルタル酸、β−メチ
ルグルタル酸、α、α′−ジメチルグルタル酸、β、β
−ツメチルグルタル酸、α−エチルグルタル酸、β−エ
チルグルタル酸、α、α′−ジエチルグルタル酸、β、
β−ジエチルグルタル酸、α−エチル−α′−メチルグ
ルタル酸、β、β−エチルメチルグルタル酸、α−プロ
ピルグルタル酸、β−プロピルグルタル酸、β、β−メ
チルグロピルグルタ／Ｌ’［、β、β−エチルグロビル
グルタル酸、２−メチルアジピン酸、３−メチルアジピ
ン酸、２−エチルアジピン酸などを挙げることができる
。−緩衝剤の量は、親水性ポリマーバインダー層に含有
させる場合には、緩衝するμ値によっても異なるが、通
常１．５〜２０　、ｌＦ／ｍ”であり、２．５〜１２１
１／ｍ２が好ましい。

本発明のアルブミン分析用乾式分析要素は通常は光透過
性水透過支持体の上に少くとも一層の前記声緩衝剤を含
む親水性ポリマーノ々インダ一層とその上に設けられて
試料を均一に拡散せしめる多孔性展開層とからなってい
る。アルブミンと結合して色変化する指示薬は親水性ポ
リマーバインダー層に含まれていてもよいし、多孔性展
開層に含まれていてもよい。このような水性液体測定用
の多層分析要素の典型的な例は米国特許第３．９９２，
１５８号及び同第４，０４２，３３５号に開示されてい
る。場合によっては米国特許３，４８５，５８７号の如
く単一ゾーンからなる要素であってもよい。

多孔性展開層としては、特開昭５５−１６４３５６号公
報、特開昭５７−６６３５９号公報等に記載の織物展開
層（例、ブロード、ボブリン等の平織等）、特願昭５９
−７９１５８号明細書等に記載の編物展開層（例、トリ
コット編、ダブルトリコット編、ミラニーズ編等）、特
開昭５７−１４８２５０号公報に記載の有機ポリマー繊
惟パルプ含有抄造紙からなる展開層、特公昭５３−２１
６７７号公報、ＵＳＰ３．９９２，１５８等に記載のメ
ンブランフィルタ−（プラッシュポリマ一層）、ポリマ
ーミクロピーズ、ガラスミクロビーズ、珪凍土が親水性
ポリマーノ々インダーに保持されてなる連続微空隙含有
多孔性層等の非繊維等方的多孔性展開層、特開昭５５−
９０８５９号公報に記載のポリマーミクロピーズが水で
膨潤しないポリマー接着剤で点接触状に接着されてなる
連続微空隙含有多孔性層（三次元格子状粒状構造物層）
からなる非繊維等方的多孔性展開層、その他特開昭５６
−２４５７６号公報、特開昭５７−９４６５８号公報、
特開昭５７−１２５８４７号公報に記載されているもの
等を用いることができる。

これらの多孔性展開層のうちで指示薬を含有保持させや
すい点で織物展開層、編物展開層に代表される繊維質展
開層が好ましい。このような多灯性の展開層を設けるこ
とによシ血清、尿のような水性液体試料を均一に拡散せ
しめて分析精度及び分析の再現性を高めることができる
。

−緩衝剤は天然又は合成の親水性ポリマーバインダーと
共に支持体上に塗布して層構成としその放出量をコント
ロールする、ＰＨ緩衝剤を含む親水性ポリマーバインダ
ー層は一緩衝剤と水に接触して膨潤し水を吸収できる親
水性ポリマーバインダーを主成分とする吸水性の層（以
下、ＰＨ調節吸水層という）である。ＰＨ調節吸水層は
分析操作時に多孔性展開層に点着された水性液体試料中
の水がこの層に到達し両層が液体接触状態になった時に
一緩衝剤を試薬展開層に拡散により供給して多孔性展開
層の液体試料の存在領域を予め定められた一定の…値ま
たはその近傍の値に維持する機能を有する。好ましい親
水性ポリマー・々インダーは血清又は尿の如き液体が水
性であることから水溶性のものである。アクリルアミド
、ビニルアルコ−ル、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、ヒ
ドロキシエｆｌ’７クリレート、Ｎ−ビニルカプロラク
タム、メチルビニルエーテル、エチルオキシド、アクリ
ル酸、メタクリル酸、２−アクリルアミド−２・メチル
プロパンスルホン酸等の親水性ビニルモノマーからなる
単独及び共重合体、又はでん粉及びセルロース及びそれ
らの誘導体をあげることができる。これらの中で水溶性
ビニルポリマーが好ましい。特に好ましいのは、アクリ
ルアミド及び／又はビニルピロリドン反復単位から成る
ポリマー、特にビニルピロリドン２０〜８０重ｔチ及び
これに対応してアクリルアミド８０〜２０重量％とを含
ｔｒポリ（ビニルピロリドンーコーアクリルアミド）、
あるいは、等重量のアクリルアミドとビニルピロリドン
とから成るモノマーブレンドから製造したアクリルアミ
ドとビニルピロリドンとのコポリマーである。アクリル
アミド−Ｎ−ビニルピロリドン共重合体の製法は特開昭
５８−７７６６４号公報に記載されている。親水性ポリ
マーバインダーの含有量は１　ｍ”当り約７９から約７
０ｇ、好ましくは約１０Ｉから約５０．９の範囲である
。親水性ポリマーバインダーは必要により２種以上を混
合して用いることができる。

本発明のアルブミン分析要素にはノニオン性界面活性剤
を使用することができる。

このような成分は非イオン性界面活性剤である。

代表的な界面活性剤には１例えばアルキルフェノキシポ
リエトキシエタノール、ポリオキシエチレンオレイルエ
ーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
、ｐ−ノニルフェノキシポリグリシドール、オクチルグ
ルコシド等がある。ノニオン性界面活性剤を一調節吸水
層に含有させることにより分析操作時に水性液体試料中
の水が一調節吸水層に実質的に一様に吸収されやすくな
り、また多孔性展開層との液体接触が迅速にかつ実質的
に一様になる。

一調節吸水層は必要に応じて２層以上設けることができ
る。２層以上の一調節吸水層を設ける場合には、試薬展
開層に近い層に低分子量のｐｔ’を緩衝剤組成物または
低分子量の酸を含有させ、試薬展開層から遠い層に高分
子量の一緩衝剤または高分子量の酸を含有させることが
好ましい。用いることができる高分子量の酸の例として
、公知のカルゲキシル基含有ポリマー、スルホン酸基含
有ポリマーがある。

一調節吸水層と支持体との間に親水性ポリマーバインダ
ーからなる吸水層を設けることもできる。

吸水層に用いられる親水性ポリマーの例として、ポリビ
ニルピロリドン、ポリアクリルアミＰ１７がロース等の
非蛋白性ポリマーがある。

光透過性水透過支持体は従来の一体型多層分析要素に用
いられる公知のものを用いることができる。その具体例
としては、ポリエチレンテレフタレート、ビスフェノー
ルＡのポリカルぜネート、ポリスチレン、セルロースエ
ステル（例、セルロースジアセテート、セルローストリ
アセテート、セルロースアセテートプロピオネート等）
のポリマーからなる厚さ約５０μｍから約１龍、好まし
くは約８０μｍから約３００μｍの範囲の透明な、すな
わち波長約２００　ｎｍから約９００　ｎｍの範囲の電
磁輻射線を透過させる、平滑平面状の支持体を用いるこ
とができる０支持体の表面には公知の下塗層または接着
層を設けて一調節吸水層または吸水層との接着を強固に
することができる。

本発明の乾式分析要素は前述の諸特許明細書に記載の公
知の方法により調製することができる。

試薬展開層に指示薬を含有させる方法として特開昭５９
−１７１８６４号公報、特願昭５９−７９１５８号明細
書、特願昭５９−７９１５９号明細書等に記載のように
、−調節吸水層の上に多孔性展開層を設けた後、展開層
の上から指示薬色素含有溶液、好ましくは有機溶媒含有
溶液を塗布することが好ましい。

本発明の乾式分析要素は一辺約１５ｘｍから約３０ｍ５
の正方形まだはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、
特開昭５４−１５６０７９号公報、特開昭５６−１４２
４５４号公報、特開昭５７−６３４５２号公報、実開昭
５８−３２３５０号公報、特表昭５８−５０１１４４号
公報等に記載のスライド枠に収めてアルブミン分析用化
学分析スライドとして用いることが、裂造、包装、輸送
、保存、測定操作等全ての観点で好ましい。使用目的に
よっては、長いテープ状でカセットまたはマガジンに収
めて用いること、または小片を開口のあるカードに貼付
または収めて用いることなどもできる。

本発明の乾式分析要素は前述の諸特許明細書等に記載の
操作により液体試料中のアルブミンの分析を実施できる
。すなわち６μｌから１５μノの範囲の血漿、血清等の
水性液体試料筒を多孔性展開層に点着し、１分から１０
分の範囲で、好ましくは３７℃近傍の温度でインクペー
ションし、光透過性支持体側からアルブミン−指示薬色
素結合の吸収極大波長またはその近傍の波長の光を用い
て試薬展開層の光学濃度を反射測光し、予め作成した検
量線を用いて比色測定法の原理により液体試料中のアル
ブミン含有量を求めることができる。

点着する水性液体試料の量、インクベーション時間と温
度は一定にすることによりアルブミンの定量分析を高精
度で実施できる。この測定操作は特開昭５６−７７７４
６号公報、特開昭５８−２１５６６号公報、特開昭５８
−１６１８６７号公報等（記載の化学分析装置によシ極
めて容易な操作で高精度の測定をすることができる。

〔作　用〕

従来のアルブミン分析用乾式分析要素では一緩衝剤に、
リンゴ酸、乳酸、コハク酸、マロン酸、クエン酸及び酒
石酸のような有機酸の中では解離定数の大きい化合物を
使用しているため、指示薬−アルブミンの反応を抑え、
結果としてグロブリンの妨害を受ける原因となっていた
。

本発明においては、従来用いられていたリンゴ酸、乳酸
、マロン酸、クエン酸のように比較的解離定数の大きい
有機カルゲン酸よシ、指示薬の色変化を生じない範囲で
高い−を保持する有機カルビン酸を使用するとグロブリ
ンの妨害を回避できた。

〔実施例〕

実施例１ 厚さ１８０μｍの無色透明ポリエチレンテレフタレー）
　（ＰＥＴ　）の支持体上に前記の各種の一緩面剤を３
．０　、！ｉ’　／　ｍ”含みアクリルアミド・Ｎ−ビ
ニルピロリドン共重合体（５０１５０ｖｒｔＬ％）を２
５Ｉｉ／ｍ”含む、緩衝剤層を塗布し、その上に厚さ１
５０μｍのＰＥＴ紡頑糸（１００番手相当）製ブロード
織布地をラミネートした。アルブミン指示薬であるＢＣ
Ｇのメタノール−水容積比１：１混合俗媒溶液を布地の
上にＢＣＧ塗布量が０．７！ｊ／ｍ２となるように塗布
し乾燥した。比較サンプルとして特開昭５７−５０６６
０号の実施例に庚用されているリンコ゛酸を緩衝剤とし
て使用したサンプルも同様にして作成した。

作成したサンプルに各々、生理食塩水、４％人アルブミ
ン、及びアルブミンの１．２５倍の人グロブリンを含む
４％人アルブミンを１０ｔｔｌスポツトし、６分間３７
℃でインキュベート後６４０　ｎｍで反射光を測定した
。その結果、本発明の緩衝剤を用いると発色濃度が増加
し、グロブリンを含む水性液体試料とのずれも半減する
ことが明らかである。

実施例２ アルブミン分析指示薬ＢＣＧとｐｌ（緩＃斎１を同じ１
研に含む特開昭５７−５０６６０号の実施例と１司じ層
構成を有し、緩衝層の−を水酸化ナト１ノウムで３．４
に合わせてサンプルを作成した。比較サンプルは特開昭
５７−５０６６０号の実施例に従って作成したサンプル
を用いた。

作成したサンプルに各々１０μＥの生理食塩水（アルブ
ミンのない水性液体に相当）、４チ人アルブミン及びア
ルブミンの１．２５倍の人グロブリンを含む４％人アル
ブミンをスポットし、３７℃で６分間インキュベート後
６４０ｎｍの反射光を測定した。結果は次表の如く１本
発明の緩衝剤を用いると発色′＆＃度が増加し、グロブ
リンを含む水性液体とのずれも大幅に低下することが示
された。

実施例３ 東洋ヂ紙Ａ−５２を用い次のような単層のアルブミン試
験紙を作成した。比較例（比較例−３とする）として米
国特許第３，４８５，５８７号の例−１２に記載のＢＣ
Ｇ−酒石酸系を用いた。実施例１及び２と同じ試験をし
次の結果を得た。単一ゾーン試験紙でも本発明の緩衝剤
を用いると、グロブリンに対するずれは半減することが
認められた。

〔発明の効果〕

本発明のアルブミン分析用乾式分析要素はグロブリンそ
の他の蛋白質の妨害を大巾に減少させたものであり、ア
ルブミンを簡便にかつ高精度で分析できる。また、構造
が簡単であるところから製造が容易であり、機械を利用
すれば連続的に多数の検体の測定を行なわせることも可
能である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）アルブミンと結合して色変化する指示薬及びｐＨ
   緩衝剤を含むアルブミン分析用乾式分析要素において、
   該ｐＨ緩衝剤としてグルタル酸、アジピン酸、ピメリン
   酸又はそれらのいずれかの誘導体が使用されていること
   を特徴とするアルブミン分析用乾式分析要素
2. （２）アルブミンと結合して色変化する指示薬がスルホ
   ンフタレイン系指示薬である特許請求の範囲第１項記載
   の分析要素
3. （３）スルホンフタレイン系指示薬がブロムクレゾール
   グリーン又はブロムクレゾールパープルである特許請求
   の範囲第２項記載の分析要素
4. （４）乾式分析要素が光透過性水透過支持体の上に、少
   なくとも一層の前記ｐＨ緩衝剤を含む親水性ポリマーバ
   インダー層及び前記アルブミンと結合して色変化する指
   示薬を含む多孔性展開層がこの順に一体に積層されてい
   るものである特許請求の範囲第１項記載の分析要素