JPH0236194A - 免疫活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 疫活性合成ベプチドに係る。

さらに詳述すれば、本発明は、熱帯マラリア原虫（Ｐｌ
ａｓｍｏｄｉｕｌＩｌｆａｌｃｉｐａｒｕ＋＋）のサー
カムスボロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｉ
ｃ）タンパク質の免疫学的優性エビトープに対する高力
価で特異な抗体反応を哺乳動物において誘発しうる新規
な合成ペプチドに係る。

マラリア［プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）
属の原虫によって起こるコは、ヒトにおける最も危険は
寄生虫による病気の１つである。

事実、この病気は毎年１億ないし２億の人が罹り、幼児
では死亡率は５０％にも達する。

ヒトに伝染する４種類のプラスモディウム属菌のうち、
最も一般的なものは、三日熱マラリア（Ｐｖｉｖａｘ）
及び゛熱帯マラリア原虫である。

特に、後者は高いマラリアの罹患率及び死亡率を示し、
このため、この病気に対するワクチンが求められている
。感染はヒトにおいては蚊によるスポロゾイトの侵入に
よって始まり、侵入したスポロゾイトは肝細胞に急速に
到達する。肝細胞内において、各スポロゾイトは２０，
０００以上の分裂小体を生成し、各分裂小体は肝細胞に
達した後、赤血球に感染する。赤血球内において、寄生
虫は環からシゾントに無性的に自己再生する。

成熟したシゾントはシングル分裂小体（さらに赤血球に
侵入する）を含有する。

いくつかの分裂小体は、分裂を続ける代りに、生殖母細
胞に分化する。これが蚊による感染過程を代表するもの
である。

マラリア寄生虫の複雑な構造及び生命サイクルのため、
これまでのところ、効果的な抗マラリアワクチンの問題
を解決することが困難であった。

事実、マラリア寄生虫は多ステップサイクルに従って発
育し、宿主組織に非常に多量の抗原性成分を与え、寄生
虫の発育の各形体により、互いに異なるステップ−特異
性抗原を含有する。

プラスモディウム保護抗体を同定することを目的とする
研究において、研究者らは、これらのうち免疫系にさら
され、かつ寄生虫の表面又は感染された赤血球の膜上に
存在するものに注目していた。中でも、プラスモディウ
ム属菌のスポロゾイトの研究（完全に有効であれば、抗
スポロゾイトワクチンの調製により、宿主におけるプラ
スモディウム属菌の発育を阻止でき、これにより、滅菌
免疫を誘発できる）が注目されている。

Ｘ線を照射した熱帯マラリア原虫及び三日熱マラリアの
スポロゾイトを使用して、動物及びヒトに対する抗スポ
ロゾイトワクチンの調製が試みられており、マラリアに
対する非菌株特異性の保護免疫が得られている。

しかしながら、このような処方のワクチンは、スポロゾ
イトの入手が限定されること及び不安定であることによ
り、大規模生産にはあまり適していない。

モノクロナール抗体を使用することにより、プラスモデ
ィウム・ベルゲイ（Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉ）［Ｎ、Ｙｏｓ
ｈｉｄａ。

Ｒ，Ｓ、Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇら「サイエンス（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ）ｊ　２０９゜７１１　（Ｉ９８０）］及び
動物及びヒトに感染する他の原虫（熱帯マラリア原虫を
含む）　［Ｆ、５ａｎｔｏｒｏら「ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、）Ｊ　２５８．３３４１　（Ｉ９８３）］のスポロ
ゾイトの主要表面タンパク質が同定されている。

このタンパク質［サーカムスポロゾイトタンパク質（Ｃ
ＳＰ）と称される］はスポロゾイトの表面を完全に覆い
、マラリア感染に対する保護を提供する特異な抗体反応
を誘発する。

最近では、ヨーロッパ特許出願公開第１６６．４１０号
において、熱帯マラリア原虫のＣＳタンパク質をコード
付ける遺伝子のクローニング配列決定が開示されており
、該タンパク質が、その中心領域にテトラペプチド配列
（ＮＡＮＰ） 一アスパラギンーアラニンーアスパラギンプロリン の３７繰返し単位及びテトラペプチド（ＮＶＤＰ）−ア
スパラギン−バリン−アスパラギン酸−プロリン− の４繰返し単位（これらのうち３つはＮ−鎖末端でＮＡ
ＮＰ配列と交互になって −ＮＡＮＰ−ＮＶＤＰ−ＮＡＮＴ’−ＮＶＤＰ−ＮＡＮ
Ｐ−ＮＶＤＰ−ＮＡＮＰ− を形成している）を含有していることが明らかにされて
いる。

Ｒ，Ｎｕｓｓｅｒ＋ｚｖｅｉｇらによって行われた実験
［ｒｓｃｉｅｎｃｅＪ　２３４．１３４９−１３５６　
（Ｉ９８６）；　ｒ＾ｒａ、　Ｊ。

Ｔｒｏｐ、　Ｍｅｄ、　Ｈｙｇｌ　３４．６７８−６Ｈ
（Ｉ９８６）］では、下記の事項が明らかにされている
。

ｌ）繰返し領域はＣ８Ｐの免疫優性エピトープを含有す
ること。

２）免疫優性エピトープは３つの連続する繰返し単位（
ＮＡＮＰ）、で限定されること。

３）抗スポロゾイトモノクロナール抗体及びポリクロナ
ール抗体は（ＮＡＮＰ）　、を認識し、抗（ＮＡＮＰ）
３抗体はスポロゾイトと反応し、インビボでスポロゾイ
トが肝細胞に侵入するのを阻止すること。

４）照射剤スポロゾイトを予防接種し、マラリアから保
護した志願者の血清中に存在する抗体は、主として（Ｗ
Ａ！ｌＰ）、に対して向けられること。

５）イムノラジオアッセイにおける抗原として（ＮＡＮ
Ｉ’）＋を使用することにより、該ペプチドは流行地域
に住む者の中からランダムに選択された人の血清と良好
に反応することが観察されたこと。

６　）（ＮＡＮＰ）、は、すべての大陸で捕らえられた
蚊から得られた熱帯マラリア原虫の全菌株に存在するこ
と。

７）ウシ血清アルブミンと結合させた（ＮＡＮＰ）３で
ウサギ及びマウスを免疫することにより、スポロゾイト
の感染性を中和する抗体の形成を誘発すること。

さらに、繰返しＮＡＮＰ配列３２個を含有するポリペプ
チドはマウスにおける有力な免疫原であり、抗体を誘発
する。

従って、これらの結果は、Ｃ３の繰返しを含有する合成
ポリペプチドが抗マラリアワクチンの開発の有望な物質
とみられることを示唆している。

（ＮＡＮＰ）３−破傷風毒素結合体及びテトラサイクリ
ン耐性の遺伝子によってコード付けられる初めのアミノ
酸３２個を含有するペプチドセグメントに結合した（Ｎ
ＡＮＰ）、、を使用して、志願者に対して臨床テストが
行われている［Ｗ、Ｒ，Ｂａｌ　ｔａｕらｒＬａｎｃｅ
ｔＪ１２７７−１２８１　（Ｉ９８７）；　Ｄ、＾、Ｈ
ｅｒｒｉｎｇｔｏｎら「ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）Ｊ
　３２８．２５７−２５９　（Ｉ９８７）］。

しかしながら、「キャリヤー」タンパク質又はポリペプ
チドの使用は少なくとも２つの潜在的な危険がある。

（Ｉ）かかる「キャリヤー−ペプチド」ワクチンは抗ペ
プチドＴ細胞（Ｔ細胞の反応は抗原決定子に向けられる
）を刺激するため、予防接種された患者は、蚊によるス
ポロゾイトの接種によって起こる天然の「ブースト（ｂ
ｏｏｓｔ）ｊにより利益を受けないことがあること。

（２）「キャリヤー」によって誘発される免疫性抗（Ｎ
ＡＮＰ）３ペプチド応答の抑制（キャリヤー誘発エピト
ープ抑制）が起こることがあること。

従って、当分野では、前記繰返し配列を含有する免疫活
性ペプチドの他の調製法が提案されている。

たとえば、ヨーロッパ特許出願公開第２０９，６４３号
には、重縮合法によって得られた繰返し数ｎ回（好まし
くは４０回）の（ＮＡＮＰ）テトラペプチドによってな
る連続性ペプチドが開示されている。

（ＮＡＮＰ）、。は強力な免疫原であり、キャリヤータ
ンパク質又はポリペプチドと結合される必要はない。

生成されたＩｇＧは、熱帯マラリア原虫に感染した蚊の
抽出物と特異的に反応し、インビトロでＴ細胞の増殖反
応を促進する。

しかしながら、インビボ及びインビトロの両方で、得ら
れた結果は、繰返しくＮＡＮＰ）配列に特異なＴ細胞の
応答が遺伝的に制限されることを明確に示した［Ｇ、Ｄ
ｅｌ　Ｇｉｕｄｊｃｅら「ジャーナル・オブ・イミュノ
ロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）Ｊ　１３７．２９５２
−２９５５（Ｉ９８６）；　Ａ、Ｒ，ＴｏｇｎａらｒＪ
、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｊ　１３７．　２９５６２９６０　
（Ｉ９８６）］。

さらに正確には、かかる応答は、マウス主要組織適合遺
伝子複合体（Ｈ−２）のＩａ領領域ｒｂ対立遺伝子の存
在に拘束される。

このような結果により、研究者らは、（ＮＡＩＩＰ）、
。

タイプの合成ワクチンはヒトに対して保護免疫を付与す
るにはあまり適しておらず、たとえヒトにおいて免疫応
答が遺伝コントロール下にあったとしても、天然の「ブ
ースティング」条件下、すなわち感染した蚊のかみ傷に
よって起こる保護抗体の生産が「応答者」においてのみ
起こるであろうと考えていた。

従って、マラリアに対する有効なワクチンは、■細胞を
刺激してＢ細胞を助け、これにより抗ＮＡＮＰ抗体を生
産でき、かつＴ細胞の増殖（抗体非依存細胞性免疫の確
立に必須である）を生じさせるエピトープを含む抗原を
含有してなる。

立体配置に冠する研究において、モデルとして水溶液中
で連続性（ＮＡＮＰ）４ｏポリペプチドを使用すること
により、該ポリペプチド鎖は二次構造に欠け、本質的に
不順であり、高度に柔軟性であることが見出されている
［Ａ、Ｓ、　Ｖｅｒｄｉｎｉ、　１ｓｔ　Ｃｏｎｆｅｒ
−ｅｎｃｅ　Ｊａｃｑｕｅｓ　Ｍｏｎｏｄ：　ｒ寄生虫
性疾患に対する予防接種に関する分子的アプローチ（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ。

＾ｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　Ｖａｃｃｔｉｎａｔｉｏ
ｎ　ａｇａｉｎｔ　ＰａｒａｓｉｔｉｃＤｉｓｅａｓｅ
ｓ）Ｊ　Ｒｏｓｃｏｆｆ、フランス、　１９８７年９月
１−４日］。

−次元及び二次元プロトン核磁気共鳴による実験では、
さらに、構造上の不順がＮＰＮ及びＩＩＰＩＩＡセグメ
ントのレベルにおけるポリペプチド鎖の数個の立体配置
の任意性によるものであろうということを示した。

ＮＰＮ配列のγ、タイプの構造、及びＮＰＮ＾配列のβ
−ｔｕｒｎ　Ｔ及び■のタイプの構造が、（ＩＩＡＮＰ
）　ｔ　ＮＡ。

（ＮＡＮＰ）、ＭＡ及び（ＮＡＮＰ）ｓの如きモデルに
おいて、水／メタノール及び水／トリフルオルエタノー
ルの媒混合物中で実験的に観察された。最も大きい分子
量を有するモデル［（ＮＡＮＴ’）４０］は、円偏光二
色性テストで示されているように、水中では二次構造を
持たないが、水−トリフルオルエタノール混合物［２／
　９８　（ｖ　／　ｖ）コ中では、トロボエラスチン（
ｔｒｏｐｏｅｌａｓｔｉｎ）に関しＵｒｒｙによって提
案されたら線構造［Ｄ、１ｆ、Ｕｒｒｙ　ｒＰｒｏｃ、
Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｊ　Ｕ、Ｓ、Ａ。

６９、１６１０　（Ｉ９７２）］に非常に類似したら線
形の構造をとっている。

Ｃ８Ｐ繰返し単位も、恐らく構造を持たないものであろ
う。ＣＳタンパク質はその中心を表面膜の外方に向って
露出しており、高度に溶媒化性で破壊性の手段（血漿）
と接触するはずである。

この仮説は、（ＮＡＮＰ）繰返しのドメインが全ＣＳタ
ンパク質の１７３以上で構成され、従って、小サイズで
あること（８−２０アミノ酸残基）により、たとえ溶媒
化性であっても、該ドメインが含有されるタンパク質の
残部の構造上のすべての条件を受ける古典的なタンパク
質「ループ」とは比較にならない場合にさらにもっとも
らしく思われる。

ＣＳタンパク質の繰返し領域に関連する生物学的機能は
、免疫応答を回避することを最終目的として、ＣＳタン
パク質に対する親和性の低い異種抗体の生産を促進する
ため、高度に柔軟性でありかつ迅速に相互変換する多数
のエピトープを免疫系に提供することである。

得られた結果に鑑み、鎖の立体配置上の任意性の数を制
限し、立体配置の平衡を、ＣＳタンパク質に対する高い
親和性を有する抗体の生産を促進し、中和させうる立体
配置と一致するようにシフトさせるため、（ＮＡＮＰ）
ｎ配列の類似体を合成した。該類似体は式 で表され、多数のプロリンに残基のため、全体的に堅固
な鎖構造に有利である。

本発明の目的は、マラリアに関連して有用であって、哺
乳動物において高力価の抗体応答を誘発しうる免疫活性
ポリペプチドにある。

本発明の他の目的は、該合成ポリペプチドの製法にある
。

本発明のさらに他の目的は、前記連続性ポリペプチドを
抗マラリアワクチンの調製に使用することにある。

さらに、本発明の他の目的は、ヒトの臨床サンプル中の
抗スポロゾイト抗体定量用の診断キットを調製するため
、上記連続性ポリペプチドを使用することにある。

本発明の他の目的については、明細書の記載から、及び
後述の実施例から明らかになるであろう。

特に、本発明によるペプチドは、配列 Ａｓｎ−Ｐｒｏ− （ここで、ＡｓｎはＬ−アスパラギンであり、Ｐｒｏは
Ｌ−プロリンである）の少なくとも２つの連続する繰返
し単位で構成される。

かかるペプチドは、好ましくは下記の式（Ｉ）によって
定義される。

−Ｈ−（Ａｓｎ　−Ｐｒｏ）ｎ　−ＯＨ（式中、Ａｓｎ
及びＰｒｏは前記と同意義であり、ｎは２以上である。

） 本発明によれば、該ペプチドは、（ａ）末端アミノ基で
保護された式 ％式％ （式中、Ｘは酸レイビル保護基である）で表されるペプ
チド（Ｉ［）を合成し、（ｂ）該ペプチド（ＩＩ）をフ
ェノールのハロゲン化誘導体との反応によって活性化さ
せて、Ｐｒｏ末端カルボン基で、式％式％ （式中、Ｘは前記と同意義であり、Ｙはフェノールのハ
ロゲン化誘導体の残基である）で表される該ペプチドの
活性エステル（ＩＩＩ）を生成させ、（Ｃ）該ペプチド
（Ｉ）から酸分解によってアミノ保護基を除去して、ペ
プチド（ＩＶ） １１ＣＱ−Ｈ−Ａｓｎ　−Ｐｒｏ　−Ａｓｎ　−Ｐｒｏ
　−ＯＹを生成し、（ｄ）該ペプチド（■）を塩基性の
有機開始剤の存在下で重縮合させ、最後に（ｅ）（Ａｓ
ｎ　−Ｐｒｏ）配列を有する少なくとも２つの連続する
繰返し単位でなるポリペプチド（ｒ）を含有するフラク
ションをクロマトグラフィーによって分離することから
なる方法によって調製される。

工程（ａ） 本発明による方法の工程（ａ）では、ペプチドの合成に
おいて公知の一般的方法の１つを利用して、均一相での
縮合によってペプチド（ＩＩ）を調製する。

代表的には、不活性有機溶媒中、縮合剤（たとえばジシ
クロへキシルカルボジイミド）の存在下で操作して合成
を行い、プロリンを末端カルボキシ基において好ましく
はベンジル基（−０Ｂｚｌ）でエステル化し、アスパラ
ギンについては、その末端アミン基において、温和な酸
分解条件下で除去可能な保護基で保護する。

この目的に好適な有機溶媒は、脂肪族炭化水素、塩素化
炭化水素、脂肪族ケトン、又はアルキルエステルの中か
ら選ばれる。

該溶媒の好適な例は、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、
クロロホルム、酢酸エチル、テトラヒドロフランである
。

アミノ基の保護基は、一般に酸性加水分解によって除去
される基（酸分解基）の中から選ばれる。

これらの中でも、第３級ブチルオキシカルボニル（Ｂｏ
ａ）が特に好適である。

縮合反応を行う際の温度は、一般に−１０ないし４０℃
であり、対応する反応時間は反応を完了又は実質的に完
了させるに必要な程度である。

終了後、反応混合物から沈殿したジシクロヘキシル尿素
を炉去又は遠沈させ、溶媒を留去して乾固させる。

このようにして得られた残渣は、ペプチドＸ　−Ａｓｎ
　−Ｐｒｏ　−０Ｂｚｌ （ここでＸは前記と同意義である）でなり、適当に洗浄
し、乾固させる。

つづいて、このジペプチドの一定量を、酢酸エチル中の
塩酸又はトリフルオル酢酸により、無水窒素の存在下、
室温で処理して、Ｌ−アスパラギンの末端アミノ基から
保護基を除去し、このようにして、末端カルボキシ基に
おいてエステル化されたし一アスパラギンーし一プロリ
ンの塩酸塩を得る。

ジペプチドの他の一定量を、水素の存在下、炭素に担持
したパラジウム触媒で処理して、プロリンの末端カルボ
キシ基からベンジルエステル基を除去し、化合物 Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＯＨ を得る。

該反応を室温において原料物質が消失するまで行う。

最後に、濾過又は遠心分離によって反応混合物から触媒
を除去し、得られた透明な溶液を蒸発乾固させる。

ついで、上述の如く得られたジペプチドを縮合剤の存在
下で有機溶媒中に懸濁させることによってテトラペプチ
ド（］ＩＩを縮合させる。

反応混合物からジシクロヘキシル尿素を分離し、溶液を
蒸発乾固させた後、残渣を晶析により精製する。

このようにして得られた生成物から、上述の如くして、
プロリンの末端カルボキシ基のエステル基を除去し、式
（Ｉ［）で表されるテトラペプチドを分離、精製する。

工程（ｂ） 本発明による方法の工程（ｂ）では、末端アミノ基が保
護されたペプチド（ｆｆ）を、フェノール誘導体との反
応によって活性化し、Ｐｒｏの末端カルボキシ基につい
ての該ペプチドの活性エステル（ＩＩ［）Ｘ　−Ａｓｎ
　−Ｐｒｏ　−Ａｓｎ　−Ｐｒｏ　−ＱＹ（ここで、Ｘ
は前記と同意義であり、Ｙはフェノールのハロゲン化誘
導体の残基である）を生成する。

本発明の方法において使用されるフェノールのハロゲン
化誘導体は、フッ素化又は塩素化フェノール誘導体であ
る。

この目的に特に好適なものは、ペンタクロロフェノール
、トリクロロフェノール及びペンタフルオルフェノール
である。

Ｐｒｏのカルボキシ基での活性化反応は、ペプチド（ｎ
）及びフェノールのハロゲン化誘導体（相互のモル比は
１−２である）を、有機溶媒の液状雰囲気中、当分野で
公知のものの中から選ばれる縮合剤の存在下で相互に接
触させることによって行われる。該反応は、温度−１０
ないし４０℃、好ましくは０℃で行われる。

かかる目的に好適な溶媒は、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムア
ミド、酢酸エチル又はテトラヒドロフランの中から選ば
れる。

使用される縮合剤は、好ましくはシクロへキシルカルボ
ジイミド（ＤＣＣＩ）である。

反応後、生成されたジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）を
反応混合物から除去し、溶媒を留去する。

ついで、得られた残渣を繰返し粉砕し、エチルエーテル
で洗浄する。

このようにして、’　ＨＮＭＲ分析及び質量分析におい
て予想した構造を有することを示す生成物が収率的９０
％で得られる。

工程（ｃ） 本発明による方法の工程（ｃ）では、ペプチド（ＩＩＩ
）の末端アミノ基に結合した保護基を酸加水分解によっ
て除去する。

該反応は、トリフルオル酢酸又は有機溶媒中の塩化水素
を使用し、室温（２０−２５℃）、反応時間約１時間で
操作することによって行われる。

ついで、窒素を溶液を通して１ないし３時間発泡させ、
沈殿した生成物を反応混合物から分離し、繰返し洗浄し
、減圧下で蒸発乾固させる。

このようにして、ＴＬＣ分析において均一性であること
を示す式（ＩＶ）の生成物が収率的９５％で得られる。

工程（ｄ） この工程では、活性化及び脱保護化されたペプチド（Ｉ
Ｖ）を有機溶媒の液相に溶解させ、塩基性有機開始剤の
存在下で重縮合させる。

この目的に好適な有機開始剤は、第３級アルキルアミン
（アルキル基は炭素原子１−４である）である。特にト
リエチルアミンが好適である。

重縮合反応は、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルム
アミド又はヘキサメチルホスホルアミドの中から選ばれ
る有機溶媒中、温度−１０ないし４０℃、反応時間２４
時間ないし６日で行われる。

実際には、反応は室温又は室温に近い温度で行われ、こ
の場合、反応の完了又は実質的な完了に必要な時間は９
６時間程度である。

重縮合反応を終了させる際には、溶液（非常に薄い）を
、穏やかに撹拌した無水エチルアルコールに滴加する。

ついで、得られた懸濁液を減圧下で蒸発乾固させ、再度
水に懸濁化させる。

液から不活性の残渣を戸去し、得られる透明な溶液を凍
結乾燥させる。

異なる分子量を有するペプチドの混合物でなる凍結乾燥
物は、そのままで抗マラリアワクチン及び診断用キット
の調製に使用され、又は常法に従って分別して、狭い分
子量分布を有するペプチドとすることもできる。

特に、本発明によれば、凍結乾燥物の分別は、カラム５
ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−５０でのクロマトグラフィー（
温度２０−２５℃）を利用し、０．１Ｍ酢酸により速度
３６峠／時間で溶出することによって行われる。

このようにして操作を行った後、分子量１２００（平均
してジペプチド７±２（Ｉｉ！ｌでなるペプチドに相当
する）に相当するフラクションを集め、分離する。

これらのペプチドはすべて、本発明の目的に特に有用な
ものである。

ペプチド（ＮＰ）　　　（実験室での動物実験では非７
±２ 常に強力な免疫原であることを示した）が特に好適であ
る。

生成された高力価を有する抗体は、合成抗原（ＮＰ）　
　　だけでなく、抗原（ＮＡＮＰ）　　をも認識す７±
２４０ る。

この結果は、（ＮＰ）　ｎ配列が、抗（ＮＡＮＰ）４ｏ
抗体の生産においてＢ細胞を非常に効果的に刺激すると
共に、Ｔ−ヘルパー細胞を刺激するエピトープを含有す
ることを示す。

このような特性のため、本発明の連続性ペプチドは、合
成杭スポロゾイトワクチンの開発に特に重要なものとな
っている。

本発明による連続性ペプチドはそのままで使用され、又
は異なるエピトープで構成されるさらに複雑なワクチン
に配合される。

以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、こ
れらに限定されない。

実施例！ ａ）第３級ブチルオキシカルボニル−し−アルパ１−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＺ）１６．２９（
Ｉ２０ミリモル）及びＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）
１２．１２１１２（Ｉ１０ミリモル）を含有するＮ、Ｎ
−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の溶液（３５０ｘＱ
）に、ＨＣＱ　−Ｐｒ。

０Ｂｚ１２４．０６ｇ（Ｉ００ミリモル）及びＢｏａ−
＾５ｎ−ＯＲ２５，５９（Ｉ１０ミリモル）を添加した
。

得られた溶液を０℃に冷却し、ＤＭＦ６０ｘＱに溶解し
たジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）２２．
７９（Ｉ１０ミリモル）を添加した。ついで、溶液を２
０℃に加熱し、撹拌しながら１６時間反応させた。

この時間の経過後、反応混合物を濾過して、沈殿したり
シクロヘキシル尿素（ＣＣＵ）を除去し、溶媒を留去し
て乾固させた。

得られた残渣を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）　３０１１２
中で集め、連続して、ＮａＨＣＯａ水溶液（５％、Ｔ／
Ｖ）５ｘＲで２回、クエン酸水溶液（５％、ｖ７　ｙ）
で２回、及び最後に水で水相中のｐＨが中性となるまで
抽出処理した。ついで、有機相を分離し、残部を無水Ｍ
ｇ５Ｏａ約１０９で完全に脱水し、減圧下で濃縮した。

上述の如く操作することによって、ゲル様の残渣が得ら
れた。ついで、ＥｔＯＡｃで洗浄し、白色の固状物が得
られるまでエチルエーテル（ＥｔｔＯ）２０ｘ１２と摩
砕し、減圧下で乾燥させた。

ＭｅＯＨ）を有する所望の生成物３０．６９（７３ミリ
モル）（７３％）を得た。

分析データ（ＴＬＣ，ＨＰＬＣ及びＮＭＲ）から、得ら
れた生成物の同−性及び純粋性を確認した。

合成 上記工程ａ）で得られたＢｏｃ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＯＢ
ｚｌ　２０゜３２ｙ（４８，４ミリモル）を、ＨＣｌ２
で飽和したＥｔＯＡｃ　２００＊Ｑと２０℃で１時間反
応させた。かかる時間の経過後、撹拌し、室温（２０−
２５℃）に維持しながら、該溶液を通して無水の窒素を
３時間発泡させた。

このようにして白色の沈殿が生成した。これを反応混合
物から戸数し、Ｅｔ　ｔＯで繰返し洗浄し、最後に減圧
下で２０時間乾燥させた。

生成物１６．４９（４５，９ミリモル）（９５％）を得
た。

の製法 Ｂｏｃ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＯＢｚｌ　　６９（Ｉ４，３
ミリモル）をメタノール（ＭｅＯＨ）２５０ｘ１２及び
Ｄ肝１００３１１２の混合物に溶解させた。

得られた溶液に触媒（活性炭に担持した１０％Ｐｄ）２
．５ｇを懸濁させ、原料物質が消失するまで（ＴＬＣで
測定）、室温で■、を発泡させた。シーライト上での濾
過によって反応混合物から触媒を除去し、残った透明な
溶液を蒸発乾固させた。

無色の泡状物５．７９が得られた。ＨＰＬＣ分析では、
下記の実験条件下において、保持時間５．６６−６を有
する１つのシングルピークの存在を示した。

Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ　Ｒｐ　１ｇ（Ｉ０μ）の逆転相
カラム２５Ｘ０．２６ｃ肩 溶離剤二０．１％トリフルオル酢酸を含有するアセトニ
トリル及びトリフルオル酢酸水 溶液（０，１％、Ｖ／　Ｖ）及び１％ＣＶ／　Ｖ）アセ
トニトリルの混合物（初期組成：有機相１５％）。該混
合物について、１５分間で有機相割合が６０％に上昇す
る線状勾配で有機相を増加させた。

ジメチルホルムアミド２５０ｘｅに、室温で、Ｂｏａ　
−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＯＨ４，２９（Ｉ４，３ミリモル）
、ＨＣｌ２−Ｈ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−０Ｂｚ１５．０４９
（Ｉ４，１１ミリモル）、Ｎ−メチルモルホリン１．５
４ｇ（Ｉ４，１１ミリモル）及びＮ−ヒドロキシ−ベン
ゾトリアゾール１．９３９（Ｉ４，３ミリモル）を溶解
させた。溶液を温度０℃とした後、Ｎ、Ｎ−ジシクロへ
キシルカルボジイミド２．８９（Ｉ３，５ミリモル）を
含有するＤＭＦ　３０ｘＱを添加し、混合物を１８時間
撹拌した。ついで、生成されたＤＣＵを濾過によって除
去し、溶液を蒸発乾固させた。得られた残渣を酢酸エチ
ル＜００ｘＱに溶解させ、前記工程ａ）で記載した如＜
　ＮａＨＣＯ，及びクエン酸で洗浄した。

有機相をＭｇ５Ｏ＋で完全に乾燥させ、濾過し、固状の
白色粉末でなる残渣が得られるまで蒸発乾固させた。

固状物を酢酸エチルに溶解させ、エチルエーテルを添加
して晶析させた。１濾過によって回収された酢酸エチル
に不溶のフラクションをエチルエーテルで洗浄し、窒素
流下、蒸発乾固させ、融点白色の固状物を得た。

を添加し、ベンジルエステルの完全な水素化分解が達成
されるまでＨｌを発泡させた。

反応後、シーライト上での濾過によって触媒を分離し、
炉液を蒸発乾固させた。白色の泡状物０．８９９（９５
％）が得られた。前記工程Ｃ）で報告したものと同じ条
件下で行ったＨＰＬＣ分析では、５．１５分に１つのシ
ングルピークを示した。

実施例２ ０リン）の合成 ０）１）の合成 ＭｅＯＨＬＯＯｉ＋Ｑ及びＨ，０１０ｘＱでなる溶液に
、Ｂｏｃ＾５ｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＯＢｚｌ　
１．１ｇ（Ｉ，７４ミリモル）を添加した。

この溶液に触媒（活性炭に担持した１０％Ｐｄ）　１　
、０９叉 実施例１に記載の如くして得られたＢｏｃ−Ａｓｎ　−
Ｐｒｏ　−Ａｓｎ　−Ｐｒｏ　−ＯＨ０，８９９（Ｉ，
６５ミリモル）を、ペンタクロロフェノール０．６９＜
２．２６ミリモル）を含有するＤＭＦ　６ＱｘＱに溶解
させた。

この溶液を０℃に冷却し、ＤＣＣＩ　０．３６９（Ｉ，
７ミリモル）を含有するＤＭＦ　５０ｘＱを添加した。

０℃で１６時間反応させた後、沈殿したＤＣＵを反応混
合物から分離し、溶媒を減圧下で蒸発させた。

得られた残渣を繰返し摩砕し、エチルエーテルで洗浄し
て、不純物として少量（約１％）のペンタクロロフェノ
ールを含有する白色粉末１．１９ｆＦ（９０％）を得た
。

ＮＭＲ及び質量分析で確認したところ、生成物は所望の
構造を有していた。

Ｂｏｃ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−０ＰＣＰ　
　１．１９９（Ｉ，４８ミリモル）を、ＨＣｌ２で飽和
したＥｔＯＡｃ　７０峠に溶解し、得られた溶液を室温
で１時間反応させた。

この溶液を通して約３時間窒素を発泡させた後、結晶性
沈殿物を戸数し、該沈殿物を繰返しＥｔ、ＯＨで洗浄し
、減圧下、ＫＯＨ上で１６時間乾燥させ、さらに２４時
間Ｐ、０．上で乾燥させた。このようにして、を有する
所望の生成物１．０４９（Ｉ，４０ミリモル）（９５％
）を得た。

ＴＬＣ分析では、該生成物が均一であることを示した。

前記工程ｂ）に記載の如くして得られた）ＩＣρ・Ｈ−
Ａｓｎ　−Ｐｒｏ　−Ａｓｎ　−Ｐｒｏ　−０ＰＣＰ　
１．０９（Ｉ，３８ミリモル）を、トリエチルアミン（
ＴＥＡ）　０　、４ｘＱと混合したジメチルスルホキシ
ド（ＤＭＳＯ）　１　ｍ＋２に溶解させた。得られた混
合物を２０℃で９６時間穏やかに撹拌した。

反応後、溶液（非常に薄い）を、穏やかに撹拌した無水
エタノール５０ｘ（ｌ中に約５分間で滴加した。

得られた懸濁液を減圧下で蒸発乾固させ、ついで水に再
度懸濁化させた。ついで、液から不溶残渣を戸主し、透
明な炉液を、溶離剤として０．１Ｍ酢酸（流速３６１Ｑ
／時間）を使用する５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−５０（微
粒状）でのクロマトグラフィー（温度２０−２５°Ｃ）
に供した。

このようにして２つのフラクションが得られた。

凍結乾燥後、それぞれ繰返しくＡｓｎ　−Ｐｒｏ）単位
数７±２及び３±１を有するペプチド２１ｔｘｇ及び３
０１１９を得た。

実施例３ 生後５週間の雄性ウサギを上記合成ペプチドで免疫する
ことにより、動物において抗体応答を誘発する（ＮＰ）
　　　の能力をテストした。

７±２ これに対し、形成された抗体の特異性を、抗原として（
ＮＰ）　　　及び（ＮＡＮＰ）　　の両方を使用し、７
±２４０ 免疫酵素法（ＥＬ　ＩＳＡ法）によって測定した。実際
には、ウサギ６匹に筋肉内法（Ｉ回接種）及び皮下法（
４回接種）で接種した。すなわち、ウサギ３匹に、（Ｎ
Ｐ）　　　ｌ　ｕ及びフロイント完全アジュバント７±
２ （ＣＦＡ）　Ｉ　ＲＱを含有するリン酸緩衝食塩水（Ｐ
ＢＳ）　（ｐＨ７，８）　１　ｘＱを接種し、他の３匹
（コントロール）にＰＢＳｌｘＱ及びＣＡＦｌｊｌＱを
接種した。

第１回目の接種から２１日後に、同じ用量及び同じ方法
で再度接種した。

第１回目の接種から３５日後に、フロインド不完全アジ
ュバント１ｒｘＱと混合した（ＮＰ）　　　１　ｍｙを
含７±２ 有するＰＢＳ　１　ｘＱを筋肉内法及び皮下法の両方で
動物に接種した。

このように処理した動物の血清を、０日、２０日、３４
日及び４８日に採取し、ＥＬＩＳＡ法によって分析して
、形成された抗体を定量し、その特異性をテストした。

実際には、合成抗原（ＮＡＮＰ）　　及び（ＮＰ）　　
　を、４０７±２ ミクロ滴定用のポリスチレン製スラブ（Ｎｕｎｃ−免疫
プレート■、Ｎｕｎｃ、デンマーク）の凹部内において
、凹部１つ当たり前記抗原４μ９／ＩＱを含有するＰＢ
Ｓ溶液５０ｘＱを分配し、該スラブを室温に１６時間維
持することによって吸収させた。

ついで、スラブをＰＢＳ　−Ｔｖｅｅｎ（０，０５％Ｔ
ｗｅｅｎ　２０（Ｖ／　Ｙ）、ｐＨ７，４）で３回洗浄
し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　−１％（Ｗ／Ｖ）ミルクパウ
ダーと共に室温で１時間インキュベートすることにより
非特異的結合部位をブロックした。

ウサギ血清のスカラー希釈液を、ＰＢＳ−１％ミルクパ
ウダー１００μＱ中で調製した。ついで、各希釈液５０
μｅをスラブの各凹部に導入し、室温で１時間インキュ
ベートした。

この時間の経過後、スラブをＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎで３
回洗浄し、ＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎ−ミルクパウダーで希
釈したダイコンのベルオキンダーゼと結合したウサギの
抗１ｇ抗体５０μσと共に室温において再度１時間イン
キュベートした。

ついで、スラブをＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した
。

最後に、メタノール＋過酸化水素中に０−フェニレンジ
アミンを含む溶液５０μＱをスラブに添加し、約３０分
後、ＥＬＩＳ＾リーダー上で４９２ｎｍにおける溶液の
吸光度を測定した。

得られた結果を次長に示す。

抗体の力価 免疫前　　　　　　　　００ ２０日　　　　　　　　　１ニア、０００　　　　１：
８００３４日　　　　　　　　　１：２０，０００　　
　１＋３．２００４８日　　　　　　　　　　１：８０
，０００　　　　１：１０，３００コントロール　　　
　　００ 上記の結果から、合成ペプチド（ＮＰ）　　　は、７±
２ （ＮＡＮＰ）４ｏ抗原に対し高力価で特異的な抗体応答
を誘発しうる強力な免疫原であることが明らかである。

さらに、発明者らは、モノクロナール抗（ＮＡＮＰ）４
０ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体が（ＮＰ）　　　を認識するこ
とを観察７±２ している。この事実は、（ＮＡＮＰ）、。及び前記ポリ
ペプチドの両者が連続性のエピトープを含有し、相互に
非常に類似した立体配置を有していることを意味する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　熱帯マラリア原虫のサーカムスポロゾイトタンパク
   質に対する高力価抗体応答を哺乳動物において誘発する
   新規な合成の免疫活性ポリペプチドにおいて、該ポリペ
   プチドは式（ I ）−Ｈ−（Ａｓｎ−Ｐｒｏ）ｎ−ＯＨ （式中、ＡｓｎはＬ−アスパラギンであり、ＰｒｏはＬ
   −プロリンであり、ｎは２以上である）で表されること
   を特徴とする、免疫活性ポリペプチド。 ２　請求項１記載のものにおいて、前記式（ I ）にお
   けるｎが１００以下である、免疫活性ポリペプチド。 ３　請求項１又は２記載のものにおいて、前記式（ I
   ）におけるｎが７である、免疫活性ポリペプチド。 ４　請求項１、２又は３記載の免疫活性ポリペプチドの
   製法において、（ａ）均一相での縮合により、末端アミ
   ノ基で保護された式 Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＯＨ（式中、Ｘ
   は酸レイビル保護基である）で表されるペプチド（II）
   を合成し、（ｂ）該ペプチド（II）をフェノールのハロ
   ゲン化誘導体との反応によって活性化させて、Ｐｒｏ末
   端カルボン基で、式Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒ
   ｏ−ＯＹ（式中、Ｘは前記と同意義であり、Ｙはフェノ
   ールのハロゲン化誘導体の残基である）で表される該ペ
   プチドの活性エステル（III）を生成させ、（ｃ）該ペ
   プチド（III）から酸分解によってアミノ保護基を除去
   し、得られたペプチド（IV） ＨＣｌ・Ｈ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＯＹを
   分離し、（ｄ）該ペプチド（IV）を、塩基性の有機開始
   剤の存在下、有機溶媒中、液相で重縮合させ、前記式（
   I ）で表される重縮合生成物を沈殿させることを特徴
   とする、免疫活性ポリペプチドの製法。 ５　請求項４記載の製法において、前記工程（ａ）につ
   いて、前記アミノ保護基が第３級ブチルオキシカルボニ
   ルである、免疫活性ポリペプチドの製法。 ６　請求項４記載の製法において、前記工程（ｂ）につ
   いて、前記フェノールのハロゲン化誘導体が、フッ素化
   及び塩素化誘導体の中から選ばれるものである、免疫活
   性ポリペプチドの製法。 ７　請求項６記載の製法において、前記工程（ｂ）につ
   いて、前記フェノールのハロゲン化誘導体が、ペンタク
   ロロフェノール、トリクロロフェノール又はペンタフル
   オルフェノールである、免疫活性ポリペプチドの製法。 ８　請求項４記載の製法において、前記工程（ｂ）につ
   いて、テトラペプチド／フェノール誘導体のモル比が１
   又は約１であり、該工程を不活性溶媒中、温度−１０な
   いし４０℃、液相で行う、免疫活性ポリペプチドの製法
   。 ９　請求項８記載の製法において、前記有機溶媒がジメ
   チルスルホキシドである、免疫活性ポリペプチドの製法
   。 １０　請求項４記載の製法において、前記工程（ｃ）に
   ついて、アミノ保護基をトリフルオル酢酸又は塩酸での
   酸分解によって除去する、免疫活性ポリペプチドの製法
   。 １１　請求項１０記載の製法において、前記酸分解を室
   温（２０−２５℃）で行う、免疫活性ポリペプチドの製
   法。 １２　請求項４記載の製法において、前記工程（ｄ）に
   ついて、前記塩基性の有機開始剤が第３級アルキルアミ
   ン（ここで、アルキル基は炭素数１ないし４を有する）
   から選ばれるものである、免疫活性ポリペプチドの製法
   。 １３　請求項１２記載の製法において、前記第３級アミ
   ンがトリエチルアミンである、免疫活性ポリペプチドの
   製法。 １４　請求項４記載の製法において、前記工程（ｄ）に
   ついて、反応を室温（２０−２５℃）又は室温に近い温
   度で行う、免疫活性ポリペプチドの製法。 １５　請求項４記載の製法において、工程（ｅ）に当た
   り、ゲルクロマトグラフィーによって、狭い分子量分布
   でポリペプチドを含有するフラクションを得る、免疫活
   性ポリペプチドの製法。 １６　請求項１−３記載のポリペプチドを抗マラリアワ
   クチンの調製に使用する、ポリペプチドの使用法。 １７　請求項１−３記載のポリペプチドを、ヒトの臨床
   サンプルに関する抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体
   を定量するための診断用キットの調製に使用する、ポリ
   ペプチドの使用法。