JPH0236232B2 - Horigarakutosaminbunkaikosonoseizoho - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規なポリガラクトサミン分解酵素
（ポリガラクトサミニダーゼ）を製造する方法に
関するものである。 更に詳細には、本発明は、ポリガラクトサミン
を加水分解してオリゴガラクトサミンを生成する
新規なポリガラクトサミン分解酵素を製造する方
法に関するものである。 一般に、微生物の生産するポリガラクトサミン
（ポリα―１，４ガラクトサミノガラクタン）と
しては、PF11（特公昭56―12639）及びPF102（特
願昭61―134799）が認知されている程度である。 近年、微生物、植物あるいは動物の生産する多
糖あるいはこれらのオリゴ糖が種々の生理活性を
有することが知られるようになり、多糖又はそれ
らのオリゴ糖に関心が高まつている。 また、ポリガラクトサミンの類似多糖として知
られるポリグルコサミン（キトサン）においても
キチン、キトサン及びそのオリゴ糖が抗腫瘍活性
を有する事が発見されている。さらにポリガラク
トサミン自身においても同様な生理活性の在るこ
とが見出され（石谷幸喜他 日本生化学会講演要
旨集871，1986）、そのオリゴ糖の生理活性にも関
心が高まつている。生理活性以外の分野にもポリ
ガラクトサミン、オリゴガラクトサミンが有用に
なる可能性があり、特にオリゴマーは、用途分野
や作用面でポリマーにない特性を発揮するものと
期待され、注目されている。 ポリガラクトサミンを酸又はアルカリによつて
加水分解することによりオリゴ糖を得ることは可
能であるが、オリゴマーの収率は非常に悪い。例
えば塩酸によつてポリガラクトサミンを加水分解
する時、ランダムな分解の結果、得られるオリゴ
糖の量はモノ―ガラクトサミン、ジ―ガラクトサ
ミン、トリ―ガラクトサミン、テトラ―ガラクト
サミン、ペンタ―ガラクトサミンの順であり、重
合度が大きい程その収量は激減するということに
なる。 そこで、ポリガラクトサミンを分解して、重合
度が大きく、種々の重合度のオリゴ糖を得ること
のできるポリガラクトサミン分解酵素が必要とさ
れるのである。 本発明者らは、広範な微生物についてはポリガ
ラクトサミン分解菌を検索した結果、シユードモ
ナス属に属する細菌が、新規なポリガラクトサミ
ン分解酵素を生産することを見出し本発明を完成
した。 本発明は新規なポリガラクトサミン分解酵素の
製造法に関する。 本発明における使用菌はシユードモナス属に属
し、ポリガラクトサミン分解酵素を生産する菌で
あればいかなる菌株でもよいが、本発明者らが土
壌より分離したシユードモナスsp H881が有利に
使用される。シユードモナスsp H881の菌学的性
質は下記のとうりである。 (a) 形 態 顕微鏡的観察（肉汁寒天培地30℃、16時間培
養） (1) 細胞の大きさ：0.3〜0.6×1.0〜2.0ミクロ
ンの桿菌 (2) 細胞の多形性：認められない (3) 運動性：極鞭毛を有し、運動性有り (4) 胞子の有無：形成せず。 (5) グラム染色性：陰性 (6) 抗酸性：陰性 (b) 各種培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養：30℃、24時間でうす黄
茶色のコロニー、表面円滑で光沢を有し半な
いし不透明である。色素の生成はない。 (2) 肉汁寒天斜面培養：よく生育する。 (3) 肉汁液体培養：培養液表面に厚膜状に生
育、液内には中程度に生育。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺養：表面に生育し、層状
に液化する。 (5) トリマスミルク：アルカリ性、完全に液化
する。 (c) 生理的性質 (1) 硝酸塩の還元：陰性 (2) 脱窒反応：陰性 (3) MRテスト：陽性 (4) VPテスト：陰性 (5) インドールの生成：陰性 (6) 硫化水素の生成：陰性 (7) 澱粉の加水分解：陰性 (8) クエン酸の利用：コーザー、クリステンセ
ンの両培地で利用する。 (9) 無機窒素の利用：硝酸塩、アンモニアとも
利用する。 (10) 色素の生成：KingA；陰性、KingB；弱
い青蛍光の色素を生成、Fagar；弱い青蛍光
の色素を生成、Pagar；陰性 (11) ウレアーゼ：陽性 (12) オキシダーゼ：陽性 (13) カタラーゼ：陽性 (14) 生育の範囲：生育PH５〜９、至適温度30
〜40℃ (15) 酸に対する態度：好気性 (16) Ｏ―Ｆテスト：酸化 (17) カゼインの分解陽性 (18) DNAの分解：陽性 (19) 耐塩性：２％食塩；陽性、５％食塩；陰
性 (20) 糖類から酸及びガスの生成

【表】 (d) その他の性質 (1) 窒素源欠乏培地で菌体内にポリ―β―ハイ
ドロキシブチル酸エステル（PHB）を蓄積
する。 (2) アルギニン、ベタインを唯一の炭素源とし
て生育し、アルギニンデヒドロラーゼ活性を
持たない。 (3) 脂肪酸（ツイーン80，60，20）を分解す
る。 (4) 40℃で生育する。４℃で生育不能。 上述の新規なポリガラクトサミン分解酵素生産
能を有する本菌の分類学的性質を、「バージエ
ズ・マニユアル・オブ・デターミイテイブ・バク
テリオロジー」第８版（1974年）及び「バージエ
ズ・マニユアル・オブ・システマテイツク・バク
テリオロジー」第１巻（1984年）の分類と対比す
ると、本菌はグロスフアクターを要求せず、
PHBを蓄積し、アルギニン、ベタインを唯一の
炭素源として生育し、アルギニン・デヒドロラー
ゼ陰性、脱窒反応陰性、40℃で生育可能からセク
シヨン２（あるいはRNAグループ２）のP.
cepacia，P.gladioli，P.marginateの類縁菌と思
われるがP.cepaciaとは硝酸塩の還元陽性、炭素
源の資化性ではＤ（−）―トレハロース、マルト
ース、ラクトース、マレイン酸において異なる。
P.gladioliとは、マルトース、ラクトース、マレ
イン酸、ｍ―ハイドロキシブチル酸エステルの資
化性の結果が異なる。 P.marginateとは、ｍ―ハイドロキシブチル酸
エステルの結果が異なる。また、P.cepacia，P.
marginateは、非蛍光性色素を生成するが本菌は
King Ｂ，Ｆ agar及びＬ―グルタミン酸、Ｌ―
アルギニン、Ｌ―スレオニン、Ｌ―ヒスチジンを
唯一の炭素源とした時弱い蛍光色素（青白蛍光）
は生成するが非蛍光性色素の生成は種々の培地条
件においても認められない。これらの結果から、
本菌はP.cepacia，P.gladioli，P.marginateとは
異なるspeciesである。 本菌の生理学的諸性質で特微的なことは、Ｏ−
Ｆテストにおいて単糖のみならずマルトース、シ
ユークロース、ラクトース、セルビオースなどの
二糖類からも酸を生成することである。この性質
はPseudomonas属、低温性のP.fragi，P.
taetrolens（いずれもセクシヨン５）P.lundensis
と似ているが生育温度で違いがある。 以上の結果より本菌はPseudomonasの新菌種
と認められ、本菌をシユードモナスsp H881と命
名し、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所に、微工研菌寄第8955号（PERM Ｐ―8955）
として寄託されている。 ポリガラクトサミン分解酵素生産菌の培養培地
としては、炭素源、窒素源、無機物、その他の栄
養素を程よく含有する培地ならば、合成培地ある
いは天然培地のいずれでも使用可能である。該培
養培地の好適な例としては、ポリガラクトサミン
0.25％、グルコース0.25％、酵母エキス0.05％、
ポリペプトン0.05％、PH7.0の例が挙げられる。
培養度は20〜40℃、好ましくは30〜38℃の範囲、
培養開始PHは６〜８、好ましくは７付近で35〜72
時間振盪又は深部撹拌培養すれば、培養液中にポ
リガラクトサミン分解酵素が得られる。そして、
ポリガラクトサミン分解酵素は必要に応じて単離
精製される。例えば、培養濾液をエタノール沈殿
法によつて粗酵素を分離し、これを水性媒質に溶
解し、セフアデツクスＧ―50ゲル濾過、CM―セ
フアデツクスＣ―25イオン交換クロマトグラフイ
ー、フエニル―セフアロースCL―4B疎水クロマ
トグラフイー等の処理により精製されたポリガラ
クトサミン分解酵素が得られる。 実施例１において得られたポリガラクトサミン
分解酵素の理化学的性質は下記のとうりである。 (1) 作用及び基質特異性 本酵素は重合度ｎ＝５（ペンタ―ガラクトサ
ミン）以上のオリゴ及びポリガラクトサミン
（α―１，４ポリガラクトサミン）に作用して
オリゴガラクトサミンを生成する。 その他の多糖類、澱粉（α―１，４グルカ
ン）、グリコーゲン（α―１，４グルカン）、プ
ルラン（α―１，４グルカン）、デキストラン
（α―１，６グルカン）、ラミナラン（β―１，
３グルカン）、カルボキシルセルロース（β―
１，４―グルカン）、キトサン（β―１，４グ
ルコサミノグルカン）、エチレングリコールキ
チン（β―１，4N―アセチルグルコサミノグ
ルカン）、Pseudomonas solanacearumのポリ
Ｎ―アセチルガラクトサミノガラクタン（ポリ
β―１，3N―アセチルガラクトサミノガラク
タン）（Y.Akiyama.，et.al.，Agric.Biol.
Chem.，50(3)747，1986）などには全く作用し
ない。 また、重合度ｎ＝４（テトラ＝ガラクトサミ
ン）以下のα―１，４ガラクトサミノオリゴ糖
にも作用しない。 (2) 至適PH及び安定PH範囲 クエン酸リン酸緩衝液を用いた場合、至適PH
は4.5〜7.0である。（第１図）また、安定PH範
囲は第２図に示すごとくPH4.5〜8.0である。こ
の測定は37℃で１時間放置した酵素の残存活性
を相対値で示した。 (3) 酵素活性の測定法 酵素活性は基質にPaecilomyces Ｉ―１菌の
生産するPF101又はPF102（その主構成糖はα
―１，４ガラクトサミノガラクタン）を用い
た。この0.5％／0.1モル酢酸緩衝液PH6.0溶液
0.5mlに酵素溶液0.5mlを加え、37℃、10分間反
応させ、生じる還元力をSomogyi―Nelson法
で測定した。なお酵素単位は１分間当りに1μ
モルのガラクトサミンに相当する還元力を増加
させる活性を１単位とした。 (4) 作用適温及び温度安定性の範囲 20〜70℃の範囲で測定した結果を第３図に示
した。この酵素の至適温度は55℃であり、それ
以上で急激に低下する。 つぎに温度安定性についてみたものが第４図
である。PH6.0の条件で各温度で０〜80分間保
つた時の残存活性を示した。50℃、１時間で70
％の活性が残存している。 (5) 金属イオン等の影響 各種金属イオン及び阻害剤1mM（PCMBのみ
0.1mM）を含む溶液中に37℃、１時間放置後、
残存酵素活性を測定し、相対値で示した。（表
―１）

【表】 以上の結果から、このポリガラクトサミン分
解酵素はスズ、鉄、銅、無機水銀及びSDSによ
り阻害される。 (6) 酵素の精製法 本酵素の単離、精製は常法に従つて行うこと
ができる。エタノールによる沈殿物をセフアデ
ツクスＧ―50カラムクロマトグラフイー（第５
図）、CM―セフアデツクスＣ―25カラムクロ
マトグラフイー（第６図）、フエニル―セフア
ロース4Bカラムクロマトグラフイー（第７図）
などの精製手段又はこれらの組合せにより精製
される。 (7) 分子量 本酵素の分子量はポリアクリルアミドゲルス
ラブ電気泳動法により測定すると、31000と計
算される。結果は第８図に示した。 (8) ポリアクリルアミドゲル電気泳動 精製酵素を常法に従つて、7.5％のポリアク
リルアミドゲル（PH8.6）電気泳動にかけた。
結果は第９図に示すとうり単一のバンドが認め
られた。 (9) 等電点 常法によりシユークロース密度勾配の等電点
電気泳動を行つた。結果は第１０図に示すよう
にこの酵素の等電点はpI＝6.7である。 本酵素は、その作用及び基質特異性において従
来全く知られていない新規酵素である。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ シユードモナスsp H881、FERM―8955を500
ml三角フラスコ中で、グルコース0.5％、酵母エ
キス0.05％、ポリペプトン0.05％の組成を有する
種培地100mlに植菌し、30℃で20時間培養する。 得られた種培養液を30のジヤーフアーメンタ
ー中で、ポリガラクトサミン（PF102）0.25％、
グルコース0.25％、酵母エキス0.05％、ポリペプ
トン0.05％の酵素生産培地18に植菌し、30℃で
48時間通気（18／分）撹拌（200rpm）培養す
る。 得られた培養液を遠心分離（14000rpm）して、
菌体を除き、得られた培養濾液（酵素活性
0.035U／ml、総活性63U／18）に冷却したエタ
ノールを60％濃度まで加えて、タンパク質を沈殿
させ、この沈殿タンパク質を遠心して、溶液から
分離する。得られたタンパク質を0.1モル酢酸緩
衝液（PH5.0）で平衡化したCM―セフアデツクス
Ｃ―25カラム（2.5×60cm）に吸着させ、０〜0.5
モル食塩の濃度勾配を有する同緩衝液を用いて溶
出させる。 溶出した酵素活性区分を集め、限外濾過装置
（分子量１万保持）を使つて濃縮する。次に、２
モル食塩を含む0.1モル酢酸緩衝液（PH6.0）溶液
とし、同緩衝液で平衡化したセフアデツクスＧ―
50カラム（５×90cm）クロマトグラフイーにかけ
る。次いで、活性区分の食塩濃度を４モルにまで
高め、同様な溶液で平衡化したフエニル―セフア
ロースCL―4Bカラム（2.5×20cm）に吸着させ、
食塩の逆濃度勾配を持つ0.1モル酢酸緩衝液で溶
出して精製ポリガラクトサミン分解酵素50mg（収
率23.1％、比活性52μg galN／min／mg
protein）を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素についての至適PHを、第２図は
安定PHを、第３図には作用適温を、第４図は温度
安定性を、第５図にはセフアデツクスＧ―50のゲ
ル濾過パターンを、第６図はCM―セフアデツク
スＣ―25のパターンを、第７図にはフエニル―セ
フアロースCL―4Bのカラムクロマトのパターン
を、第８図はポリアクリルアミドゲルスラブ電気
泳動の結果を、第９図はポリアクリルアミドゲル
デスク電気泳動の結果を、さらに第１０図には等
電点電気泳動の結果を、それぞれ示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ シユードモナス属に属するポリガラクトサミ
   ン分解酵素生産菌を培養し、培養物よりポリガラ
   クトサミン分解酵素を採取することを特徴とす
   る、ポリガラクトサミン分解酵素の製造法。