JPH01228465A - 新規なβ−アガラーゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、微生物由来の新規なβ−アガラーゼ及びその
製造法に関する。さらに詳しくは、シュードモナス（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する細菌を培養して得ら
れる新規なβ−アガラーゼ及びその製造法に関する。

〔従来の技術〕

アガロースは、テングサ、オゴノリなどのン毎藻（紅藻
）から得られる多ｖＭ類で、古くから食品用に供されて
きている寒天の主成分である。その構造は第１図に示し
たように、Ｄ−ガラクトースと３．６−アンヒドロ−し
−ガラクトースが交互にβ−１，４結合、α−１，３結
合した多糖である。

また、寒天にはアガロースに硫酸やピルビン酸が部分的
にエステル結合したアガロペクチンも含まれている。

アガロースを部分加水分解すると、オリゴ糖が得られる
が、加水分解方法によって異なったオリゴ糖が生成する
ことが知られている。今までの知見をまとめると、アガ
ロースの加水分解様式は第１図のようになる。すなわち
、希酸で弱く加水分解すると、α−１，３結合が比較的
選択的に分解されアガロビオース（酸（１）、酸（２）
、酸（３）の各位置で加水分解された２Ｉりをはじめと
するアガロオリゴ糖が得られる（Ｃ，Ａｒａｋｉ、　Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　４ｔｈＩｎｔ、　Ｃｏｎ
ｇｒｅｓｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１＋　
１５〜３０　（１９５９）Ｐｅｒｇａａ＋ｏｎ　Ｐｒｅ
ｓｓ　Ｌｔｄ、）。

また別にα−１，３結合を分解して、アガロテトラオー
ス（α−アガラーゼ（１）、　（２）を分解）を主とし
て生成するα−アガラーゼも知られている（Ｋ、Ｓ、　
Ｙｏｕｎｇ　ら、　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　６６２０７〜２１２　　（１９７８））　
。

一方、β−１，４結合は酵素β−アガラーゼによっての
み選択的に分解されて主としてネオアガロテトラオース
（β−アガラーゼ（１）と（２））、ネオアガロヘキサ
オース（β−アガラーゼ（１）と（３））を生ずる（Ｌ
、　Ｍ、　Ｍｏｒｒｉｃｅ　ら、　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　
Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３
７．１４９−１５４　（１９８３）など）。

一般にβ−アガラーゼはネオアガロテトラオース以下の
オリゴ糖は加水分解できず、これらのオリゴ糖は別の酵
素で分解されることが知られている（ｔｌ、Ｊ、　ｖａ
ｎ　ｄｅｒ　Ｍｅｕｌｅｎら、Ａｎｔｏｎｉｅ　ｖａｎ
　Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ婬、８１〜９４　（１９７６
）など）。

寒天の主要な用途は食品用であり、ゲル化剤。

増粘剤として幅広く使われ、他にはゲル形成能を利用し
た試薬、培地原料、クロマトグラフ用担体。

電気泳動用担体、さらには歯科印象剤、芳香・消臭剤な
どの用途がある。一方、酵素分解などによって得られる
オリゴ糖類の用途は未開発であったが、最近澱粉老化防
止作用、静菌作用、難消化性が明らかになり、（特開昭
６２−２１０９５５゜同６２−２１０９６５．同６２−
２１０９７４）、新たな用途開発が期待されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

寒天のオリゴ糖を効率良く製造するためには、酵素によ
る部分加水分解法は酸による方法よりもオリゴ糖の収率
、脱色脱塩などの精製の容易性。

作業性、製造装置の簡易性等の点で明らかに優れている
。しかし、今までに知られている寒天分解酵素アガラー
ゼはその殆んどが、海水、海藻、海辺の土壌など海由来
の微生物から調製されたものである。一般に海洋性微生
物から得られる酵素の耐熱性は低いことが知られており
、アガラーゼもまたその至適温度が高いもので４０〜４
５°Ｃで、多（は４０°Ｃ以下である。一方、寒天は高
温（８０゛Ｃ以上）で水に溶解するが、寒天溶液の温度
を降下させると５０〜４０°Ｃでゲル化してしまい、酵
素による分解を非常に受けにくくなる。寒天をゲル化さ
せないためには基質である寒天の濃度を１％以下にしな
ければならず、オリゴ糖の生産性を著しく低めてしまう
という課題がある。従って、これらの課題を解決するた
めに耐熱性の酵素が必要となってきている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは上記の課題を解決するための、耐熱性の向
上したアガラーゼを取得すべく鋭意検討を重ねた結果、
シュードモナス属に属する微生物によって産生される新
規なβ−アガラーゼが従来より優れた耐熱性を有するこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、このように微生物由来の優れた耐熱
性を存する新規なβ−アガラーゼを供給することにより
寒天オリゴ糖の製造を工業的に容易に実施可能とするも
のである。

本発明は第１に以下に示す理化学的性質を有する新規な
β−アガラーゼに関する。

０作用 アガロースのβ−１，４結合を加水分解して２、速にア
ガロース溶液の粘度を低下させ、主としてネオアガロテ
トラオースとネオアガロヘキサオースを生成する。

■基質特異性 β−１，４力ラクトシド結合を有するアガロース。

アガロペクチン、寒天などのガラククン系の多糖類なら
びにネオアガロオクタオース以上の少糖類に作用する。

ネオアガロへキサオース、ネオアガロテトラオース、ネ
オアガロビオースには作用しにくく、乳糖には作用しな
い。

■至適ρ■及びｐＨ安定性 寒天を基質としたとき至適ｐｎは７．０であり、４５°
Ｃ９３０分、基質非存在の条件下ではｐ）１５〜９で安
定である。

■至適温度及び熱安定性 寒天を基質としたとき至適温度は５０°Ｃであり、ｐ１
１６．０．３０分、基質非存在の条件下では４５°Ｃで
は安定、５０’Ｃで約７５％、５５゛ｃで約３５％の活
性が残存している。

■失活の条件 ｐＨ６，０，６５’Ｃ，３０分以上又はｐＨ６，０゜１
００°Ｃ１１０分でほぼ完全に失活する。

■分子量 ３６０．０００　（ゲル濾過クロマト法）■等電点 ４．９（等電点電気泳動法） ■金属塩の影響 ｐＨ６、ｏ、４５°Ｃ，１ｍＭの金属塩濃度下、３時間
の処理でＦｅ−”、Ｈｇ”“、Ａｇ”、Ａ／２”“が１
０％以下、Ｃｕ”、Ｚｎ’＋が約５０〜８０％の残存活
性を示し、Ｎａ”、に’、Ｍｇ”、Ｃｏ”。

Ｍｎ″”、ｐｂ”では安定である。また、Ｃａ　”によ
って活性化され、ＥＤＴＡ（５ｍＭ）で残存活性が１０
％以下となる。

本発明のβ−アガラーゼの至適ｐＨ（基質；０．５％、
０．５ｄ、温度：４５°Ｃ１反応時間１０分）を第２図
に、ｐ）１安定性（４５°Ｃ１３０分静置、４５’Ｃ，
ｐＨ６，１０分にて活性測定）を第３図に、至適温度（
基質＝０．５％、０．５緘、ｐＨ６、ＩＪン酸緩衝液、
反応時間１０分）を第４図に、熱安定性（ｐ）１６．３
０分静置、４５°Ｃ，ｐＨ６，１０分にて活性測定）を
第５図にそれぞれ示す。

本発明のβ−アガラーゼは分子量、至適温度。

耐熱性が高いことにおいて従来のアガラーゼとは全く異
なるが、その他の性質、たとえば等電点。

至適ｐｌ＋、基質特異性については近似するアガラーゼ
がある。

第２に本発明は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ　）属に属し、上記の性質を有する新規なβ−アガ
ラーゼの産生する微生物を培養し、培養液中に該酵素を
蓄積させて分離、採取することを特徴とするβ−アガラ
ーゼの製造法に関する。　本発明の新規なβ−アガラー
ゼは微生物を用いて生産されるが、その生産菌としては
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）属に属し
、上記性質を有する酵素を生産する能力を有する微生物
であればよく、例えば本発明者らによって新たに土壌か
ら分離されたシュードモナス・エスピー　Ｎ　−７（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、　Ｎ−７）が挙げられる
。本菌株は微工研菌寄第９８８４号として微生物工業技
術研究所に寄託されており、その菌学的性質は以下の通
りである。

（１）　　形態 ■細胞の形および大きさ 桿菌　　　０．２〜０．４　μｍＸ１．０〜２．０　ｐ
ｍ■多形性　　　　　なし ■運動性　　　　あり ■鞭毛　　　　　　極鞭毛１本を有する■胞子形成　　
　　なし ■ダラム染色　　　陰性 ■抗酸性　　　　　なし く２）各培地における生育状態 ■肉汁寒天平板培地 生育は微弱である。

■肉汁液体培養（人工海水使用） 普通の生育、着脱色なし、表面生育なし、沈渣を生じる
。

■マリンアガー平板培地（デイフコ社）生育は良好、形
状は円形であるが、寒天を穿孔し孔の表面に付着して生
育する。コロニー周辺の寒天の濁りは透明となる。色調
は黄白色。

（３）生理学的性質 ■硝酸塩の還元　　　：陽性 ■インドールの生成　：陰性 ■硫化水素の生成　　：陰性 ■デンプンの加水分解：陽性 ■無機窒素源の利用：硝酸塩、アンモニウム塩を窒素源
として利用する。

■色素生成：黄白色の非水溶性色素を生成する。

■オキシダーゼ：陰性 ■カタラーゼ　：陽性 ■生育の範囲　：温度１０〜４５°Ｃで生育し、２８〜
３７゛Ｃが至適である。

生育のｐＨは中性付近が適して いる。

［相］酸素に対する態度二好気的にのみ生育する。

■０−Ｆテスト：０型 ■糖からの酸の生成 Ｉ！　類　　　　　　　　　酸生成 Ｌ−アラビノース　　　　　　　＋ Ｄ−キシロース　　　　　　　　　＋ Ｄ−グルコース　　　　　　　　　＋ Ｄ−マンノース　　　　　　　　　＋ Ｄ−フラクトース　　　　　　　− Ｄ−ガラクトース　　　　　　　士 麦芽糖　　　　　　　　　　　　モ ショ糖　　　　　　　　　　　　　　　−乳糖　　　　
　　十 トレハロース　　　　　　　　　　＋ Ｄ−ソルビトール　　　　　　　− Ｄ−マンニトール　　　　　　　− イノシトール　　　　　　　　　− グリセリン　　　　　　　　　− デンプン　　　　　　　　　　　　＋ アドニトール　　　　　　　　　− ネオアガロテトラロース　　　　士 ネオアガロヘキサオース　　　　＋ アガロース　　　　　　　　　　士 寒天　　　　　　＋ （４）その他の諸性質 ■ＤＮアーゼの生産　　：陰性 ■ゼラチン分解テスト　：陰性 ■アルギニン分解テスト：陰性 ■エスクリンの分解性　：陽性 ■好塩性試験　：好塩性（人工海水と水道水を用いた同
一培地で比較） 以上の菌学的性質を有する本菌株について、パージエイ
ズ・マニュアル・オプ・システマティソク・バタテリオ
ロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｒ　Ｓｙ
ｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）　（１９
８６年）、海洋微生物研究法（学会出版センター、　１
９８５年）に基づき検索した結果、シュードモナス（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する菌株と同定した。ま
た、本菌株を詳細に比較すると、本菌株はシュードモナ
ス属に属する新菌株の可能性が大と認め、シュードモナ
ス・エスピー　Ｎ−７（Ｐｓｅｕｄｏ＋ｗｏｎａｓ　ｓ
ｐ、　Ｎ−７）　　と命名した。

本発明に用いる微生物としては、本菌株とその変種、変
異株に限定されるものでなく、新規なβ−アガラーゼ生
産能を有するものであれば良い。

本発明の新規なβ−アガラーゼの生産菌は、公知の常法
によって培養することができる。使用する培地としては
炭素源、窒素源、無機化合物及びその他の栄養素を適当
量含有する培地ならば、合成培地または天然培地のいず
れも使用可能であり、液体または固体の培地を用いて培
養することができる。具体的には炭素源としては、アガ
ラーゼが誘導酵素であるので、寒天、アガロース、アガ
ロペクチン、寒天の部分加水分解物、さらには寒天の原
料であるテングサ、オゴノリなどの紅藻類を単独あるい
は併用して用いることが出来る。なお、グルコースなど
他の炭素源を併用することも可能である。

また、窒素源としては肉エキス、ペプトン、酵母エキス
、乾燥酵母、大豆粉、カゼイン、カザミノ酸、各種アミ
ノ酸、コーンステイープリカー。

フィツシュミール、尿素など動物、植物、微生物由来の
蛋白質、その加水分解物のような有機窒素源や各種無機
アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物を使用微
生物の資化性を考慮して１種または２種以上を適宜選択
して用いる。

無機塩としてナトリウム、マグネシウム、カルシウム、
鉄、亜鉛、マンガン、銅などのリン酸塩。

塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩、酢酸塩などの１種または２種
以上を適宜添加するか、好塩性の菌を使用する場合には
、人工海水を使用するか食塩濃度を海水濃度程度までの
適当な範囲で設定して用いることができる。また、必要
に応じて植物油、３面活性剤などの消泡剤を添加しても
良い。

培養は、前記培地成分を含む液体培地中で振とう培養２
通気撹拌培養、連続培養など通常の培養法を用いて実施
できる。培養条件は培地の種類。

培養法により適宜選択すれば良く、アガラーゼ生産菌が
増殖しβ−アガラーゼを産生できる条件であれば特段の
制限はない。通常、培養初発ｐＨ６，５〜８．５．２５
〜３７°Ｃで通気攪拌して培養するのが好ましい。培養
日数は通常１〜２日が適当である。

以上のようにして培養中に産生されたβ−アガラーゼは
次のような方法で分離、回収できる。木β−アガラーゼ
は主に菌体外に蓄積されるので、培養終了後、菌体を濾
過、遠心分離等の方法で除去して培養濾液を得る。菌体
酵素については通常用いられる手段により菌体を破砕し
てβ−アガラーゼを抽出し、用いることができる。

得られた酵素を含む液をそのまま真空−ａｗＩ又は限外
濾過膜を用いて濃縮して液状酵素として、あるいは凍結
乾燥法、噴霧乾燥法により粉末化して用いることができ
る。別な方法としては通常用いられる精製方法、例えば
硫安塩析、溶媒沈澱法によりβ−アガラーゼを沈澱させ
精製する方法、あるいはイオン交換クロマト９ゲル濾過
クロマトさらにはアガロースアフィニティ吸着法、クロ
マトフオーカシング、等電点電気泳動などの精製方法を
１種あるいは２種以上組合わせて高純度に精製する方法
を用いることもできる。

本発明でのβ−アガラーゼの活性測定法は以下の通りで
ある。ｐＨ６，０，０，１Ｍ酢酸緩衝液に希釈溶解した
酵素０．５　ｄを４５°Ｃに保温しておき、これに０．
５％寒天溶液（４５°Ｃに予熱）０．５ｍｅを添加して
反応を開始させる。反応は４５°Ｃで１゛０分間行ない
、反応停止はソモギー液を添加することで行ない、ソモ
ギー・ふルソン法で還元糖を定量する。活性は１μｍｏ
ｌｅのガラクトースに相当する還元力を生成する酵素量
を１単位として表示する。

［実施例］ 次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ シュードモナス・エスピー　Ｎ　　７　（Ｐｓｅｕｄｏ
−ｍｏｎａｓ　ｓｐ、　Ｎ−７）（微工研菌寄第９８８
４号）を天草裁断物１．５％、ポリペプトン０．５％、
酵母エキス０．５％を人工海水に懸濁熔解し、ｐＨ６，
５に調整し殺菌した培地４０ｄ（２００ｄ三角フラスコ
）に１白金耳植菌し、２５“Ｃで４５時間振とう培養し
た。培養終了後、菌体と天草残渣を遠心分離で除去し、
酵素活性を測定したところ、β−アガラーゼが　０．１
９単位／戚生産されていた。

実施例２ シュードモナス・エスピー　Ｎ−７（微工研菌寄第９８
８４号）を粉末寒天０．７％、グルコース０．１％、硝
酸ナトリウム０．５％、酵母エキス０．５％。

硫酸マグネシウム０．２％、塩化カルシウム０．２％。

塩化ナトリウム２．０％を含むｐＨ８，５の培地４０１
１１！（２００ｍｆ三角フラスコ）に１白金耳植菌し、
３７℃で１口振とうして前培養した後、この前培養液を
同じ培地１．５Ｉ！、を含む３１ジャーファーメンタ−
に植菌した。３７°Ｃで２４時間、通気量１、５　ｌ／
ｍｉｎ攪拌速度４００　ｒｐｍの条件で培養した。

培養終了後、菌体を遠心分離で除去して培養濾液１．４
ｊ２を得た。培養濾液中のアガラーゼ活性は１．０単位
／ｄであった。この培養濾液を分画分子量１万の限外濾
過膜で約２０倍に濃縮したところ、２１．３単位／戚の
酵素液６０ｄを得た。

実施例３ シュードモナス・エスピー　Ｎ−７（微工研菌寄第９８
８４号）をアガロース０．５％、硝酸ナトリウム０．５
％、酵母エキス０．５％を人工海水に溶解したｐ）１７
．５の培地で前培養した。前培養液を同組成の培地１５
Ｉ！、を入れた３０２ジャーファーメンタ−に植菌し、
３０℃で３０時間培養した。

培養中、通気量は１５　ｉ！、／ｍｉｎとし、２００ｒ
ｐｍの撹拌を行なった。

培養終了後、菌体を濾過により除き培養濾液を得た。培
養濾液中のアガラーゼ活性は１．１単位１　ｍｌであっ
た。培養濾液をＣＬ−セファロース６Ｂ（ファルマシア
社）５０ｍｊ！のカラムに５００　ｍｌ／ｈｒの流速で
通液しアフィニティー吸着させ、水洗浄後、２％ネオア
ガロオリゴｔＪＨ容液液５００ｄ７容出しアガラーゼを
溶出した。その後、常法として用いられているＤＥＡＥ
　ｌ−ヨバール（東ソー社）。

トヨバールＨＷ５５　Ｓ、　　クロマトフオーカシング
で精製してほぼ純品に近い精製酵素を得た（２２単位／
ｍｇ蛋白質）。なお、活性収率は約１５％であった。

〔発明の効果］ 本発明によれば、シュードモナス属に属する綴植を培養
することにより新規なβ−アガラーゼが得られる。この
酵素は優れた耐熱性を有しているため、寒天オリゴ糖の
工業的製造に利用することができる。寒天オリゴ垢は澱
粉老化防止作用、静菌作用、難消化性などの性質を有し
ており、様々な分野での利用が期待される。

【図面の簡単な説明】

第１図はアガロースの構造と加水分解様式を示すもので
ある。 第２図は本発明のβ−アガラーゼの至適ｐｌ＋を示すも
のである。 第３図は本発明のβ−アガラーゼのｐＨ安定性を示すも
のである。 第４図は本発明のβ−アガラーゼの至適温度を示すもの
である。 第５図は本発明のβ−アガラーゼの熱安定性を示すもの
である。 特許出願人　食品産業バイオリアクターシステム第２図 ｐＨ 第３ｒ！１Ｊ ４）ｅ＋／ａ　　　　　９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記の理化学的性質を有する新規なβ−アガラー
   ゼ。 ［１］作用 アガロースのβ−１，４結合を加水分解して急速にアガ
   ロース溶液の粘度を低下させ、主としてネオアガロテト
   ラオースとネオアガロヘキサオースを生成する。 ［２］基質特異性 β−１，４ガラクトシド結合を有するアガロース、アガ
   ロペクチン、寒天などのガラクタン系の多糖類ならびに
   ネオアガロオクタオース以上の少糖類に作用する。ネオ
   アガロヘキサオース、ネオアガロテトラオース、ネオア
   ガロビオースには作用しにくく、乳糖には作用しない。 ［３］至適ｐＨ及びｐＨ安定性 寒天を基質としたとき至適ｐＨは７．０であり、４５℃
   、３０分、基質非存在の条件下ではｐＨ５〜９で安定で
   ある。 ［４］至適温度及び熱安定性 寒天を基質としたとき至適温度は５０℃であり、ｐＨ６
   ．０、３０分、基質非存在の条件下では４５℃では安定
   、５０℃で約７５％、５５℃で約３５％の活性が残存し
   ている。 ［５］失活の条件 ｐＨ６．０、６５℃、３０分以上又はｐＨ６．０、１０
   ０℃、１０分でほぼ完全に失活する。 ［６］分子量 ３６０，０００（ゲル濾過クロマト法） ［７］等電点 ４．９（等電点電気泳動法） ［８］金属塩の影響 ｐＨ６．０、４５゜Ｃ、１ｍＭの金属塩濃度下、３時間
   の処理でＦｅ＾＋＾＋＾＋、Ｈｇ＾＋＾＋、Ａｇ＾＋、
   Ａｌ＾＋＾＋＾＋が１０％以下、Ｃｕ＾＋＾＋、Ｚｎ＾
   ＋＾＋が約５０〜８０％の残存活性を示し、Ｎａ＾＋、
   Ｋ＾＋、Ｍｇ＾＋＾＋、Ｃｏ＾＋＾＋、Ｍｎ＾＋＾＋、
   Ｐｂ＾＋＾＋では安定である。また、Ｃａ＾＋＾＋によ
   って活性化され、ＥＤＴＡ（５ｍＭ）で残存活性が１０
   ％以下となる。 （２）シュードモナス￥（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）￥
   属に属する請求項１記載の理化学的性質を有する新規な
   β−アガラーゼ生産菌を培養し、培養物から該β−アガ
   ラーゼを採取することを特徴とする新規なβ−アガラー
   ゼの製造法。 （３）シュードモナス￥（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）￥
   属に属する新規なβ−アガラーゼ生産菌がシュードモナ
   ス・エスピーＮ−７（￥Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ￥ｓｐ
   ．Ｎ−７）（微工研菌寄第９８８４号）である請求項２
   記載の製造法。