JPH0236353A - 免疫測定方法 - Google Patents
免疫測定方法Info
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- JPH0236353A JPH0236353A JP18466988A JP18466988A JPH0236353A JP H0236353 A JPH0236353 A JP H0236353A JP 18466988 A JP18466988 A JP 18466988A JP 18466988 A JP18466988 A JP 18466988A JP H0236353 A JPH0236353 A JP H0236353A
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- Japan
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- casein
- immunoassay
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（イ）産業上の利用分野
本発明は、抗原−抗体反応を利用して免疫学的に物質の
量を測定するに際し、被検液中の測定目的物質′以外の
成分による血清干渉〈以下血清干渉と記す）を排除し、
被検液中の測定目的物質を正確に測定する新規な免疫測
定方法に関するものである。
量を測定するに際し、被検液中の測定目的物質′以外の
成分による血清干渉〈以下血清干渉と記す）を排除し、
被検液中の測定目的物質を正確に測定する新規な免疫測
定方法に関するものである。
（０１従来の技術
抗原と抗体の特異的な反応を利用した免疫測定方法は、
特異性が高く又測定感度が非常に高いことから広く用い
られている方法であり、１９７５年モノクローナル抗体
の発見とともに、ますます発展が期待される。この免疫
測定方法の検出手段が放射性物質であるラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ）（Ｙａｌｏｗら、 Ｎａｔｕｒｅ、
１８４． Ｐ１６４８〜１６４９． １９５９）は、
その特異的選択性と共に、特に高感度の測定が可能とな
ることから、血清、尿１組織液等の生体試料中の微口物
質の測定に利用されてきた。
特異性が高く又測定感度が非常に高いことから広く用い
られている方法であり、１９７５年モノクローナル抗体
の発見とともに、ますます発展が期待される。この免疫
測定方法の検出手段が放射性物質であるラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ）（Ｙａｌｏｗら、 Ｎａｔｕｒｅ、
１８４． Ｐ１６４８〜１６４９． １９５９）は、
その特異的選択性と共に、特に高感度の測定が可能とな
ることから、血清、尿１組織液等の生体試料中の微口物
質の測定に利用されてきた。
その後、酵素を検出手段として用いる酵素免疫測定法（
１＋ｕ＋ｕｎｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８： ８７１
〜８７４゜１９７１ ）や、螢光物質を用いる方法が開
発され、特にＥＩＡは、■放割性物質に比べ酵素が長期
保存時の安定性、経済性に優れていること、■測定方法
が簡便且つ汎用性を有し、且つＲＩＡと同等の測定感度
であること等の利点を有しているため、近年急速に普及
している。
１＋ｕ＋ｕｎｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８： ８７１
〜８７４゜１９７１ ）や、螢光物質を用いる方法が開
発され、特にＥＩＡは、■放割性物質に比べ酵素が長期
保存時の安定性、経済性に優れていること、■測定方法
が簡便且つ汎用性を有し、且つＲＩＡと同等の測定感度
であること等の利点を有しているため、近年急速に普及
している。
ＥＩＡのなかでも競合法、サンドイツチ法（酵素免疫測
定法、第２版 医学書院１９８２Ｐ３０〜４９）。
定法、第２版 医学書院１９８２Ｐ３０〜４９）。
同時サンドインチ法等が広く用いられ、いずれも、既知
濃度の標準物質を用いて得られる標準曲線に基いて被検
液中に含まれる測定対象物質（抗原）の団が測定されて
いる。
濃度の標準物質を用いて得られる標準曲線に基いて被検
液中に含まれる測定対象物質（抗原）の団が測定されて
いる。
さて、これらの免疫測定法を構成する場合、標準物質と
しては体液等から抽出や分離操作によって精製したもの
を使用する場合が多いのに対し、方被検液としては血清
や血漿等がよく用いられる。被検液中には測定対象物質
以外の成分が含まれており、その物質が測定時の免疫反
応に影響し、いわゆる血清干渉と呼ばれる現象を起こす
。そのため標準物質と被検液との間に免疫反応に差異を
生じて、正確な測定値が得られないことが多い。
しては体液等から抽出や分離操作によって精製したもの
を使用する場合が多いのに対し、方被検液としては血清
や血漿等がよく用いられる。被検液中には測定対象物質
以外の成分が含まれており、その物質が測定時の免疫反
応に影響し、いわゆる血清干渉と呼ばれる現象を起こす
。そのため標準物質と被検液との間に免疫反応に差異を
生じて、正確な測定値が得られないことが多い。
したがって、この血清干渉を極力低く抑えることが正確
な免疫測定法を完成するための重要な技術的ポイントで
ある。それゆえに、従来から種々の試みが行われている
。
な免疫測定法を完成するための重要な技術的ポイントで
ある。それゆえに、従来から種々の試みが行われている
。
その手段として最も広く行われているのは、■測定用緩
衝液に血清干渉を抑制する添加剤を加えることである。
衝液に血清干渉を抑制する添加剤を加えることである。
例えば、特開昭５６−４２１４２号公報はゼラチン分解
物又はゼラチン分解物と塩類を共存させて添加する方法
、特開昭６０−５３８４６号公報は、ｏ、ｏｏｉ〜０．
１％の非イオン性または陰イオン性界面活性剤を添加す
る方法、また特開昭５５−１５２４５８号公報は、疎水
性蛋白と塩類を添加する方法について各々記載している
。そのほか、免疫反応時に用いる緩衝液の塩濃度を高め
てヒト成長ホルモンの測定系における血清干渉を抑制し
た例が知られている（ Ｎ ａｓｈｉｄａ Ｓ 、ら
、 Ｃｌ１ｎ −Ｃｈｉｉ −Ａｃｔａ 、 １９
８３ Ｄｅｃ、３０． １３５＜ ３） 、
Ｐ ２６３−７３）。
物又はゼラチン分解物と塩類を共存させて添加する方法
、特開昭６０−５３８４６号公報は、ｏ、ｏｏｉ〜０．
１％の非イオン性または陰イオン性界面活性剤を添加す
る方法、また特開昭５５−１５２４５８号公報は、疎水
性蛋白と塩類を添加する方法について各々記載している
。そのほか、免疫反応時に用いる緩衝液の塩濃度を高め
てヒト成長ホルモンの測定系における血清干渉を抑制し
た例が知られている（ Ｎ ａｓｈｉｄａ Ｓ 、ら
、 Ｃｌ１ｎ −Ｃｈｉｉ −Ａｃｔａ 、 １９
８３ Ｄｅｃ、３０． １３５＜ ３） 、
Ｐ ２６３−７３）。
その他の手段としては、■被検液の希釈倍率を高くして
測定系に添加する被検液の量を少なくすることにより血
清干渉を抑える方法等が行われている。
測定系に添加する被検液の量を少なくすることにより血
清干渉を抑える方法等が行われている。
（ハ） 発明が解決しようとする課題
しかしながら、今まで述べてきた従来の方法も経験的な
ものが多く、しかも、いずれも特定の測定系に限られる
もので広い範囲の血清干渉を排除できないという問題点
があった。
ものが多く、しかも、いずれも特定の測定系に限られる
もので広い範囲の血清干渉を排除できないという問題点
があった。
ざらに■の方法においては、添加する物質の購入ロット
間に品質の違いがあって血清干渉抑制効果にバラツキを
生じることが多かった。特に動物血清を用いる場合大き
なバラツキがみられ、再現性よく血清干渉を抑制できな
いという問題があった。
間に品質の違いがあって血清干渉抑制効果にバラツキを
生じることが多かった。特に動物血清を用いる場合大き
なバラツキがみられ、再現性よく血清干渉を抑制できな
いという問題があった。
又、緩衝液の塩濃度を変える場合は濃度を上げて抑制効
果をもたせる場合が多いのであるが、塩濃度を上げると
特異的な反応も同時に抑制してしまうので測定感度が低
下するという問題があり好ましい方法ではなかった。
果をもたせる場合が多いのであるが、塩濃度を上げると
特異的な反応も同時に抑制してしまうので測定感度が低
下するという問題があり好ましい方法ではなかった。
次に、■の被検液の希釈倍率を高くして測定系に添加す
る方法は、希釈によって測定感度が低下するので、被検
液中の測定対象物が微潰の場合には用いることができな
い等の問題点があった。
る方法は、希釈によって測定感度が低下するので、被検
液中の測定対象物が微潰の場合には用いることができな
い等の問題点があった。
に） 課題を解決するための手段
そこで本発明者らは、かかる状況に鑑みて血清干渉を抑
える物質や手法を詳細に検討し鋭意研究した結果、免疫
反応溶液に、分子量約１０００〜２６０００のカゼイン
分解物を免疫反応溶液における最終濃度が所定の範囲と
なるように添加することにより血清干渉を抑制すること
ができ、標準物質と被検液との免疫反応の差異をなくし
て正確な測定値が得られ、高感度の免疫測定ができるこ
とを見出し本発明に到達した。
える物質や手法を詳細に検討し鋭意研究した結果、免疫
反応溶液に、分子量約１０００〜２６０００のカゼイン
分解物を免疫反応溶液における最終濃度が所定の範囲と
なるように添加することにより血清干渉を抑制すること
ができ、標準物質と被検液との免疫反応の差異をなくし
て正確な測定値が得られ、高感度の免疫測定ができるこ
とを見出し本発明に到達した。
すなわち本発明は、抗原−抗体反応を利用した免疫測定
を行うに際し、免疫反応溶液に分子量約１０００〜２６
０００のカゼイン分解物を含有せしめることを特徴とす
る免疫測定方法、更に詳しくは溶液中における抗原−抗
体反応を利用した免疫測定を行うに際し、免疫反応溶液
に分子量約１０００〜２６０００のカゼイン分解物を含
有せしめ、該カゼイン分解物の免疫反応溶液中における
最終濃度を０．０５〜２．５重量％に調整することを特
徴とする免疫測定方法である。
を行うに際し、免疫反応溶液に分子量約１０００〜２６
０００のカゼイン分解物を含有せしめることを特徴とす
る免疫測定方法、更に詳しくは溶液中における抗原−抗
体反応を利用した免疫測定を行うに際し、免疫反応溶液
に分子量約１０００〜２６０００のカゼイン分解物を含
有せしめ、該カゼイン分解物の免疫反応溶液中における
最終濃度を０．０５〜２．５重量％に調整することを特
徴とする免疫測定方法である。
本発明のカゼイン分解物のカゼインは哺乳動物の乳汁中
に多く含まれておりそれを精製して使用するが、−膜内
には牛乳が多く用いられている。
に多く含まれておりそれを精製して使用するが、−膜内
には牛乳が多く用いられている。
かかるカゼインを分解する方法としては、例えばキモト
リプシン、パパイン、トリプシン、バンクレアチン等の
消化酵素による加水分解法、１！ｉ！又はアルカリによ
る加水分解法等を上げることができ、分子量約１００〜
５ｏｏｏｏのカゼイン分解物が得られる。かかる消化酵
素は、１種又は２種以上を同時に用いることもできるが
、２種以上を用いる例として、例えばカゼインと豚の臓
の切片及びバンクレアチン粉を混合し約１０日間消化し
てカゼイン分解物を得る方法を用いることもできる（Ｊ
。
リプシン、パパイン、トリプシン、バンクレアチン等の
消化酵素による加水分解法、１！ｉ！又はアルカリによ
る加水分解法等を上げることができ、分子量約１００〜
５ｏｏｏｏのカゼイン分解物が得られる。かかる消化酵
素は、１種又は２種以上を同時に用いることもできるが
、２種以上を用いる例として、例えばカゼインと豚の臓
の切片及びバンクレアチン粉を混合し約１０日間消化し
てカゼイン分解物を得る方法を用いることもできる（Ｊ
。
Ｍｏｗａｒｅｄ Ｍｕｅｌｌｅｒらが、Ｊ、 Ｂａ
ＣｔｅｒｉＯｌ ６７Ｐ−２７１〜２７７ （１９５
４） ）。
ＣｔｅｒｉＯｌ ６７Ｐ−２７１〜２７７ （１９５
４） ）。
カゼイン（分子量約７５０００〜３７５０００ ）をそ
のまま使用した場合はほとんど血清干渉の抑制効果が認
められなかったのに対し、上記カゼイン分解物のうちで
も分子１約１０００〜２６０００のものが特に血清干渉
の抑制効果が優れていた。
のまま使用した場合はほとんど血清干渉の抑制効果が認
められなかったのに対し、上記カゼイン分解物のうちで
も分子１約１０００〜２６０００のものが特に血清干渉
の抑制効果が優れていた。
すなわち本発明のカゼイン分解物は、分子量約１０００
〜２６０００のものをいう。
〜２６０００のものをいう。
このようなカゼイン分解物としては、特にカゼインのト
リプシンによる分解物が好ましく挙げられるが、なかで
も例えばＮ Ｚ ｃａｓｅ （＠ ｕｉｋ。
リプシンによる分解物が好ましく挙げられるが、なかで
も例えばＮ Ｚ ｃａｓｅ （＠ ｕｉｋ。
５ｈｅＨｅｌｄ Ｃｈｅｇ＋１ｃａ１社製）が挙げられ
る。
る。
本発明の血清干渉抑制効果の発現メカニズムは十分解明
されていないが、カゼイン分解物の分子員約１０００〜
２６０００のものを免疫反応時の反応溶液に加えること
により、血清や血漿のあるなしにかかわらず免疫反応時
の環境を一定の状況にする効果があるものと推定される
。
されていないが、カゼイン分解物の分子員約１０００〜
２６０００のものを免疫反応時の反応溶液に加えること
により、血清や血漿のあるなしにかかわらず免疫反応時
の環境を一定の状況にする効果があるものと推定される
。
本発明においてはかかるカゼイン分解物を免疫反応溶液
に含有せしめるが、特に免疫反応溶液における最終濃度
が０．０５〜２．５重量％になるように調整して用いる
のが好ましい。カゼイン分解物濃度０．０３重量％から
血清干渉の抑制効果があられれはじめるが、０．０５重
量％未満では血清干渉を抑制する効果がまだ十分でなく
、また２、５重量％より高濃度では免疫反応溶液中に完
全に溶解することができず、室温に放置した場合に沈澱
を生じて懸濁状態となり、免疫反応にバラツキを生じる
ため、カゼイン分解物の最終濃度を０．０５〜２．５重
量％の範囲を決めた。より好ましくは０．１〜１．５重
量％の範囲である。
に含有せしめるが、特に免疫反応溶液における最終濃度
が０．０５〜２．５重量％になるように調整して用いる
のが好ましい。カゼイン分解物濃度０．０３重量％から
血清干渉の抑制効果があられれはじめるが、０．０５重
量％未満では血清干渉を抑制する効果がまだ十分でなく
、また２、５重量％より高濃度では免疫反応溶液中に完
全に溶解することができず、室温に放置した場合に沈澱
を生じて懸濁状態となり、免疫反応にバラツキを生じる
ため、カゼイン分解物の最終濃度を０．０５〜２．５重
量％の範囲を決めた。より好ましくは０．１〜１．５重
量％の範囲である。
かかるカゼイン分解物は、例えばＥＩＡの場合であれば
免疫測定用の試薬キットの構成要素の一部とするか、あ
るいは不溶化抗体、標識化抗体。
免疫測定用の試薬キットの構成要素の一部とするか、あ
るいは不溶化抗体、標識化抗体。
アッセイ緩衝液および標準物質等からなる試薬キットの
いずれかに含有せしめることもできる。後者の場合には
、なかでも標識化抗体又はアッセイ緩衝液が好ましく、
特にアッセイ緩衝液が好ましい。そして、例えば溶液中
における抗原−抗体反応を利用した免疫測定を行う場合
には、免疫反応溶液における最終濃度が所定の濃度にな
るように、例えばアッセイ緩衝液におけるかかるカゼイ
ン分解物の濃度を調整する。あるいは、例えば成形多孔
体等を用いた、いわゆるドライＥＩＡ（特表昭８２−５
００１２１号公報参照）の場合であれば、被検液。
いずれかに含有せしめることもできる。後者の場合には
、なかでも標識化抗体又はアッセイ緩衝液が好ましく、
特にアッセイ緩衝液が好ましい。そして、例えば溶液中
における抗原−抗体反応を利用した免疫測定を行う場合
には、免疫反応溶液における最終濃度が所定の濃度にな
るように、例えばアッセイ緩衝液におけるかかるカゼイ
ン分解物の濃度を調整する。あるいは、例えば成形多孔
体等を用いた、いわゆるドライＥＩＡ（特表昭８２−５
００１２１号公報参照）の場合であれば、被検液。
標識抗体等からなる試薬キットのいずれかに、特に好ま
しくは免疫反応溶液における最終濃度が所定の濃度にな
るように調整してかかるカゼイン分解物を含有せしめる
ことができる。
しくは免疫反応溶液における最終濃度が所定の濃度にな
るように調整してかかるカゼイン分解物を含有せしめる
ことができる。
本発明の免疫測定方法は、ポリスチレン、ポリカーボネ
ート、ポリエステル、ポリオレフィン。
ート、ポリエステル、ポリオレフィン。
酢酸セルロース、ナイロン、グラスファイバーミネラル
ファイバー等を材料とした、ビーズ、チューブ、プレー
ト、ラテックス、成形多孔体等の担体に抗体を不溶化し
た固定抗体と、測定対象物を含む溶液とを反応させるＥ
ＬＩＳＡ系、あるいはリポソーム等を使用して抗体を不
溶化させ、抗原−抗体反応及び補体の作用によってリポ
ソームを破壊させて、リポソームに内蔵している標識物
の漏出量により抗原憬を測定する系等にも適用できる。
ファイバー等を材料とした、ビーズ、チューブ、プレー
ト、ラテックス、成形多孔体等の担体に抗体を不溶化し
た固定抗体と、測定対象物を含む溶液とを反応させるＥ
ＬＩＳＡ系、あるいはリポソーム等を使用して抗体を不
溶化させ、抗原−抗体反応及び補体の作用によってリポ
ソームを破壊させて、リポソームに内蔵している標識物
の漏出量により抗原憬を測定する系等にも適用できる。
（ホ） 発明の効果
本発明のカゼイン分解物をその最終濃度が０．０５〜２
．５重量％となるように抗原−抗体反応を利用した免疫
測定系に使用した場合、血清干渉を約１／２０に抑制す
る効果が表われ被検液中の抗原ｍを正確に測定すること
が可能となった。
．５重量％となるように抗原−抗体反応を利用した免疫
測定系に使用した場合、血清干渉を約１／２０に抑制す
る効果が表われ被検液中の抗原ｍを正確に測定すること
が可能となった。
すなわち本発明によるカゼインの分解物を例えば血清中
に存在するヒト・胎盤由来酸性グルタチオンｓ−ｈラン
スフェラーゼ（胎盤由来酸性ＧＳＴ）を測定する場合の
緩衝液に添加して使用すると高い特異性及び高い感度で
容易に測定することができるとともに、正確な測定値を
得る免疫測定法を提供することができる。かかる場合に
抗ヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴ抗体としては、ポリクロー
ナル抗体あるいはモノクローナル抗体のいずれを用いる
こともできる。かかるモノクローナル抗体は本出願人の
先に出願した再公表公報昭和６２８０３３７７号に記載
されている方法によって得ることができる。
に存在するヒト・胎盤由来酸性グルタチオンｓ−ｈラン
スフェラーゼ（胎盤由来酸性ＧＳＴ）を測定する場合の
緩衝液に添加して使用すると高い特異性及び高い感度で
容易に測定することができるとともに、正確な測定値を
得る免疫測定法を提供することができる。かかる場合に
抗ヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴ抗体としては、ポリクロー
ナル抗体あるいはモノクローナル抗体のいずれを用いる
こともできる。かかるモノクローナル抗体は本出願人の
先に出願した再公表公報昭和６２８０３３７７号に記載
されている方法によって得ることができる。
以下具体的に実施例を用いて説明するが実施例によって
本発明が限定されるものではない。
本発明が限定されるものではない。
実施例中の％は重量％を意味する。
実施例１ ヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴ測定系におけるＮ
Ｚｃａｓｅによる血清干渉の抑制効果（１）ポリクロー
ナル抗体固定化ビーズの調製ポリスチレン製ビーズ（直
径６ ｔｕｔｓ ）をよく洗浄してから、兎抗ヒト・胎
盤由来酸性ＧＳＴＳポークローナル抗体の２０μｇ／ｌ
ｄの濃度を有する、０．０１ Ｍリン酸０．１５ Ｍ
Ｎａ Ｃ１ｐＨ７，４（ＰＢＳ）溶液中に４℃の温度
で１昼夜放置した模、ＰＢＳで洗浄し、１％牛血清アル
ブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ溶液中に４℃の温度で１
昼夜放置してポストコーティング処理を実施して、ポリ
クローナル抗体固定化ビーズを得た。
Ｚｃａｓｅによる血清干渉の抑制効果（１）ポリクロー
ナル抗体固定化ビーズの調製ポリスチレン製ビーズ（直
径６ ｔｕｔｓ ）をよく洗浄してから、兎抗ヒト・胎
盤由来酸性ＧＳＴＳポークローナル抗体の２０μｇ／ｌ
ｄの濃度を有する、０．０１ Ｍリン酸０．１５ Ｍ
Ｎａ Ｃ１ｐＨ７，４（ＰＢＳ）溶液中に４℃の温度
で１昼夜放置した模、ＰＢＳで洗浄し、１％牛血清アル
ブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ溶液中に４℃の温度で１
昼夜放置してポストコーティング処理を実施して、ポリ
クローナル抗体固定化ビーズを得た。
（２ホースラデイツシュ・ペルオキシダーゼ標識モノク
ローナル抗体のｍ製 抗ヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴモノクローナル抗体６Ａ（
再公表公報昭和６２−８０３３７７号に記載されている
方法で得られた）の１．ＯＩＩｇ／ｄのＰＢＳ溶液にＮ
−（ｍ−マレイミド安患香酸）−Ｎ−サクシミドエステ
ル（ＭＢＳ）の１０■／−のジメチルホルムアミド溶液
５０μ旦を添加し、２５℃の温度で、３０分間反応させ
た。次いでセファデックスＧ−２５を充填したカラムを
用いて、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ−１６，０）でゲ
ル濾過を行い、マレイミド化モノクローナル抗体と未反
応ＭＢＳとを分離した。
ローナル抗体のｍ製 抗ヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴモノクローナル抗体６Ａ（
再公表公報昭和６２−８０３３７７号に記載されている
方法で得られた）の１．ＯＩＩｇ／ｄのＰＢＳ溶液にＮ
−（ｍ−マレイミド安患香酸）−Ｎ−サクシミドエステ
ル（ＭＢＳ）の１０■／−のジメチルホルムアミド溶液
５０μ旦を添加し、２５℃の温度で、３０分間反応させ
た。次いでセファデックスＧ−２５を充填したカラムを
用いて、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ−１６，０）でゲ
ル濾過を行い、マレイミド化モノクローナル抗体と未反
応ＭＢＳとを分離した。
方、ホースラデイツシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
の１．ＯＩ１ｇ／ｄのＰＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミ
ジルー３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰ
ＤＰ）の１１０ｌ１／、ｄの濃度のエタノール溶液を添
加し、２５℃の温度で３０分間反応させた。次いで、セ
ファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、０．１
Ｍ酢酸ｍｉｉ液（ｐＨ４，５）でゲル濾過して精製し、
ピリジルジスルフィド化ＨＲＰを含有する画分を採取し
、これをコロジオンバック中において水冷中に約１０倍
濃縮した後、これに０゜８５％ＮａＣ１と０．１Ｍジチ
オスレイトールとを含有する０、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
４，５） ｌａｄを添加して、２５℃の温度で３０分間
撹拌してＨＲＰ分子中に導入しピリジルジスルフィド基
を還元した。還元後、セファデックスＧ−２５カラムに
かけてゲル濾過し、チオール化ＨＲＰと混合し、コロジ
オンパックを用いて水冷下に４■／−の蛋白質濃度まで
濃縮し、４℃の温度で１昼夜放置した。
の１．ＯＩ１ｇ／ｄのＰＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミ
ジルー３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰ
ＤＰ）の１１０ｌ１／、ｄの濃度のエタノール溶液を添
加し、２５℃の温度で３０分間反応させた。次いで、セ
ファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、０．１
Ｍ酢酸ｍｉｉ液（ｐＨ４，５）でゲル濾過して精製し、
ピリジルジスルフィド化ＨＲＰを含有する画分を採取し
、これをコロジオンバック中において水冷中に約１０倍
濃縮した後、これに０゜８５％ＮａＣ１と０．１Ｍジチ
オスレイトールとを含有する０、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
４，５） ｌａｄを添加して、２５℃の温度で３０分間
撹拌してＨＲＰ分子中に導入しピリジルジスルフィド基
を還元した。還元後、セファデックスＧ−２５カラムに
かけてゲル濾過し、チオール化ＨＲＰと混合し、コロジ
オンパックを用いて水冷下に４■／−の蛋白質濃度まで
濃縮し、４℃の温度で１昼夜放置した。
その後、ウルトロゲルＡｃ Ａ４４ （ＬＫＢ社）を充
填したカラムでゲル濾過し、ＨＲＰ標識モノクローナル
抗体を得た。
填したカラムでゲル濾過し、ＨＲＰ標識モノクローナル
抗体を得た。
（３） ヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴ欠損血清の作製（
イ） 抗ヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴ抗体固定カラムの作
製 アガロースゲルをＣＮＢｒで活性化したもの、例えばフ
ァルマシア社のＣＮＢｒ活性化Ｓ ｅｐｈａｒｏｓｅ４
Ｂに抗ヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴポリクローナル抗体
をアミノ基を介して化学的に結合させた。その場合ゲル
１１ｄに対して５〜１０１９の抗体蛋白を、０．１Ｍ炭
酸０．１５ ＭＮａＣ１緩衝液（ｐＨ８，５） ２ａｔ
ｅに溶解して加え、４℃の温度で１６時間ゆっくり撹拌
しながら固定した。次いで、ガラスフィルターにてゲル
と抗体溶液を分離し、ゲルを０．１Ｍ酢酸、０．１５Ｍ
ＮａＣ１緩衝液（ＤＨ４，０＞及び０，１Ｍ炭酸。
イ） 抗ヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴ抗体固定カラムの作
製 アガロースゲルをＣＮＢｒで活性化したもの、例えばフ
ァルマシア社のＣＮＢｒ活性化Ｓ ｅｐｈａｒｏｓｅ４
Ｂに抗ヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴポリクローナル抗体
をアミノ基を介して化学的に結合させた。その場合ゲル
１１ｄに対して５〜１０１９の抗体蛋白を、０．１Ｍ炭
酸０．１５ ＭＮａＣ１緩衝液（ｐＨ８，５） ２ａｔ
ｅに溶解して加え、４℃の温度で１６時間ゆっくり撹拌
しながら固定した。次いで、ガラスフィルターにてゲル
と抗体溶液を分離し、ゲルを０．１Ｍ酢酸、０．１５Ｍ
ＮａＣ１緩衝液（ＤＨ４，０＞及び０，１Ｍ炭酸。
ｏ、１５ Ｍ Ｎａ Ｃ１緩衝液（ｐＨａ、ｓ）で交
互に３回洗浄して、固定しなかった抗体を除去した。
互に３回洗浄して、固定しなかった抗体を除去した。
その後、ＣＮＢｒ活性化３ ｅｐｈａｒｏｓｅ４ Ｂ
（７）残った活性部位を１Ｍエタノールアミン（ＤＨ８
，０＞溶液５ｄを加えて室温で２時間ゆっくり撹拌して
ブロックした。ブロック後再びガラスフィルター上に移
し、抗体固定後の洗浄方法と同一操作にて洗浄した。次
にアフィニティークロマトグラフィーに使用するＰＢＳ
にて２回洗浄した。
（７）残った活性部位を１Ｍエタノールアミン（ＤＨ８
，０＞溶液５ｄを加えて室温で２時間ゆっくり撹拌して
ブロックした。ブロック後再びガラスフィルター上に移
し、抗体固定後の洗浄方法と同一操作にて洗浄した。次
にアフィニティークロマトグラフィーに使用するＰＢＳ
にて２回洗浄した。
この様にして作製したゲルをカラムに充填した。
［０） アフィニティークロマトグラフィー抗ヒト・
胎盤由来酸性ＧＳＴポリクローナル抗体を固定したＳ
ｅｐｈａｒｏｓｅ４ Ｂカラムを、ＰＢＳで平衡化した
後、健常人血清を２回通液して、ヒト・胎盤由来酸性０
８丁欠損血清を得た。
胎盤由来酸性ＧＳＴポリクローナル抗体を固定したＳ
ｅｐｈａｒｏｓｅ４ Ｂカラムを、ＰＢＳで平衡化した
後、健常人血清を２回通液して、ヒト・胎盤由来酸性０
８丁欠損血清を得た。
（４） 本測定法における血清干渉抑制試験免疫測定
用緩衝液（１，０％ＢＳＡ、０．１％スキムミルクＰＢ
Ｓ）でヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴの０、１２．５ｎＯ／
ｄ溶液を作製し、それぞれの１００μ文と同上１１衝液
で２倍に希釈したヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴ欠損血清を
１００μｐ及びＨＲＰ標識抗ヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴ
モノクローナル抗体６Ａ（再公表公報昭和６２−８０３
３７Ｔ号に記載されている方法で得られた）を含有する
同上緩衝液１００μ文をガラス試験管に入れ、「血清あ
り」の試料を得た。同様にしてヒト・胎盤由来酸性ＧＳ
Ｔ欠損向清の代わりに同上！ｌ！ｌｌｉ液を用いて「血
清なし」の試料を得た。次に終濃度が０〜２％になるよ
う１ｉ製したＮ Ｚ ｃａｓｅを含む同上緩衝液１００
μΩを添加してよく混和した。これに、兎抗ヒト・胎盤
イガ来酸性ＧＳＴポリクローナル抗体を固定したビーズ
１個をそれぞれの試験管に入れて、３７℃の温度で２時
間インキュベートした。次に試験管内の溶液を吸引除去
した後、生理食塩水２ｄで３回洗浄してから、３．３’
、５．５’ テトラメチルベンジジン塩Ｍ塩０．０２
％、 Ｈ２０２２，５１１１Ｍを含有する０、 １Ｍリ
ン酸−クエン酸Ｍ衝液（ｒ）Ｈ４，０）を０．４−ずつ
各試験管に加えて、３７℃の温度で３０分間インキュベ
ートした後、反応停止剤として、１Ｎｌｉｉ！ｌ酸水溶
液を１ｄずつ加えて酵素反応を停止させた。
用緩衝液（１，０％ＢＳＡ、０．１％スキムミルクＰＢ
Ｓ）でヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴの０、１２．５ｎＯ／
ｄ溶液を作製し、それぞれの１００μ文と同上１１衝液
で２倍に希釈したヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴ欠損血清を
１００μｐ及びＨＲＰ標識抗ヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴ
モノクローナル抗体６Ａ（再公表公報昭和６２−８０３
３７Ｔ号に記載されている方法で得られた）を含有する
同上緩衝液１００μ文をガラス試験管に入れ、「血清あ
り」の試料を得た。同様にしてヒト・胎盤由来酸性ＧＳ
Ｔ欠損向清の代わりに同上！ｌ！ｌｌｉ液を用いて「血
清なし」の試料を得た。次に終濃度が０〜２％になるよ
う１ｉ製したＮ Ｚ ｃａｓｅを含む同上緩衝液１００
μΩを添加してよく混和した。これに、兎抗ヒト・胎盤
イガ来酸性ＧＳＴポリクローナル抗体を固定したビーズ
１個をそれぞれの試験管に入れて、３７℃の温度で２時
間インキュベートした。次に試験管内の溶液を吸引除去
した後、生理食塩水２ｄで３回洗浄してから、３．３’
、５．５’ テトラメチルベンジジン塩Ｍ塩０．０２
％、 Ｈ２０２２，５１１１Ｍを含有する０、 １Ｍリ
ン酸−クエン酸Ｍ衝液（ｒ）Ｈ４，０）を０．４−ずつ
各試験管に加えて、３７℃の温度で３０分間インキュベ
ートした後、反応停止剤として、１Ｎｌｉｉ！ｌ酸水溶
液を１ｄずつ加えて酵素反応を停止させた。
次いで、この溶液を分光光度計を用いて、精製水を対照
として４５０ｒｖにおける吸収強度を測定し、得られた
結果を第１図に示した。
として４５０ｒｖにおける吸収強度を測定し、得られた
結果を第１図に示した。
第１図から、ヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴ０゜１２．５μ
ｇ／ ＩＩｄｌいずれの場合もＮ Ｚ ｃａｓｅの添加
量が０％のときには、「血清なしＪ （Ｏ印、・印）
と、「血清あり」 （△印、ム印）の吸光度に差異を生
じているが、Ｎ Ｚ ｃａｓｅの添加量が０．０３％か
ら血清干渉抑制効果が現われはじめた。その程度は、ヒ
ト・胎盤由来酸性Ｇ Ｓ Ｔ １２．５μｇ／ ｄにお
ける「血清なし」の吸光度（Ｏ印）を１００％とした場
合、「血清あり」の場合の吸光度（Δ印）はＮＺＣａｓ
ｅが０％時は血清干渉によって３８％の吸光度差がある
が、０．１％のＮ Ｚ ｃａｓｅを添加するとその差は
１．５％となる。更に０．５％のＮＺｃａｓｅを添加す
るとその差は３．３％となり正確な測定値が得られるこ
とがわかった。
ｇ／ ＩＩｄｌいずれの場合もＮ Ｚ ｃａｓｅの添加
量が０％のときには、「血清なしＪ （Ｏ印、・印）
と、「血清あり」 （△印、ム印）の吸光度に差異を生
じているが、Ｎ Ｚ ｃａｓｅの添加量が０．０３％か
ら血清干渉抑制効果が現われはじめた。その程度は、ヒ
ト・胎盤由来酸性Ｇ Ｓ Ｔ １２．５μｇ／ ｄにお
ける「血清なし」の吸光度（Ｏ印）を１００％とした場
合、「血清あり」の場合の吸光度（Δ印）はＮＺＣａｓ
ｅが０％時は血清干渉によって３８％の吸光度差がある
が、０．１％のＮ Ｚ ｃａｓｅを添加するとその差は
１．５％となる。更に０．５％のＮＺｃａｓｅを添加す
るとその差は３．３％となり正確な測定値が得られるこ
とがわかった。
実施例２ ヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴの同時サンドイン
チ酵素免疫測定法 兎抗ヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴＳポークローナル抗体を
固定化したビーズ８１個と精製したヒト・胎盤由来酸性
ＧＳＴ０． ６．２５ 、１２．５．２５．５０ｎｇ／
ｊｌＩｌ！を含有する１％ＢＳＡ、０．５％Ｎ Ｚ ｃ
ａｓｅ。
チ酵素免疫測定法 兎抗ヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴＳポークローナル抗体を
固定化したビーズ８１個と精製したヒト・胎盤由来酸性
ＧＳＴ０． ６．２５ 、１２．５．２５．５０ｎｇ／
ｊｌＩｌ！を含有する１％ＢＳＡ、０．５％Ｎ Ｚ ｃ
ａｓｅ。
０．１％スキムミルク、ＰＢＳ溶液２００μ文と、ＨＲ
Ｐ標識抗ヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴモノクローナル抗体
６Ａを含有する１％ＢＳＡ、０．５％Ｎ Ｚｃａｓｅ、
０．１％スキムミルクＰＢＳ溶液２００μＡとをそれ
ぞれのガラス試験管に添加して３７℃の温度で２時間イ
ンキュベートした。次に、試験管内の溶液を吸引除去し
た後、生理食塩水２ＩＲ１で３回洗浄してから、３．３
’ 、５．５’ −テトラメチルベンジジン塩酸塩０．
０２％、 ８２０２ ２．５１Ｍを含有する０、１Ｍリ
ン酸−クエンＩＩＩ！１Ｉｌｉ液（ＤＨ４，０）を０．
４ｄずつ各試験管内に加え、３７℃の温度で３０分間イ
ンキュベートした後、反応停止剤として１Ｎ硫酸水溶液
を１−ずつ加えて酵素反応を停止させた。次いでこの溶
液を分光光度計を用いて精製水を対照として４５０ｎｉ
におけ吸収強度を測定し、これを標準物質濃度に対して
プロットすることにより濃度依存性のよい検量線を得た
。結果を第２図に示した。
Ｐ標識抗ヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴモノクローナル抗体
６Ａを含有する１％ＢＳＡ、０．５％Ｎ Ｚｃａｓｅ、
０．１％スキムミルクＰＢＳ溶液２００μＡとをそれ
ぞれのガラス試験管に添加して３７℃の温度で２時間イ
ンキュベートした。次に、試験管内の溶液を吸引除去し
た後、生理食塩水２ＩＲ１で３回洗浄してから、３．３
’ 、５．５’ −テトラメチルベンジジン塩酸塩０．
０２％、 ８２０２ ２．５１Ｍを含有する０、１Ｍリ
ン酸−クエンＩＩＩ！１Ｉｌｉ液（ＤＨ４，０）を０．
４ｄずつ各試験管内に加え、３７℃の温度で３０分間イ
ンキュベートした後、反応停止剤として１Ｎ硫酸水溶液
を１−ずつ加えて酵素反応を停止させた。次いでこの溶
液を分光光度計を用いて精製水を対照として４５０ｎｉ
におけ吸収強度を測定し、これを標準物質濃度に対して
プロットすることにより濃度依存性のよい検量線を得た
。結果を第２図に示した。
実施例３１床検体中のヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴの測定
健常人及び大腸癌患者血清を採取し、この血清各５０μ
ρをガラス試験管に添加し１％ＢＳＡ。
ρをガラス試験管に添加し１％ＢＳＡ。
０．５％Ｎ Ｚ ＣａＳｅ、 ０．１％スキムミルク
、ＰＢＳ溶液１５０μ旦加えて希釈した後、これに兎抗
ヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴＳポークローナル抗体を固定
化したビーズ１個と、ＨＲＰ標識抗ヒト・胎盤由来酸性
ＧＳＴモノクローナル抗体６Ａを含有する１％ＢＳＡ、
０，５％Ｎ Ｚ ｃａｓｅ、 ０．１％スキムミルク
、ＰＢＳ溶液２００ｕｕとを、それぞれ試験管に添加し
て３７℃の濃度で２時間インキュベートした。
、ＰＢＳ溶液１５０μ旦加えて希釈した後、これに兎抗
ヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴＳポークローナル抗体を固定
化したビーズ１個と、ＨＲＰ標識抗ヒト・胎盤由来酸性
ＧＳＴモノクローナル抗体６Ａを含有する１％ＢＳＡ、
０，５％Ｎ Ｚ ｃａｓｅ、 ０．１％スキムミルク
、ＰＢＳ溶液２００ｕｕとを、それぞれ試験管に添加し
て３７℃の濃度で２時間インキュベートした。
次に、実施例２の検ｌＩ！を作成するのと全く同じ操作
により、洗浄、酵素反応及び反応停止を行った後、分光
光度計を用いて、精製水を対照として４５０ｎｍにおけ
る吸収強度を測定し、検量線より濃度を求めた。その結
果、健常人血清中のヒト・胎盤由来酸性Ｇ５Ｔｉ１度は
１２．８ｎＭ ｔｅｌであり、大腸癌患者血清中のヒト
・胎盤由来酸性ＧＳＴＩＩ度は５１．０ｎ（Ｊ／ｄであ
った。
により、洗浄、酵素反応及び反応停止を行った後、分光
光度計を用いて、精製水を対照として４５０ｎｍにおけ
る吸収強度を測定し、検量線より濃度を求めた。その結
果、健常人血清中のヒト・胎盤由来酸性Ｇ５Ｔｉ１度は
１２．８ｎＭ ｔｅｌであり、大腸癌患者血清中のヒト
・胎盤由来酸性ＧＳＴＩＩ度は５１．０ｎ（Ｊ／ｄであ
った。
第１図はヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴ測定系におけるＮ
ｚ ｃａｓｅｌ１度と血清干渉抑制効果を示している。 第１図中、Ｏ１Δ印は各々ヒト・胎盤由来酸性Ｇ Ｓ
Ｔ １２．５ｎＭ ｄ テ血ｍ すＬ／ 、 ｌ） リ
’ｆｉ： 示Ｌ／、・。 ム印は各々ヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴＯｎｇ／ｌｉ！で
血清なし、ありを示している。 第２図はヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴ測定系におけるヒト
・胎盤由来酸性ＧＳＴの検量線を示している。 特許出願人 帝 人 株 式 会 社ＮＺ
α己（、、、シト力。％（％） 自ＳＴ−ル 貼 （−１／、、ｌ）
ｚ ｃａｓｅｌ１度と血清干渉抑制効果を示している。 第１図中、Ｏ１Δ印は各々ヒト・胎盤由来酸性Ｇ Ｓ
Ｔ １２．５ｎＭ ｄ テ血ｍ すＬ／ 、 ｌ） リ
’ｆｉ： 示Ｌ／、・。 ム印は各々ヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴＯｎｇ／ｌｉ！で
血清なし、ありを示している。 第２図はヒト・胎盤由来酸性ＧＳＴ測定系におけるヒト
・胎盤由来酸性ＧＳＴの検量線を示している。 特許出願人 帝 人 株 式 会 社ＮＺ
α己（、、、シト力。％（％） 自ＳＴ−ル 貼 （−１／、、ｌ）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、抗原−抗体反応を利用した免疫測定を行うに際し、
免疫反応溶液に、分子量約１０００〜２６０００のカゼ
イン分解物を含有せしめることを特徴とする免疫測定方
法。 ２、溶液中における抗原−抗体反応を利用した免疫測定
を行うに際し、免疫反応溶液に、分子量約１０００〜２
６０００のカゼイン分解物を含有せしめ、該カゼイン分
解物の免疫反応溶液における最終濃度を０．０５〜２．
５重量％に調整することを特徴とする免疫測定方法。 ３、カゼイン分解物がカゼインの消化酵素による分解物
であることを特徴とする請求項２記載の免疫測定方法。 ４、測定対象がヒト・胎盤由来酸性グルタチオンＳ−ト
ランスフェラーゼである請求項２記載の免疫測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63184669A JPH0746106B2 (ja) | 1988-07-26 | 1988-07-26 | 免疫測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63184669A JPH0746106B2 (ja) | 1988-07-26 | 1988-07-26 | 免疫測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0236353A true JPH0236353A (ja) | 1990-02-06 |
| JPH0746106B2 JPH0746106B2 (ja) | 1995-05-17 |
Family
ID=16157288
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63184669A Expired - Lifetime JPH0746106B2 (ja) | 1988-07-26 | 1988-07-26 | 免疫測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0746106B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102830226A (zh) * | 2011-06-16 | 2012-12-19 | 富士胶片株式会社 | 高灵敏度的免疫色谱方法以及免疫色谱用试剂盒 |
| JP2018021903A (ja) * | 2016-07-26 | 2018-02-08 | 三洋化成工業株式会社 | 免疫測定用試薬、免疫測定用キット及び免疫測定方法 |
| CN110187098A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-08-30 | 武汉科前生物股份有限公司 | 一种辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂的制备方法及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5642142A (en) * | 1979-08-31 | 1981-04-20 | Amano Pharmaceut Co Ltd | Removing method for nonspecific reaction inhibiting action in immunity measuring method |
| JPS6316266A (ja) * | 1986-07-09 | 1988-01-23 | Toyobo Co Ltd | 自己抗体測定用試薬組成物 |
| JPS63127161A (ja) * | 1986-09-15 | 1988-05-31 | クールター・コーポレーション | 化学阻止剤およびこれを使用するイムノアッセイ法並びにイムノアッセイ用キット |
| JPH01217266A (ja) * | 1988-02-26 | 1989-08-30 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 非特異的吸着防止剤および非特異的吸着防止方法 |
-
1988
- 1988-07-26 JP JP63184669A patent/JPH0746106B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5642142A (en) * | 1979-08-31 | 1981-04-20 | Amano Pharmaceut Co Ltd | Removing method for nonspecific reaction inhibiting action in immunity measuring method |
| JPS6316266A (ja) * | 1986-07-09 | 1988-01-23 | Toyobo Co Ltd | 自己抗体測定用試薬組成物 |
| JPS63127161A (ja) * | 1986-09-15 | 1988-05-31 | クールター・コーポレーション | 化学阻止剤およびこれを使用するイムノアッセイ法並びにイムノアッセイ用キット |
| JPH01217266A (ja) * | 1988-02-26 | 1989-08-30 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 非特異的吸着防止剤および非特異的吸着防止方法 |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102830226A (zh) * | 2011-06-16 | 2012-12-19 | 富士胶片株式会社 | 高灵敏度的免疫色谱方法以及免疫色谱用试剂盒 |
| EP2535713A1 (en) | 2011-06-16 | 2012-12-19 | Fujifilm Corporation | Highly sensitive immunochromatography method and immunochromatography kit |
| JP2013019888A (ja) * | 2011-06-16 | 2013-01-31 | Fujifilm Corp | 高感度なイムノクロマトグラフ方法及びイムノクロマトグラフ用キット |
| US8716032B2 (en) | 2011-06-16 | 2014-05-06 | Fujifilm Corporation | Highly sensitive immunochromatography method and kit employing protein hydrolysates |
| JP2018021903A (ja) * | 2016-07-26 | 2018-02-08 | 三洋化成工業株式会社 | 免疫測定用試薬、免疫測定用キット及び免疫測定方法 |
| CN110187098A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-08-30 | 武汉科前生物股份有限公司 | 一种辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定剂的制备方法及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0746106B2 (ja) | 1995-05-17 |
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