JPH08313530A - 総ヘモグロビン測定方法及び測定キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 検体にヘモグロビン除去正常ヒト血清、また
はヒトハプトグロビンを添加し、検体中に存在する遊離
ヘモグロビンを、ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体
に形成せしめたのち、酵素免疫測定法により、検体中に
存在する総ヘモグロビン量を測定する方法及び測定キッ
ト。 【効果】 溶血性疾患の指標となる総ヘモグロビン量を
検体（例えば血清、血漿、尿等）より、正確、簡便かつ
迅速に測定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は総ヘモグロビン測定法お
よび総ヘモグロビン測定キットに関し、詳しくは臨床検
査分野などで用いられる総ヘモグロビンを免疫学的手法
により簡便、迅速かつ精度よく測定することができる総
ヘモグロビン測定法および総ヘモグロビン測定キットに
関する。

【０００２】

【従来の技術ならびに発明が解決すべき問題点】体外循
環、熱傷、不適合輸血、溶血性疾患などでは、大量の溶
血を引き起こす可能性があり、溶血に伴う腎障害などの
合併症を併発することが多い。

【０００３】このため、血漿または血清中の総ヘモグロ
ビン量を測定することは臨床上重要な意義を持つ。通
常、血漿または血清の総ヘモグロビン（以下Ｔ−Ｈｂ）
の定量にはシアンメトヘモグロビン法、オキシヘモグロ
ビン法、ベンチジン法、ベンチジン変法などの化学法が
知られている。

【０００４】しかしながら、シアンメトヘモグロビン法
は血中のＴ−Ｈｂをシアンメトヘモグロビンにフェリシ
アン化カリウムおよびシアン化カリウムを加え、５４０
ｎｍの波長で測定を行なうが猛毒のシアン化カリウムを
用いるので操作に危険を伴う上に、測定感度が低いとい
う欠点がある。

【０００５】また、オキシヘモグロビン法は検体を水で
希釈しオキシヘモグロビンに変換後、５４０ｎｍの波長
で測定を行なうものであるが、ｐＨが高くなるとメトヘ
モグロビンに変わり、あるいは中性付近になると濁りが
生じるという欠点を伴うので測定に正確性を欠いてい
る。また、ベンチジン法、ベンチジン変法はヘモグロビ
ンのペルオキシダーゼ活性を利用する方法であり、過酸
化水素がベンチジンを酸化して発色させるものでこの発
色の程度を定量するものであるが、この方法ではＨｂの
みならずメトヘモグロビンおよびメトヘムアルブミンも
合わせて定量してしまうこと、さらにはベンチジン自身
が発癌性を有することから、３，３′−５，５′−テト
ラメチルベンチジンが利用されているが、条件、精度、
感度および特異性に問題があり、より精度の高い測定法
が望まれていた。

【０００６】以上のことから本発明者らは操作上安全
で、かつ特異性および感度が高い酵素免疫測定法（以下
ＥＬＩＳＡ法）によるＴ−Ｈｂ測定を長年研究してき
た。本測定法は血漿または血清中のＨｂがヘモグロビン
−ハプトグロビン複合体（以下Ｈｂ−Ｈｐ）および遊離
Ｈｂ（以下Ｆ−Ｈｂ）として存在しているため、ＥＬＩ
ＳＡ法に用いる抗Ｈｂ抗体に対する反応性が異なるため
に正確な定量ができないという重大な問題に直面した。
このことは特に低ハプトグロビン血症患者の検体あるい
は溶血の著しい患者の検体では不正確な測定になってし
まう。（比較例参照）

【０００７】そこで本発明者らは、さらに鋭意研究した
結果、検体中のＦ−Ｈｂがヘモグロビンを除去したヒト
血清またはヒトハプトグロビン（Ｈｐ）をあらかじめ添
加しておくことにより、検体中のＦ−ＨｂはすべてＨｂ
−Ｈｐ複合体に変換されることに注目し、血漿あるいは
血清、さらには尿中に存在する微量のＴ−ＨｂをＨｂ−
Ｈｐ複合体の形で正確にしかも簡便に、迅速に測定する
方法を見出だし、「総ヘモグロビン測定方法及びキッ
ト」を完成するに至った。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明のＴ−Ｈｂ測定法
は検体（例えば血清、血漿、尿等）中のＦ−ＨｂをＨｐ
と反応させＨｂ−Ｈｐ複合体を形成せしめたのち、Ｈｂ
−Ｈｐ複合体を抗Ｈｂ抗体固定化固相を用いるＥＬＩＳ
Ａ法により測定を行なうことを特徴とするものである。
また、本発明のＴ−Ｈｂ測定キットとは上述した本法の
測定に使用する測定用キットであり、検体中に存在する
遊離のＨｂと反応するヘモグロビンを除去した血清、ま
たはＨｐからなる試薬を含むことを特徴とする測定キッ
トを意味するものである。

【０００９】詳しくは検体中のＦ−Ｈｂにヘモグロビン
を除去した血清、またはＨｐを加え、Ｈｂ−Ｈｐ複合体
を形成させた後、抗Ｈｂ抗体固定化固相に反応せしめ、
さらに固相を洗浄後、酵素を標識した抗Ｈｂ抗体を反応
せしめ過剰の酵素標識抗Ｈｂ抗体を洗浄により除いた
後、酵素基質および発色剤を加えて発色させる。

【００１０】反応停止剤を加えた後、発色強度を比色計
で測定する。対照として標準Ｈｂ−Ｈｐ複合体の溶液も
同様に測定し、あらかじめ作成しておいた標準曲線から
直接定量するものである。

【００１１】なお、本発明において使用するヘモグロビ
ン除去ヒト血清とはヒト血清中に存在するヘモグロビン
−ハプトグロビン複合体あるいは遊離ヘモグロビンを、
例えば抗ヒトＨｂ抗体を用いたアフィニティークロマト
グラフィーなどであらかじめ除去した遊離のＨｐを含有
するヒト血清である。一方、ハプトグロビンは特に限定
されるものではないが精製品としてシグマ社などで市販
されているＨｐの精製レベルであれば本測定は可能であ
る。

【００１２】また、抗Ｈｂ抗体はポリクロナール抗体や
モノクロナール抗体どちらでも用いることができる。通
常、ポリクロナール抗体は医学生物学研究所、モノクロ
ナール抗体はＭＥＤＩＸ ＢＩＯＴＥＣＨ（株）などで
市販されており容易に入手が可能である。また、モノク
ロナール抗体はヒトＨｂを免疫したマウス脾細胞とマウ
ス骨髄細胞を細胞融合する通常の方法で容易に得ること
もできる。さらに、抗体の純度を高めるためにはＨｂ−
セファロースによるアフィニティークロマトグラフィー
を適宜用いることができる。

【００１３】次に本発明におけるＴ−Ｈｂ測定には各種
の方法があるが、一般に使用されているＥＬＩＳＡ法の
サンドイッチ法が好適である。抗Ｈｂ抗体を固定化する
固相材料としては、ＥＬＩＳＡ法などで従来から使用さ
れている固相材料のいずれも用いることができるが、多
数検体の測定にあたっては、例えばマイクロプレート、
磁性体ビーズ、プラスチックビーズなどが好ましい。ま
た、本発明において使用できる酵素標識物の酵素として
は様々なものがあるが、その中でもペルオキシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等が
特に好適である。

【００１４】抗体に酵素を標識する方法は幾つかの方法
があるが、各々に課せられた最も重要な条件は、１）酵
素および抗体の活性低下を起こさない。２）結合が安定
で長期間の保存に耐えること。３）なるべく操作が煩雑
でなく、容易に標識抗体が得られることなどがあげられ
る。これらの条件を満たすものとして現在までに開発さ
れてきた酵素標識法は大きく分けて２つに分類できる。
その１つは酵素と抗体とを化学的に結びつける方法であ
り、グルタールアルデヒド法（Ｓ．Ａｖｒａｍｅａｓ，
Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６，４３，１９６
９）や過ヨウ素酸酸化法（Ｐ．Ｋ．Ｎａｋａｎｅ，Ａ．
Ｋａｗａｏｉ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈ
ｅｍ．，２２，１０８４，１９７４）はこれに相当す
る。もう一方は抗体などを仲立ちとして酵素と第一抗体
を結合する方法であり、この方法ではアビジン−ビチオ
ン法（Ｓ．Ｍ．Ｈｓｕ，Ｌ．Ｒａｉｎｅ，Ｈ．Ｆｒａｎ
ｇｅｒ，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，７５，
７３４−７３８，１９８１）が知られている。

【００１５】本発明においてはいずれの標識法を用いて
も測定が可能である。本発明に用いられる標識抗体の調
製の一態様として、ペルオキシダーゼで標識した抗体を
得る方法が知られている。詳しくはペルオキシダーゼの
遊離のアミノ基をすべて１−フルオロ−２，４−ジニト
ロベンゼン（ＦＤＮＢ）によりブロックし、次いでジニ
トロフェニール化されたペルオキシダーゼの糖部分の隣
接水酸基を過ヨウ素酸で切断し、アルデヒド基を新生さ
せる。未反応の過ヨウ素酸はエチレングリコールを加え
て分解し、反応を停止する。

【００１６】次に０．０１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ９．５）で透析した後、新生したアルデヒド基と抗体
のアミノ基とを反応させるとシッフ塩基が形成される。
次いでシッフ塩基の反応成績体を化学的に安定化するた
めに水素化ホウ素ナトリウムで還元する。還元後、過剰
の水素化ホウ素ナトリウムを透析により除去すると所望
の酵素標識抗体が得られる。さらに、得られたこの標識
抗体をゲル濾過クロマトグラフィーにて精製し使用する
のが好ましい。

【００１７】また、発色基質および発色剤としては、ペ
ルオキシダーゼの場合には過酸化水素と３，３′−５，
５′−テトラメチルベンチジンまたは３，３′−ジアミ
ノベンチジンが用いられ、一方、アルカリフォスファタ
ーゼの場合はブロモクロロインドールホスフェイトニト
ロ−テトラゾリウム原体が用いられる。さらに発色剤の
反応条件としては通常の酵素反応と同様でよく、特に温
度については規定はしないが、室温付近で行なうのが最
も好ましい。

【００１８】Ｈｂ標準品としてはＨｂ−Ｈｐ複合体を用
いるが、本複合体はＨｂ精製品に過剰のＨｐ精製品（シ
グマ社製）を加えて数時間反応させて容易に調製するこ
とができる。また、先のＨｐ精製品の代りに、あらかじ
め正常ヒト血清を抗ヒトＨｂ抗体−アフィニティーカラ
ムで処理したＨｂ除去正常ヒト血清を用い、これにＨｂ
精製品（シグマ社製）を加えることによってもＨｂ標準
品（Ｈｂ−Ｈｐ複合体）を調製することもできる。以下
に比較例を示すが、本比較例はヒトＨｂ−Ｈｐ複合体と
Ｆ−Ｈｂとの抗ヒトＨｂ抗体に対する反応性が異なるた
めに通常の測定法では正確な定量が得られない根拠を示
したものである。

【００１９】［比較例］ヒトＨｂ−ヒトＨｐ複合体とＦ−Ｈｂの抗ヒトＨｂ抗体
に対する反応性の差異による測定上の問題点 《ヒトＨｂ−ヒトＨｐ複合体およびヒトＨｂ，ヒトＨｐ
溶液の調製》２回結晶ヒトＨｂ（シグマ社製）を１６０
ｎｇ／ｍｌになるように０．１％ウシ血清アルブミン
（以下ＢＳＡ）−リン酸緩衝生理食塩液（以下ＰＢＳ）
で希釈した。次にＨｐ（シグマ社製）を８００ｎｇ／ｍ
ｌになるように０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈し、各々
１ｍｌを等量混合し、３７℃で１時間インキュベートし
たのち、ヒトＨｂ−ヒトＨｐ複合体を調製した。一方、
ヒトＨｂ、ヒトＨｐの反応性を調べるため、２回結晶ヒ
トＨｂは８０ｎｇ／ｍｌ濃度になるように、またＨｐは
４００ｎｇ／ｍｌ濃度になるように０．１％ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳを各々加えて調製した。

【００２０】《抗ヒトＨｂ抗体固相化マイクロプレート
の作製》自家でウサギに免疫して得られたポリクロナー
ル抗体（Ｎｏ．７０３，３０７），自家で作製したモノ
クロナール抗体（Ｎｏ．６）および日本バイオテスト社
製モノクロナール抗体（ＳＵ１１０，ＳＵ１１２）の５
種を被検体として用いた。あらかじめ、ＰＢＳで２μｇ
／ｍｌに希釈した各々の抗体を９６穴マイクロプレート
（コースター社製）の各々のウエルに２００μｌずつ加
え、４℃で１晩反応した。反応後、各ウエルの液を除去
し、各ウエルにＰＢＳ２５０μｌずつ加え、攪拌後、液
を除去した。この操作を３回繰り返した後、マスキング
試薬として１％ＢＳＡ−ＰＢＳを加え、３７℃、１時間
インキュベートした。マスキング後、各ウエル内の液を
除去し、保存液（０．１％ＮａＮ₃ を含む０．１％ＢＳ
Ａ−ＰＢＳ）を各ウエルに２００μｌずつ加えた。

【００２１】《ヒトＨｂ−ヒトＨｐ複合体およびヒトＨ
ｂ測定》ヒトＨｂ，ヒトＨｂ−ヒトＨｐ複合体およびヒ
トＨｐの測定はＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法）を用い
た。すなわち、先に作製した抗Ｈｂ抗体固相化−９６穴
マイクロプレートの保存液を除去した後、検体を各ウエ
ルに２００μｌずつ加え、標準Ｈｂ（シグマ社製）０〜
１６０ｎｇ／ｍｌも同様に各ウエルに２００μｌずつ加
えた。マイクロプレートミキサーで１分間攪拌後、３７
℃で１時間反応した。各ウエル内の液を除去した後、洗
浄液（０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ）を各ウエルに２５０μ
ｌずつ加え、攪拌後、液を除去した。この操作を３回繰
り返し、ペルオキシダーゼ標識抗Ｈｂ抗体液を各ウエル
に２００μｌずつ加え、同様に３７℃で１時間反応し
た。反応後、液を除去し、上記の洗浄液で同様に洗浄操
作を行なった。次に基質液（過酸化水素＋ｏ−フェニレ
ンジアミン）を加え、室温で１５分間反応した。反応停
止は４Ｎ硫酸５０μｌで行い、マイクロプレート用比色
計（４９２ｎｍ／６３０ｎｍ，Ｓｊｅｉａオートリーダ
ー 三光純薬株式会社製）で測定した。ヒトＨｂ値はあ
らかじめ標準Ｈｂ（シグマ社製）を用いて作成した標準
曲線から算出した。

【００２２】《ヒトＨｂ−ヒトＨｐ複合体、ヒトＦ−Ｈ
ｂおよびヒトＨｐに対する各種抗Ｈｂ抗体との反応性》
表１に各抗Ｈｂ抗体を用いたヒトＨｂ−ヒトＨｐ複合
体、ヒトＦ−ＨｂおよびヒトＨｐに対するＨｂ値とそれ
ぞれのＦ−Ｈｂ値を１００％としたときの相対活性
を（）内に示した。Ｆ−Ｈｂでは各抗ヒトＨｂ抗体に対
する反応性は７８〜８４ｎｇ／ｍｌの範囲であり、理論
値８０ｎｇ／ｍｌに対してどの抗体を用いても近似して
いた。一方、ヒトＨｂ−ヒトＨｐ複合体においては３７
〜２２９ｎｇ／ｍｌ（４６〜２８６％）の範囲に測定値
が得られ抗体の種類によって感度が異なることが判っ
た。しかしながら、Ｈｐはいずれの抗体とも全く反応し
なかった。

【００２３】以上表１に示したように、抗Ｈｂ抗体の種
類によってヒトＦ−ＨｂおよびヒトＨｂ−ヒトＨｐ複合
体との反応性が異なることが判ったので総ヘモグロビン
を測定する場合には、ヘモグロビンを除去したヒト血
清、またはＨｐをあらかじめ加えて、以下の実施例に記
載したごとくすべてのＨｂをＨｂ−Ｈｐ複合体に変換す
れば正確な定量が可能となった。以下に実施例の一態様
を示すが、本発明は本実施例によって何ら限定されるも
のではない。

【００２４】

【表１】

【００２５】［実施例１］Ｈｐ処理Ｈｂ液の定量性について 《Ｈｂ除去正常ヒト血清の調製》ＣＮＢｒ−活性化セフ
ァロース４Ｂ（ファルマシア社製）１０ｇを１ｍＭ塩酸
水で膨潤した後、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１
Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）２００ｍｌ
で平衡化し、精製ヤギ抗Ｈｂ抗体３０ｍｇを加えた。室
温で２時間攪拌した後、上記緩衝液５００ｍｌで洗浄
し、１％ＢＳＡを含む上記緩衝液１００ｍｌで残存活性
基をマスキングした。室温で２時間攪拌した後、上記緩
衝液で洗浄して抗Ｈｂ抗体−セファロース４Ｂを調製し
た。次に抗Ｈｂ抗体−セファロース４Ｂ ３０ｍｌを
２，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、沈査に溶血し
ていない正常ヒト血清１５ｍｌを加え、室温で３時間振
盪して吸着した。吸着後、２，０００ｒｐｍ、１５分間
遠心分離を行い上清を得た。さらに、３，０００ｒｐ
ｍ、２０分間再度遠心分離を行い上清を得、Ｈｂ除去正
常ヒト血清を調製した。なお、確認のため先に調製した
Ｈｂ除去正常ヒト血清を抗ヒトＨｂ抗体を用いるＥＬＩ
ＳＡ法で測定したところ、全くＨｂは検出されなかっ
た。

【００２６】《標準Ｈｂ−Ｈｐ複合体の調製》２回結晶
ヒトＨｂ（シグマ社製）をシアンメトヘモグロビン法で
測定し、１０ｍｇ／ｍｌになるように蒸留水で調製し
た。この液をさらに３２０ｎｇ／ｍｌになるように０．
１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈を行った。一方、あらかじめ
Ｈｂを除去した正常ヒト血清をＰＢＳで１０³ 倍に希釈
した。上記で調製したヒトＨｂ希釈液（３２０ｎｇ／ｍ
ｌ）５０ｍｌにＨｂ除去正常ヒト血清希釈液（Ｈｐ１．
４μｇ／ｍｌ相当）５０ｍｌを加え、３７℃で１時間反
応した。この反応液を１５ｍｌバイアルビンに１ｍｌず
つ分注し、凍結乾燥したものを標準Ｈｂ−Ｈｐ複合体と
した。

【００２７】《２種類のＨｐ処理希釈液の調製》上記で
調製したヒトＨｂ希釈液（３２０ｎｇ／ｍｌ）を０．１
％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて、さらに１６０ｎｇ／ｍｌ、
８０ｎｇ／ｍｌに希釈し、各々Ａ、Ｂ、Ｃ液とした。各
Ｈｂ液０．５ｍｌに市販の精製Ｈｐ（シグマ社製）より
調製した液（１．４μｇ／ｍｌ）、これとは別にＨｂ除
去正常ヒト血清希釈液（Ｈｐ：１．４μｇ／ｍｌ）を各
々０．５ｍｌずつ各Ｈｂ液に添加し、２種類のＨｐ処理
希釈液を調製した。

【００２８】《Ｈｂ測定法及び総ヘモグロビン標準曲線
の作成》Ｈｂ測定法は比較例に準じ、固相化抗体として
表１のモノクロナール抗体６を用い、標準品としては先
に調製した標準Ｈｂ−Ｈｐ複合体を用いた。また、２種
類のＨｐ処理希釈液の定量性については理論値との比較
を行った。Ｈｂ標準曲線は標準Ｈｂ−Ｈｐ複合体をＨｂ
相当量として５〜１６０ｎｇ／ｍｌの６段階について測
定し、その結果を横軸に標準Ｈｂ−Ｈｐ複合体のＨｂ相
当量、縦軸に各濃度の吸光値としてプロットし作成し
た。（図３参照）

【００２９】《精製Ｈｐ処理とＨｂ除去正常ヒト血清に
よる定量性について》各Ｈｂ液の精製Ｈｐ（市販品）お
よびＨｂ除去正常ヒト血清処理の測定結果を表２に示し
た。２種類のＨｐ処理希釈液ともにＨｂ濃度としての定
量値は理論値の９５〜１０３％の範囲に入っており精度
の高い定量性が認められた。

【００３０】

【表２】

【００３１】

【実施例２】低ハプトグロビン血症患者における血清中の総ヘモグロ
ビンの定量性 《希釈方法》低ハプトグロビン血症患者のＨｐ低値溶血
血清（検体Ｎｏ．７７）１ｍｌを０．１％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓを用いて１０³ 倍に希釈し希釈検体とした。次いで本
希釈液に実施例１で記載したＨｂ除去正常ヒト血清希釈
液（Ｈｐ：１．４μｇ／ｍｌ）を等量混合し、３７℃で
１時間反応し、この反応液をＨｐ処理溶血血清とした。
本疾病患者の溶血血清（Ｈｐ無処理）および本患者の溶
血血清のＨｐ処理溶血血清を各々０．１％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓを用いて２，４，８，１６倍に希釈し実験に供した。

【００３２】《Ｈｂ測定法》上記各段階に希釈した希釈
液を比較例に準じて固相化抗体として表１のモノクロナ
ール抗体６を用い、総Ｈｂを測定した。なお、標準品に
ついては実施例１で調製した標準Ｈｂ−Ｈｐ複合体を用
いた。

【００３３】《定量性》横軸に希釈倍率、縦軸にＨｂ値
をとり、溶血血清（Ｈｐ無処理）およびＨｐ処理溶血血
清の各希釈液のＨｂ測定値および対照としての標準Ｈｂ
−Ｈｐ複合体のＨｂ測定値をプロットした結果を図１に
示した。３例とも直線性を示すが、溶血血清（無処理）
は標準Ｈｂ−Ｈｐ複合体と直線の傾きが著しく異なって
いる。一方、Ｈｐ処理溶血血清は標準Ｈｂ−Ｈｐ複合体
と同じ傾きであることから、本法は精度の高い定量が可
能となった。

【００３４】

【実施例３】Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ＨＲカラムクロマトグ
ラフィーによるＨｐ処理検体のＨｂ−Ｈｐ複合体生成の
確認 《Ｈｐ処理検体のＨｂ−Ｈｐ複合体の作製法》実施例２
に用いたＨｐ低値溶血血清（検体Ｎｏ．７７）１ｍｌに
Ｈｐ除去正常ヒト血清（Ｈｐ：１．４ｍｇ／ｍｌ）１ｍ
ｌを加え３７℃で１時間反応しＨｐ処理検体とした。な
お、対照としてＨｐ低値溶血血清（検体Ｎｏ．７７）１
ｍｌに０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ１ｍｌを加え、同様に操
作したものを無処理検体とした。

【００３５】《Ｈｂ−Ｈｐ複合体の確認》Ｈｐ処理検体
１ｍｌをあらかじめ、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化したＳｅ
ｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ＨＲカラム（φ１．８ｃｍ
×６９ｃｍ，ファルマシア社製）に負荷しゲル濾過を行
なった。各溶出画分について実施例１に準じてＥＬＩＳ
Ａ法を用いヒトＨｂ含量を測定した。図２に示すよう
に、Ｈｐ処理検体はＨｂ−Ｈｐ複合体画分に単一ピーク
として検出された。一方、対照の無処理検体はＨｂ−Ｈ
ｐ複合体画分とＨｂ画分の２つのピークとして検出され
た。以上のことからＨｐ処理を行なうことによって検体
中のＦ−ＨｂはＨｂ−Ｈｐ複合体として形成されている
ことが判った。総ヒトヘモグロビン定量キットの一態様
を以下に示すが、本発明は本実施例によって何ら限定さ
れるものではない。

【００３６】

【実施例４】総ヒトヘモグロビン定量キットの構成 Ａ．キットの構成は以下（１）〜（１１）に示した構成
要素からなる。 （１）ヒトＨｐ（Ｈｂ除去ヒト正常血清、凍結乾燥品） （２）抗ヒトＨｂ抗体固相化プレート（抗ヒトＨｂ抗体
結合マイクロプレート、アジ化ナトリウム含リン酸緩衝
生理食塩液） （３）緩衝液（０．１％ウシ血清アルブミン含リン酸緩
衝生理食塩液） （４）酵素標識抗体（ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＨｂ
抗体、凍結乾燥品） （５）酵素標識抗体溶解液（０．１％ウシ血清アルブミ
ン含リン酸緩衝生理食塩液） （６）ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン１６ｍｇ含有、
リン酸緩衝液、凍結乾燥品） （７）ＯＰＤ溶解液（精製水） （８）標準ヒトＨｂ−Ｈｐ複合体（リン酸生理食塩液、
凍結乾燥品） （９）過酸化水素液（０．６％過酸化水素液） （１０）洗浄原液（５倍濃度液）（０．５％ウシ血清ア
ルブミン含有リン酸緩衝生理食塩液） （１１）反応停止液（４Ｎ硫酸）

【００３７】Ｂ．測定法は以下（１）〜（１３）の操作
手順によって実施した。 （１）ヒトＨｐを緩衝液で溶解した。 （２）被検血清（または血漿）を緩衝液で１０³ 希釈し
た。 （３）ヒトＨｐ液と希釈血清を０．５ｍｌずつ混合し、
３７℃、１時間反応した。 （４）標準ヒトＨｂ−Ｈｐ複合体を緩衝液で希釈し、０
〜２００ｎｇ／ｍｌの標準液を調整した。 （５）抗ヒトＨｂ固相化プレートの各ウエルにヒトＨｐ
処理血清および標準ヒトＨｂ−Ｈｐ複合体の溶液２００
μｌを添加した。 （６）マイクロプレートミキサーで１分間攪拌し、覆い
などをして３７℃で１時間静置した。

【００３８】（７）インキュベート後プレートを逆さに
して、ウエルに残っている溶液を一気に捨てた。全ウエ
ルに洗浄液を約２００μｌ加え、マイクロプレートミキ
サーで３０秒間攪拌後、一気に捨てた。この洗浄を３回
繰り返し、最後にペーパータオル上でプレートを逆さに
してたたき、ウエルから完全に洗浄液を取り除いた。 （８）ブランクのウエルを除く、各ウエルに酵素標識抗
体液２００μｌを同一順序で迅速に加えマイクロプレー
トミキサーで３０秒間攪拌後３７℃で１時間静置した。 （９）（７）と同様に洗浄を行った。 （１０）全ウエルに基質液（過酸化水素＋ｏ−フェニレ
ンジアミン）２００μｌを同一順序、同一時間間隔で加
えマイクロプレートミキサーで３０秒間攪拌後遮光して
室温（１５−２５℃）で１５分間静置した。 （１１）全ウエルに同一順序、同一時間間隔で反応停止
液５０μｌを加えた。 （１２）ブランクのウエルを対照としてマイクロプレー
ト用比色計（４９２ｎｍ／６３０ｎｍ）で測定した。 （１３）標準ヒトＨｂ−Ｈｐ複合体の溶液の吸光値よ
り、標準曲線（図３）を作成し、総ヒトＨｂを算出し
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】標準Ｈｂ−Ｈｐ複合体、Ｈｐ処理溶血血清およ
び溶血血清（Ｈｐ無処理）のスタンダードカーブ

【図２】Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＨＲカラム
クロマトグラフィーによるＨｐ処理検体のＨｂ−Ｈｐ複
合体生成の確認

【図３】総ヘモグロビン標準曲線

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 前田 孚 東京都中央区日本橋室町１−５−３ わか もと製薬株式会社内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヘモグロビン除去ヒト血清、またはヒト
   ハプトグロビンを検体に添加し、検体中に存在する遊離
   ヘモグロビンと反応せしめ、ヒトヘモグロビン−ヒトハ
   プトグロビン複合体を形成せしめたのち、ヘモグロビン
   標準品を用いる酵素免疫測定法により測定することを特
   徴とする総ヘモグロビン測定法。
2. 【請求項２】 総ヘモグロビン測定に用いるヘモグロビ
   ン標準品が標準ヒトヘモグロビン−ヒトハプトグロビン
   複合体であることを特徴とする請求項１記載の測定法。
3. 【請求項３】 請求項１記載の測定法を利用する総ヘモ
   グロビン測定のためのキットであり、検体中に存在する
   遊離ヘモグロビンと反応するヘモグロビン除去ヒト血
   清、またはヒトハプトグロビンからなる試薬を含むこと
   を特徴とする測定キット。